Nghiên cứu chọn lọc giống vi khuẩn khởi động lên men phomat có hương vị đặc trưng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN VĂN LÂM NGHIÊN CỨU CHỌN LỌC GIỐNG VI KHUẨN KHỞI ĐỘNG LÊN MEN PHOMAT CÓ HƢƠNG VỊ ĐẶC TRƢNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN VĂN LÂM NGHIÊN CỨU CHỌN LỌC GIỐNG VI KHUẨN KHỞI ĐỘNG LÊN MEN PHOMAT CÓ HƢƠNG VỊ ĐẶC TRƢNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC THỰC NGHIỆM MÃ SỐ: 60.42.01.14 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn La Anh PGS.TS Nguyễn Quang Huy Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực đề tài hồn thành luận văn, tơi nhận giúp đỡ tận tình quan, thầ y cô hướng dẫn, thầy cô giáo, bạn bè, đồng nghiệp gia đình Tơi xin gửi tình cảm chân thành tới lòng biết ơn sâu sắc tới: - Thầ y giáo PGS TS Nguyễn Quang Huy – Chủ nhiệm khoa Sinh học , Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quố c gia Hà Nội - Cô giáo PGS.TS Nguyễn La Anh – Trưởng Bộ môn công nghệ sinh học vi sinh, Viện Công nghiệp Thực phẩm - Khoa Sau đại học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên , Đại học Quố c gia Hà Nội tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt thời gian học tập nghiên cứu - Các cán nghiên cứu thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học vi sinh, Viện Công nghiệp Thực phẩm cung cấp vật liệu, giúp đỡ động viên suốt trình thực đề tài nghiên cứu - Các thành viên gia đình, bạn bè, đờ ng nghiê ̣p động viên tạo mọi điều kiện suốt trình thực nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng Tác giả luận văn Nguyễn Văn Lâm i năm 2015 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG BIỂU v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi BẢNG CHỮ VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU CHƢƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung phomat .3 1.1.1 Phomat 1.1.2 Phân loại phomat 1.1.3 Tình hình sản xuất tiêu thụ phomat giới Việt Nam 1.2 Công nghệ sản xuất phomat .9 1.2.1 Quy trình sản xuất phomat 1.2.2 Vai trò vi khuẩn lactic sản xuất phomat 12 1.2.2.1 Q trình chuyển hóa lactose 12 1.2.2.2 Q trình chuyển hóa axit lactic .13 1.2.2.3 Q trình chuyển hóa citrate 15 1.2.2.4 Quá trình phân giải lipit chuyển hóa axit béo 17 1.2.2.5 Quá trình phân giải protein 19 1.3 Giống khởi động cho sản xuất phomat .22 1.3.1 Các nhóm vi khuẩn lactic khởi động 22 1.3.1.1 Các chủng vi khuẩn lactic ƣa ấm 22 1.3.1.2 Các chủng vi khuẩn lactic ƣa nhiệt 23 1.3.1.3 Các chủng khởi động “thủ công” 23 1.3.2 Chức cần thiết giống khởi động công nghiệp 24 1.3.2.1 Sản xuất axit 24 1.3.2.2 Tổng hợp exopolysaccharide (EPS) 25 1.3.2.3 Khả tạo hƣơng 25 1.3.3 Kết hợp chủng vi khuẩn ƣa ấm ƣa nhiệt sản xuất phomat 26 1.3.4 Tình hình nghiên cứu tạo giống khởi động sản xuất phomat Việt Nam 26 CHƢƠNG - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Nguồn sữa và chủng vi sinh vâ ̣t nghiên cứu 28 2.2 Hóa chất 28 ii 2.3 Thiết bị 28 2.4 Môi trƣờng 28 2.4.1 Môi trƣờng MRS 28 2.4.2 Môi trƣờng thử citrate 29 2.4.3 Môi trƣờng thử hoạt tính protease ngoại bào 29 2.4.4 Môi trƣờng thử khả đông tụ sữa 30 2.5.1 Phƣơng pháp vi sinh 30 2.5.2 Phƣơng pháp bảo quản giống 31 2.5.3 Xác định mật độ tế bào 31 2.5.3.1 Xác định mật độ tế bào phƣơng pháp đo độ đục 31 2.5.3.2 Xác định mật độ tế bào phƣơng pháp trang cấy 32 2.5.4 Phƣơng pháp kiểm tra khả đông tụ sữa 33 2.5.5 Phƣơng pháp xác định kiểu len men 33 2.5.6 Phƣơng pháp kiểm tra phổ nhiệt độ sinh trƣởng 33 2.5.7 Phƣơng pháp xác định khả phát triển phổ pH 33 2.5.8 Phƣơng pháp kiểm tra khả sử dụng citrate 33 2.5.9 Phƣơng pháp định lƣợng EPS 34 2.5.10 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng đƣờng tổng số phenol - axit sunfuric 34 2.5.11 Phƣơng pháp xác định độ axit 34 2.5.13 Phƣơng pháp kiểm tra khả sử dụng nguồn cacbon 36 2.5.14 Phƣơng pháp kiểm tra hoạt tính enzym 36 2.5.15 Phƣơng pháp cảm quan 36 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .39 3.1 Nghiên cƣ́u đă ̣c điể m của giố ng khởi đô ̣ng cho sản xuấ t phomat 39 3.1.1 Khả đông tụ sữa 40 3.1.2 Đánh giá khả tạo EPS lên men citrate 40 3.1.3 Khả tạo hƣơng thơm chủng LAB phomat tƣơi 43 3.2 Tuyển chọn chủng giống, định tên lập hồ sơ chủng giống 44 3.2.1 Định tên chủng 44 3.2.2 Khả sử dụng nguồn đƣờng 46 3.2.3 Phổ hoạt tính enzym 48 3.3 Phố i hơ ̣p các chủng giố ng lên men đông tu ̣ sƣ̃a làm phomat .51 3.3.1 Ảnh hƣởng mật độ giống tới thời gian đông tụ sữa 51 iii 3.3.