Bước đầu xây dựng mô hình đánh giá hoạt tính đông cầm máu của công thức dược liệu định hướng tác dụng điều trị trĩ trên mô hình in vitro

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC LƯƠNG PHÚ HƯNG KHẢO SÁT CƠ CHẾ CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VỚI CHẤT KÍCH TẬP ADP CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT CÂY DONG RIỀNG ĐỎ Canna warszewiczii A Dietr KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Người thực hiện: LƯƠNG PHÚ HƯNG KHẢO SÁT CƠ CHẾ CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VỚI CHẤT KÍCH TẬP ADP CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT CÂY DONG RIỀNG ĐỎ Canna warszewiczii A Dietr KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2015.Y Người hướng dẫn: TS Vũ Thị Thơm TS Nguyễn Thị Vân Anh Hà Nội – 2020 LỜI CẢM ƠN Khi nhận đề tài khóa luận này, tơi cảm thấy thân may mắn học tập nghiên cứu lĩnh vực mà tơi u thích Tơi khơng học hỏi thêm nhiều kiến thức mà nhận quan tâm, giúp đỡ thầy cô, nhà trường, bệnh viện, gia đình bạn bè Đầu tiên, tơi xin gửi cảm ơn đến tồn thể Ban chủ nhiệm Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội Bộ môn Y dược học sở thầy cô giáo khoa tạo điều kiện cho tơi làm khóa luận tốt nghiệp giúp đỡ tơi hồn thành chương trình học tập suốt năm qua Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến TS Vũ Thị Thơm TS Nguyễn Thị Vân Anh Các cô người thầy tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập hồn thành khóa luận Khơng truyền đạt kiến thức khoa học kinh nghiệm q báu mình, cịn truyền cho tơi lịng u nghề, nhiệt huyết tận tâm với công việc Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Hồng Luyến nhóm sinh viên đến từ Đại học Khoa học Công nghệ Hà Nội quan tâm, giúp đỡ tơi q trình thực nghiên cứu phịng thí nghiệm Tơi xin gửi lời cảm ơn đến bác sĩ nhân viên Khoa Huyết học, Bệnh viện Bạch Mai giúp đỡ, tạo điều kiện cho thực đề tài cách thuận lợi Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tình yêu thương sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè, người ln quan tâm, khuyến khích, động viên tạo điều kiện giúp đỡ thời gian học tập thực đề tài khóa luận Hà Nội, ngày 10 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Lương Phú Hưng DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT A AC ADP APTT Arg-Gly-Asp ATP AUC Ca++ CalDAG-GEFI cAMP COX-1 CW DCM DEA DMSO EA FPA GDP GP GTP G-actin IP3 K+ LTA Mg++ Phần mặt đất (Aerial) Adenylyl cyclase Adenosine diphosphate Thời gian thromboplastin phần hoạt hóa (Activated partial thromboplastin time) Arginylglycylaspartic acid Adenosine triphosphate Mức độ ngưng tập tiểu cầu (Area Under the aggregation Curve) Ion Canxi Yếu tố trao đổi guanine điều hòa canxi DAG – Cyclic adenosine monophosphate Cyclooxygenase Canna warszewiczii A Dietr Dichloromethane Mức độ phân rã ngưng tập (Deaggregation) Dimethyl sulfoxide Ethyl acetate Phần trăm ngưng tập tiểu cầu điểm cuối (Final Platelet Aggregation) Guanine diphosphate Glycoprotein Guanine triphosphate Monomer actin Inositol (1,4,5) trisphosphate Ion Kali Phương pháp đo độ ngưng tập tiểu cầu thông qua độ dẫn truyền ánh sáng (Light Transmission Aggregometry) Ion Magie MPA PIP2 PI 3-K PKB/Akt Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (Maximal Platelet Aggregation) n-Hexan Ngưng tập tiểu cầu Thụ thể hoạt hóa protease (Protease – activated receptor) Phosphatidylcholine Phosphatidylethanolamine Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate Phosphoinositide 3-kinase Serine-threonine