Nghiên cứu tuyển chọn một số vi khuẩn có hoạt tính phân giải protein cao ứng dụng xử lý nước thải giàu đạm​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài : NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ VI KHUẨN CĨ HOẠT TÍNH PHÂN GIẢI PROTEIN CAO ỨNG DỤNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI GIÀU ĐẠM NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN : CN NGUYỄN HOÀNG MỸ SINH VIÊN THỰC HIỆN MSSV : 107111072 : NGUYỄN PHẠM HUYỀN LỚP : 07DSH3 TP HỒ CHÍ MINH, 2011 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1.1 Đặt vấn đề Hiện nay, Việt Nam công xây dựng kiến thiết đất nước theo hướng cơng nghiệp hóa, đại hóa với phát triển dân số tốc độ thị hóa cao Cùng với ngành nghề khác ngành nuôi trồng chế biến thủy sản giữ vai trò quan trọng phát triển kinh tế nước Tuy nhiên, bên cạnh gia tăng vấn đề môi trường, đặc biệt ô nhiễm nguồn nước thải từ nhà máy chế biến Việc tìm phương pháp xử lý nước thải cho hiệu giảm tình trạng nhiễm môi trường vấn đề quan tâm không doanh nghiệp mà nhà quản lý Xử lý sinh học chủng vi sinh vật với ưu điểm phù hợp điều kiện tự nhiên, giảm chi phí lượng, hóa chất, đơn giản, có khả tận dụng sản phẩm phụ sau xử lý phương pháp có tiềm Trong hoạt động vi sinh vật giữ vai trò quan trọng, ảnh hưởng đến hiệu xử lý toàn hệ thống Trong nước thải thủy sản chế biến thịt số vi sinh vật có khả phân hủy hợp chất hữu chứa nitơ quan tâm, đặc biệt vi khuẩn thuộc chi Bacillus Các chủng vi sinh vật có nhiều ứng dụng nhiều lĩnh vực khác như: công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp thực phẩm ý lĩnh vực xử lý nước thải chứa nhiều đạm Việc phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn tiến hành đề tài: "Nghiên cứu tuyển chọn số vi khuẩn có hoạt tính phân giải protein cao ứng dụng xử lý nước thải giàu đạm"với mục đích từ nước thải ngành chế biến thủy sản thịt tìm chủng vi sinh vật nâng cao hiệu xử lý góp phần bảo vệ mơi trường 1.2 Ý nghĩa đề tài 1.2.1 Ý nghĩa khoa học Trang Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Giúp bổ sung thêm số chủng vi khuẩn phân lập có hoạt tính protease mạnh ứng dụng vào xử lý nước thải giàu đạm 1.2.2 Ý nghĩa thực tiễn Giúp xử lý nước thải giàu protein đạt hiệu quả, góp phần bảo vệ mơi trường ngành thủy sản nói riêng mơi trường nước nói chung Hình thành vài chế phẩm sinh học phù hợp xử lý nước thải giàu đạm TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Lĩnh vực sử dụng vi sinh vật xử lý nước thải chưa nghiên cứu công bố phổ biến Tuy nhiên có nhiều tài liệu nghiên cứu enzyme protease vi sinh vật có khả phân hủy protein đặc biệt vi khuẩn Bacillus Nhiều cơng trình nghiên cứu cơng bố biết đến như:  Trên giới Năm 2002, B Aslin, N Saglam Y Beyatli nghiên cứu số đặc điểm Bacillus phân lập từ đất Năm 2005, tác giả S Sharmin, Md Towhid Hossain M.N Anwar thuộc trường đại học Chittagong nghiên cứu đặc điểm protease từ Bacillus amovivorus tối ưu hóa số yếu tố ảnh hưởng điều kiện sinh tổng hợp enzyme protease  Ở Việt Nam Năm 2004, Đỗ Thị Bích Thủy Trần Thị Xơ công bố đề tài nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh enzyme protease từ số chủng Baciilus Tác giả Ngô Tự Thành, Bùi Việt Hà, Vũ Minh Đức Chu Văn Mẫn nghiên cứu hoạt tính enzyme protease ngoại bào số chủng Bacillus phân