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới khả đông tụ sữa 54 3.3.3 Phố i hơ ̣p các chủng giố ng lên men đông tu ̣ sƣ̃a làm phomat .56 3.3.4 Động ho ̣c của hỗn hợp chủng môi trƣờng sữa 60 3.3.5 Đặc tính phomat làm từ hỗn hợp chủng 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .63 Kết luận 63 Kiến nghị 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO .65 iv DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Phân loại phomat theo độ ẩm cấu trúc Bảng 1.2 Sản lƣợng phomat giới giai đoạn 2000-2020 Bảng 1.3 Mô tả vị ngƣỡng giá trị vị số axit amin phomat Cheddar (ủ chín tháng) 20 Bảng 2.1 Phiếu đánh giá tiêu chí cảm quan mẫu phomat 37 Bảng 3.1 Thố ng kê kiể u hiǹ h lên men của các chủ ng vi khuẩ n lactic 39 Bảng 3.2 Danh sách các chủng vi khuẩ n lactic làm đông sữa nhanh 40 Bảng 3.3 Hàm lƣợng EPS đƣợc các chủng vi khuẩ n lactic tổ ng hợp 41 Bảng 3.4 Cảm quan hƣơng thơm của các mẫu phomat 43 Bảng 3.5 Khả sử dụng đƣờng 47 Bảng 3.6 Phổ hoạt tính enzym 49 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả sinh trƣởng 51 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng 51 Bảng 3.9 Phối hợp tỷ lệ giống VNC1/VNC53 56 Bảng 3.10 Kết cảm quan mẫu phomat tƣơi sử dụng chủng kết hợp với tỷ lệ giống khác 57 Bảng 3.11 Kết phối hợp chủng giống lên men sữa 58 Bảng 3.12 Đánh giá cảm quan mẫu kết hợp chủng 59 Bảng 3.13 Đặc tính sữa lên men hỗn hợp chủng 62 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Các loại phomat Hình 1.2 Thống kê tiêu thụ giá trị loại sản phẩm sữa năm 2013 Việt Nam Hình 1.3 Các bƣớc sản xuất phomat 11 Hình 1.4 Các đƣờng lên men hexose (glucose) vi khuẩn lactic 13 Hình 1.5 Các đƣờng chuyển hóa lactate giai đoạn ủ chín phomat 15 Hình 1.6 Con đƣờng tiềm tổng hợp succinate chủng Lactobacillus .16 Hình 1.7 Các đƣờng chuyển hóa citrate chủng Cit+ thuộc Lactococcus Leuconostoc sp 17 Hình 1.8 Các đƣờng chuyển hóa axit béo tự 18 Hình 1.9 Khái qt đƣờng chuyển hóa protein tạo hƣơng sản phẩm sữa lên men 21 Hình 3.1 Hình ảnh đánh giá khả lên men citrate củ a mô ̣t số chủng vi khuẩ n lactic 43 Hình 3.2 Hình ảnh điện di Sản phẩm PCR đoạn gen 16S rADN chủng LAB 45 Hình 3.1 Ảnh hƣởng mật độ tế bào tới thời gian đông tụ sữa chủng VNC1 52 Hình 3.2 Ảnh hƣởng mật độ tế bào tới thời gian đông tụ sữa chủng VNC53 52 Hình 3.3 Ảnh hƣởng mật độ tế bào tới thời gian đông tụ sữa chủng VNY3 53 Hình 3.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới đông tụ sữa chủng VNC1 54 Hình 3.5 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới đơng tụ sữa chủng VNC53 54 Hình 3.6 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới thời gian đông tụ VNY3 55 Hình 3.7 Hình ảnh số mẫu phomat tƣơi 57 Hình 3.8 Các mẫu sữa sau đông tụ gia nhiệt 59 Hình 3.9 Sự thay đổi mật độ tế bào hỗn hợp chủng VNC1, VNC53 60 Hình 3.10 Sự thay đổi mật độ tế bào hỗn hợp chủng VNC1, VNY3 60 vi BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Chữ viết tắt BSA Bovine serum albumin CFU Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc) CoA Coenzyme A CO2 Carbon dioxide CPS Capsular polysaccharides cs cô ̣ng sƣ̣ DNA Deoxyribonucleic Acid DPPH 2,2 – diphenyl – – picrylhydrazyl EPS Exopolysaccharide 10 FAA Free amino acid (axit amin tự do) 11 FAO Tổ chƣ́c Nông – Lƣơng Liên hơ ̣p quố c 12 GC-MS Gas chromatography – Mass spectrometry 13 H2 Hydrogen 14 LAB Lactic acid bacteria (vi khuẩn lactic) 15 MRS de Man, Rogosa and Sharpe (Medium for LAB) 16 OD Optical Density (mật độ quang) 17 pNA p-nitroaniline 18 PCR Polymerase Chain Reaction 19 rDNA Ribosomal Deoxyribonucleic Acid 20 TCA cycle Tricarboxylic acid cycle 21 WHO Tổ chƣ́c Y tế Thế giới vii MỞ ĐẦU Phomat sản phẩm chế biến từ sữa, có từ lâu