Nghiên cứu bênh sán dây trên chó tại một số tỉnh ở đồng bằng sông cửu long và biện pháp phòng trị tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI Mã ngành: 62640102 NGUYỄN PHI BẰNG NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC CỦA BỆNH SÁN DÂY TRÊN CHÓ TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỮU LONG VÀ BIỆN PHÁP PHÕNG TRỊ Cần Thơ, 2020 CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN HỮU HIƢNG Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: ……………………………………, Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc … … ngày … tháng … năm … Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Có thể tìm hiểu luận án thƣ viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC LIỆT KÊ CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ Nguyễn Phi Bằng, Nguyễn Thị Chúc, Nguyễn Hữu Hưng, Nguyễn Hồ Bảo Trân, 2016 Các yếu tố nguy ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm giun sán chó ni thành phố Long Xun, tỉnh An Giang Tạp chí Đại học Cần Thơ, số 43b, chuyên đề Nông nghiệp, trang 68-73 Nguyễn Phi Bằng, Nguyễn Hồ Bảo Trân, Phạm Đức Phúc, Nguyễn Hữu Hưng, 2016 Sán dây chó hai tỉnh An Giang, Đồng Tháp lồi sán dây có truyền lây sang người Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, số 2/2016, trang 58-65 Nguyễn Phi Bằng, Nguyễn Thị Chúc, Nguyễn Hữu Hưng, Nguyễn Hồ Bảo Trân, 2016 Tình hình nhiễm giun sán ký sinh chó mối tương quan yếu tố nguy lây nhiễm sang người thành phố Long Xuyên, tỉnh An Giang Tạp chí khoa học Kỹ thuật thú y, số 4/2016, trang 44-53 Nguyễn Phi Bằng, Nguyễn Hồ Bảo Trân, Nguyễn Hữu Hưng, 2016 Đặc điểm hình thái học sinh học phân tử loài sán dây ký sinh chó số tỉnh Đồng Bằng Sơng Cửu Long Tạp chí Đại học Cần Thơ, số 6B, chuyên đề Nông nghiệp, trang 49-56 Nguyễn Phi Bằng, Nguyễn Hữu Hưng, Nguyễn Hồ Bảo Trân, 2018 Tình hình nhiễm ngoại ký sinh chó tỉnh An Giang chu trình phát triển bọ chét chó Ctenocephalides Tạp chí phịng chống Bệnh sốt rét Ký sinh trùng Số 2(104) /2018, trang 15-22 Chƣơng GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết đề tài Lồi chó người hóa từ sớm ni rộng rãi khắp quốc gia giới, 10.000 năm Chó người bạn thân thiết gần gũi người nên chó nguồn truyền lây bệnh từ động vật truyền sang người Trong đó, bệnh sán dây chó bệnh tiềm tàng gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ chó người Việc phịng bệnh cho thú cưng người ni quan tâm kiểm sốt chặt chẽ loại vaccine góp phần hạn chế lớn bùng nổ bệnh truyền nhiễm bệnh ký sinh trùng đặc biệt bệnh sán dây gây tồn quan tâm Một số bệnh sán dây ký sinh chó cịn có khả lây lan sang người kể đến Dipylidium caninum, Spirometra mansoni, Taenia hydatigenea… Bệnh thường dạng tiềm ẩn với cường độ cảm nhiễm thấp dễ dẫn đến lơ chẩn đốn nhầm lẫn khơng có phương pháp chẩn đoán chuyên biệt Hiện nay, việc kiểm soát vệ sinh thú y chăn ni chó kiểm sốt giết mổ chưa nhiều địa phương quan tâm mức nên nguy lây lan bệnh sán dây bệnh ấu trùng chó lớn Bệnh xuất quốc gia phát triển nước phát triển gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe người kinh tế nhiều quốc gia (Agnieszka Tylkowska et al., 2010; Jahangir Abdi et al., 2013) Ở Việt Nam, đặc biệt vùng nơng thơn đa số chó ni phương thức thả tự nên sán dây dễ lây lan, trứng sán theo phân phát tán khắp nơi, bệnh sán dây xuất nhiều nơi có xu hướng gia tăng gây ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng (Lê Trần Anh Nguyễn Khắc Lực, 2013) Chính lý trên, với mong muốn cần có sở khoa học nhằm giúp cho có nhìn quan tâm mức để có biện pháp phịng bệnh sán dây gây Đề tài “NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC CỦA BỆNH SÁN DÂY TRÊN CHÓ TẠI MỘT SỐ TỈNH Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ BIỆN PHÁP PHÕNG TRỊ” tiến hành 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Xác