lập khả ứng dụng chúng xử lý nước thải MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI Phân lập vi khuẩn có hoạt tính phân giải protein từ số nguồn nước thải thủy sản chế biến thịt Khảo sát hoạt tính protease chủng vi khuẩn phân lập Trang Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp tổng hợp tài liệu: Nghiên cứu, thu thập tài liệu tham khảo, tài liệu internet liên quan đến đề tài Phương pháp thực nghiệm:  Phương pháp phân lập vi khuẩn có khả phân giải protein từ vài nguồn nước thải từ nhà máy chế biến thủy sản thịt  Phương pháp thử nghiệm sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập  Phương pháp xác định mật độ tế bào  Phương pháp xác định hoạt độ protease từ vi sinh vật phương pháp Amano  Phương pháp khảo sát hoạt độ protease chủng vi khuẩn phân lập KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC Xác định đặc điểm hình thái sinh hóa 10 chủng có khả phân hủy protein từ nước thải thủy sản chế biến thịt Xác định hoạt độ phân giải protease mật độ tế bào Khảo sát ảnh hưởng pH nhiệt độ đến hoạt độ protease KẾT CẤU CỦA ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Lời mở đầu Chương 1: Tổng Quan Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết biện luận Chương 4: Kết luận kiến nghị Trang Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Trang Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền 1.1 Tổng quan nước thải giàu đạm 1.1.1 Sơ lược ngành sản xuất có nước thải giàu đạm Ni trồng chế biến thủy hải sản xem ngành công nghiệp mũi nhọn Việt Nam Theo số liệu thống kê thủy sản, có 1.470.000 hecta mặt nước sơng ngịi dùng cho ni trồng thủy sản Ngồi cịn có 544.500.000 hecta ruộng trũng, 56.200.000 hecta hồ dùng để nuôi cá Mặt khác, nước ta nằm vùng có địa lý thuận lợi với bờ biển dài 3.260 km, vùng biển thềm lục địa rộng lớn triệu km2 thích hợp cho việc ni trồng thủy hải sản có giá trị kinh tế cao Tổng trữ lượng cá tầng đáy vùng biển Việt Nam có khoảng 1,7 triệu lồi, khả cho phép khai thác khoảng triệu tấn/năm Tổng trữ lượng cá tầng khoảng 1,2 – 1,3 triệu Nguồn lợi thủy sản chủ yếu tôm, cá, có khoảng triệu tấn/năm khai thác triệu tấn/năm Theo báo cáo tổng cục thống kê tháng đầu năm 2010, xuất thủy sản Việt Nam đạt giá trị 2,047 tỷ USD tăng 17% so với kỳ năm 2009 Trong tơm sản phẩm xuất chủ lực chiếm 35% sản lượng xuất khẩu, lại sản phẩm khác Bảng 1.1: Sản lượng kim ngạch xuất thủy sản giai đoạn 2007 – 6th/2010 Năm Chỉ tiêu 2007 2008 2009 6th/2010 Sản lượng (nghìn tấn) 12 1239 1219 597,9 Kim ngạch (triệu USD) 3760 4510 4251 2047 ( Nguồn: Hải quan Việt Nam - Tổng cục thống kê) Trang Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Bảng 1.2: Sản lượng kim ngạch mặt hàng thủy sản xuất giai đoạn 2007 – 6th/2010 Mặt hàng Sản lượng (nghìn tấn) 2007 2008 Kim ngạch( triệu USD) 2009 6th/2010 2007 2008 2009 6th/2010 Tôm 160,5 192 209 87,2 1500 1630 1692 718 Cá tra basa 372 644 608 304 - 1460 1357 653 Loại khác 631,5 403 402 61,9 - 1420 1202 256 (Nguồn: Hải quan Việt Nam-Tổng cục thống kê) Cùng với ngành nuôi trồng khai thác thủy sản ngành chế biến thủy sản có nhiều đóng góp thành tích chung ngành thủy sản Việt Nam Trong năm gần đây, khoảng 35% đầu sản phẩm thủy sản sản xuất để xuất phần lại bán thị trường nội địa dạng tươi sống (34,5%), qua chế biến (45,7%) dạng bột cá, nước mắm, cá khô Bên cạnh phát triển ngành thủy sản ngành giết mổ gia súc chế biến thịt không ngừng lớn mạnh qui mô phát triển kỹ thuật giết mổ thật trở thành ngành cơng nghiệp Ở nước ta thấy việc giết mổ gia súc diễn phức tạp, manh mún, quy trình kỹ thuật giết mổ từ nhỏ đến quy mô lớn dẫn đến chất lượng thịt không đảm bảo khơng đạt vệ sinh an tồn thực phẩm Hiện thành phố Hồ Chí Minh có 41 sở giết mổ (số liệu đến ngày 13.3.2003), có sở phép giết mổ trâu bị, có sở giết mổ có cơng suất 300-1000 heo/ ngày đêm 1.1.2 Tính chất nước thải giàu đạm  Nước thải chế biến thủy sản Nước thải ngành chế biến thủy sản chứa nồng độ chất hữu gây ô nhiễm cao (các phế phẩm sau chế biến, hóa chất xử lý), nhiều chất có chứa hàm lượng nitrogen liên kết lưu huỳnh Các nhà máy chế biến thủy sản đơng lạnh thường có lượng nước thải lớn so với sở chế biến hàng khơ, nước mắm, đồ hộp bình qn khoảng 50000m3 ngày Trang Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Giá trị đặc tính nước thải chế biến thủy sản có phổ phân tán biến động tương đối rộng chúng có đặc điểm chung phụ thuộc vào loại nguyên liệu, quy trình sản xuất sản phẩm chế biến Những yếu tố định thành phần, đặc tính mức độ nhiễm sở sản xuất chế biến Nhìn chung, hàm lượng chất hữu trung bình dao động từ 300-3000 mg/l COD, từ 200-2000 mg/l BOD5, từ 9,5-400 mg/l SS, hàm lượng nitơ tổng số từ 90270mg/l, photpho tổng từ 30-90mg/l Trong nước thải có hàm lượng chất hữu cao nước máu cá nước dính nhớt từ sở sản xuất bột cá, COD lên đến 93.000mg/l, BOD5 lên đến 76.000mg/l Tuy nhiên tùy giai đoạn mà giá trị có thay đổi đáng kể, nước thải từ trình rã đơng, sơ chế rửa ngun liệu khâu chế biến đồ hộp thủy sản đông lạnh có độ đậm đặc cao cao BOD từ 1.000-10.0000 mg/l, SS từ 1.000-2.000 mg/l Nước thải từ trình hấp, luộc có hàm lượng BOD từ 10.00020.000 mg/l, SS từ 1.000-10.000 mg/l Nước thải từ trình ngâm để sản xuất Jam bơng, xúc xích thủy sản có COD từ 1.000-3.000 mg/l, SS từ 5002.000 mg/l Nước thải từ q trình vệ sinh cơng nghiệp có COD từ 400-2.000 mg/l BOD từ 10-1.000 mg/l, SS từ 300-3.000mg/l Sau số kết phân tích thành phần tính chất nước thải thủy hải sản tham khảo vài nhà máy chế biến thủy sản điển hình Bảng 1.3: Thành phần tính chất nước thải nhà máy chế biến thuỷ hải sản Bà Rịa - Vũng Tàu Chỉ tiêu Mức độ BOD5 1000 – 2000 mg/l Tổng chất rắn lơ lửng 1500 – 2000 mg/l Tổng nitơ 75 – 230 mg/l Tổng photpho – 10 mg/l pH 6,6 – 7, (Nguồn: CEFINEA, 2002) Trang Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Bảng 1.4: Thành phần tính chất nước thải nhà máy chế biến thuỷ hải sản Ngô Quyền - Kiên Giang Chỉ tiêu Đơn vị Nước thải Nước thải Nước thải Nước thải chế biến chế biến phân xưởng mực tôm đông lạnh 6,62 7,32 7,14 7,08 pH cống xả phân xưởng đông lạnh TDS mg/l 1440 1160 1640 1410 Độ đục PTU 121 92 242 152 Độ màu Pt-Co 1674 852 2273 1600 P - PO4 mg/l 21,01 12,56 3,75 12,44 SS mg/l 9,5 55 36 32 N-amoni mg/l 165,19 76 52,71 98 1000 1100 19000 - 893 336 230 1200 Coliform MPN/100ml COD mg/l (Nguồn: CEFINEA, 2002) Bảng 1.5: Đặc trưng thành phần tính chất nước thải nhà máy chế biến thuỷ sản STT Đặc trưng ô nhiễm Hàm lượng Quy chuẩn Việt Nam 11:2008, loại B BOD5 300-2000 50 COD 500-3000 80 SS 200-1000 100 pH 6,5-7,5 5,5-9 N 50-200 60 P 10-100 (Nguồn: CEFINEA, 2002) Trang Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền  Nước thải chế biến thịt Ngoài sở chế biến thủy sản sở giết mổ, chế biến thịt thải môi trường lượng lớn nước thải có nồng độ nhiễm tương đối cao BOD5 từ 2.500-7.400 mg/l, COD từ 2.400-9.600mg/l Mặt khác nước thải sở chế thịt thường chứa lượng lớn vi sinh vật Nếu khơng có biện pháp xử lý dễ gây nhiễm vi sinh vật gây bệnh, gây ngộ độc nguồn nước sử dụng Ngoài ngành giết mổ ngành đòi hỏi sử dụng nước nhiều, cơng đoạn xử lý ngun liệu có nhu cầu dung nước khâu rửa sơ nguyên liệu, khâu làm rã nước đá đông lạnh, khâu xử lý nguyên liệu, khâu chế biến Nước thải công nghiệp chế biến thịt gần giống nước thải sinh hoạt có mức độ nhiễm cao nhiều, với nồng độ dầu, mỡ, axit béo cao, cịn có chất tẩy rửa lơng Bảng 1.6: Đặc trưng thành phần tính chất nước thải chế biến thịt STT Thông số Đơn vị Hàm lượng pH - 5,3-8,9 Độ dẫn điện - 2,8-6,1 Clo mg/l 1,1-390 Chất rắn qua lọc - 160-580 BOD5 mg/l 1500-7400 COD mg/l 2400-9600 Chất béo - 115-300 Axit hữu - 61-350 Nitơ amon mg/l 230-1120 10 H2 S - 0-20 11 Tổng P mg/l 1,6-53 12 Độ cứng - 35,6-125 13 Độ kiềm - 30-70 Trang Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Trang 57 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Hình 3.8: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ enzyme protease Từ kết phân tích cho thấy hầu hết chủng vi khuẩn phân lập có nhiệt độ tối ưu 500C Kết phù hợp với nghiên cứu Đặng Văn Hợp (2000) enzyme protease tách chiết từ Aspergillus oryzae A4 hoạt động tốt 500C Tuy nhiên kết lại thấp kết nghiên cứu Vũ Ngọc Bội enzyme protease từ Bacillus subtilis S5 có nhiệt hoạt động tối ưu 550C.[1] Trang 58 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Trang 59 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền 4.1 Kết luận - Từ mẫu nước thải nhà máy thủy sản chế biến thịt cá phân lập 10 chủng vi khuẩn có khả phân hủy protein Dựa vào kết nhuộm gram, bào tử đặc điểm sinh hóa bước đầu định danh 10 chủng vi khuẩn phân lập thuộc chi Bacillus sở hệ thống phân loại Bergey - Đã xác định hoạt độ phân giải protease chủng vi khuẩn phương pháp Amano thu chủng M2, M5, M4, V2, V3 có hoạt độ phân giải chủng lại Hoạt độ phân giải protease hầu hết chủng vi khuẩn phân lập tăng theo thời gian nuôi cấy, kết cho cao nuôi cấy 72 - Tiến hành khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease, cụ thể khảo sát ảnh hưởng pH nhiệt độ Kết khảo sát cho thấy pH=7 chủng vi khuẩn cho hoạt độ phân giải protease cao nhất, vượt nhiệt độ hoạt độ phân giải giảm Và nhiệt độ tối ưu cho hoạt độ phân giải protease 500C 4.2 Kiến nghị - Do thời gian tiến hành thí nghiệm có hạn nên đề tài dừng lại việc phân lập chủng vi khuẩn điều kiện nuôi cấy tĩnh Một số hướng mà đề tài nghiên cứu hồn thiện như: - Tiếp tục phân lập thêm chủng vi sinh vật có khả phân hủy protein cao từ nguồn nước thải khác chế biến sữa, đường - Tiếp tục thực thí nghiệm để định danh xác 10 chủng vi khuẩn phân lập có sở khoa học việc giải thích hoạt tính - Cần nghiên cứu thêm ảnh hưởng độ bền nhiệt đến hoạt độ phân giải enzyme để xác định điểu kiện tối ưu cho việc nuôi cấy tạo chế phẩm - Cần xác mật mật độ tế bào thời điểm đo hoạt tính 24, 48, 72, 96 nhằm xác định mối tương quan mật độ tế bào hoạt độ phân giải protease