Luận văn thạc sĩ hóa học: Nghiên cứu hoá học các hợp chất có hoạt tính sinh học trong quả ké đầu ngựa

Nhằm làm rõ các cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây Ké đầu ngựa như một nguồn dược liệu quý, dùng làm thuốc chữa bệnh. Với ý nghĩa khoa học và thực tiễn nêu trên, nhiệm vụ của đề tài này là tiến hành phân lập các chất hoá học có trong quả Ké đầu ngựa, nhận dạng cấu tạo hoá học của một số chất tách được bằng các phương pháp hoá lý hiện đại.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên htt p :// w w w l rc -tnu e d u.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

- -NGUYỄN THỊ HỒNG THÁI

NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT

CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG QUẢ

KÉ ĐẦU NGỰA

(XANTHIUM STRUMARIUM L.)

Chuyên ngành: Hoá học hữu cơ.

Mã số: 60.44.27

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Văn Thỉnh

Thái Nguyên 2007

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên htt p :// w w w l rc -tnu e d u.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM - -

NGUYỄN THỊ HỒNG THÁI

NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT

CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG QUẢ

KÉ ĐẦU NGỰA

(XANTHIUM STRUMARIUM L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

Thái Nguyên 2007

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên htt p :// w w w l rc -tnu e d u n

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ TRONG LUẬN VĂN

Trang

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 KHÁI QUÁT VỀ HỌ CÚC (ASTERACEAE) VÀ CHI XANTHIUM 3

1.1.1 Họ cúc (asteraceae) 3

1.1.2 Chi xanthium 3

1.2 GIỚI THIỆU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÂY KÉ ĐẦU NGỰA 4

1.2.1 Đặc điểm thực vật 4

1.2.2 Đặc điểm sinh thái 4

1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT CHI XANTHIUM 5

1.3.1 Một số nghiên cứu hoá thực vật quả Ké đầu ngựa 5

1.3.2 Sử dụng trong y học dân gian 8

1.3.3 Một số bài thuốc dân gian từ quả Ké đầu ngựa 9

1.4 CÁC DẠNG AXIT BÉO HAY GẶP TRONG TỰ NHIÊN .10

CHƯƠNG 2: PHẦN THỰC NGHIỆM 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18

2.1.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp sử lý mẫu 18

2.1.2 Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết 20

2.1.3 Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất 20

2.2 DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 20

2.2.1 Dụng cụ và hoá chất 20

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu 22

2.3 CÁC DỊCH CHIẾT TỪ QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L.) 22

2.3.1 Các dịch chiết 22

2.3.2 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (antimicrobial activity) 24

2.3.3 Phát hiện định tính các nhóm chất 25

2.3.3.1 Các ancaloit 25

2.3.3.2 Các sterol 26

2.3.3.3 Các flavonoit 26

2.3.3.4 Các saponin 26

2.3.3.5 Các cumarin 26

2.3.3.6 Các tanin 27

2.3.3.7 Các glucozit trợ tim 27

2.4 PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT .28

2.4.1 Phân tích thành phần các axit béo trong dịch chiết n-hexan của quả Ké đầu ngựa trên GC 29

2.4.2 Phân lập và tinh chế các chất trong dịch chiết n-hexan; etylaxetat của quả ké đầu ngựa bằng phương pháp sắc ký cột 31

2.4.2.1 β – Sitosterol (KĐN.H8) 31

2.4.2.2 3-O-β -D-glucopyranosyl-β-Sitosterol (KĐN.E33) 32

CHƯƠNG 3: THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 NGUYÊN TẮC CHUNG .35

3.2 PHÁT HIỆN CÁC NHÓM CHẤT CÓ TRONG DỊCH CHIẾT N-HEXAN, DỊCH CHIẾT ETYLAXETAT VÀ DỊCH CHIẾT METANOL CỦA QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L.) 36

3.3 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH DỊCH CHIẾT N-HEXAN, DỊCH CHIẾT ETYLAXETAT VÀ DỊCH CHIẾT METANOL CỦA QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L) 36

3.4 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VÀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA 38

3.4.1 Các axit béo 38

3.4.2 Các hợp chất sterol 41

3.4.2.1 β-sitosterol hay 24R-stigmast-5 en-3-õ-ol (KĐN.H8)

41 3.4.2.2 3-O-β-D-glucopyranosyl-β-sitosterol (KĐN.E33) 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

PHỤ LỤC .49

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả

Nguyễn Thị Hồng Thái

Lời cảm ơn

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Phạm VănThỉnh người thầy đã chỉ ra hướng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình, động viên

và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Quyết Tiến, TS Phạm ThịHồmg Minh, phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hoá học - Viện khoa học vàcông nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi đểtôi hoàn thành công việc nghiên cứu của mình

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn Phòng Phân tích cấu trúc - Viện Hóa học,Phòng Hoá - Sinh Biển Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên, đã giúp tôithực hiện các phép phân tích phổ và phân tích thành phần axit béo trong mẫunghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong bộ môn hoá hữu cơ, cácthầy, cô trong khoa Hoá học, các phòng ban của trường ĐHSP Thái Nguyên

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian tôi học tập và hoàn thành luậnvăn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình,các bạn bè đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi đểtôi nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Thái Nguyên , ngày 20 tháng 9 năm 2007