protein kinase B/Akt PLC Phospholipase C PLCγ PPADS PPP PRP PS PT R Slope Phospholipase Cγ Pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2′,4′-disulfonic acid Huyết tương nghèo tiểu cầu (Platelet-poor plasma) Huyết tương giàu tiểu cầu (Platelet-rich plasma) Phosphatidylserine Thời gian prothrombin (Prothrombin time) Phần thân rễ (Rhizome) Tốc độ ngưng tập tiểu cầu TXA2 t-SNARE UDP UTP Thromboxane A2 Protein liên kết màng bào tương Uridine diphosphate Uridine triphosphate Yếu tố von Willebrand Protein liên kết màng hạt tiểu cầu nH NTTC PAR PC PE vWF v-SNARE DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên Bảng Trang Bảng 1.1 Đặc điểm số GP Bảng 1.2 Thành phần hạt α Bảng 2.1 Các nhóm tiến hành đo ngưng tập tiểu cầu 26 Bảng 3.1 Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope) 29 Bảng 3.2 Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA) 30 Bảng 3.3 Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) 32 Bảng 3.4 Giá trị P sai khác AUC nhóm 32 Bảng 3.5 Mức độ phân rã ngưng tập (DEA) 33 Bảng 3.6 Đánh giá phối hợp PPADS phân đoạn dịch chiết 39 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên Hình Trang Hình 1.1 Cấu trúc tiểu cầu cắt theo mặt phẳng xích đạo Hình 1.2 Giai đoạn bám dính Hình 1.3 Giai đoạn ngưng tập tiểu cầu Hình 1.4 Hiện tượng thay đổi hình dạng 13 Hình 1.5 Cơ chế hoạt hóa GPIIb/IIIa 14 Hình 1.6 Cơ chế hịa màng giải phóng chất từ hạt tiểu cầu 16 Hình 1.7 Các đường hoạt hóa tiểu cầu đích tác dụng thuốc kháng tiểu cầu 17 Hình 2.1 Mẫu Dong riềng đỏ C warszewiczii A Dietr 22 Hình 2.2 Sơ đồ tách chiết phân đoạn dịch chiết C warszewiczii A Dietr 23 Hình 2.3 Quá trình ngưng tập tiểu cầu gây ADP M 25 Hình 3.1 So sánh khác biệt giá trị trung bình Slope nhóm 30 Hình 3.2 So sánh khác biệt giá trị trung bình MPA nhóm 31 Hình 3.3 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu nhóm 34 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Sinh lý học tiểu cầu 1.1.1 Cấu trúc tiểu cầu 1.1.2 Chức tiểu cầu .7 1.1.2.1 Vai trò tiểu cầu trình cầm máu ban đầu 1.1.2.2 Vai trò tiểu cầu trình đơng máu huyết tương 10 1.2 Ngưng tập tiểu cầu in vitro hoạt hóa ADP 10 1.2.1 Thụ thể purinergic 10 1.2.2 Quá trình ngưng tập tiểu cầu in vitro gây ADP 12 1.2.2.1 Pha ngưng tập nguyên phát 12 1.2.2.2 Pha ngưng tập thứ phát 15 1.3 Các thuốc kháng ngưng tập tiểu cầu .16 1.3.1 Nhóm ức chế Cyclooxygenase (COX-1) 17 1.3.2 Nhóm ức chế thụ thể P2Y12 18 1.3.3 Nhóm ức chế thụ thể thrombin 18 1.3.4 Nhóm ức chế phức hợp GPIIb/IIIa .19 1.3.5 Nhóm ức chế phosphodiesterase 19 1.4 Tổng quan Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A Dietr 19 1.4.1 Đặc điểm thực vật, thực trạng phân bố công dụng 19 1.4.2 Các nghiên cứu trước Canna warszewiczii A Dietr .20 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.1.1 Đối tượng 22 2.1.2 Thu thập mẫu máu 23 2.1.3 Dụng cụ nghiên cứu 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu .24 2.2.1 Phương pháp pha phân đoạn dịch chiết hóa chất 24 2.2.2 Phương pháp thu thập xử lý mẫu bệnh phẩm 24 2.2.3 Phương pháp phân tích ngưng tập tiểu cầu 24 2.2.4 Phân tích xử lý số liệu 27 2.2.5 Đạo đức nghiên cứu 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29 3.1 Kết .29 3.1.1 Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope) 29 3.1.2 Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA) .30 3.1.3 Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) .31 3.1.4 Mức độ phân rã ngưng tập (Deaggregation – DEA) 33 3.1.5 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu 33 