đời đƣợc sử dụng rộng rãi khắp giới đặc biệt nƣớc phƣơng Tây Phomat đƣợc khám phá tình cờ từ ngƣời du mục Ả Rập khả đông sữa dày cừu Phomat dạng thƣ̣c phẩm giàu dinh dƣỡng, có hàm lƣợng protein cao với đầy đủ axit amin không thay thế, vitamin A, B2, B12 chất khống: kẽm, photpho, canxi … thực phẩm lý tƣởng kết hợp nhiều loại thức ăn khác giúp tăng hƣơng vị, đem lại lợi ích mặt sức khỏe: bảo vệ răng, chống loãng xƣơng, ngăn ngừa ung thƣ đƣợc chuyên gia dinh dƣỡng đánh giá cao Sản lƣợng phomat toàn giới liên tục tăng qua năm Năm 2013, sản lƣợng phomat đạt khoảng 20 triệu tấn/năm chủ yếu đƣợc sản xuất tiêu thụ nƣớc phát triển Ở Việt Nam, sản phẩm đƣợc biết đến thời gian gần mà lý quan trọng cho khác biệt thói quen ăn uống Khi xã hội ngày đại, việc giao lƣu với giới trở lên dễ dàng, nhu cầu tìm hiểu thực phẩm bổ dƣỡng tăng cao phomat đƣợc ý sử dụng nhiều Tuy nhiên hầu hết phomat đƣợc nhập mức tiêu thụ khiêm tốn Một nguyên nhân sản phẩm chƣa hợp với thị hiếu ngƣời Việt Nam giá thành cao Tuy nhiên, với đà tăng trƣởng kinh tế nhu cầu sản phẩm có giá trị dinh dƣỡng, tốt cho sức khỏe nhƣ phomat tăng cao Nhƣ thấy nhu cầu sữa sản phẩm từ sữa có phomat Việt Nam lớn Trong công nghiệp sản xuất sản phẩm lên men từ sữa nói chung phomat nói riêng, điều quan trọng tạo sản phẩm có chất lƣợng cao ổn định Giống khởi động yếu tố quan trọng định chất lƣợng phomat Các sản phẩm giống khởi động đƣợc thƣơng mại hóa thƣờng kết hợp vài chủng vi khuẩn lactic thuộc chi Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc Các vi khuẩn góp phần tạo nên đặc điểm đặc trƣng cấu trúc, hƣơng vị chất lƣợng phomat Hình 3.8 Các mẫu sữa sau đông tụ gia nhiệt Cảm quan mẫu phomat tươi làm từ sữa đông tụ hỗn hợp chủng: Sau đông tụ, tiến hành sản xuất phomat tƣơi từ mẫu Đánh giá cảm quan phomat qua tiêu màu sắc, mùi, vị, cấu trúc (Bảng 3.12): Bảng 3.12 Đánh giá cảm quan mẫu kết hợp chủng Chỉ tiêu đánh giá Mẫu 2.1 Mẫu 2.2 Mẫu 2.3 Mẫu 2.4 Màu sắc 4 4 Hƣơng 4,5 4,5 4,5 Vị 4 4,5 Cấu trúc 4,5 4,5 4,5 Trung bình 4,25 4,38 4,25 Kết bảng cho thấy M2.1, M2.3, M2.4 đƣợc đánh giá cảm quan tốt Chủng VNY3 ảnh hƣởng rõ ràng đến cấu trúc vị phomat Vì kết hợp với Bảng 3.11 ta thấy mẫu M2.3 có đầy đủ yếu tố để thỏa mãn yêu cầu lên men phomat Mẫu M2.3 kết hợp hai chủng VNC1 VNY3 với tỷ lệ 106:106 CFU/ml nhƣng thời gian đông tụ nhanh, tƣơng đƣơng với M2.1 có bổ sung thêm VNC53 Bên cạnh tỷ lệ kết hợp sau q trình ép thu đƣợc khối lƣợng phomat thành phẩm nhiều so với mẫu lại mà độ ẩm phomat đạt yêu cầu (61,7%) Không đánh giá cảm quan M5 thu đƣợc ý kiến tích cực đƣợc nhiều ngƣời ƣa thích hƣơng, vị nhƣ kết cấu 59 phomat tan miệng Do đó, lựa chọn tỷ lệ tiếp giống ban đầu chủng 1x106:1x106 CFU/ml để tiến hành thí nghiệm động học Hơn nữa, vào kết sử dụng nguồn cacbon cho thấy, chủng VNY3 không sử dụng đƣợc galactose Khi kết hợp với chủng VNC1 không tạo cạnh tranh dinh dƣỡng, đồng thời có ƣu điểm sử dụng triệt để nguồn cacbon, hạn chế phát triển mạnh hệ vi sinh vật khơng đóng vai trị giống khởi động 3.3.4 Động ho ̣c của hỗn hợp chủng mơi trƣờng sữa Trong q trình lên men sữa, mật độ tế bào có vai trị quan trọng định khả sinh axit gây đông tụ sữa Tiến hành khảo sát động học hỗn hợp chủng VNC1/VNC53 VNC1và VNY3 với tỷ lệ 106/106 (CFU/ml) thu đƣợc kết quả: D o n g h o c q u a tr in h le n m e n ,5 8 ,0 ,0 ,5 a x it 5 ,5 ,0 ,0 pH L o g ( m a t d o te b a o C F U /m l) pH L o g ( m a t d o te b a o C F U /m l) ,5 ,5 ,0 ,0 ,5 ,5 5 0 6 ,0 0 0 T h o i g ia n le n m e n ( h ) ,0 10 T h o i g ia n le n m e n ( h ) VNC1 VNC1 VNC53 VNY3 pH pH a x it a x it Hình 3.9 Sự thay đổi mật độ tế bào Hình 3.10 Sự thay đổi mật độ tế bào hỗn hợp chủng VNC1, VNC53 hỗn hợp chủng VNC1, VNY3 Mật độ tế bào hai chủng VNC1, VNC53 tăng song song với Chủng VNC1, đầu, phát triển mạnh, mật độ tăng từ 1,19x106 đến 1,05x108(CFU/ml), sau tăng chậm đạt tới mật độ 1,43x109 (CFU/ml) cuối giai đoạn lên men Tƣơng tự, mật độ tế bào chủng VNC53 tăng nhanh từ 1,11x106 đến 1x108 (CFU/ml) đầu tăng chậm Kết thúc giai đoạn lên men, mật độ chủng VNC53 đạt 60 a