Tác giả Nguyễn Thị Hồng Thái

GC - MS : Gas Chromatography - Mass Spectroscopy

EI - MS : Electron Impact Mass Spectroscopy

ESI - MS : Electron sprayionisation - Mass Spectroscopy

FAB - MS : Fast Atom Bombardment Mass spectroscopy

FT-IR : Fourier Transform Infrared Spectroscopy

NMR : Nuclear Magnetic Resonance

1H-NMR : 1H-Nuclear Magnetic Resonance

13C-NMR : 13C- Nuclear Magnetic Resonance

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

HMQC : Heteronuclear Multiple - Quantum Coherence

HMBC : Heteronuclear multiple - Bond Correlation

NOESY : Nuclear Overhauser and Exchange Spetroscopy

MIC : Minimum inhibitory concentration

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên htt p :// w w w l rc -tnu e d u n

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

TRONG LUẬN VĂN

Hình

Và sơ đồ

Hình 1.1 Công thức dạng tổng quát của các chất I, II, III 7

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ chung nghiên cứu một số thành phần hoá học quả

Ké đầu ngựa thuộc chi Xanthium strumarium L.

28

Sơ đồ 2.3 Phân lập chất từ dịch chiết n-Hexan của quả Ké đầu ngựa 31

Sơ đồ 2.4 Phân lập chất từ dịch chiết Etylaxetat của quả Ké đầu ngựa 33

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên htt p :// w w w l rc -tnu e d u n

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

Bảng 1.1 Các dạng axit béo no thường gặp trong tự nhiên 13Bảng 1.2 Các axit béo không no thường gặp trong tự nhiên 15Bảng 2.1 Khối lượng cặn chiết từng phân đoạn của quả Ké đầu ngựa

Bảng 3.1 Các cấu tử có hàm lượng axit béo trên 1% trong quả Ké

Theo các số liệu thống kê mới nhất thảm thực vật Việt Nam có trên

12000 loài, trong số đó có trên 3200 loài thực vật được sử dụng làm thuốc trong Y học dân gian [1], [2], [3], [4], [5]

Từ xưa đến nay, những cây thuốc dân gian vẫn đóng vai trò hết sứcquan trọng trong việc chăm sóc sức khoẻ cho con người Ngày nay những hợpchất tự nhiên có hoạt tính sinh học được phân lập từ cây cỏ đã được ứng dụngtrong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp và chăm sóc sức khoẻ conngười Chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật,làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm v.v Mặc dùcông nghệ tổng hợp hoá dược ngày nay đã phát triển mạnh mẽ, tạo ra các biệtdược khác nhau sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh, nhờ đó giảm tỷ lệ

tử vong rất nhiều, song những đóng góp của các thảo dược cũng không vì thế

mà mất đi chỗ đứng trong Y học Nó vẫn tiếp tục được dùng như là nguồnnguyên liệu trực tiếp, gián tiếp hoặc cung cấp những chất đầu cho công nghệbán tổng hợp nhằm tìm kiếm những dược phẩm mới cho việc điều trị các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên htt p :// w w w l rc -tnu e d u n

2

chứng bệnh thông thường cũng như các bệnh nan y Các số liệu gần đây chothấy rằng, có khoảng 60% dược phẩm được dùng chữa bệnh hiện nay, hoặcđang thử cận lâm sàng đều có nguồn gốc từ thiên nhiên [7]

Trong công tác phòng chữa bệnh ở nước ta, Đảng và Nhà nước luônchủ trương và khuyến khích Đông Tây y kết hợp để chăm sóc sức khoẻ chonhân dân, kế thừa và phát huy vốn quý của nền Y học cổ truyền trong đó cónhiều cây thuốc quý

Trong thế giới thực vật muôn màu, nhiều loài cây cỏ đã được sử dụngnhư những dược liệu quý Trong số đó có cây Ké đầu ngựa đặc biệt là bộphận quả của cây Loài cây này mọc rất phổ biến ở Việt Nam, thường mọc ởvùng đất hoang, bờ ruộng, bờ đường, xen kẽ với các loại cỏ khác

Dân gian thường dùng Ké đầu ngựa chữa phong hàn, đau đầu, chân tayđau co rút, phong tê thấp, đau khớp, mũi chảy nước hôi, mày đay, lở ngứa,chữa đau răng, đau họng, biếu cổ, hủi, eczema [4]

Để góp phần nghiên cứu làm rõ thành phần, tính chất của các chất hoáhọc trong thực vật làm thuốc chữa bệnh chúng tôi chọn hướng nghiên cứu hoáhọc các hợp chất thiên nhiên

Tên đề tài là: “Nghiên cứu hoá học các hợp chất có hoạt tính sinh

học trong quả Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.)”, nhằm làm rõ các

cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây Ké đầu ngựa như một nguồn dược liệuquý, dùng làm thuốc chữa bệnh

Với ý nghĩa khoa học và thực tiễn nêu trên, nhiệm vụ của đề tài này làtiến hành phân lập các chất hoá học có trong quả Ké đầu ngựa, nhận dạng cấutạo hoá học của một số chất tách được bằng các phương pháp hoá lý hiện đại

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên htt p :// w w w l rc -tnu e d u n

3

1.1.1 Họ cúc (Asteraceae)

Họ cúc (Asteraceae) là họ lớn nhất trong thực vật có hoa, gồm 2 phân

họ Ở Việt Nam có khoảng 125 chi và trên 350 loài [1], chủ yếu là cỏ dại,một số được trồng làm thực vật cảnh (các loại Cúc), rau ăn (Ngải cứu, Cảicúc, Rau diếp), gia vị (Cúc tần), phẩm nhuộm (Hồng hoa)

Họ cúc gồm 2 phân họ là:

+ Phân họ hoa ống (Rubuliflorae): Trên cụm hoa chỉ có hoa hình ống,

hoặc hoa hình ống ở giữa, hoa hình lưỡi nhỏ ở xung quanh đầu Cây không cónhựa mủ,

+ Phân họ hoa lưỡi nhỏ (Liguliflorae, Cichorioideae) : Tất cả các hoa

trong cụm hoa đầu là hoa lưỡi nhỏ, không có hoa ống Cây có nhựa mủ

Họ cúc là họ có số loài làm thuốc lớn nhất trong thực vật giới, cókhoảng 51 loài thường làm thuốc, trong đó có 18 loài dùng trong công nghiệpdược là: Atiso, Bạch truật, Cỏ nhọ nồi, Cỏ ngọt, Cúc hoa, Cúc tần, Hồng hoa,

Hy thiêm, Ké đầu ngựa, Khoản đông hoa, Mần tưới, Mộc hương, Ngải cứu,Ngưu bàng, Sài đất, Thương truật, Thanh cao hoa vàng, Tử uyển

1.1.2 Chi xanthium

Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.): Thân xù xì, lá chia 3-5 thuỳ

hay hình bầu dục có khía răng Quả Ké đầu ngựa có răng móc, cây thườngmọc ở ven đường bãi hoang ven sông, suối Quả dùng làm thuốc gọi làThương nhĩ tử, chữa phong tê thấp, mụn nhọt Theo Đỗ Tất Lợi quả Ké đầungựa là thành phần thuốc nam thiết yếu trong một số bài thuốc Y học cổtruyền Việt Nam Trên thế giới có 25 loài còn ở Việt Nam có 2 loài đó là:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên htt p :// w w w l rc -tnu e d u n

4

Xanthium Strumarium L là loài rất phổ biến, mọc hoang ở mọi nơi trong

nước ta, được dùng làm nguyên liệu cho Đông y và Xanthium Inaequilaterum

DC., loài này phân bố từ miền Trung trở vào, cũng được làm thuốc như loài

trên [6]

1.2 GIỚI THIỆU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÂY KÉ ĐẦU NGỰA

1.2.1 Đặc điểm thực vật.

Cây Ké đầu ngựa còn gọi là thương nhĩ (tên Trung Quốc), phắt ma

(Thổ) Tên khoa học là Xanthium strumarium L thuộc họ cúc (Asteraceae).

Cây Ké đầu ngựa mọc hoang ở khắp nơi trong nước ta, từ vùng núi caotới vùng trung du, đồng bằng Trên thế giới loài này cũng được phân bố ở hầuhết các nước có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới Mọc nhiều ở các nước

Châu Á như Trung Quốc, Malaixia, Ấn độ Ngoài ra, Xanthium strumarium còn được biết đến ở Brazin, Mỹ Ở Việt Nam Xanthium strumarium là một

loài rất phổ biến

1.2.2 Đặc điểm sinh thái.

Cây Ké đầu ngựa là một cây nhỏ, cao độ 2m, thân có khía rãnh, lá mọc

so le, phiến lá hơi 3 cạnh, mép có răng cưa có chỗ khía hơi sâu thành 3-5thuỳ, có lông ngắn cứng Hoa tự hình đầu có thứ lưỡng tính ở phía trên, có thứchỉ gồm có 2 hoa cái nằm trong hai lá bắc dầy và có gai Quả giả hình thoi, cómóc, có thể móc vào lông động vật, cắt đôi ở trong có hai quả thực [4]

Cây Ké đầu ngựa có thể sống trên nhiều loại đất khác nhau, cây bắt đầumọc vào mùa Xuân sinh trưởng và phát triển nhanh trong mùa mưa ẩm, sang

Hạ cây ra hoa, kết trái, cuối Hạ sang Thu quả chín Cây ưa ánh sáng và có thểchịu hạn, thường mọc thành đám ở ven đường, vùng đồi, bãi hoang, bờ sông Mùa Xuân, nhân dân thường trồng cây Ké đầu ngựa bằng cách đào lỗnhỏ cho vào 3-4 hạt mỗi hố cách nhau chừng 50-60cm, phủ ít đất lên và tưới

ẩm, độ 10 ngày sau cây mọc [5]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên htt p :// w w w l rc -tnu e d u n

5

1.3.1 Một số nghiên cứu hoá thực vật quả Ké đầu ngựa.

Trong quả Ké đầu ngựa có nhiều iốt và vitamin C, ngoài hai chấtnày trong quả Ké đầu ngựa còn có các glucoza, β-sitosterol, β-(D,L)-glucozit

có tác dụng chống viêm [11]

Trong quả Ké đầu ngựa ở Liên Xô có chứa ancaloit nhưng theo sựphân tích của Viện Y học Bắc Kinh (1958) thì trong quả Ké đầu ngựa có chấtsaponin (glucozit), không có ancaloit [6]

Theo Khafagy trong quả Ké đầu ngựa có một số secqiutecpen - lactonchưa no có khung xanthonolit: xanthinin (nhiệt độ nóng chảy 123- 1240),xanthanol và izoxanthanol [5]

Trong quả Ké đầu ngựa có 30% dầu béo Nghiên cứu thực nghiệm chothấy có hoạt tính giảm đường huyết của chuột bình thường, ức chế thần kinhtrung ương, kháng khuẩn Gr (-), kháng nấm [11]

Theo Wehmer trong quả Ké đầu ngựa có 1,27% một glucozit(xanthostrumarin) tương ứng với chất datixin, chưa rõ hoạt tính, 3.3% nhựa

và vitamin C

Quả Ké đầu ngựa có chứa:

+ Carboxy atractylozit ở dạng muối có tác dụng hạ đường huyết rấtmạnh, có độc tính

+ Xanthetin và Xanthamin là những chất có tác dụng kháng khuẩn[4]

Theo nghiên cứu của Ying-Tsun Ma, Mu-Chi Huang và các cộng sự,

họ đã tìm ra hai chất mới thiazinediones cùng với năm chất đã biết được tách

ra từ quả của Xanthium strumarium L.