Trang 60 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Vũ Ngọc Bội, Nghiên cứu trình thủy phân protease cá enzyme protease từ Bacillus subtilis S5, Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố HCM [2] Đỗ Hồng Lan Chi, Lâm Minh Triết, Vi sinh môi trường Nhà xuất Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh [3] Nguyễn Lân Dũng cộng ,(1976) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập ІІ Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, 1976 [4] Nguyễn Lân Dũng cộng sự, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập ІІІ Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, 1978 [5] Trần Liên Hà, Đặng Ngọc Sâm “Phân lập tuyển chọn Bacillus để xử lý nước hồ ô nhiễm” , Viện CNSH – CNTP, Trường đại học Bách Khoa Hà Nội [6] Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Thị Thùy Dương,(2003), Công nghệ xử lý nước thải Nhà xuất Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh [7] Nguyễn Đức Lượng cộng sự, (2004), Công nghệ enzyme Nhà xuất Đại học quốc gia thành phố Hồ chí Minh [8] Lương Đức Phẩm, Công nghệ xử lý nước thải phương pháp sinh học Nhà xuất Giáo dục [9] Nguyễn Đức Lượng, (2006), Thí nghiệm vi sinh vật học Nhà xuất Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh [10] Trần Linh Thước cộng sự, Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm, mỹ phẩm Nhà xuất Giáo dục [11] S.Sharmin, Md Towhid Hossain and M.N Anwar (2005), Isolation and characterization of a Protease Producing bacteria Bacillus amovivorus and Optimization of Some Factors of culture Condition for Protease Production, Jomal of Biologycal Scences [12] Do Thi Bich Thuy, Tran Thi Xo, Production, purification and application of protease from Bacillus subtilis, Joumal of Agricultural Science and Technology Trang 61 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền PHỤ LỤC Bảng hệ thống phân loại Bergey (1989) Thể mang bào tử không phình lên rõ rệt Bào tử hình elip, hình viên trụ trịn đầu Bào tử có màng mỏng, gram dương A Nguyên sinh chất tế bào non phát triển thạch glucose có khơng bào nhuộm nhạt Đường kính thể sinh dưỡng 0,9µm hay lớn 1- Tạo thành acid từ manitol, không tạo thành acetylmethyl carbinol B.megaterium 2- Không tạo thành acid từ manitol, tạo thành acetylmethyl carbinol a- Hoại sinh vài nòi gây bệnh nhẹ b- Khi phát triển thạch khơng có dạng rễ cây, thường di động B.cereus bb- Khi phát triển thạch có dạng rễ cây, thường không di động B.cereus var mycodes aa - Gây bệnh b- Gây bệnh than, không di động B.anthracsis bb- Gây bệnh số côn trùng, thường di dộng B.thuringiensis B Nguyên sinh chất tế bào non phát triển thạch glucose, khơng có dạng khơng bào nhuộm nhạt Đường kính thể sinh dưỡng nhỏ 0,9µm 1- Trên mơi trường thạch glucose phát triển tốt tốt môi trường thạch khô đậu tương a- Phát triển môi trường chứa 7% NaCl b- Thủy phân tinh bột tạo thành nitrite từ nitrate c- Trong môi trường canh thang glucose phát triển tốt điều kiện kỵ khí pH dịch ni cấy 5,2 hay thấp Tạo thành khí từ nitrate điều kiện kỵ khí, kiềm tính Trang 62 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền B.licheniformis cc- Mọc yếu có canh thang glucose điều kiện kỵ khí, pH dịch ni cấy 5,2 Khơng tạo thành khí nitrate điều kiện kỵ khí kiềm tính B.subtilis d- Tạo thành sắc tố