3.2 Bàn luận 35 3.2.1 Thiết kế nghiên cứu 35 3.2.2 Kết nghiên cứu .35 3.2.3 Hạn chế nghiên cứu 40 KẾT LUẬN .41 KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO .43 ĐẶT VẤN ĐỀ Các bệnh lý tim mạch nguyên nhân gây tử vong hàng đầu giới Phần lớn số có liên quan đến đau tim đột quỵ Đây triệu chứng cấp tính gây tắc nghẽn lưu thông máu đến tim não mà tác nhân xuất huyết khối [32, 48] Những nghiên cứu sinh lý học chứng minh vai trò quan trọng tiểu cầu hình thành cục máu đơng Nằm chuỗi biến đổi xảy kể từ tiểu cầu hoạt hóa, ngưng tập tiểu cầu, kết tập tiểu cầu tạo thành đám tiểu cầu, xem tiền đề để hình thành huyết khối Để ngăn ngừa điều trị bệnh lý có liên quan đến huyết khối, nhiều thuốc kháng tiểu cầu nghiên cứu đời Bên cạnh lợi ích mang lại điều trị, thuốc kháng tiểu cầu gây nhiều tác dụng không mong muốn làm tăng nguy chảy máu hay loét dày Do đó, xu hướng nghiên cứu hợp chất có nguồn gốc tự nhiên ngày quan tâm với mong muốn phát triển thuốc kháng tiểu cầu có tác dụng tốt quan trọng gây tác dụng khơng mong muốn người sử dụng Việt Nam nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa với thảm thực vật vơ phong phú Hơn nữa, kinh nghiệm sử dụng cỏ làm thuốc chữa bệnh người dân dồi Điều giúp cho Việt Nam có nguồn tài nguyên thuốc quý giá Theo kinh nghiệm dân gian số địa phương, Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A Dietr sử dụng để điều trị số triệu chứng bệnh lý tim mạch đau thắt ngực, đau tim [6, 35] Theo đó, vài nghiên cứu tiến hành để đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu, chống đông máu phân đoạn dịch chiết Canna warszewiczii A Dietr Tổng hợp kết nghiên cứu cho thấy phân đoạn dịch chiết ethyl acetate, dichloromethane, n-hexan có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu gây chất kích tập ADP, collagen, ristocetin [13, 31] Do đó, đề tài “Khảo sát chế chống ngưng tập tiểu cầu với chất kích tập ADP phân đoạn dịch chiết Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A Dietr” thực với mục tiêu: Nhận xét: Các nhóm EA mg/mL + PPADS 100 M, DCM 12 mg/mL DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M làm giảm mức độ NTTC cách rõ rệt so sánh với nhóm chứng âm DMSO 0,5% Đặc biệt, AUC nhóm DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M thấp có ý nghĩa thống kê so với AUC nhóm PPADS 100 M EA mg/mL 3.1.4 Mức độ phân rã ngưng tập (Deaggregation – DEA) Bảng 3.5 Mức độ phân rã ngưng tập (DEA) Nhóm N DEA (%) PKruskal-Wallis Chứng âm DMSO 0,5% PPADS 100 M 27,99 ± 14,50 DMSO 0,5% + PPADS 100 M 53,32 ± 22,69 EA mg/mL 67,70 ± 13,42 EA mg/mL + PPADS 100 M 38,43 ± 16,17 DCM 12 mg/mL 94,12 ± 5,88 DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M 75,00 ± 25,00 0,097 Nhận xét: Hai nhóm chứng âm DMSO 0,5% khơng có xảy tượng phân rã ngưng tập Hai nhóm có chứa phân đoạn DCM có mức độ phân rã mạnh PKruskal-Wallis > 0,05 cho thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê mức độ phân rã ngưng tập (DEA) nhóm 3.1.5 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu 33 Hình 3.3 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu nhóm (A: Chứng âm, B: DMSO 0,5%, C: PPADS 100 M, D: DMSO 0,5% + PPADS 100 M, E: EA mg/mL, F: EA mg/mL + PPADS 100 M, G: DCM 12 mg/mL, H: DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M) Nhận xét: Hai nhóm chứng âm DMSO 0,5% cho đồ thị đặc trưng trình NTTC in vitro gây chất kích tập ADP Đồ thị nhóm chứa 34 PPADS và/hoặc phân đoạn dịch chiết xuất pha ngưng tập nguyên phát, vắng mặt pha ngưng tập thứ phát Một cách trực quan, phối hợp dịch chiết