định đặc điểm dịch tễ yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm sán dây chó tỉnh ĐBSCL - Đề xuất biện pháp tẩy trừ bệnh sán dây chó tỉnh ĐBSCL 1.3 Ý nghĩa khoa học - Là cơng trình nghiên cứu có hệ thống sán dây chó; xác định tình hình nhiễm bệnh yếu tố liên quan đến phân bố mầm bệnh Xác định loài sán dây chủ yếu gây tác hại chó hình thái học sinh học phân tử sử dụng RADP-PCR giải trình tự gene - Là cơng trình ĐBSCL nghiên cứu vòng đời sán dây chó, nghiên cứu bệnh lý chó, điều trị thử nghiệm đề biện pháp tẩy trừ Cung cấp thêm tư liệu khoa học loài D caninum ký sinh chó ĐBSCL, đồng thời bổ sung thơng tin khoa học cho giáo trình thú y phục vụ công tác giảng dạy 1.4 Ý nghĩa thực tiễn - Kết luận án sở khoa học để khuyến cáo người ni chó ĐBSCL, nắm bắt yếu tố có ảnh hưởng đến phân bố bệnh biện pháp phòng trị hữu hiệu nhằm giảm thiểu tác động có hại lồi sán dây gây tác hại chó mà lồi có khả truyền lây cho người 1.5 Những đóng góp luận án - Đây cơng trình nghiên cứu khu vực ĐBSCL xác định đặc điểm dịch tễ học bệnh sán dây chó số yếu tố nguy liên quan đến tỷ lệ nhiễm sán dây ký sinh chó Xác định lồi sán dây D caninum chó kỹ thuật sinh học phân tử PCR giải trình tự gene ĐBSCL - Cơng trình xác định thành phần ký chủ trung gian, mơ tả vịng đời lồi sán dây D caninum chó ĐBSCL mô tả bệnh lý học sán dây D caninum gây chó Chƣơng 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu 2.1.1 Xác định đặc điểm dịch tễ sán dây chó tỉnh ĐBSCL - Xác định số đặc điểm dịch tễ sán dây chó tỉnh ĐBSCL qua phương pháp kiểm tra phân - Xác định tỷ lệ nhiễm sán dây, cường độ thành phần lồi sán dây chó tỉnh ĐBSCL qua phương pháp mổ khám 2.1.2 Xác định số đặc điểm hình thái học sinh học phân tử sán dây D caninum chó tỉnh ĐBSCL - Xác định số đặc điểm hình thái lồi sán dây D caninum - Xác định loài sán dây D caninum qua định danh phân loại kỹ thuật PCR giải trình tự gene 2.1.3 Nghiên cứu vịng đời loài sán dây D caninum - Nghiên cứu chu trình phát triển ký chủ trung gian tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán dây bên ký chủ trung gian đến giai đoạn cảm nhiễm - Xác định vòng đời sán dây ký chủ cuối qua gây nhiễm ấu trùng gây bệnh 2.1.4 Nghiên cứu bệnh lý học chó nhiễm sán dây D caninum - Xác định triệu chứng lâm sàng chó nhiễm sán dây - Xác định bệnh tích đại thể chó nhiễm sán dây - Khảo sát biến đổi vi thể bệnh tích ruột chó bị nhiễm sán dây - Khảo sát số tiêu huyết học chó nhiễm sán dây khơng nhiễm sán dây 2.1.5 Nghiên cứu biện pháp phịng trừ bệnh sán dây D caninum chó - Thử nghiệm hiệu tẩy trừ sán dây thuốc niclosamide praziquantel - Xác định độ an toàn thuốc tẩy trừ sán dây chó - Thử nghiệm hiệu thuốc ivermectine tiêu diệt bọ chét (Ctenocephalides canis) phịng bệnh sán dây chó 2.2 Đối tƣợng, thời gian, địa điểm nghiên cứu 2.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu: Chó tỉnh ĐBSCL: Cần Thơ, An Giang, Đồng tháp, Kiên Giang, Bến Tre Sóc Trăng bọ chét chó Ctenocephalides canis 2.2.2 Thời gian tiến hành: từ tháng 12/2014 đến tháng 08/2018 2.2.3 Địa điểm tiến hành - Các hộ ni chó tỉnh ĐBSCL, địa điểm giết mổ chó tỉnh khảo sát, phịng thí nghiệm Ký sinh trùng phịng thí nghiệm Mơ học thuộc Bộ mơn Thú Y - Khoa Nông nghiệp - Trường Đại học Cần Thơ 2.3 Dụng cụ hố chất: Một số dụng cụ, hóa chất cần thiết để nghiên cứu ký sinh trùng sinh học phân tử 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Xác định tình hình nhiễm sán dây chó ĐBSCL - Phƣơng pháp kiểm tra phân: theo phương pháp gạn rửa sa lắng Benedek (1943) - Phƣơng pháp mổ khám: theo phương pháp Skrjabine and Petrov (1963) - Chỉ tiêu theo dõi Tỷ lệ nhiễm, thành phần loài sán dây chung chó, tỷ lệ nhiễm sán dây theo giống, tuổi, phương thức nuôi, mùa vụ, vùng sinh thái số yếu tố nguy ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm như: phương thức vệ sinh, vệ sinh thú y, phương thức cho ăn, kiểu lông - Phân tích thống kê: Dùng trắc nghiệm Chi-Square chương trình Minitab version 16 để so sánh tỷ lệ nhiễm 2.4.2 Phƣơng pháp định danh phân loại 2.4.2.1 Phƣơng pháp định danh phân loại sán dây hình thái học Định danh phân lồi sán dây chó dựa vào tài liệu theo Soulsby (1982), Nguyễn Thị Kỳ (1994) 2.4.2.2 Phƣơng pháp định danh sán sán dây D caninum kỹ thuật sinh học phân tử (PCR) giải trình tự gene Thu trữ mẫu ly trích DNA Chọn ngẫu nhiên 12 mẫu sán dây D caninum thu thập từ ruột chó lị giết mổ đại diện cho tỉnh ĐBSCL Mẫu trữ dung dịch nước muối sinh lý đem phịng thí nghiệm để ly trích DNA Tách chiết DNA từ mẫu sán Kiểm tra nồng độ DNA Thực phản ứng PCR Mồi cho phản ứng PCR chuyên biệt gene ITS thiết kế chương trình mã nguồn mở với phần mềm Primer3 Phusa Biochem cung cấp, Gene 28S đoạn mồi thiết kế theo nghiên cứu công bố Beugnet et al., (2014) Bảng 2.1 Trình tự mồi tương ứng với gene Tên Gene Tên mồi Trình tự mồi (5’ – 3’) ITS1 ITS1F/ITS1-R DC-1R:5'-CGTCCACTGTGCGTGGATCT-3' DC-1F:5’- CCATGGTATAGCCTCAGCC-3' DC28S-1R:5’CACATTCAACGCCCGACTCCTGTAG -3’ DC28S-1F:5’GCATGCAAGTCAAAGGGTCCTACG-3’ 28S DC28S-1R Nhiệt độ -Tm (oC) 56 56 * Chỉ tiêu theo dõi Xác định loài sán dây D caninum đoạn mồi tự thiết kế phần mềm primer3 gene ITS mồi 28S Beugnet et al., (2014) So sánh trình tự nucleotide đoạn gene ITS1 mẫu sán dây địa phương khác So sánh trình tự gene lồi sán dây D caninum tỉnh khảo sát với Ngân hàng gene giới (sử dụng chương trình Blast để truy cập ngân hàng gene) nhằm tìm kiếm chuỗi nucleotide tương đồng) * Phân tích xử lý số liệu:Trình tự đoạn gene ITS-1 12 mẫu sán dây sử dụng truy cập Ngân hàng gene dùng chương trình BLASTN NCBI để so sánh với trình tự Genebank; Clustal Omega để so sánh khác biệt trình tự, so sánh mức tương đồng phương pháp Pairwise alignment/Calculate identity/Similarity for sequences (Bioedit) 2.4.3 Nghiên cứu vòng đời loài sán dây Dipilidium caninum 2.4.3.1 Nghiên cứu chu trình phát triển Ctenocephalides canis xác định tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán dây (cysticercoid) bên Ctenocephalides canis a Theo dõi chu trình phát triển bọ chét (Ctenocephalides canis): Phương pháp định danh phân loại bọ chét dựa vào mơ tả khóa phân loại tác giả Phan Trong Cung ctv (1977), Bownman (2009), Pedro and Juliana (2012), Krista and Phillip (2014) Xác định thời gian phát triển C canis qua giai đoạn: Bọ chét trưởng thành đẻ trứng, trứng nở đến ấu trùng giai đoạn (larva 1), ấu trùng giai đoạn thành ấu trùng giai đoạn (larva 2), ấu trùng giai đoạn thành ấu trùng giai đoạn (larva 3), ấu trùng giai đoạn hóa kén, kén nở thành bọ chét b Xác định tỷ lệ nhiễm oncosphere thành cysticercoid bên Ctenocephalides canis Thí nghiệm theo dõi tỷ lệ oncosphere thành cysticercoids ký chủ trung gian: Thí nghiệm chia làm đợt riêng biệt, đợt gây nhiễm gồm 100 ấu trùng Ctenocephalides canis giai đoạn Ghi nhận tỷ lệ oncosphere biến đổi thành cysticercoid bên Ctenocephalides canis trưởng thành Chỉ tiêu theo dõi: Đặc điểm hình thái kích thước ấu trùng, thời gian biến đổi hình thái Ctenocephalides canis qua giai đoạn 2.4.3.2 Xác định vòng đời D caninum ký chủ cuối qua gây nhiễm ấu trùng gây bệnh Tỷ lệ phát triển cysticercoid thành sán dây trƣởng thành thời gian thải đốt sán chó sau nhiễm cysticercoid Thí nghiệm khảo sát thời gian thải đốt sán chó ấu trùng cysticercoid sán dây D caninum thực cá thể chó >24 tháng tuổi giống chó ta kiểm tra khơng có diện sán dây phương pháp Benedek (1943) (trích nguồn Nguyễn Thị Kim Lan, 2008) Chỉ tiêu theo dõi: Thời gian thải đốt xác định tỷ lệ cysticercoid phát triển thành sán dây trưởng thành hệ tiêu hóa chó thí nghiệm 2.4.4 Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể, biến đổi vi