x it 8,36x108 CFU/ml Nhƣ vậy, kết hợp chủng với vai trò giống khởi động cho q trình lên men sữa, khơng tạo cạnh tranh hai chủng Theo tăng mật độ tế bào chủng VNC1, VNC53 trình lên men, giá trị pH độ axit mẫu phomat thay đổi Dịch sữa lên men có giá trị pH cao độ axit thấp đầu trình lên men, giai đoạn – giờ, thay đổi pH độ axit sữa diễn cách rõ ràng, pH giảm từ 5,9 – 4,80, độ axit tăng 0,19 – 0,44, thời gian đông tụ Với tỷ lệ tiếp giống ban đầu hỗn hợp VNC1/VNC53 1,19x106 1,11x106 CFU/ml, sữa đông tụ sau Kết nhanh so với thí nghiệm trƣớc với tỷ lệ 1,26x106/ 2,06x106 CFU/ml (thời gian đơng tụ 9h30phút) Điều tần suất sử dụng tủ nuôi cấy 30oC lớn, tủ đƣợc mở nhiều, nhiệt độ tủ bị ảnh hƣởng từ nhiệt độ phịng (36- 37oC) Do đó, q trình lên men diễn nhanh nhiệt độ cao 30oC Đặc tính động học hỗn hợp VNC 1/VNY3: đầu hai chủng phát triển chậm, mật độ tế bào chủng VNY3 tăng không nhiều, đạt 2x106 CFU/ml thứ Sau đó, mật độ tế bào hai chủng tăng lên nhanh chóng giai đoạn từ – Cuối giai đoạn lên men, mật độ tế bào chủng VNC1 VNY3 tƣơng ứng đạt 1,31x109 6,95x108 CFU/ml pH sữa hầu nhƣ không thay đổi nhiều đầu, nhƣng sau đó, có tăng đáng kể độ axit sữa từ 0,391 đến 0,711 mmol/100g Điều đƣợc giải thích đầu khoảng thời gian cần cho sinh trƣởng chủng giống, nên chƣa tích tụ nhiều axit lactic mơi trƣờng 3.3.5 Đặc tính phomat làm từ hỗn hợp chủng Kết thúc trình lên men tiến hành bƣớc cần thiết tạo sản phẩm phomat tƣơi Mẫu phomat đƣợc đánh giá cảm quan, kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa hàm lƣợng exopolysaccharide Kế t quả đƣơ ̣c thể hiê ̣n ta ̣i Bảng 3.13 Hàm lƣợng EPS mẫu phomat đƣợc làm từ hỗn hợp chủng VNC1/VNC53 đạt 99,15(mg/l) Hàm lƣợng EPS mẫu phomat làm từ hỗn hợp chủng 61 VNC1/VNY3 đạt 155,13 (mg/l) Kết cao so với mẫu phomat làm từ hỗn hợp chủng Lactococcus lactis subsp cremoris M11 Streptococcus thermophilus T21 101,91 (mg) [13] Hàm lƣợng EPS ảnh hƣởng đến cấu trúc mịn độ đàn hồi phomat, số quốc gia việc bổ sung chất ổn định bị yêu cầu khắt khe, việc chủng giống có khả thay tác dụng chất ổn định đƣợc đánh giá cao Bảng 3.13 Đặc tính sữa lên men hỗn hợp chủng Chủng khởi động pH Độ axit Độ ẩm (%) Cảm quan VNC1/VNC53 4,8 0,44 56,82 Màu trắng ngà, thơm mùi bơ, sữa, mềm, vị chua dịu 60,58 Mẫu màu trắng ngà, có mùi thơm bơ, kem, vị chua vừa, ngậy, vị mặn hài hòa, cấu trúc mềm, mịn VNC1/VNY3 4,38 0,711 Hoạt tính chống oxy hóa phomat làm từ hỗn hợp chủng ƣa ấ m VNC1/VNC53 kết hợp ƣa ấm ƣa nhiệt VNC 1/VNY3 theo phƣơng pháp DPPH có hiê ̣u quả bắ t gố c tƣ̣ lầ n lƣơ ̣t là 68,59 84,87% cao so với phomat làm chủng ƣa ấm Lactococcus lactis subsp cremoris M11 58,13%, cao so với mẫu phomat sử dụng hỗn hợp chủng Lactococcus lactis subsp cremoris M11 Streptococcus thermophilus T21 71,3% [13] Các gốc tự đƣợc hình thành từ hoạt động q trình trao đổi chất có thực phẩm, tồn thể gây oxy hóa phân tử sinh học, làm chết tế bào tổn thƣơng mô Theo Halliwell cs., (1984) [30], bệnh ung thƣ, xơ gan, xơ vữa động mạch, viêm khớp có mối tƣơng quan với oxy hóa mà gốc tự gây 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã tuyể n cho ̣n đƣơ ̣c chủng VNC1, VNC53, VNY3 có đặc điểm cần thiết giớ ng khởi đô ̣ng cho sản xuấ t phomat: Đặc điểm chủng VNC 1, VNC53: ƣa ấ m , lên men đồ ng hin ̀ h , dải nhiệt độ sinh trƣởng từ 15-37oC, chuyể n hóa đƣợc citrate , thời gian đông tu ̣ sƣ̃a nhanh từ 8-10h Sử dụng tốt nguồn đƣờng galactose, glucose, fructose, mannose, maltose, lactose, N-Acetyl-Glucosamine, cellobiose, trehalose, gentiobiose Các enzym có hoạt tính mạnh: axit phosphatase leucine arylamidase, có khả tạo EPS môi trƣờng sƣ̃a lầ n lƣơ ̣t 129,47 mg/l 101,82 mg/l Đặc điểm chủng VNY 3: ƣa nhiê ̣t , dải nhiệt độ sinh trƣởng từ 28-45oC, lên men đồ ng hiǹ h , không chuyể n hóa đƣơ ̣c citrate , thời gian đông tu ̣ sƣ̃a nhanh tƣ̀ 67h Sử dụng tốt loại đƣờng: glucose, lactose Các enzym có hoạt tính mạnh: leucine arylamidase β-galactosidase, có khả tạo EPS mơi trƣờng sƣ̃a là 68,50 mg/l Đã xây dựng hồ sơ chủng giống cho chủng vi khuẩn lên men phomat Streptococcus thermophilus