dược liệu PPADS cho thấy tác dụng ức chế ngưng tập mạnh nhóm có hai dịch chiết dược liệu Xu hướng phân rã ngưng tập sau ngưng tập đạt cực đại ghi nhận, thể qua phần trăm NTTC điểm cuối (FPA) thấp phần trăm NTTC tối đa (MPA) Tuy nhiên, tốc độ mức độ phân rã khác nhóm, hai nhóm chứa phân đoạn DCM phân rã ngưng tập nhanh hoàn toàn 3.2 Bàn luận 3.2.1 Thiết kế nghiên cứu Phương pháp phân tích ngưng tập tiểu cầu sử dụng phương pháp đo độ ngưng tập tiểu cầu thông qua độ dẫn truyền ánh sáng (Light Transmission Aggregometry – LTA) Được giới thiệu lần 50 năm trước, đến nay, LTA tiêu chuẩn vàng để đánh giá chức tiểu cầu hiệu thuốc kháng tiểu cầu [10, 28] ADP chất kích tập sử dụng ADP gây NTTC qua tương tác với hai thụ thể P2Y1 P2Y12 Sự phối hợp hai thụ thể giúp trình ngưng tập gây ADP diễn đầy đủ Nghiên cứu sử dụng L ADP 10 M (nồng độ cuối cùng) Sự uốn cong nhẹ báo hiệu phản ứng giải phóng chất từ hạt tiểu cầu, bắt đầu pha ngưng tập thứ phát không quan sát thấy PPADS sử dụng làm chất ức chế không đặc hiệu thụ thể purinergic màng tiểu cầu PPADS ức chế thụ thể P2X hoạt hóa ATP, P2Y1 P2Y12 hoạt hóa ADP Nồng độ cuối PPADS thí nghiệm đo NTTC 100 M Đây nồng độ ức chế tối đa 50% (IC50) PPADS với thụ thể P2Y12 Ái lực PPADS với P2Y1 KB = – 12 M [30] 3.2.2 Kết nghiên cứu Đồ thị ngưng tập miêu tả cách trực quan diễn biến trình NTTC Kết hợp với bốn thơng số: tốc độ NTTC (Slope), phần trăm NTTC tối đa 35 (MPA), mức độ phân rã ngưng tập (DEA) mức độ NTTC (AUC), q trình NTTC với chất kích tập ADP đánh giá phân tích đầy đủ [11] Từ Hình 3.3, sau thêm chất kích tập ADP, kiện tiểu cầu thay đổi hình dạng ghi nhận tất nhóm, thể việc đồ thị lên nhẹ, hình thành đỉnh nhọn, xuống báo hiệu pha ngưng tập nguyên phát bắt đầu [24] Thụ thể P2Y1 chịu trách nhiệm cho giai đoạn thay đổi hình dạng pha ngưng tập nguyên phát ADP gắn vào P2Y1 châm ngòi cho chuỗi phản ứng hoạt hóa cuối dẫn đến tương tác IP với thụ thể hệ thống ống dày đặc, huy động làm tăng nồng độ Ca ++ nội bào Sự gia tăng Ca+ + nội bào dẫn đến số thay đổi Thứ nhất, loạt protein tham gia vào trình cắt, ghép vi sợi actin hoạt hóa Từ đó, hệ khung xương tế bào bị phá vỡ Từ hình đĩa, tiểu cầu phồng lên thành hình cầu Sau đó, tiểu cầu co lại, đồng thời hình thành chân giả phần mở rộng (lamellipodia) [9], [44], [47] Đồ thị tất nhóm ghi nhận tượng Do đó, phân đoạn EA mg/mL, DCM 12 mg/mL hay PPADS 100 M không ảnh hưởng đến giai đoạn tiểu cầu thay đổi hình dạng Hiện tượng thứ hai gây gia tăng nồng độ Ca ++ nội bào hoạt hóa thụ thể GPIIb/IIIa (Hình 1.5), dẫn đến hình thành ngưng tập tiểu cầu Theo đó, CalDAG-GEFI xúc tác phản ứng biến đổi RAP1-GDP thành RAP1-GTP, hoạt hóa thụ thể GPIIb/IIIa từ trạng thái lực thấp thành trạng thái lực cao liên kết với fibrinogen tan huyết tương [9] Nhờ đó, tiểu cầu liên kết với thơng qua cầu fibrinogen, hình thành ngưng tập nguyên phát Tiểu cầu ngưng tập nhiều độ dẫn truyền ánh sáng tăng Do đó, đồ thị ngưng tập có xu hướng xuống Pha ngưng tập nguyên phát đánh giá thông qua tốc độ NTTC (Slope) Slope tính cách vẽ đường tiếp tuyến với đồ thị ngưng tập sau giai đoạn tiểu cầu thay đổi hình dạng phản ánh thay đổi ngưng tập phút Bởi vậy, tiểu cầu ngưng tập nhanh nhiều, đồ thị xuống dốc, giá trị Slope lớn Dựa vào Bảng 3.1 Hình 3.1, nhóm có chứa phân đoạn dịch chiết và/hoặc PPADS làm giảm tốc độ 36 NTTC so sánh với nhóm chứng âm DMSO 0,5% Điều đáng ý hai nhóm EA mg/mL + PPADS 100 M DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M có tốc độ ngưng tập thấp có ý nghĩa thống kê so với nhóm PPADS 