Cấu trúc của 2 chất mới này đã được xác định là:

* 7-Hydroxymethyl-8,8-dimethyl-4,8-dihydrobenzol [1,4] 3,5-dione-11-0-β-D-glucopyranoside (chất I).

thiazine-* 2-Hydroxy-7-hydroxymethyl-8,8-dimethyl-4,8-dihydrobenzol[1,4] thiazine-5,5-dione-11-0-β- D-glucopyranoside (chất II)

Năm chất đã biết được xác định là:

Trên thế giới chi Xanthium có 25 loài [10] Các loài Xanthium được sử

dụng như một loại thuốc thảo mộc cổ truyền trong một thời gian dài ở các

nước phương Đông Xanthium strumarium L là loài chính được tìm thấy

nhiều ở Trung Quốc, quả của nó là Fructus Xanthi (Tên Trung Quốc là Er-Zi), người dân Trung Quốc sử dụng quả này để chữa viêm xoang, đau đầu

Cang-do cảm lạnh, viêm khớp [9] Từ Xanthium strumarium L người ta đã phân lập

và nhận dạng được một số chất thuộc các nhóm sau:

* Diterpenoit

* Secquiterpen lacton

* Caffeoylquinic axit

* Thiazinedion

Các chất trên đã được I R Chu công bố năm 1965

Các hợp chất dầu trong hạt của Xanthium strumarium L đã được V K

Kapoor công bố năm 1976

Chất I: R1= β- D-Glu; R2=HChất II: R1= β- D-Glu; R2=OHChất III: R1=H; R2=H

Hình 1.1 Công thức cấu tạo tổng quát của các chất I, II, III.

1 2 3

Họ tách được các chất từ Xanthium strumarium L., bằng cách phân chia

chúng trên cột sắc ký silicagel kết hợp với cột sephadex LH-20 trong các hệdung môi khác nhau, kết quả thu được hai chất mới: 7-hydroxymethyl-8,8-dimethyl-4,8-dihydrobenzol[1,4]thiazine-3,5-dione-11-0-β-D-glucopyranoside(chất I) và 2-hydroxy-7-hydroxymethyl-8,8-dimethyl-4,8-dihydrobenzol [1,4]thiazine-5,5-dione-11-0-β-D-glucopyranoside (chất II), cùng với năm chất đãbiết là: Xanthiazone (chất III), chlorogenic acid (chất IV), ferulic acid (chấtV) từ phần chiết trong n-butanol, fomononetin (chất VI) và ononin (chất VII)

từ phần chiết trong ethyl acetate

Hợp chất I thu được là chất bột mầu trắng vô định hình, có nhiệt

độ nóng chảy là: 180-1820C, phổ tử ngoại-khả kiến có ởmax (MeOH) là: 280

nm; phổ khối ion hoá bụi electron (ESI) cho tín hiệu m/z = 402 [M+H]+, công

thức hoá học là C17H23N2SO8, được xác định bằng phổ khối phân giải cao.Phổ hồng ngoại của chất I chỉ ra sự hiện diện của nhóm hydroxyl (3369cm-1)

và hai nhóm cacbonyl (1680 cm-1 ,1655cm-1)

Từ các dữ liệu về phổ IR, UV, nhất là phổ NMR và phổ MS, TingHan đã đề xuất cấu trúc hợp chất I là glucozit Liên kết glucozit với genninđược thực hiện ở nhóm OH tại C-11 Đường tham gia tạo liên kết là đườngglucoza và liên kết glucozit là õ-glucozit

Hình 1.2: Cấu trúc của chất (I)

1.3.2 Sử dụng trong y học dân gian

Quả Ké đầu ngựa (Thương nhĩ tử) có vị ngọt nhạt, hơi đắng, tính

ấm, có tác dụng tiêu độc, sát trùng, tán phong, trừ thấp Lương y Việt Cúc ghinhận về Ké đầu ngựa như sau: Thương nhĩ thảo ấm, giải phong nhiệt thấp tê,

bổ não tuỷ, chữa nhức đầu, viêm mũi dị ứng bạch đới, lâm lậu [4]

Hiện nay Ké đầu ngựa là một vị thuốc thường dùng trong nhân dânViệt Nam, được dùng chủ trị các bệnh ngoài da, bệnh mũi xoang, bệnh xươngkhớp

Trong bài thuốc Y học cổ truyền của Trung Quốc quả Ké đầu ngựađược dùng để chữa viêm xoang, đau đầu do cảm lạnh, viêm khớp, ung thưphát bối (sau lưng), đau răng, viêm mũi [12]

Nhân dân Liên xô cũ dùng Ké đầu ngựa để chữa bướu cổ, các bệnh mụn nhọt, nấm tóc, hắc lào, lỵ và đau răng.