đen môi trường chứa cacbohydrat B.subtili var.aterrimus dd- Tạo thành sắc tố đen môi trường chứa tyrosine B.subtili var niger bb- Không thủy phân tinh bột, không tạo thành nitrite từ nitrate B.pumilus aa- Không phát triển môi trường chứa 7% NaCl b- Đồng hóa glucose Nếu có thủy phân gelatine yếu B.coagulans bb- Khơng đồng hóa glucose, thủy phân gelatine mạnh B.badius 2- Phát triển môi trường thạch glucose không tốt môi trường thạch Nếu có phát triển mơi trường thạch khơ đậu tương yếu a- Thủy phân casein, khơng có men urease B.firmus aa- Khơng thủy phân casein, có men urease B.lentua Thể mang bào tử phình lên rõ rệt, bào tử hình elip, hình viên trụ, tròn đầu Màng bào tử dày dễ nhuộm màu.Gram thay đổi A- Tạo thành khí từ carbohydrate 1- Tạo thành acetylmethyl carbinol , không tạo thành dextrin tinh thể từ tinh bột B.polymyxa Trang 63 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền 2- Không tạo thành acetylmethyl carbinol, tạo thành dextrin tinh thể từ tinh bột B.macerans B- Khơng tạo thành khí từ carbohydrate 1- Hoại sinh, sinh trưởng môi trường thông thường a-Thủy phân tinh bột b-Tạo thành indol acetyimethyl carbinol B.alvei bb- Không tạo thành indol acetylmethyl carbinol c-Sinh trưởng 650C B.stearothermophilus cc- Không sinh trưởng 650C B.circulans aa- Không thủy phân tinh bột b- pH dịch nuôi cấy canh thang glucose thấp 8.0 Sinh trưởng mơi trường glucose điều kiện kỵ khí c- Tạo thành indol, tạo thành acid từ glucose manitol mơi trường có muối amonium nguồn nitơ B.laterosporus cc- Không tạo thành indol, không sinh trưởng môi trường chứa carbohydrat với nguồn nitơ muối amonium B.pulvifacien bb- pH môi trường glucose 8.0 hay cao hơn, không phát triển môi trường canh thang glucose điều kiện kỵ khí Bbrevis 2- Ký sinh, khơng phát triển môi trường thông thường a- Gây thối trứng ong mật B.larvae aa- Gây bệnh sữa cánh cứng Nhật Bản Typ A-21 B.popilliae Typ B-22 B.lenti Trang 64 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Thể mang bào tử phình lên rõ rệt, bào tử hình cầu gần với hình cầu, gram thay đổi A- Phát triển môi trường thông thường pH 6.0, không thiết phát triển môi trường urea kiềm tính 1- Thủy phân tinh bột, phát triển môi trường chứa 10% NaCl B.pantothenticus 2- Không thủy phân tinh bột, không phát triển môi trướng chứa 10% NaCl B.sphaericus B- Không phát triển môi trường thông thường pH 6.0, thiết phát triển mơi trường urea hay kiềm tính B.pasteurii Các mơi trường sử dụng q trình phân lập vi khuẩn * Mơi trường dinh dưỡng có nguồn protein (NA) : Peptone : 1g Meat extract : 0.3g NaCl : 0.5g Nước cất : 100ml Agar : 2% * Môi trường dinh dưỡng (NB) : Peptone : 1g Cao thịt : 0.3g NaCl : 0.5g Nước cất : 100ml * Môi trường dinh dưỡng bổ sung gelatine (NG) Gelatin : 5g Pepton : 0.5g Nước cất :100ml Trang 65 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Môi trường dinh dưỡng bổ sung 1% tinh bột (NT) Tinh bột : 1g Pepton : 0.5g NaCl : 0.5g Nước cất : 100ml Xác định hình thái khuẩn lạc  Nhuộm Gram * Nguyên tắc : Dựa khả bắt màu tế bào chất màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh iơt mà hình thành nên hai loại phức chất khác + Loại phức chất thứ giữ nguyên màu thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi xử lý cồn Vi sinh vật có phức chất thuộc