100 M, EA mg/mL DCM 12 mg/mL Kết đưa đoán tác dụng hiệp đồng PPADS hai phân đoạn dịch chiết ức chế tiểu cầu ngưng tập với làm giảm tốc độ NTTC Quá trình ngưng tập tiếp tục diễn theo hai xu hướng Xu hướng gọi ngưng tập ổn định, phản ứng giải phóng chất từ hạt tiểu cầu xảy ra, khuếch đại củng cố ngưng tập, hình thành pha ngưng tập thứ phát Thụ thể P2Y12 thể vai trò trung tâm giai đoạn ADP tương tác với P2Y 12, hoạt hóa phosphoinositide 3-kinase (PI 3-K) thông qua tiểu đơn vị  PI 3-K có hai tác động quan trọng Thứ nhất, PI 3-K ức chế RASA3, chất xúc tác biến đổi RAP1-GTP trở lại thành RAP1-GDP Do đó, PI 3-K trì trạng thái hoạt hóa GPIIb/IIIa, làm bền vững liên kết tiểu cầu củng cố đám ngưng tập Thứ hai, PI 3-K tác động đến trình giải phóng chất từ hạt tiểu cầu theo chế chưa ++ làm rõ Hạt đặc tiết lượng lớn ADP, ATP, Ca , serotonin, histamine giúp khuếch đại ngưng tập tiểu cầu ATP gắn với P2X 1, hoạt hóa kênh ion vận chuyển ++ Ca , làm tăng nồng độ Ca ++ nội bào ADP giải phóng hoạt hóa tiểu cầu khác tham gia vào trình ngưng tập Hạt α tiết protein dính fibrinogen, vWF củng cố liên kết tiểu cầu Ngoài ra, P2Y 12 gián tiếp ổn định ngưng tập thông qua ức chế adenylyl cyclase (AC) Quá trình ngưng tập ổn định quan sát thấy đồ thị ngưng tập chứng âm DMSO 0,5% (Hình 3.3 A B) Theo đó, phản ứng giải phóng xảy ra, pha ngưng tập thứ phát bắt đầu, đồ thị tiếp tục xuống thoải dần kết thúc thí nghiệm đo Bởi vậy, phần trăm NTTC tối đa (MPA) hai nhóm phần trăm NTTC điểm cuối (FPA) Tuy nhiên, đồ thị nhóm cịn lại (Hình 3.3 C – H) diễn theo xu hướng phân rã ngưng tập Đồ thị đạt đến điểm thấp nhất, uốn cong ngược trở lại lên Do đó, FPA < MPA MPA nhóm thấp MPA 37 chứng âm DMSO 0,5% Đặc biệt, nhóm DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M có phần trăm NTTC tối đa thấp có ý nghĩa thống kê so với nhóm PPADS 100 M, EA mg/mL DCM 12 mg/mL Tiểu cầu ngưng tập với hầu hết thông qua liên kết thụ thể GPIIb/IIIa với fibrinogen Do đó, tượng phân rã ngưng tập phá vỡ liên kết Hiện tượng xuất nhóm có chứa phân đoạn dịch chiết và/hoặc PPADS Tuy nhiên, mức độ tốc độ phân rã lại khác nhóm Đối với nhóm PPADS 100 M DMSO 0,5% + PPADS 100 M, thụ thể P2Y1 P2Y12 bị ức chế Do đó, tín hiệu đáp ứng ngưng tập ADP không đủ mạnh để gây phản ứng giải phóng nồng độ PPADS (100 M) lớn khoảng 10 lần nồng độ ADP (10 M) Củng cố cho lập luận thể ngưng tập gây ADP nồng độ thấp (< 2,5 M) thường không xuất pha ngưng tập thứ phát [24] Thụ thể GPIIb/IIIa khơng trì trạng thái hoạt hóa khiến liên kết tiểu cầu lỏng lẻo dễ bị phá vỡ dòng chất lỏng chuyển động tạo viên bi khuấy Đồ thị ngưng tập hai nhóm lên từ từ ngưng tập chưa phân rã hết điểm cuối (Hình 3.3 C D) Xu hướng phân rã quan sát thấy đồ thị ngưng tập nhóm EA mg/mL EA mg/mL + PPADS 100 M (Hình 3.3 E F) Tuy nhiên, nhóm DCM 12 mg/mL DCM 12 mg/mL + PPADS 100 M (Hình 3.3 G H) cho ngưng tập phân rã nhanh hầu hết phân rã hồn tồn trước phút thứ thí nghiệm đo NTTC Điều chất có mặt phân đoạn DCM tác động trực tiếp đến liên kết GPIIb/IIIa fibrinogen, làm ngưng tập phân rã nhanh Nghiên cứu Lê Hồng Luyến cộng sự khác biệt thành phần chất hai phân đoạn dịch chiết Theo đó, ngồi chất xuất hai phân đoạn (glycoside, glycoside tim, steroid, cholesterol), phân đoạn EA phần mặt đất chứa lượng polyphenol flavonoid lớn Trong đó, phân đoạn DCM có thêm coumarin tannin [31] Polyphenol coumarin chứng minh có tác dụng ức chế NTTC [12] Đặc biệt, flavonoid ức chế ngưng 38 tập gây nhiều chất kích tập khác in vitro TXA2, thrombin, collagen ADP Flavonoid coumarin có