Nhân dân ta và Trung Quốc thường chế Ké đầu ngựa thành cao thương nhĩ để chuyên chữa lỏ loét, mụn nhọt

Ở Ấn Độ, người ta dùng Ké đầu ngựa trị sốt rét, làm toát mồ hôi, trị bệnh tràng nhạc, ung thư, quả làm dịu kích thích, trị bệnh đậu mùa

Một số loài của chi Xanthium có nguồn gốc từ Bắc Mỹ được dùng trong y

học

1.3.3 Một số bài thuốc dân gian từ quả Ké đầu ngựa

Chữa phong tê thấp, tay chân co rút: Quả Ké đầu ngựa 12g giã nát sắc uống [6]

Chữa đau răng: Sắc nước quả Ké đầu ngựa, Ngậm lâu lại nhổ Ngậm nhiều lần [6]

Chữa mũi chảy nước trong, đặc: Quả Ké đầu ngựa sao vàng tán bột Ngày uống 4-8g [6]

Chữa thuỷ thũng, bí tiểu tiện (lợi tiểu): Thương nhĩ tử, thiêu tồn tính;đình lịch Hai vị bằng nhau, tán nhỏ Uống với nước mỗi lần 8g, ngày hailần [2]

Chữa biếu cổ: Ngày uống 4-5g quả Ké đầu ngựa dưới dạng thuốc sắc(đun sôi, giữ sôi 15 phút ) (Đỗ tất lợi )

Chữa tổ đỉa: Quả Ké đầu ngựa 50g, hạ khô thảo 50g, vỏ núc nác30g, sinh địa 20g, hạt dành dành 15g, được tán bột làm viên Ngày uống20-25g

Chữa các bệnh phong, dị ứng gan, mẩn ngứa, mày đay: Ké đầu ngựa 15g,kinh giới bông 10g, muồng trâu 15g, cỏ mần trầu 15g, cam thảo đất 10g,bạc hà 10g, cỏ hôI 10g, bèo tai tượng 10g, chổi đực 10g, nghề bà 10g Các

vị hiệp chung 1 thang, đổ 1 bát nước, sắc còn 8 phần, uống ngày 1 thang(bài thuốc ở An Giang).

Các bệnh ngoài da do dị ứng, chàm (BS Nguyễn Xuân Sơn, khoa da liễu Bệnh viện Việt- Tiệp): Ké đầu ngựa 9kg, thổ phục linh 9kg, cồn benzoic 10% 300ml Nước vừa đủ 23lit Nếu không dùng đường thì nấu nước, cô cao, tán bột làm viên Đã điều trị 124 trường hợp cho kêt quả tốt Chữa ung thư não: Thương nhĩ tử 15g, thất diệp nhất chi hoa (cây 7 lá 1 hoa) 16g, viễn chi 10g, xương bồ 6g, sắc uống ngày 1 thang [6]

Lipit là những hợp chất hữu cơ tự nhiên rất phổ biến trong tế bào các

cơ thể sống, trong động vật, thực vật và vi sinh vật Chúng có thành phần hoáhọc và cấu tạo khác nhau nhưng cùng có tính chất chung là không hoà tantrong nước mà hoà tan tốt vào các dung môi hữu cơ như: ete, clorofom,benzen, ete dầu hoả…

Cấu trúc đa dạng của lipit được bắt nguồn từ các axit béo khác nhautham gia vào trong thành phần của nó Ngày nay, đã phát hiện được hơn 500axit béo khác nhau ở mức độ và đặc điểm phân nhánh của mạch hydrocacbon,

số lượng và vị trí các nối đôi trong mạch, vị trí và số lượng các nhóm chức,

độ dài của mạch hydrocacbon

Các axít béo có mặt trong thành phần lipit thực vật, động vật, thường

có từ 16-20 nguyên tử cacbon trong phân tử Theo Ackman trong sinh vậtbiển số lượng nguyên tử các bon của axít béo còn nhiều hơn có khi đến 30nguyên tử cacbon

Hầu hết các axit béo no có mặt trong tự nhiên có cấu tạo mạch thẳngvới số nguyên tử cacbon chẵn Các axit với số nguyên tử cacbon từ C2-C30được biết đến, nhưng phổ biến và quan trọng nhất là C12-C22 Chúng có thểđược gọi tên theo tên thường và tên khoa học hoặc gọi theo kí hiệu số như

16:0 (nghĩa là axit béo có 16 cacbon và không có nối đôi) Những axit béođơn giản trong tự nhiên là các axit béo no, với mạch hydrocacbon dài, khôngphân nhánh có công thức chung như sau:

CH3(CH2)nCOOHTrước đây người ta cho rằng số n bao giờ cũng là số chẵn, hiện naynhờ các phương pháp phân tích hiện đại, người ta đã phát hiện trong dầu mỡ

tự nhiên có cả các axit béo no có số nguyên tử cacbon n lẻ Các axit nàychiếm khoảng 1% so với tổng số các axit béo

Hơn một trăm axit béo một nối đôi được tìm thấy trong tự nhiên,nhưng hầu hết chúng là những hợp chất hiếm Thực tế tất cả các axit béo mộtnối đôi đều có công thức chung là:

nhóm có vị trí nối đôi được phân cách đều đặn bởi nhóm metylen

(methylene-interrupted) và nối đôi cấu hình dạng cis (Z), đại diện cho nhóm này là 2 axit

linoleic và axit archidonic

Nhóm khác là các axit có tất cả một hoặc một phần không no trong một

hệ liên kết đôi liên hợp dạng cis (Z) hoặc trans (E).