thể sinh lý máu chó nhiễm sán dây 2.4.4.1 Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng chó nhiễm D caninum Quan sát thể trạng biểu lâm sàng 60 chó nhiễm sán dây D caninum tự nhiên chó thực nghiệm gây nhiễm D caninum 2.4.4.2 Nghiên cứu bệnh tích đại thể vi thể chó nhiễm sán dây Khảo sát bệnh tích đại thể: Đối tượng khảo sát chó gây nhiễm D caninum thực nghiệm 30 chó nhiễm sán dây tự nhiên từ sở giết mổ chó huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang với cường độ cảm nhiễm >15 sán dây D caninum/cá thể, nghiên cứu ghi nhận bệnh tích chủ yếu hệ tiêu hóa chó nhiễm sán dây (Heinz, 2012; Nguyễn Thị Kim Lan ctv, 2017) Khảo sát biên đổi vi thể: Thực tiêu bệnh tích vi thể chó thí nghiệm gây nhiễm, phương pháp làm tiêu nhuộm Hematoxilin – Eosin (Bộ y tế, 2016), đọc kết chụp ảnh tổn thương vi thể kính hiển vi quang học độ phóng đại 10x, 40x (100 lần 400 lần) 2.4.4.3 Khảo sát tiêu huyết học chó nhiễm không nhiễm sán dây: Theo dõi thay đổi số huyết học chó nhiễm không nhiễm sán dây bao gồm tiêu như: số lượng hồng cầu (RBC), bạch cầu (LYM, NEU), Hb (hemoglobin), HCT (hematocrit) Chỉ số huyết học chó bình thường dựa vào tham chiếu Huỳnh Thị Bạch Yến, (2006); Rahway N U (1986) Chỉ tiêu theo dõi: xác định tần suất xuất triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể vi thể tiêu hồng cầu, bạch cầu, Hb, Hematocrit (HCT) 2.4.5 Hiệu điều trị bệnh sán dây D caninum số thuốc tẩy trừ thuốc ivermectine điều trị bọ chét 2.4.5.1 Hiệu điều trị bệnh D caninum số thuốc tẩy trừ a Chuẩn bị thí nghiệm Chọn chó nhiễm sán dây D caninum tự nhiên phương pháp xét nghiệm phân thuộc giống nội lai, lứa tuổi >24 tháng tuổi có trọng lượng bình qn 13,17 ± 1,91 kg Thuốc thử nghiệm praziquantel niclosamide liều khác b Phƣơng pháp tiến hành Kiểm tra phân để tìm đốt sán dây sau cấp thuốc 7, 14 21 ngày Hiệu tẩy trừ xác định cách kiểm tra tỷ lệ sán giai đoạn dùng thuốc, so sánh cường độ nhiễm trước tẩy trừ sau tẩy trừ c Bố trí thí nghiệm hiệu tẩy trừ sán dây D caninum praziquantel niclosamide Thí nghiệm xác định hiệu praziquantel niclosamide thể bảng 2.2 sau: Bảng 2.2 Phác đồ thử nghiệm tỷ lệ bệnh chó nhiễm sán dây D caninum sau điều trị praziquantel niclosamide SCSS sau tẩy trừ (con) 14 21 Ngày Ngày Ngày Nghiệm thức Uống 10 Nghiệm thức 10 Uống 10 Nghiệm thức 100 Uống 10 Nghiệm thức 150 Uống 10 Nghiệm thức Không SCTN: Số chó thí nghiệm; SCSS: Số chó sán Thí nghiệm Liều dùng Cách SCTN (mg/kg P) dùng Tỷ lệ giảm (%) 14 21 Ngày - e Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu lực tẩy trừ thuốc thử nghiệm sau 7, 14, 21 ngày điều trị Tỷ lệ bệnh, tỷ lệ giảm thải đốt sán tác dụng phụ thuốc chó thí nghiệm CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tình hình nhiễm sán dây chó ĐBSCL 3.1.1 Kết kiểm tra phân Bảng 3.1 Tỷ lệ nhiễm sán dây chó ĐBSCL Địa điểm SMKT SMN TLN% Cần Thơ 267 52 19,48a An Giang 414 108 26,09b Đồng Tháp 328 77 23,48ab Kiên Giang 303 83 27,39b Sóc Trăng 339 54 15,93a Bến Tre 348 76 21,84bc TỔNG 1999 450 22,51 Chú thích: giá trị cột có chữ khác khác có ý nghĩa thống kê P< 0,05; SMKT: số mẫu kiểm tra; SMN: số mẫu nhiễm; TLN(%): tỷ lệ nhiễm (%) Bảng 3.1 cho thấy, chó ni tất tỉnh khảo sát ĐBSCL có diện sán dây, chó nhiễm sán dây với tỷ lệ nhiễm chung 22,51 Trong đó, chó ni Kiên Giang có tỷ lệ nhiễm cao 27,39 , chó An Giang, Đồng Tháp, Bến Tre có tỷ lệ nhiễm 26,09; 23,48 21,84 , thấp Cần Thơ Sóc Trăng có tỷ lệ nhiễm sán dây 19,48 15,93 , kết cho thấy bệnh sán dây chó địa bàn khảo sát phổ biến Kết tỷ lệ nhiễm sán dây chó tỉnh ĐBSCL có cao kết trước tác giả trước Lê Hữu Khương (2005), Nguyễn Hữu Hưng Ơn Hịa Thịnh (2002), Nguyễn Quốc Vinh (2010) Bảng 3.2 Tỷ lệ nhiễm sán dây chó theo giống chó tỉnh ĐBSCL Địa điểm SMKT Chó ngoại SMN TLN% Chó nội lai SMKT SMN TLN% Bảng 3.5 cho thấy, tỷ lệ nhiễm sán dây chó chiếm tỷ lệ cao 25,86 Trong đó, Kiên Giang có tỷ lệ nhiễm sán dây cao 30,09 Đồng Tháp Bến Tre với tỷ lệ nhiễm gần 26,92 26,42 , hai tỉnh có tỷ lệ nhiễm thấp cịn lại Cần Thơ Sóc Trăng với 23,94 23,47 điều cho thấy sán dây chó địa bàn khảo sát bệnh phổ biến Tuy nhiên, khác biệt tỷ lệ nhiễm vùng khảo sát khơng có ý nghĩa mặt thống kê Khi so sánh tỷ lệ nhiễm sán dây theo lứa tuổi cho thấy tỷ lệ nhiễm chó tăng dần theo độ tuổi đặc biệt chó 24 tháng tuổi, tỷ lệ nhiễm sán tăng dần theo lứa tuổi tuổi thọ sán lâu khoảng từ đến 10 năm, ấu trùng sán dây chí tồn nhiều năm thể vật chủ, tuổi thọ giun tròn thường khoảng vài tháng (Nguyễn Văn Đề Phạm Văn Khuê, 2009; Trần Mỹ Duyên Nguyễn Thị Mộng Siêng, 2016) Bảng 3.6 Thành phần loài sán dây chó theo lứa tuổi tỉnh ĐBSCL Lồi sán dây VT KS Nhiễm chung (n=1431) SCN Bộ Cyclophyllidea (1) D caninum (2) T pisiformis (3) T hydatigena Bộ Pseudophyllidea (4) S mansoni (5) D latum TLN (%) Nhiễm theo lứa tuổi (tháng) 13 - 24 > 24 (n=748) (n=683) SCN TLN (%) SCN TLN (%) Ruột Ruột Ruột 368 85 71 25,72 5,94 4,96 148 34 30 19,79 4,545 4,011 220 51 41 32,21 7,47 6,00 Ruột Ruột 222 13 15,51 0,91 93 12,43 0,535 129 18,89 1,32 Ghi chú: SCN: Số mẫu nhiễm ; TLN:Tỷ lệ nhiễm; VTKS: vị trí ký sinh Qua bảng 3.6 cho thấy, chó ĐBSCL nhiễm lồi sán dây thuộc Cyclophyllidea Pseudophyllidea tìm thấy qua cơng tác định danh hình thái Cụ thể Cyclophyllidea có lồi D caninum, T pisifomis, T hydatigena, Pseudophyllidea có lồi Spirometra mansoni D latum Trong đó, lồi D caninum chiếm tỷ lệ cao nhất, Spirometra mansoni lồi có tỷ lệ nhiễm cao thứ nhì Kết cho thấy, D caninum lồi sán dây thuộc Cyclophyllidea có tỷ lệ nhiễm cao chúng 10 qua ký chủ trung gian Ctenocephalides, loài ngoại ký sinh phổ biến chó nước ta 3.2 Kết định danh phân loại loài sán dây D caninum chủ yếu gây tác hại chó ĐBSCL 3.2.1 Phân loại định danh hình thái học Bảng 3.7 Một số đặc điểm hình thái D caninum (n=120, ±SE) Kích thước Đặc điểm nhận dạng 61,53 ± 8,98 Sán trưởng thành có màu trắng sữa hồng nhạt, đốt sán có hình elíp đốt dài 0,36 ± 0,09 Đầu hình thoi, có chùy đầu với hàng móc, có khả thụt vói hay thịi ra, có giác bám bên hình elip, khoảng 30 - 40 móc Cổ sán (mm) 0,40 ± 0,08 Phần cổ nối đầu đốt chưa trưởng thành, vừa ngắn vừa mảnh Đốt trưởng thành 14,02 ± 3,02 Chứa quan sinh dục đực sinh dục cái, lỗ (mm) sinh dục định vị bờ bên đốt sán 2-3mm Đốt chửa (mm) 11,54 ± 0,79 Đốt chửa chứa đầy túi trứng sán dây, có hình hạt dưa, chiều ngang 1,5-2 mm Đường kính 31,86 ± 2,40 Trứng có hình cầu, thường chụm lại thành trứng (µm) đám chứa đơi móc sắc bọc Số lượng trứng 27,99 ± 3,53 Chứa nang trứng đốt chữa, trứng dính túi với chùm nho nang trứng Bộ phận sán Chiều dài sán (cm) Đầu sán (mm) Hình 3.1 Hình thái lồi sán dây D caninum 11 Kết nghiên cứu cho thấy D caninum có chiều dài trung bình 61,53±8,98 cm, chiều rộng đốt trưởng thành khoảng 2-3 mm Kết phù hợp với Huỳnh Hồng Quang (2010a) Cabello R.R et al., (2011) Đầu sán có chiều dài 0,36±0,09 mm với cổ sán dài 0,40±0,08 mm Về hình thái, đốt trưởng thành có chứa quan sinh dục đực quan sinh dục với kích thước đốt 14,02±3,02 mm Đốt chửa có chiều dài trung bình 11,54±0,79 mm đường kính trung bình trứng 31,86±2,40 µm, trứng hình cầu chứa đơi móc bọc Số lượng trứng nang trứng trung bình 27,99 ± 3,53 Kết phù hợp với mô tả Bowman (2009), Cabello et al., (2011), Burton et al., (2013) 3.2.2 Định loại loài D caninum kỹ thuật sinh học phân tử 3.2.2.1 Kết giải trình tự đoạn gene ITS1 Blast nucleotide National Center for Biotechnology Information (NCBI) PCR khuếch đại vùng gene ITS1 sán dây D.caninum Nghiên cứu chọn ngẫu nhiên 12 mẫu sán D caninum địa điểm thu mẫu khác tỉnh ĐBSCL Các sản phẩm DNA mẫu thực phản ứng PCR để khuyếch đại gene ITS1 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR gene ITS1 M: thang chuẩn 100 bp Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ,10, 11,12 chứa sản phẩm PCR thu thập từ mẫu sán dây D caninum tỉnh An Giang, Kiên Giang, Bến Tre, Cần Thơ, Đồng Tháp, Sóc Trăng khu vực ĐBSCL Kết sản phẩm PCR điện di gel agarose soi phát ánh sáng tử ngoại hình ảnh điện di khuếch đại đoạn gene ITS1 12 mẫu sán dây D caninum Kết thể hiện, sản phẩm PCR cho cặp mồi thu đặc hiệu, có dải băng sáng gel khơng có vạch phụ độ dài khoảng 850 bp so với thang chuẩn Kết cho thấy, 12/12 sản phẩm PCR từ mẫu sán dây D caninum khuếch đại đoạn mồi gene ITS1 nhờ phản ứng PCR, chiếm 100 tổng số mẫu giám định 12 Hình 3.3 Kết Blast trình tự nucleotide sán dây D.caninum gene ITS1 NCBI Kết so sánh trình tự đoạn rDNA (850bp) hình 3.3 tỷ lệ tương đồng nucleotide cho thấy trình tự nucleotide mẫu sán dây D.caninum thu thập tỉnh ĐBSCL có độ tương đồng cao đến 99 mẫu đăng ký có mã số AM491339.1 ngân hàng gene Trong đó, mẫu giải trình tự khác so với mẫu chuẩn vài nucleotide đến 12/12 mẫu phân tích có trình tự trùng khớp 99 so với mẫu đăng ký trước Lin,R.Q., (2009) thu thập Quảng Đông (Trung Quốc) 3.2.2.2 Kết khuếch đại vùng gene 28S rRNA cặp mồi DC28S Blast nucleotide National Center for Biotechnology Information (NCBI) Nghiên cứu tiếp tục sử dụng 12 mẫu sán D caninum để thực phản ứng PCR đoạn mồi đặc hiệu gene 28S Các sản phẩm DNA mẫu thực phản ứng PCR để khuếch đại gene 28S đoạn mồi Beugnet et al., (2014) Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR gene 28S M: thang chuẩn 100 bp Giếng AG1, KG1, BT1, CT1, DT1, ST1, AG2, KG2, BT2, CT2, DT2, ST2 chứa sản phẩm PCR thu thập từ mẫu sán dây D caninum tỉnh An Giang, Kiên Giang, Bến Tre, Cần Thơ, Đồng Tháp, Sóc Trăng khu vực ĐBSCL 13 Hình 3.5 Kết Blast trình tự nucletide sán dây D caninum gene 28S rDNA NCBI Qua ly trích DNA mẫu sán dây, nghiên cứu thực khuếch đại thêm đoạn gene 28S rDNA cặp mồi đặc hiệu thiết kế chuyên biệt cho loài sán dây D caninum Một đoạn nucleotide gắn vào đoạn mồi ngược DC28S-1R: CACATTCAACGCCCGACTCCTGTAG-3; làm tăng tính chuyên biệt cho loài này, giúp phát loài D.caninum (Beugnet, 2014) Sản phẩm PCR điện di gel agarose soi ánh sang tử ngoại Kết thu cho thấy 12/12 mẫu cho sản phẩm PCR với kích thước băng đặc hiệu khoảng 653bp khơng có sản phẩm phụ Điều cho thấy phản ứng nhân đoạn gene đặc hiệu loài D.caninum Kết nghiên cứu trình tự nucleotide đoạn gene 28S rDNA D.caninum Các mẫu sán dây thu thập chó cho kết dương tính phản ứng PCR tinh gửi giải trình tự Kết cho thấy chuỗi nucleotide có độ dài 653 bp BLAST trình tự nucleotide thí nghiệm thu so sánh với chuỗi nucleotide cơng bố Genebank Hình 3.6 Sơ đồ phả hệ quan hệ di truyền mẫu sán tỉnh ĐBSCL mẫu đăng ký NCBI 14 Dựa kết cho thấy, 12 chủng có mối quan hệ gần gũi với DcZJ (AM491339.1) chủng DcGZ (AM491338.1) 3.3 Kết nghiên cứu vịng đời sán dây D caninum chu trình phát triển ký chủ trung gian (Ctenocephalides canis) 3.3.1 Nghiên cứu chu trình phát triển Ctenocephalides canis Bảng 3.8 Kết thời gian phát triển Ctenocephalides canis giai đoạn khác nhiệt độ từ 25-28oC với ẩm độ từ 75-80% Lần nuôi Bọ chét Trứng nở đẻ trứng Larva (n=30) (n=30) 18,00±4,49 65,40±1,62 20,20±3,43 63,90±2,17 17,60±4,41 64,30±2,33 Tổng 18,60±4,29 64,53±2,61 Thời gian biến đổi hình thái (giờ) Larva Larva Larva Larva Larva Kén (n=30) (n=30) (n=30) 39,10±3,08 50,40±2,42 78,90±2,62 37,50±2,16 50,10±1,76 80,70±2,24 38,40±2,65 51,50±1,57 78,00±1,79 38,33±2,74 50,67±2,04 79,20±2,51 Kén bọ chét (n=30) 251,50±4,63 253,40±4,32 250,30±4,71 251,72±4,73 Hình 3.7 Các dạng hình thái trứng ấu trùng đến trưởng thành Bọ chét đẻ trứng sau thu thập từ chó ni khoảng 17,60 đến 20,20 trung bình 18,60 giờ, kết bảng 3.8 cho thấy bọ chét biến đổi hình thái từ trứng thành ấu trùng giai đoạn (larva 1) từ 63,90 