VNY3, Lactococcus lactis subsp lactis VNC1, Lactococcus lactis subsp cremoris VNC53 Đã cho ̣n đƣơ ̣c hai sƣ̣ kế t hơ ̣p tố i ƣu các chủng ấ m VNC 1/VNC53 chủng ƣa ấ m và ƣa nhiê ̣t VNC1/VNY3 để ứng dụng sản xuất phomat tƣơi với mật độ tế bào tiếp giống 106:106 CFU/ml Kiến nghị Tiến hành thí nghiệm phân tích hƣơng với mẫu phomat lên men từ hỗn hợp chủng để có kết cảm quan xác 63 Có thể tiến hành chọn lọc tỷ lệ tiếp giống khác với mật độ tế bào thấp để lên men phomat đạt lợi ích kinh tế cao mà đảm bảo ƣu điểm vốn có chủng giống kết hợp 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn La Anh, Đặng Thu Hƣơng, Dƣơng Văn Khải, Quách Thị Việt (2013), “Hợp tác nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức từ vi khuẩn probiotics”, Đề tài nghị định thư với Thái Lan Nguyễn La Anh, Đặng Thu Hƣơng, Dƣơng Văn Khải (2010), “Báo cáo đề tài nhánh: Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm lactic dùng cho tôm chua”, Đề tài cấp nhà nước KC 07, 12/06-10, 51tr Nguyễn La Anh , Đinh Mỹ Hằ ng , Vũ Quỳnh Hƣơng , Nguyễn Hƣơng Giang, Nguyễn Thi ̣Lô ̣c (2003), “Đặc điểm chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum có ƣ́ng du ̣ng công nghê ̣ sản xuấ t nƣớc CVAS ”, Tuyể n tập báo cáo Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc năm 2003, pp 159161 Công ty Cổ phần chứng khốn Bảo Việt (2009), Báo cáo phân tích cơng ty cổ phần sữa Việt Nam – Vinamilk, Hà Nội Cơng ty Cổ phần Phân tích Dự báo thị trƣờng Việt Nam (2010), Chuyên đề thị trường sữa 2010, Hà Nội Nguyễn Thi ̣Hồ ng Hà , Lê Thiên Minh, Nguyễn Thùy Châu (2003), “Nghiên cƣ́u công nghê ̣ sản xuấ t chế phẩ m vi khuẩ n lactic probiotic ”, Tuyể n tập báo cáo Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc năm 2003, pp 251255 Nguyễn Hoài Hƣơng, Dƣơng Thúy Vy, Trần Linh Châu, Đoàn Kim Nhƣ (2011), “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic từ nem chua truyền thống làm giống khởi động nem chua probiotic”, Kỷ yếu hội nghị Khoa học Môi trường Công nghệ sinh học năm 2011, pp 149-155 Trần Thị Ngọc Mai (2010), “Nghiên cứu ổn định giống Kefir cho sản xuất sữa chua”, Kỷ yếu Hội nghị Khoa học Công nghệ lần thứ ISS_ HUTECH, pp 507 - 514 Lê Thị Liên Thanh, Lê Văn Hồng (2002), Cơng nghệ chế biến sữa sản phẩm từ sữa, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 65 10 Lâm Xuân Thanh (2002), Giáo trình cơng nghệ chế biến sữa sản phẩm từ sữa, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 11 Ngân hàng TMCP Việt Nam Thịnh Vƣợng (2014), Báo cáo ngành thực phẩm đồ uống Việt Nam, Hà Nội 12 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9633:2013 ISO 27205:2010 (2013), Sản phẩm sữa lên men – Giống vi khuẩn khởi động – Tiêu chuẩn nhận dạng 13 Đinh Huy Sơn (2014), Nghiên cứu tuyển chọn chủng giống khởi động cho lên men mát, Luận văn tốt nghiệp cao học ngành Vi sinh vật học, Trƣờng Đại học khoa học tự nhiên, Hà Nội Tiếng Anh 14 Atasoy, A.F (2007), “Determination of pH change kinetics during different stages of Kashar Cheese manufacturing from raw and pasteurized milk with addition of Thermophilic, Mesophilic and mix Thermophilic culture”, Sanliurfa Vocational High School Department of Food Technology Harran University 63010, Sanliurfa, Turkey 15 Bassyouni, R.H., Walla S Abdel-all, Mostafa G Fadl, Saed Abdel-all and Zeinat kamel (2012), “Characterization of Lactic Acid Bacteria Isolated from Dairy Products in Egypt as a Probiotic”, Life Science Journal, 9(4), pp 2924 – 2933 16 Bulut, C (2003), Isolation and molecular characterization of lactic acid bacteria from cheese, Izmir Institute of Technology, Turkey 17 Carroll, R (2002), Home Cheese Making Recipes for 75 Home made Cheese, 3rd Edition, Kindle Edition 18 Christensen J.E., Dudley E.G., Pederson J.A., and Steele J.L (1999), “Peptidases and aminoacid catabolism in lactic acid bacteria” Ant Leeuwenhoek, 76, pp 217–246 19 Cogan T M., Barbosa M., Beuvier e., Branchi-Salvodari B., Cocconcelli P.S., FernandesbI., Gomez J., Gomez R., Kalantzopoulos G., Ledda A., Medina M., Rea M C: and Rodriguez E (1997), “Characterization of the lactic acid bacteria in artisanal dairy products”, International of Dairy Research, 64, pp 409 – 421 20 Condron, R., Patricia Desmarchelier, Rod Dyson, Doug Eddy, Martyn Kink 66 (2009), Microbiological risk assessment of raw milk cheeses Food Standards Australia, New Zealand 21 Dias B and Weimer B (1998), “Conversion of methionine to thiols by lactococci, lactobacilli and brevibacteria”, Applied and Environmental Microbiology, 64, pp 3320 - 3326 22 Degraeve P., Martial-Gros A (2003), “Purification and partial characterisation of X-prolyl dipeptidyl aminopeptidase of Lactobacillus helveticus ITG LH1”, International Dairy Journal, 13(7), pp 497-507 23 Dubois M., K Gillie s, I Hamilton, P Peters and E Smith (1956), “Colometric method for determination of sugars and related substances”, Analytical Chemistry, 28, pp 350 - 356 24 Dudley E.G and J.L Steele (2005), “Succinate production and citrate calabolism by Cheddar cheese nonstarter lactocilli” Journal of Applied Microbiology, 98, pp 14 – 23 25 Fellows, P (2008), Cheese making, Practical Action, United Kingdom 26 Fernandes, R (2008), Microbiology handbook dairy products, Biddles Ltd., United Kingdom 27 Frengovaa, G.I., Emilina D Simovaa, Dora M Beshkovaa and Zhelyasko I Simov (2002), “Exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria of Kefir grains”, Z Naturforsch, 57c, p 805 - 810 28 Fox, P.F., Paul L.H McSweeney, Timothy M Cogan and Timothy P Guinee (2004), Cheese Chemistry, Physics and Microbiology, Volume General Aspects, Elsevier Ltd., United Kingdom 29 Fox P F and Paul L.H McSweeney (1998), Dairy chemistry and biochemistry, Great Britain 30 Halliwell B., Gutteridge JMC (1984), “Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease”, Biochemical Juornal, (219): – 31 Hassan, F.A.M., Mona A.M Abd El – Gawad, A.K Enab (2013) “Flavour Compounds in Cheese (Review)” Research on Precision Instrument and Machinery, 2, pp 15 – 29 32 Garrault, P., J M Faurie, J Mengaud, A Druesne, and G Quere-Chassang (2006), “Souche de Streptococcus thermophilus AMI déficiente post- 67 acidification réduite”, Intl Pat No PCT/EP2005/055443, International Publ No WO 2006/042862 A1 33 Garvie E.I (1984), “Taxonomy and Identification of Bacteria Important in Cheese and Fermented Dairy Products”, Advances in The Microbiology and Biochemistry of Cheese and Fermented Milk, pp 35 - 67 34 Gelais D St-, J Lessard, C P Champagne and J.- C Vuillemard (2009), “Production of fresh Cheddar cheese curds with controlled postacidification and enhanced flavor”, Journal of Dairy Science, 92, pp 1856-1863 35 Kempler G.M and L.L McKay (1980), “Improved medium for detection of citrate – fermenting Streptococcus lactics subsp Deacetylactis”, Applied and Environmental Microbiology 39 (4): pp 926 36 Lahtinen, S., Seppo Salminen, Atte von Wright, Arthur Ouwehand (2011), Lactic acid bacteria: microbiological and functional aspects, CRC Press 37 Lees G.J and Jago G.R (1976), “Formation of acetaldehyde from threonine by lactic acid bacteria”, Journal of Dairy Research, 43, pp 75 – 83 38 Lindner, Juliano D.D (2008), Traditional and innovative approaches to evaluate microbial contribution in long ripened fermented foods: the case of Parmigiano Reggiano cheese, University of Parma, Italia 39 Ling W.H., M Saxelin, O Hanninens and S Salminen (1994), “Enzyme Profile of Lactobacillus Strain GG by a Rapid API ZYM System: A Comparison of Intestinal Bacterial Strains, Microbial ecology in health and disease, 7, pp 99-104 40 Lopez-Diaz T.M., Alonso C.,Roman, C Garcia-Lopez M.L., and Moreno, B (2000), “Lactic acid bacteria isolated from a hand-made blue cheese”, Food Microbiology, 17, pp 23 - 32 41 McSweeney, Paul L.H (2004), “Biochemistry of cheese ripening”, International Journal of Dairy Technology, 57, pp 127 – 144 42 Paul L.H.McSweeney (2000), “Biochemical pathways for the production of flavour compounds in cheeses during ripening: Areview”, INRA, EDP Sciences, Lait 80, pp 293 - 324 43 Noni, I.D, Richard J