loại gram dương + Loại phức chất thứ hai khơng cịn giữ màu thuốc nhuộm nên màu xử lý cồn bắt màu thuốc nhuộm bổ sung Vi sinh vật có phức chất thuộc loại gram âm * Tiến hành : Sử dụng phương pháp Hucker cải tiến - Tạo vết bôi: dùng que cấy vơ trùng lấy vi khuẩn từ thạch (sau cấy 24h) hoà vào giọt nước cất phiến kính - Cố định vết bơi: hơ nhanh vết bôi lửa đèn cồn 2-3 lần - Nhuộm dung dịch Tím kết tinh phút, rửa nước, thấm khô - Nhuộm lại dung dịch Iod phút, rửa nước, thấm khô - Nhỏ cồn 96o, giữ khoảng 30 giây, rửa nước, thấm khô - Nhuộm bổ sung dung dịch Fucshin 30 giây, rửa nước, thấm khơ - Soi kính: 100x với dầu soi kính Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ  Nhuộm bào tử * Nguyên tắc : Trang 66 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Sự hình thành bào tử hình thức đổi tế bào gặp điều kiện khơng thuận lợi chu trình sống Dựa cấu trúc đặc biệt màng bào tử : dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipit Trước hết xử lý để tế bào chất bào tử dễ bắt màu nhiệt axit Nhuộm màu tế bào chất bào tử tế bào thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh Tẩy màu tế bào chất tế bào nhuộm thuốc nhuộm khác bổ sung Nhờ tế bào chất bào tử tế bào chất tế bào bắt màu phân biệt * Tiến hành : Sử dụng phương pháp Schaeffer-Fulton - Tạo vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ thạch (sau cấy 24h) hồ vào giọt nước cất phiến kính - Cố định vết bôi: hơ nhanh vết bôi lửa đèn cồn 2-3 lần - Nhuộm dung dịch lục Malachite 10 phút, rửa nước, thấm khô - Nhuộm lại dung dịch Fucshin 30 giây, rửa nước, thấm khơ - Soi kính: 100x với dầu soi kính Bào tử có màu lục, tế bào có màu đỏ Các thử nghiệm sinh hóa chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải protein  Thử nghiệm catalase * Nguyên tắc : Enzyme catalase diện tế bào vi sinh vật hiếu khí kỵ khí tùy ý có khả biến dưỡng lượng theo phương thức hô hấp hiếu khí Catalase thủy phân H2O2 thành H2O O2, ngăn cản tích tụ phân tử có độc tính cao tế bào Sự thủy phân H2O2 giải phóng O2 ghi nhận qua tượng sủi bọt khí * Tiến hành : - Nhỏ trực tiếp H2O2 3-10% lên khuẩn lạc thạch đĩa Kết (+) : tượng sủi bọt Kết (–) : không sủi bọt  Thử nghiệm khả di động Trang 67 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền * Nguyên tắc : Vi sinh vật di động nhờ cấu trúc protein gọi tiên mao Khả di động quan sát dựa vào tăng trưởng di động vi sinh vật vào bên môi trường thạch mềm * Tiến hành : - Sử dụng môi trường NA 0,5 % agar - Cấy đâm sâu vi khuẩn vào môi trường thạch bán lỏng, ủ 37oC 1-3 ngày Kết (+) : Vi khuẩn mọc lan rộng quanh vết cấy Kết (–) : Vi khuẩn mọc theo vết cấy  Thử nghiệm citrate * Nguyên tắc : Một số vi sinh vật sử dụng nguồn citrate nguồn cacbon để thu lấy lượng vật chất Vi sinh vật sử dụng citrate sinh CO2 làm kiềm hóa môi trường, vi sinh vật sử dụng muối ammonium nguồn đạm tạo NH3 làm kiềm hóa môi trường Sự tăng giá trị pH biểu thị đổi màu thị pH môi trường * Tiến hành : - Cấy ria vi khuẩn vào môi trường thạch nghiêng Simmon citrate agar, ủ 37oC 24 – 48h Kết (+) : môi trường chuyển sang màu xanh dương Kết (–) : môi trường chuyển giữ nguyên màu xanh lục  Thử nghiệm khả sinh indol * Nguyên tắc : Tryptophan axit amin bị oxi hóa số vi sinh vật có hệ emzyme tryptophanase tạo nên sản phẩm chứa gốc indol Việc