Nhóm thứ ba thường xuyên miêu tả là liên kết đôi C=C không bị

phân cách đều đặn bởi nhóm metylen (non methylene-interrupted diens

NMID), axit 5,9,12-18:3 có trong dầu hạt cây tùng lớn là ví dụ:

Các axit béo không no đa nối đôi phân cách đều đặn bởi nhóm allyl(-CH=CHCH2)- đều có chung công thức là:

CH3(CH2)m(CH=CHCH2)n(CH2)COOH

Các axit béo đa nối đôi liên hợp (conjugated polyenenoic fatty acids)

là các axit béo không no chứa nhiều liên kết đôi liên hợp tồn tại trong thành phần

Các axit béo đa nối đôi liên hợp không có dấu hiệu tồn tại trong lipitbất kì một loại động vật nào và được thừa nhận có vai trò đáng kể chỉ trongmột số dầu hạt thực vật, trong đó có dầu trẩu là một loại dầu thương mại quantrọng Phần lớn các axit béo đa nối đôi liên hợp trong tự nhiên thường tồn tạidưới 7 dạng đồng phân của axit octadecatrienoic Trước đây đã có thời gianngười ta cho rằng chỉ có 1dạng của axit này tồn tại, nhưng gần đây nhờ phổ

13C- NMR phân giải cao và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã chỉ ra rằng

các axit béo đa nối đôi liên hợp khác nhau bởi chính các dạng đồng phân cis (Z) hoặc trans (E) của chúng Điều đó được chỉ ra trên phổ tử ngoại UV,

chúng có nhiệt độ nóng chảy cao và thường tồn tại dưới dạng không no cấu

hình trans (E) Tính đặc biệt của dầu hạt sồi (Sapium sebierum) là trong một

vài dạng glyxerit của nó có chứa 4 nhóm RCO (axyl), bao gồm 2 axit C18thông thường, một axit C8 hydroxy allenic và 1 axit deca-2E,4Z-dienoic.Dạng glyxerit trong dầu hạt sồi có công thức như sau:

CH2OCO(CH2)7CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH3

CHOCO(CH2)7CH=CHCH2CH=CH(CH2)4CH3

CH2OCO(CH2)3CH=C=CHCH2OCOCH=CHCH=CH(CH2)4CH3

Mặc dù các axit béo mạch nhánh có mặt nhiều trong tự nhiên, nhưngchúng thường tồn tại như những thành phần phụ và hiếm khi chúng có sốlượng đáng kể trong các axit béo tổng Hầu hết kiểu nhánh chỉ là một nhómmetyl Các axit với một nhóm metyl ở các vị trí hai hoặc ba [n-2 (izo axit), n-

3 (anteiso axit)], hoặc có thể ở vị trí khác Các axit có nhiều hơn một nhómmetyl thường gắn với các nguyên tử cacbon chẵn Đây là sự giải thích về mặtsinh tổng hợp cho hầu hết các cấu trúc chung của các axit béo mạch nhánh

Các axit béo có mạch vòng là các axit béo tồn tại trong tự nhiên màtrong phân tử có chứa cacbon mạch vòng gồm 3 nguyên tử cacbon (cyclopropan), chúng thường có mặt trong dầu hạt họ thông, tùng Các axit béocyclopropanyl cũng thường xuất hiện nhiều trong phốtpholipit màng vi khuẩn,chúng cũng thường đi kèm axit cyclopropenyl có trong thành phần axit béocủa dầu các hạt thực vật

Trong tự nhiên các axit béo với nhóm chức khác nhóm cacboxyl và mộthoặc nhiều dạng khác của axit béo không no thì thường gặp, tuy nhiên phổbiến hơn cả là dạng hydroxy axit và eproxy axit

Các epoxy axit và furanoic axit là các axit béo có chứa vòng epoxyhoặc vòng furan trong phân tử, chúng có mặt trong thành phần một số dầu hạtthực vật, thường tồn tại ở dạng triaxylglyxerol và trong cutin mà ở đó chúngtồn tại dưới dạng polyme của các hydroxy axit

Bảng 1.1 Các dạng axít béo no thường gặp trong tự nhiên [7]

Điểm chảy Mpt.

( 0 C)

Phân bố trong tự nhiên

nhiều trong thực vật và một vàitriglycerit thực vật Thườngthey trong dạ cỏ động vật dướidạng muối

3 n-Propanoic Propionic -22.0 Thường thấy trong dạ cỏ động

vật

béo của động vật nhai lại

động vật thực vật

12 n-Dodecanoic Lauric 44,2 Phân bố rải rác, là cấu phần

quan trọng trong thành phầndầu 1 vài hạt thực vật, sinh vậtbiển

14 n-Tetradecanoic Myristic 54,1 là cấu phần quan trọng của các

đối tượng trong thiên nhiên

16 n-Hexadecanoic Palmitic 62,7 Là cấu phần quan trọng hay

gặp trong tự nhiên và là mộttrong những axít béo phổ biếnnhất của quá trình sinh tổnghợp chất béo trong thực vật,động vật biển

18 n-Octadecanoic Stearic 69,9 Là cấu phần quan trọng trong

dầu béo thiên nhiên

20 n-Eicosanoic Arachidic 75,4 Là cấu tử thứ yếu đôi khi đóng

vai trò rất quan trọng ở một vài

đối tượng như sinh vật biển

triglycerit của dầu một số hạt thực vật

24 n-Tetracosanoic Lignoceric 84,2 Khá phổ biến ở triglycerit của

dầu hạt các loài thực vật biển

26 n-Hexacosanoic Cerotic 57,7 Phổ biến là cấu của dầu hạt

thực vật và nhựa sáp của côn trùng, sâu bọ

28 n-Octacosanoic Montanic 90,9 Cấu phần quan trọng của một

vài loài sáp thực vật, sinh vật biển

Bảng 1.2: Các axít béo không no thường gặp trong tự nhiên [7]

Điểmchảy(0C)