gắn với thụ thể GPIIb/IIIa [15, 49] AUC thơng số quan trọng đánh giá q trình ngưng tập cách tổng quan Mức độ NTTC nhóm DMSO 0,5% tương đương nhóm chứng âm (lần lượt 272,93 ± 21,31 281,27 ± 20,33) chứng tỏ khơng có ảnh hưởng dung mơi lên trình ngưng tập gây ADP AUC PPADS 100 M (143,14 ± 40,27) DMSO 0,5% + PPADS 100 M (73,70 ± 18,78) thấp so với chứng âm DMSO, cho thấy khả ức chế NTTC PPADS Các phân đoạn dịch chiết EA mg/mL (93,60 ± 25,04) DCM 12 mg/mL (50,85 ± 24,83) cho thấy tác dụng ức chế NTTC Sự phối hợp đồng thời PPADS phân đoạn dịch chiết làm giảm mức độ NTTC thấp so với nhóm có dược liệu đơn lẻ Bảng 3.6 Đánh giá phối hợp PPADS phân đoạn dịch chiết M1 M2 Slope MPA AUC EA + PPADS EA *   DMSO + PPADS    * *     DCM + PPADS DCM DMSO + PPADS ( : Giá trị M1 thấp M2; *: Sai khác có ý nghĩa thống kê (P < 0,05)) Sự phối hợp PPADS với hai phân đoạn dịch chiết làm giảm thơng số phản ánh q trình ngưng tập tiểu cầu so sánh với nhóm phân đoạn dịch chiết đơn lẻ hay nhóm DMSO 0,5% + PPADS 100 M Đây tác dụng hiệp đồng ức chế tượng ngưng tập tiểu cầu với chất kích tập ADP ADP hoạt hóa tiểu cầu qua tương tác với hai thụ thể P2Y P2Y12 Tín hiệu nội bào hoạt hóa thụ thể GPIIb/IIIa tiểu cầu ngưng tập với qua cầu fibrinogen Số lượng liên kết tiểu cầu giảm nguyên nhân dẫn đến sụt 39 giảm thơng số Điều ADP phải cạnh tranh với nhiều chất đối vận phân đoạn dịch chiết để gắn vào thụ thể nó, dẫn đến đáp ứng ngưng tập yếu Tín hiệu kích thích phản ứng giải phóng chất từ hạt tiểu cầu bị ức chế Fibrinogen phải cạnh tranh với flavonoid, coumarin để tạo liên kết với GPIIb/IIIa Với đa dạng thành phần chất, hai phân đoạn dịch chiết EA DCM ức chế ngưng tập theo nhiều đường khác 3.2.3 Hạn chế nghiên cứu Cỡ mẫu nghiên cứu nhỏ, độ lặp lại chưa cao Phương pháp đo NTTC kỹ thuật LTA tốn nhiều thời gian chịu ảnh hưởng nhiều biến thiên kỹ thuật Thiết bị đo độ NTTC Chrono-Log-490 khơng tính tốn phần trăm NTTC điểm cuối (FPA) Nghiên cứu chưa khảo sát với chất hoạt hóa chọn lọc thụ thể P2Y 1, P2Y12 nên chưa đánh giá đầy đủ tác dụng ức chế ngưng tập phân đoạn dịch chiết Nghiên cứu khảo sát chế chống NTTC gây ADP Trong đó, phân đoạn dịch chiết cho thấy khả ức chế ngưng tập với nhiều chất kích tập khác (collagen, ristocetin) 40 KẾT LUẬN Khảo sát chế chống ngưng tập tiểu cầu in vitro phân đoạn dịch chiết Dong riềng đỏ C warszewiczii A Dietr, rút số kết luận theo mục tiêu đề sau:  Sự phối hợp phân đoạn dịch chiết CW.A.EA mg/mL CW.A.DCM 12 mg/mL với PPADS 100 M có tác dụng hiệp đồng, làm tăng khả ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro thể qua thông số tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope), phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA), mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) mức độ phân rã ngưng tập (DEA)  Do đa dạng thành phần chất, hai phân đoạn dịch chiết chống ngưng tập tiểu cầu theo nhiều chế khác 41 KIẾN NGHỊ Nghiên cứu với chất ức chế hoạt hóa đặc hiệu P2Y1 P2Y12 Đo ngưng tập tiểu cầu với chất kích tập khác collagen, ristocetin để đánh giá chế đầy đủ Phân tích xác định thành phần cấu trúc chất phân đoạn dịch chiết Tiến hành nghiên cứu với thiết bị đại Lumiaggregometry (khảo sát phản ứng giải phóng chất từ hạt tiểu cầu) hay PAP-8E (tính tốn thêm thơng số pha lag, slope pha ngưng tập thứ phát, phần trăm ngưng tập điểm cuối mức độ phân rã) 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Quang Đông (2015), Nghiên cứu chất lượng số yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng khối tiểu cầu, Luận văn