phát indol thực phản ứng phân từ với thuốc thử chứa pdimethylaminobenzaldehyde (p-DMAB) Nhân pyrol indol chứa nhóm –CH2 kết hợp với nhân benzen p-DMAB tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ Trang 68 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền * Tiến hành : - Cấy sinh khối vi khuẩn vào môi trường canh trypton, ủ 37oC 24 – 48h - Trước quan sát nhỏ 1ml ether lắc đều, sau nhỏ giọt thuốc thử Kovacs Kết (+) : xuất lớp màu đỏ bề mặt Kết (–) : xuất lớp màu vàng bề mặt  Thử nghiệm urease * Nguyên tắc : Một số vi sinh vật tổng hợp enzyme urease xúc tác thủy phân urea giải phóng NH3 CO2 Sự phóng thích NH3 CO2 làm tăng pH mơi trường, theo dõi qua đổi màu chất thị pH * Tiến hành : - Cấy sinh khối vi khuẩn vào môi trường lỏng Urea Broth, ủ 37oC 48h Kết (+) : mơi trường màu đỏ tím Kết (–) : môi trường không đổi màu  Thử nghiệm Voges – Proskauer * Nguyên tắc : Thử nghiệm nhằm xác định aceton sản phẩm trung tính q trình lên men glucose, tiền chất 2,3-butanediol, tiền chất nên q trình ni cấy tích lũy ít, để dễ dàng phát q trình ni cấy thử nghiệm tiến hành điều kiện hiếu khí, sau phát aceton môi trường thuốc thử α-naphtol môi trường kiềm mạnh tạo KOH 40% * Tiến hành : - Cấy sinh khối vi khuẩn vào môi trường lỏng MR-VP broth, ủ 37oC 24 – 48h - Bổ sung giọi α-napthol giọt KOH 40% vào môi trường, lắc nhẹ Kết (+) : môi trường màu đỏ Kết (–) : môi trường màu đồng  Thử nghiệm Nitrate * Nguyên tắc : Trang 69 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền Vi sinh vật có khả khử nitrate tổng hợp hệ enzyme nitratase xúc tác khử nitrate thành nitrite nitơ phân tử Hầu hết vi sinh vật hiếu khí sử dụng nitrate vi khuẩn hiếu khí tùy nghi, thực trình khử nitrate điều kiện khơng có oxy phân tử Hoạt tính nitratase định tính dựa tạo thành nitrite cạn kiệt nitrate Nitrite tạo từ nitrate phản ứng thuốc thử Diphenylamin * Tiến hành : - Cấy sinh khối vi khuẩn vào môi trường lỏng Nitrat broth, ủ 37oC 24 – 48h - Bổ sung vài giọt thuốc thử Sunfanilamide 0,2% Nnapthyenediamin hydroclorit Kết (+) : môi trường màu hồng Kết (–) : môi trường không đổi màu Kết dựng đường chuẩn tyrosin mật độ tế bào  Đường chuẩn tyrosine Trang 70 Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Phạm Huyền  Kết đếm mật độ tế bào 72 Chủng Lặp lại M1 M2 M3 M4 M5 Mật đô tế bào 10-4 10-5 10-6 125 211 83 207 192 60 58 59 60 60 95 55 212 180 150 200 198 98 398 350 320 390 393 380 269 235 205 264 248 115 Chủng Lặp lại M6 M7 V1 V2 V3 Trang 71 Mật độ tế bào 10-4 10-5 10-6 192 180 100 187 170 120 200 100 100 198 208 81 298 200 180 270 220 150 67 60 47 76 54 59 395 270 100 310 262 180 ... tài: "Nghiên cứu tuyển chọn số vi khuẩn có hoạt tính phân giải protein cao ứng dụng xử lý nước thải giàu đạm"với mục đích từ nước thải ngành chế biến thủy sản thịt tìm chủng vi sinh vật nâng cao. .. Bacillus phân lập khả ứng dụng chúng xử lý nước thải MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI Phân lập vi khuẩn có hoạt tính phân giải protein từ số nguồn nước thải thủy sản chế biến thịt Khảo sát hoạt tính protease... Phạm Huyền Vi? ??c phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải protein tiến hành trình tự theo bước hình 2.2 2.3.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn phân giải protein từ nước thải môi