đến 65,40 từ giai đoạn larva đến larva trung bình từ trung bình từ 37,50 đến 39,10 giờ, khoảng 50,10 đến 51,50 cho biến đổi hình thái từ larva đến larva 3, đến giai đoạn hình thành kén khoảng 78,00 đến 80,70 giờ, cuối giai đoạn biến đổi hình thái thành bọ chét trưởng thành từ 250,30 đến 251,50 sau đóng kén, 15 giai đoạn dài vòng đời bọ chét Như vậy, kết nghiên cứu cho thấy, điều kiện ẩm độ nhiệt độ thích hợp ấu trùng bọ chét hồn thành vịng đời trung bình tổng cộng khoảng 503 tương đương 20,9 ngày đêm 3.3.2 Khảo sát tỷ lệ nhiễm thời gian biến đổi hình thái ấu trùng sán dây ký chủ trung gian Bảng 3.9 Tỷ lệ biến đổi hình thái của ấu trùng sán dây từ oncosphere thành cysticercoid Đợt gây nhiễm Số oncosphere gây nhiễm ấu trùng bọ chét Số cysticercoid thu đƣợc Tỷ lệ oncosphere thành cysticercoid (%) Tổng 522 481 567 459 2029 88 92 101 96 377 16,86 19,13 17,81 20,92 18,58 Hình 3.8 Oncosphere chuẩn bị gây nhiễm A: Các đốt sán D caninum thu thập từ phân chó; B: Chùm trứng sán sau tán đốt sán (10x10); C: Trứng sán với độ phóng đại 10x40; D: Phơi móc trứng sán (10x100) Kết bảng 3.9 cho thấy qua gây nhiễm đợt có 522 oncosphere gây nhiễm cho ấu trùng bọ chét giai đoạn (larva 1), kết thu 88 cysticercoid chiếm 16,86 số oncosphere gây nhiễm, đợt gây nhiễm 481 oncosphere kết thu 92 cysticercoid chiếm 19,13 , đợt gây nhiễm 567 oncosphere thu 101 cysticercoid chiếm 17,81 , cuối 16 đợt có 459 oncosphere gây nhiễm thu 96 cysticercoid với tỷ lệ phát triển 20,92 Như trung bình đợt gây nhiễm kết trung bình có trung bình 507,25±41,25 oncosphere gây nhiễm vào ấu trùng bọ chét, thu trung bình 94,25±4,82 tỷ lệ oncosphere biến đổi hình thái thành cysticercoid chiếm 18,58 Kết phù hợp với nghiên cứu tỷ lệ nhiễm cysticercoid bọ chét Beugnet (2017) 4.3.3 Thời gian hồn thành vịng đời tỷ lệ phát triển cysticercoid thành sán dây trƣởng thành Bảng 3.10 Thời gian hồn thành vịng đời tỷ lệ phát triển cysticercoid thành sán dây trưởng thành Thứ tự chó Số cysticercoid gây nhiễm Số sán thu Tỷ lệ phát triển thành D.caninum Tổng 88 92 101 96 377 17 18 24 20 79 19,32 19,57 23,76 20,83 20,95 Thời gian thải đốt (ngày) 30 29 28 31 = 29,5 Hình 3.9 Sơ đồ tóm tắt vịng đời sán dây D caninum Đốt sán phóng thích theo phân ngồi Đốt sán bị phân hủy phóng thích oncosphere Oncosphere ấu trùng bọ chét nuốt vào đường tiêu hóa Cysticercoid phát triển thể Ctenocephalides canis Cystycercoid phát triển thành sán dây trưởng thành thể chó A Giai đoạn ấu trùng D caninum ký chủ trung gian (Ctenocephalides canis) 17 B Giai đoạn ấu trùng D caninum ký chủ cuối (chó) Qua chó gây nhiễm thực nghiệm, bảng 3.10 cho thấy, với chó có 88 cysticercoid gây nhiễm với số sán dây D caninum thu 17 sán dây với thời gian thải đốt 30 ngày, tỷ lệ ấu trùng sán dây cysticercoid phát triển thành sán dây trưởng thành 19,32 Ở chó thứ 2, nghiên cứu thu thập 18 sán dây D caninum từ cá thể chó gây nhiễm với 92 cysticercoid với tỷ lệ biến đổi thành sán trưởng thành 19,57 thời gian thải đốt 29 ngày, chó gây nhiễm thứ thu 24 sán dây từ 101 cysticercoid gây nhiễm chiếm tỷ lệ 23,76 , chó có thời gian thải đốt sán 28 ngày cuối 20 sán dây trưởng thành thu thập từ chó gây nhiễm với 96 cysticercoid, tỷ lệ thành sán trưởng thành 20,83 , thời gian thải đốt 31 ngày Như vậy, tổng số ấu trùng gây nhiễm qua đợt 377 nghiên cứu thu 79 sán dây D caninum trưởng thành có tỷ lệ cysticercoid phát triển thành sán dây trưởng thành 20,95 3.4 Kết nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chó bệnh sán dây D caninum 3.4.1 Triệu chứng lâm sàng chó nhiễm sán dây D caninum Bảng 3.11 Tần suất xuất triệu chứng lâm sàng chó nhiễm sán dây D caninum STT Triệu chứng lâm sàng Bỏ ăn, sụt cân Xù lông, suy nhược Run rẩy, xiêu vẹo Rối loạn tiêu hóa Ngứa, cắn hậu môn, thải đốt Tiêu chảy nặng phân có máu Chó nhiễm