tiến sĩ y học, Đại học Y Hà Nội Phạm Thị Minh Đức (2006), Sinh lý học, NXB Y học, Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học Đỗ Trung Phấn (2006), Bài giảng Huyết học - Truyền máu sau đại học, NXB Y học, Hà Nội Ngô Đức Phương, Nguyễn Duy Như, Nguyễn Duy Thuần (2015) Bổ sung loài thuốc - Canna warszewiczii A.Dietr - cho hệ thực vật Việt Nam Tạp chí Dược học, 476, 20–23 Nguyễn Anh Trí (2008), Đơng máu ứng dụng lâm sàng, NXB Y học TÀI LIỆU TIẾNG ANH Born G.V (1962) Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal Nature, 194, 927–929 Cattaneo M (2019) 14 - The Platelet P2 Receptors Platelets (Fourth Edition) Academic Press, 259–277 10.Cattaneo M (2009) Light transmission aggregometry and ATP release for the diagnostic assessment of platelet function Semin Thromb Hemost, 35(2), 158– 167 11 Cattaneo M., Cerletti C., Harrison P cộng (2013) Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH J Thromb Haemost 12.Costa A.G.V., Garcia-Diaz D.F., Jimenez P cộng (2013) Bioactive compounds and health benefits of exotic tropical red–black berries Journal of Functional Foods, 5(2), 539–549 13.Do Nhat H (2018), In vitro anti-platelet aggregation of Canna warszewiczii extracts, Bachelor Thesis, University of Science and Technology of Hanoi 14.Estevez B Du X (2017) New Concepts and Mechanisms of Platelet Activation Signaling Physiology (Bethesda), 32(2), 162–177 15.Faggio C., Sureda A., Morabito S cộng (2017) Flavonoids and platelet aggregation: A brief review Eur J Pharmacol, 807, 91–101 16.Flaumenhaft R Sharda A (2019) 19 - Platelet Secretion Platelets (Fourth Edition) Academic Press, 349–370 17.Gachet C (2012) P2Y12 receptors in platelets and other hematopoietic and non-hematopoietic cells Purinergic Signal, 8(3), 609–619 18.Gachet C (2015) Antiplatelet drugs: which targets for which treatments? Journal of Thrombosis and Haemostasis, 13(S1), S313–S322 19.Gachet C Cazenave J.P (1991) ADP induced blood platelet activation: a review Nouv Rev Fr Hematol, 33(5), 347–358 20.Gremmel T., Iii A.L.F., Michelson A.D (2016) Platelet Physiology Semin Thromb Hemost, 42(3), 191–204 21 Gryka R.J., Buckley L.F., Anderson S.M (2017) Vorapaxar: The Current Role and Future Directions of a Novel Protease-Activated Receptor Antagonist for Risk Reduction in Atherosclerotic Disease Drugs R D, 17(1), 65–72 22.Gurney D (2016) Platelet function testing: from routine to specialist testing Br J Biomed Sci, 73(1), 10–20 23.Hanke A.A., Roberg K., Monaca E cộng (2010) Impact of platelet count on results obtained from multiple electrode platelet aggregometry (MultiplateTM) European Journal of Medical Research, 15(5), 214 24.Hayward C.P.M Moffat K.A (2019) 34 - Platelet Aggregation Platelets (Fourth Edition) Academic Press, 609–626 25.Jennings L.K (2009) Mechanisms of platelet activation: need for new strategies to protect against platelet-mediated atherothrombosis Thromb Haemost, 102(2), 248–257 26.Katzung B.G Trevor A.J (2015), Basic & Clinical Pharmacology, Lange 27.Kauskot A Hoylaerts M.F (2012) Platelet receptors Handb Exp Pharmacol, (210), 23–57 28.Koltai K., Kesmarky G., Feher G cộng (2017) Platelet Aggregometry Testing: Molecular Mechanisms, Techniques and Clinical Implications IJMS, 18(8), 1803 29.Koupenova M Ravid K (2018) Biology of Platelet Purinergic Receptors and Implications for Platelet Heterogeneity Front Pharmacol, 30.von Kügelgen I (2019) Pharmacology of P2Y receptors Brain Research Bulletin, 151, 12–24 31.Luyen L., Thom V., Huong L.T cộng (2020) Inhibitory effect on human platelet aggregation, antioxidant activity, and phytochemicals of Canna warszewiczii (A Dietr) Nb tanaka Phcog Res, 12(1), 47 32.McFadyen J.D., Schaff M., Peter K (2018) Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis Nat Rev Cardiol, 15(3), 181– 191 33.Müller C.E., Baqi Y., Namasivayam V (2020) Agonists and Antagonists for Purinergic Receptors Methods Mol Biol, 2041, 45–64 34.Murugappa S Kunapuli S.P (2006) The role of ADP receptors in platelet function Front Biosci, 11, 1977–1986 35.Nguyen T.V.A., Ly H.D.T., Vu T.T cộng (2018) Novel finding on anticoagulant activity of Canna warszewiczii extracts Asian Journal of Pharmacognosy, 36.Paniccia R., Priora R., Alessandrello Liotta A cộng (2015) Platelet function tests: a comparative review Vasc Health Risk Manag, 11, 133–148 37.Patrono C., Morais J., Baigent C cộng (2017) Antiplatelet Agents for the Treatment and Prevention of Coronary Atherothrombosis J Am Coll Cardiol, 70(14), 1760–1776 38.Puri R.N., Colman R.W., Liberman M.A (1997) ADP-lnduced Platelet Activation Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 32(6), 437–502 39.Rendu F Brohard-Bohn B (2001) The platelet release reaction: granules’ constituents, secretion and functions Platelets, 12(5), 261–273 40.Ruggeri Z.M Jackson S.P (2013) Chapter 20 - Platelet Thrombus Formation in Flowing Blood Platelets (Third Edition) Academic Press, 399– 423 41.Sarikaya E (2019) Functions of Purinergic Receptors Receptors P1 and P2 as Targets for Drug Therapy in Humans 42.Savage B., Cattaneo M., Ruggeri Z.M (2001) Mechanisms of platelet aggregation Curr Opin Hematol, 8(5), 270–276 43.Selvadurai M.V Hamilton J.R (2018) Structure and function of the open canalicular system - the platelet’s specialized internal membrane network Platelets, 29(4), 319–325 44.Shin E.-K., Park H., Noh J.-Y cộng (2017) Platelet Shape Changes and Cytoskeleton Dynamics as Novel Therapeutic Targets for AntiThrombotic Drugs Biomol Ther (Seoul), 25(3), 223–230 45 Smith S.A Morrissey J.H (2019) 21 - Interactions Between Platelets and the Coagulation System Platelets (Fourth Edition) Academic Press, 393–400 46.Teng R (2015) Ticagrelor: Pharmacokinetic, Pharmacodynamic and Pharmacogenetic Profile: An Update Clin Pharmacokinet, 54(11), 1125– 1138 47.Thomas S.G (2019) - The Structure of Resting and Activated Platelets Platelets (Fourth Edition) Academic Press, 47–77 48.WHO Cardiovascular diseases (CVDs) , accessed: 03/04/2020 49.Zaragozá C., Monserrat J., Mantecón C cộng (2016) Antiplatelet activity of flavonoid and coumarin drugs Vascul Pharmacol, 87, 139–149 50.Zhou L Schmaier A.H (2005) Platelet Aggregation Testing in PlateletRich Plasma: Description of Procedures With the Aim to Develop Standards in the Field Am J Clin Pathol, 123(2), 172–183 51.Treatment_of_H_mophilia_2008._Platelet_Function_Disorders.pdf , accessed: 21/03/2020 ... thể hoạt hóa protease (Protease – activated receptor) Phosphatidylcholine Phosphatidylethanolamine Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate Phosphoinositide 3-kinase Serine-threonine protein kinase... Fibrinogen, vWF, fibronectin, vitronectin thrombospondin GPIa/IIa Integrin α2β1 Collagen GPIb/IX/V Thụ thể nhiều đoạn acid amin giàu leucine lặp lại vWF GPVI Thụ thể thuộc siêu họ globulin miễn... dài sợi acin bảo vệ sợi khỏi khử trùng ngưng (depolymerization) Hệ thống vi sợi hình thành chủ yếu nhờ filamin α-actinin Filamin protein có hình dạng giống chữ V, đầu chụm vào tương tác với phần