Phân bố trong tự nhiên

-Có trong thực vật, khuẩnque

-Có trong dong tảo, thực vậtbậc cao, vi khuẩn

cis-9- hexadecenoic Palmitoleic -Phổ biến trong động vật,

-Phổ biến hầu hết trong cácđộng vật, thực vật và tổ chức

vi sinh vật

-Có trong E-coli và các vikhuẩn khác

-Cấu tử thứ yếu

Cấu phần thứ yếu ở động vậtsống

-Cấu phần chủ yếu trong lipitthực vật, ở động vật và conngười, nó chỉ bổ xung vàoqua con đường thức ăn rauquả hoặc dầu mỡ thực vật vàsinh vật biển

Ax

í t b éo 3 n ố i đ

ô i

-Là cấu phần thứ yếu trongđộng vật và một vài loài rongbiển.Là cấu thành rất quantrọng của một vài loài thựcvật

-Phổ biến ở thực vật bậc cao

và rong tảo biển, là cấu phầnđặc biệt của galatosyldiglycerit

-Có trong dầu hạt một số loàicây đặc biệt dầu trẩu

-Là cấu phần quan trọng củalipit động vật và một vài rongtảo biển Đặc biệt là thànhphần chủ yếu củaphospholipit

Ax

i t b éo 5 n ố i đ

ô i

Phổ biến ở động vật sống,đặc biệt tham gia cấu thànhphospholipit, rất đa dạng ởtrong mỡ cá biển

CHƯƠNG 2: PHẦN THỰC NGHIỆM

2.1.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu

Nguyên liệu để nghiên cứu là quả của cây Ké đầu ngựa được thu háivào cuối tháng 8 đầu tháng 9 năm 2006 tại huyện Phú Lương, tỉnh TháiNguyên

Quả Ké đầu ngựa còn được gọi là Thương nhĩ tử (Trung Quốc) Có tên

khoa học là Xanthium strumarium L., thuộc họ Cúc Asteraceae [5].

Mẫu quả tươi thu hái về (16kg), đưa đi sấy ngay ở nhiệt độ 1100 C khoảng 10phút để diệt men Sau đó sấy khô ở 50-600 C cho tới khi độ ẩm nhỏ hơn 10%thu được 8.8kg mẫu khô Mẫu khô được nghiền nhỏ và được ngâm chiết kiệtnhiều lần bằng etanol 900 ở nhiệt độ phòng

Sau khi cất loại dung môi, cặn cô được chiết lần lượt bằng các loạidung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etylaxetat và metanol

Các dịch chiết được đuổi kiệt dung môi bằng thiết bị cô quay ở nhiệt độkhoảng 500 C dưới áp suất giảm Các cặn thô được đưa lên các loại cột sắc kýkhác nhau để phân lập các chất có trong từng phân đoạn và thường phải kếthợp nhiều phương pháp khác nhau như: dùng hệ dung môi chạy cột có độphân cực tăng dần để phân ly các chất có độ phân cực gần giống nhau, kếthợp với kết tinh phân đoạn và kết tinh lại trong dung môi thích hợp Riêngcặn thô n-Hexan được metyl hoá (este hoá) bằng MeOH xúc tác HCl Đun hồilưu khoảng 8 tiếng, sau đó trung hoà bằng NaHCO3 cho đến pH = 7, chiết 3lần bằng n-Hexan Dịch chiết tổng cô khô và được đưa đi phân tích bằng thiết

bị GC

Hình 2.1 Cây Ké đầu ngựa

Hình 2.2 Quả Ké đầu ngựa

2.1.2 Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết

Để phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch cô khác nhau củaquả Ké đầu ngựa cần phối hợp sử dụng các phương pháp sắc ký và kết tinh lạitrong dung môi thích hợp :

- Sắc ký lớp mỏng (SKLM)

- Sắc ký cột Silicagel thường

2.1.3 Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

Các chất tinh khiết phân lập ra sẽ được xác định những hằng số lý hoáđặc trưng: màu sắc, mùi vị, Rf, điểm nóng chảy, v.v Sau đó sẽ tiến hành ghicác các loại phổ như: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộnghưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), cacbon-13 (13C-NMR) với các kỹ thuậtmột chiều (1D-NMR) và 2 chiều (2D-NMR) tuỳ theo từng hợp chất

2.2.1 Dụng cụ và hoá chất

Các loại dung môi dùng để ngâm chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure),còn các loại dung môi dùng để chạy sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng hay dùngtrong phân tích là loại tinh khiết phân tích (PA)

Loại Silicagel G60 của hãng hoá chất Merck được dùng để tráng ra cácloại sắc ký lớp mỏng với các kích cỡ khác nhau trên tấm thuỷ tinh, và đượchoạt hoá 4 giờ ở nhiệt độ 1100 C Ngoài ra các tấm sắc ký lớp mỏng đế nhômDC-Alufolien Kieselgel 60F254 Art.5554 và đế nhựa (polyme) DC-Plastikfolien Kieselgel 60F254 Art.5735 tráng sẵn, độ dày 0,2mm cũng đãđược sử dụng để xác định số thành phần có trong các dịch chiết, các phânđoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được

Các hệ dung môi triển khai SKLM

(UV-Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai được biểu thị: RfA(B,C)x100.