FitzGerald, Hannu J T Korhonen, Yves Le Roux, Chris T Livesey, Inga Thorsdottir, Daniel Tomé, Renger Witkamp (2009), “Review of the potential health impact of β-casomorphins and 68 related peptides”, EFSA Scientific Report, 231, pp 1-107 44 Oberg, C J., and J R Broadbent (1993), “Thermophilic starter cultures Another set of problems”, J Dairy Sci (76): 2392–2406 45 Okuklu, B (2005) Investigation of chromosomal and plasmid DNA profiles of Lactococcus lactis ssp Lactis, Izmir Institute of Technology, Turkey 46 Puchades R Lemieux L., Simard R.E (1989), “Evolution of free amino acids during ripening of Cheddar cheese containing added lactobacilli strains”, Journal of Food Science and Technology, 54, 885 – 888 47 Quintans N G., Blancato V., Repizo G., Magni C and Paloma López P (2008), “Molecular aspects of lactic acid bacteria for traditional and new application”, Applied Microbiology and Biotechnology, (51): 422 – 430 48 Rimada, Pablo S and Analía G Abraham (2003), “Comparative study of different ethodologies to determine the exopolysaccharide produced by kefir grains in milk and whey”, Lait, 83, pp 79 - 87 49 Ross, R.P., Stanton, C., Hill, C., Fitzgerald, G.F and Coffey, A (2000), “Novel Cultures for cheese improvement”, Trends in Foood Science and Technology, 11, pp 96 -104 50 Savadogo, A., Cheik A T Ouattara, Paul W Savadogo, Nicolas Barro, Aboubacar S Ouattara, Alfred S Traoré (2004), “Identification of exopolysaccharides - producing lactic acid bacteria from Burkina Faso fermented milk samples”, African Journal of Biotechnology, 3(3), pp 189-194 51 Sgarbi, E (2012), Non stater lactic acid bacteria during cheese ripening: survival, growth and production of molecules potentially involved in aroma formation, University of Parma, Italia 52 Smit G and W.J.M Engels (2005), “Flavour formation by lactic acid bacteria and biochemical flavour profiling of cheese products”, FEMS Microbiology Review, 29, pp 591 – 610 53 Tison, W., M F Ratcliff, A J Hillier, and G R Jago (1982), “Metabolism of Streptococcus thermophilus III Influence of the level of bacterial metabolites in Cheddar cheese” Aust J Dairy Technol (37):17–21 54 Wallace J.M and P.F Fox (1997), "Effect of adding free amino acids to cheddar cheese curd on proteolysis, flavour and texture development”, International Journal of Dairy Technology, 7, pp 157 – 167 69 55 Walstra, P.; Jan T.M Wouters, Tom J Geurts (2006), Dairy Science and Technology, Second Edition, Taylor and Francis Group, USA 56 Winn, W.C., Elmer William Koneman (2006), Koneman's Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia 57 Yvon, M., and Rijnen, L (2001), “Cheese flavor formation by amino acid catabolism”, International Dairy Journal, 11, pp 185-201 Tài liệu Website 58 www.healthyeating.org 59 www.ctahr.hawaii.edu 60 http://www.fao.org 61 www.blmedien.de 62 http://www.customs.gov.vn/ 63 www.eufic.org 64 http://www.dairyscience.info/index.php/cheese-starters/49-cheesestarters.html 70 PHỤ LỤC Các trình tự 16S rADN chủng vi khuẩn lactic VNC53, VNC1, VNY3 >VNC53 (100% tƣơng đồng Lactococcus lactis subsp cremoris) GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTTGAGCGATGAAGATTGGTGCTTGCA CCAATTTGAAGAGCAGCGAACGGGTGAGTAACGCGTGGGGAATCTGCCTTTGAGCGGGGG ACAACATTTGGAAACGAATGCTAATACCGCATAACAACTTTAAACATAAGTTTTAAGTTT GAAAGATGCAATTGCATCACTCAAAGATGATCCCGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGT AAAGGCTCACCAAGGCGATGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGA CTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGA AAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTG GTAGAGAAGAACGTTGGTGAGAGTGGAAAGCTCATCAAGTGACGGTAACTACCCAGAAAG GGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGAT TTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGTGGTTTATTAAGTCTGGTGTAAAAGGCAGTGGCTC AACCATTGTATGCATTGGAAACTGGTAGACTTGAGTGCAGGAGAGGAGAGTGGAATTCCA TGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTG GCCTGTAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGT AGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGATGTAGGGAGCTATAAGTTCTCTGTATCGCAG CTAACGCAATAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATT GACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCT TACCAGGTCTTGACATACTCGTGCTATTCCTAGAGATAGGAAGTTCCTTCGGGACACGGG ATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCA ACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAACGAGACTGCC GGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGG CTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTCGCGAGACAGTGATGTTTAGCTAATC > VNC1 (100% tƣơng đồng Lactococcus lactis subsp lactis ) GGTTGGTACTTGTACCAACTGGATGAGCAGCGAACGGGTGAGTAACGCGTGGGGAATCTG CCTTTGAGCGGGGGACAACATTTGGAAACGAATGCTAATACCGCATAAAAACTTTAAACA CAAGTTTTAAGTTTGAAAGATGCAATTGCATCACTCAAAGATGATCCCGCGTTGTATTAG CTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGATGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGAT CGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCT TCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATC GTAAAACTCTGTTGGTAGAGAAGAACGTTGGTGAGAGTGGAAAGCTCATCAAGTGACGGT AACTACCCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCG AGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGTGGTTTATTAAGTCTGGTGTA AAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTATGCATTGGAAACTGGTAGACTTGAGTGCAGGAGAGG AGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCG AAAGCGGCTCTCTGGCCTGTAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGA TTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGATGTAGGGAGCTATAAGT TCTCTGTATCGCAGCTAACGCAATAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGA AACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGC AACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTCGTGCTATTCCTAGAGATAGGAAGTTC CTTCGGGACACGGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTG GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACT CTAACGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCC CCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTCGCGAGACAGTG ATGTTTAGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTAC ATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGC 71 >VNY3 (100% tƣơng đồng Streptococcus thermophilus ) TGCAAGTAGAACGCTGAAGAGAGGAGCTTGCTCTTCTTGGATGAGTTGCGAACGGGTGAG TAACGCGTAGGTAACCTGCCTTGTAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACC GCATAACAATGGATGACACATGTCATTTATTTGAAAGGGGCAATTGCTCCACTACAAGAT GGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTAGGTGAGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATACATAG CCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGA GGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGCAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGT GAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTAAGTCAAGAACGGGTGTGAGAGTGGAA AGTTCACACTGTGACGGTAGCTTACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGC GGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGG TTTGATAAGTCTGAAGTTAAAGGCTGTGGCTCAACCATAGTTCGCTTTGGAAACTGTCAA ACTTGAGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAT GGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAG CGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAG GTGTTGGATCCTTTCCGGGATTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGG AGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGC ATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGATGCTAT TTCTAGAGATAGAAAGTTACTTCGGTACATCGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAG CTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGC CATCATTCAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTAATAAACCGGAGGAAGGTGGGGAT GACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTGGTAC AACGAGTTGCGAGTCGGTGACGGCGAGCTAATCTCTTAAAGCCAATCTCAGTTCGGATTG TAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGC GGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACAC CCGAAGTCGGTGAGGTAACCT So sánh độ tƣơng đồng trình tự ADN 16S chủng VNC53 với số chủng khác So sánh độ tƣơng đồng trình tự ADN 16S chủng VNC1 với số chủng khác 72 So sánh độ tƣơng đồng trình tự ADN 16S chủng VNY3 với số chủng khác 73