Realtime PCR

Realtime PCR Nguyên tắc ứng dụng TS BS Đỗ Thị Thanh Thủy PCR PCR VÀ GIỚI HẠN CỦA PCR PCR phát sản phẩm điện di gel agarose Phát điểm cuối (End-Point Detection) Độ đặc hiệu Độ nhạy thấp Độ phân giải Chỉ phân biệt dựa kích thước sản phẩm PCR Phải xử lý sau PCR, dễ ngoại nhiễm Chạy gel nhờ Ethidium bromide (chất gây ung thư) REALTIME PCR → Real-time PCR phản ứng PCR mà trình nhân DNA theo dõi trực tiếp máy luân nhiệt theo chu kỳ nhiệt Kiểm sốt tín hiệu huỳnh quang phát chu kỳ phản ứng (tỉ lệ với lượng sản phẩm PCR tạo thành chu kỳ nhiệt - Real time) Phát định lượng nồng độ sản phẩm sau chu kỳ nhiệt dựa cường độ phát huỳnh quang REALTIME PCR HOẠT ĐỘNG CỦA MÁY REALTIME PCR Kính lọc phát sáng Kính lọc kích thích Nguồn: laser, LED, đèn tungsten-halogen Detector: CCD (charge coupled device), PMT (photomultiplier tube) 10 102 103 104 105 106 Cycle 11 Cycle 13 Cycle 15 Cycle 19 Cycle 23 Cycle 26 Cycle 29 Cycle 31 Cycle 33 Cycle 34 Cycle 36 Cycle 39 Cycle 41 10 102 103 104 105 106 10 102 103 104 105 106 Cycle 11 Cycle 13 Cycle 15 Cycle 19 Cycle 23 Cycle 26 Cycle 29 Cycle 31 Cycle 33 Cycle 34 Cycle 36 Cycle 39 C.41 Mẫu chưa biết [C] C.39 C.36 Standard curve C.34 C.33 C.31 Cycle 41 C.29 10 102 103 104 105 106 PHƯƠNG TRÌNH TÍNH SỐ COPY/MẪU THỜI ĐIỂM PHÁT HIỆN TÍN HIỆU Threshold: điểm bắt đầu quan sát tín hiệu huỳnh quang phát ra, thời điểm tín hiệu sản phẩm PCR > tín hiệu - Ct (Threshold cycle): số chu kỳ mà tín hiệu huỳnh quang sản phẩm khuếch đại vượt qua ngưỡng -Động học RealtimePCR Phân tích tiến trình phản ứng chu kỳ nhiệt nhờ computer Q R 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ R Kéo dài mạch R Q Taq 3’ 5’ 5’ 3’ R Q Phân cắt 3’ Taq 5’ 5’ 3’ R Taq Hoàn tất tổng hợp Q 3’ 5’ 5’ 3’ R Taq Phát Q 3’ 5’ 5’ 3’ Primers có nhiệt độ bắt cặp 60oC Taqman probe 70oC REALTIME PCR SỬ DỤNG BEACON PROBE DNA probe T Loop G A A A A C Stem TC A T G CG G GC AT AT CG CG C A C C T C C DNA đích FQ Reporter Dye Que nc he rD C G T T T C A T A G T A G G GA G GT A CGC A A A G T A T C A T C C C T C C A G G G C A T A T C G C G F ye Q NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG Giai đoạn biến tính NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG Giai đoạn bắt cặp NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG Giai đoạn kéo dài ĐỌC KẾT QUẢ REALTIME PCR 1) Reaction efficiency (PCR efficiency): E%, sử dụng đường cong chuẩn (standard curve) Tối ưu E 100% E=2 2) Reproducibility/linearity (R=Corelation coefficiency) sử dụng giá trị R hay R2 =1 đánh giá độ xác thao tác 3) Specificity sử dụng Melting Curve 4) Contamination sử dụng NC ĐỌC KẾT QUẢ REALTIME PCR E%=PCR efficiency (90%-105%) R=Corelation coefficiency (>0.990) E = 10-1/slope E=10-1/slope = 10 -1/-3.425 = 1.959 E% = (E-1) x 100% E% =(1.959 - 1) x 100% = 95,9 ĐỌC KẾT QUẢ REALTIME PCR E%=PCR efficiency (90%-105%) R=Corelation coefficiency (>0.990) Y= ax+b → Y = a.(log10Sq) + b Y: Ct Sq= 10 [(Ct-b)/a] X: log10Sq Sq: Starting quantity ỨNG DỤNG CỦA REALTIME PCR TRONG CHẨN ĐỐN VÀ NGHIÊN CỨU Realtime PCR cơng cụ phát tác nhân gây bệnh tốt mẫu bệnh phẩm (vi sinh, ký sinh lâm sàng, vi sinh thực phẩm)  Đơn giản, nhanh chóng, dễ phân tích kết  Tránh ngoại nhiễm khơng cần phân tích sau PCR  Có thể định lượng ph m vi l n (log đ ến log 8)  Độ nhạy cao so với PCR  Độ đặc hiệu cao so với PCR Thích hợp cho lâm sàng Khơng ngoại nhiễm Độ nhạy tốt Độ đặc hiệu tốt Công cụ tốt Realtime PCR công cụ định lượng tác nhân gây bệnh tốt mẫu bệnh phẩm • Xác định số lượng virus (HIV, HBV, HCV ) • Xác định số lượng khởi đầu tác nhân gây bệnh khẩn cấp mẫu bệnh (Sốt xuất huyết, H5N1, H1N1 ) Theo dõi điều trị Tiên đoán mức độ nghiêm trọng tiên đốn kết Tình trạng nhiễm khuẩn thực phẩm: Samonella, Campyllobacter… Realtime PCR ứng dụng ung thư học lâm sàng Phát tồn lưu ác tính bệnh ung thư -Trong bệnh bạch cầu mạn dòng tủy (CML) bệnh bạch cầu cấp dòng Lympho (ALL), dùng realtime PCR định lượng tổ hợp gen khác gây bệnh p190 p210 So sánh kết định lượng trước sau điều trị giúp đánh giá mức độ tồn lưu ác tính bệnh Realtime PCR nghiên cứu biểu gen Ứng dụng rộng rãi việc đánh giá mức độ biểu gen VD: Sau tế bào xử lý với kháng ngun hay hóa chất, tìm hiểu đáp ứng TB mức độ biểu gen đích Các ứng dụng khác Real-Time PCR   Phát GMO (genetically modified organism) hay GEO (genetically engineered organism): sinh vật biến đổi gene Phát SNP (single nucleotide polymorphism) (genotypic/allelic discrimination) ... computer REALTIME PCR REALTIME PCR Log view Rael time PCR định lượng số copies giai đoạn tăng lũy thừa TÍN HIỆU HUỲNH QUANG TRONG REAL TIME PCR Primers Taq polymerase dNTP PCR buffer MgCl2 Chất... dựa kích thước sản phẩm PCR Phải xử lý sau PCR, dễ ngoại nhiễm Chạy gel nhờ Ethidium bromide (chất gây ung thư) REALTIME PCR → Real-time PCR phản ứng PCR mà trình nhân DNA theo dõi trực tiếp máy... lượng sản phẩm PCR tạo thành chu kỳ nhiệt - Real time) Phát định lượng nồng độ sản phẩm sau chu kỳ nhiệt dựa cường độ phát huỳnh quang REALTIME PCR HOẠT ĐỘNG CỦA MÁY REALTIME PCR Kính lọc phát