Sắc ký cột thường sử dụng silicagel Merck 60, cỡ hạt 230-400 mesh(0,040 đến 0,063mm hoặc 0,1 đến 0,16mm)

Các dụng cụ khác được sử dụng trong quá trình nghiên cứu là:

- Cân phân tích

- Máy cất quay chân không

- Bộ chiết Shoxlet

- Bình nón, bình định mức, bình cầu, buret, picromet, pipet

- Cột thủy tinh các cỡ có khóa để làm cột sắc kýH

o á c h ấ t :

− Dung dịch axit sunfuric (H2SO4)

− Dung dịch axit chlohiđric (HCl)

− Dung dịch axit axetic (CH3COOH)

− Tinh thể muối natrisunfat khan (Na2SO4)

− Dung dịch Sodium metanolat, axetyl chlorit

− Dung dịch axit HCl 0,5N trong nước

− Dung dịch KOH 0,5N trong cồn

− Dung dịch KOH 0,1N trong nước

− Hỗn hợp dung môi ete etylic - cồn 950 (2:1 theo thể tích)

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu

- Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Boátus (Đức) hoặc trên máyElectrothermal IA-9200

- Góc quay cực [α]D đo trên máy Polartronic-D, chiều dài cuvet = 1cm

Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT410 (Viện Hoá học TTKHTN & CNQG) dạng viên nén KBr

Phổ khối lượng ghi trên máy MS Engine 5989 HP ion hoá bằng vachạm electron (EI-MS) 70eV, và sử dụng ngân hàng dữ liệuDATABASE/WILLEY 250L Phổ FAB-MS(NaCH3COO) ghi trên máy LC-MS-Trap-00127

- Phổ 1H-NMR và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz (Viện Hoáhọc –Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam ) hoặc Bruker 200MHz,400MHz AVANCE (Bruker) nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3 , DMSO-d6hoặc C5H5N-d5

- Phổ GC-MS ghi trên máy sắc ký khí Finigan Trace GC ultra-Colum, cột:BFX70 (50Mx0.32MM x 0.25uM)

Carrier: N2, Pressure cant: 1000kPa, split 15:1, Air: 350ml/min,

Quả Ké đầu ngựa đã sấy khô, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằngetanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dịch không màu Dịch chiếtđược cất loại dung môi ở áp suất giảm đến dạng cao lỏng, sau đó lần lượtchiết với các loại dung môi: n-hexan, etylaxetat và metanol

Các dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc và cất kiệtdung môi bằng cô quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 500 C Cặn được sấy khô

và cân để xác định trọng lượng Như vậy từ quả Ké đầu ngựa thu nhận được 3phân đoạn là n-hexan, etylaxetat, metanol với các ký hiệu tương ứng là: KĐN.H, KĐN.E và KĐN.M (xem trong sơ đồ 2.1)

Kí hiệu:

- KĐN.H sản phẩm thu được từ dịch chiết quả Ké đầu ngựa bằng n-Hexan

- KĐN.E sản phẩm thu được từ dịch chiết quả Ké đầu ngựa bằng EtOAc

- KĐN.M sản phẩm thu được từ dịch chiết quả Ké đầu ngựa bằng MeOH

Sơ đồ 2.1 Qui trình ngâm chiết mẫu

Mẫu khô nghiền nhỏ

1.Etanol2.Cặn + H2O

Bảng 2.1: Khối lƣợng cặn chiết từng phân đoạn

của quả Ké đầu ngựa

(Xanthium strumarium L.)

Bộ phận

Khốilượngmẫu (g)

Cặn chiếtn-hexan (g) EtOAc (g) MeOH (g)

2.3.2 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

(antimicrobial activity).

* Đối tượng thử: Các chủng vi sinh vật và nấm gây bệnh kiểm định

- Vi khuẩn Gr (-): Pseudomonas aeruginosa (Pa), E coli (Ec)

- Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis (Bs), Staphylococcus aureus (Sa)

- Nấm men : Candida albicans (Ca)

Chất tham khảo: Amphotericin B

Amoxicilin

*Phương pháp thử :

Bước1: Pha loãng mẫu thử bằng phương pháp pha loãng đa nồng độ

Mẫu ban đầu có nồng độ 20mg/ml được pha loãng bằng các nồng độ khác nhau để thử hoạt tính với các chủng có từ nồng độ 128ỡg/ml; 32ỡg/ml;8ỡg/ml; 2ỡg/ml; 0,5ỡg/ml đối với chất sạch, 256ỡg/ml; 64ỡg/ml; 16ỡg/ml;4ỡg/ml; 1ỡg/ml đối với dịch chiết

Bước 2: Thử hoạt tính:

Chuẩn bị dung dịch vi sinh vật hoặc nấm với nồng độ 5.105 khi tiến hànhthử

Lấy 10ỡl dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã được pha loãng thêm200ỡl dung dịch vi sinh vật hoặc nấm, ủ 370 sau 24 giờ, đọc độ đục tế bào trênmáy Tecan, xử lý số liệu và tính toán giá trị IC50

Bảng 2.2 Kết quả thử hoạt tính sinh học các dịch chiết

từ quả Ké đầu ngựa

Tên chủng vi sinh vật kiểm định

Ec.

Escherichia coli

IC 50 µg/ml

Pa:

Pseudomonas aeruginosa

IC 50 µg/ml

Bs:

Bacillus subtilis

IC 50 µg/ml

Sa:

Staphylococcus aureus

IC 50 µg/ml

Ca: Candida albicans

Ống 1: cho 1 – 2 giọt dung dịch silicostungtic axit 5%, nếu có tủa trắng và nhiều là dương tính

Ống 2: cho 1 – 2 giọt thuốc thử Dragendorff: nếu thấy xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính

Ống 3 : cho 3 – 5 giọt thuốc thử Mayer: nếu xuất hiện kết tủa trắng

là dương tính