bệnh tự nhiên (n=60) Chó nhiễm bệnh thực nghiệm (n=4) Số có biểu Tỷ lệ (%) Số có biểu Tần suất xuất 10 18 16 16,67 30,00 8,33 26,67 1/4 2/4 1/4 3/4 60 100 4/4 3,33 0/4 Qua quan sát triệu chứng lâm sàng 60 chó nhiễm sán dây tự nhiên cho thấy chó nhiễm sán dây có thải đốt sán, có biểu triệu chứng lâm sàng ngứa, cắn hậu mơn có chiếm tỷ lệ 100 tổng số chó nhiễm sán dây Trong triệu chứng phổ biến thường gặp liệt kê bảng 3.11 triệu chứng lâm sàng thường gặp bệnh sán dây chó xù lơng, suy nhược chiếm tỷ lệ cao 30,00 , triệu chứng rối loạn tiêu hóa 18 biểu lâm sàng thường thấy chó nhiễm sán dây chiếm tỷ lệ 26,67% Các biểu lâm sàng khác như: Bỏ ăn, sụt cân; run rẩy, xiêu vẹo; tiêu chảy nặng, phân có máu có tỷ lệ 16,67 , 8,33 , 3,33 Trong đó, chó nhiễm sán dây D caninum chó thực nghiệm có triệu chứng phổ biến ngứa, cắn hậu môn, thải đốt với tần suất 4/4 chó, triệu chứng rối loạn tiêu hóa có tần suất xuất 3/4, cịn lại triệu chứng xù lông, suy nhược bỏ ăn, sụt cân có tần suất xuất 2/4 1/4, khơng có tiêu chảy có máu chó thực nghiệm Kết nghiên cứu triệu chứng lâm sàng bệnh sán dây chó cho thấy, tất chó nhiễm sán dây D caninum có thải đốt sán phân, đốt sán theo nhu động ruột bị ngồi gây ngứa ngáy hậu mơn, làm chó khó chịu hay quay lại cắn, liếm hậu mơn (Phạm Sỹ Lăng Nguyễn Hữu Hưng, 2015) 3.4.2 Kết nghiên cứu bệnh tích đại thể, vi thể biến đổi sinh lý máu chó nhiễm sán dây D.caninum 3.4.2.1 Bệnh tích đại thể Bảng 3.12 Tỷ lệ tần suất xuất bệnh tích chủ yếu chó nhiễm sán dây Stt Các bệnh tích đại thể Chó nhiễm Chó nhiễm D D.caninum tự nhiên caninum thực nghiệm (n=30) (n=4) Số chó biểu Tỷ lệ Số chó biểu Tần suất (%) xuất Xuất huyết cục vị 16 53,33 4/4 trí bám đầu sán Viêm cata ruột non, niêm 16,67 2/4 mạc ruột xuất tiết nhầy vàng nâu Ruột non có nốt sần 26,67 1/4 vết loét Niêm mạc ruột xuất 3,33 1/4 huyết, phủ chất nhầy đỏ Qua khảo sát bệnh tích 30 chó nhiễm sán dây D caninum, đa số chó có bệnh tích xuất huyết cục vị trí bám sán chiếm tỷ lệ 53,33 so với tổng số chó khảo sát, thể viêm ruột cata, xuất tiết chất nhầy vàng nâu chiếm 16,67 cuối thể viêm loét ruột với nhiều nốt sần chiếm 26,67 niêm mạc ruột xuất huyết, phủ chất nhầy đỏ 3,33 Kết cho thấy qua khảo sát bệnh tích chó nhiễm sán dây D caninum, chó có bệnh tích xuất huyết cục vị trí bám sán có tần suất xuất 4/4, thể viêm ruột cata, xuất tiêt chất nhầy vàng hay vàng nâu có tần 19 suất xuất 2/4 cuối thể viêm loét ruột với nhiều nốt sần thể niêm mạc ruột xuất huyết chó thứ có tần suất xuất 1/4 Hình 3.10 Mổ khám bệnh tích chó nhiễm sán dây Hình 3.11 Các thể bệnh tích ruột non chó nhiễm sán dây ruột non 3.4.2.2 Bệnh tích vi thể chó nhiễm sán dây Hình 3.12 Viêm tổn thương niêm mạc ruột A: Viêm ruột, đầu cầu lông nhung bong tróc, nhiều bạch cầu niêm mạc ruột áo B: Hư hoại niêm mạc ruột, mô ruột hoại tử có calci 20 Hình 3.13 Viêm tổn thương niêm mạc ruột C: Viêm cơ, viêm lớp áo ruột D: Viêm ruột sợi huyết bề mặt Hình 3.14 Hạch bạch huyết ruột sưng to E, F: Hạch bạch huyết ruột to có phản ứng viêm Kết bệnh tích vi thể cho thấy sán ký sinh đường ruột dùng giác hút móc bám bám vào niêm mạc ruột, làm niêm mạc ruột bị viêm, sung huyết, xuất huyết, tế bào biểu mơ ruột bị tổn thương nghiêm trọng gây bong tróc thối hóa; q sản mạnh tạo thành nhiều nhú, nhơ vào lịng ruột, lớp niêm mạc mơ đệm xâm nhập nhiều tế bào viêm Hạch lâm ba ruột non viêm sưng to kết phản ứng viêm ruột non chó nhiễm sán dây Những tác động làm cho chó bị tiêu chảy nặng, phân nhầy lẫn máu, gầy yếu trúng độc (Nguyễn Thị Kim Lan ctv., 2017) 3.4.2.3 Kết kiểm tra tiêu huyết học chó nhiễm sán dây Bảng 3.13 So sánh số tiêu huyết học chó nhiễm sán dây khơng nhiễm sán dây D caninum Chó nhiễm Chó khơng nhiễm Chỉ tiêu P- Value (n=38) (n=38) WBC (103/mm3) 13,83±1,63 9,15±1,13 0,05 21 NEU (103/mm3) 5,93±0,86 3,11±0,79