Nghiên cứu biểu hiện gen mã hoá nhân tố phiên mã ZmDREB2A nhằm tăng cường tính chịu hạn ở một số dòng ngô việt nam tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM  ĐỒN THỊ BÍCH THẢO NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HĨA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ ZmDREB2A NHẰM TĂNG CƯỜNG TÍNH CHỊU HẠN Ở MỘT SỐ DỊNG NGƠ VIỆT NAM Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã sớ : 94202001 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội – Năm 2020 i Cơng trình hồn thành tại: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: GS TS Nông Văn Hải TS Bùi Mạnh Cường Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi h ngày tháng năm 20 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư Viện Quốc gia Thư Viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Thư Viện Viện Nghiên cứu Ngơ ii MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Tình trạng biến đổi khí hậu tồn cầu, hạn hán kéo dài, lượng mưa khơng vùng vào thời điểm năm khó khăn lớn cho sản xuất nơng nghiệp nhiều nước châu Á, châu Phi, Nam Mỹ Ngoài tác động trực tiếp lên trình canh tác, biến đổi khí hậu cịn làm thu hẹp diện tích sản xuất nơng nghiệp Việt Nam có khoảng 75% diện tích đồi núi, đất dốc nên thường xuyên khan nguồn nước gây khó khăn cho canh tác nhiều loại trồng, có ngơ Hạn nhân tố có ảnh hưởng lớn tới suất phạm vi rộng lớn, có tính chất tồn cầu, ngơ khơng nằm tác động hạn, vùng trồng ngơ nhờ nước trời Có nhiều biện pháp tác động đến phát triển ngô điều kiện hạn kỹ thuật canh tác, chọn tạo giống Để giải vấn đề chọn tạo giống ngơ chịu hạn giải pháp nhà khoa học đặt lên hàng đầu có tính khả thi cao Cho đến chọn giống trồng chịu hạn nói chung ngơ nói riêng thực theo hướng chủ yếu: 1) Chọc lọc trực tiếp đồng ruộng; 2) Chọn lọc truyền thống phối hợp thị phân tử; 3) Chuyển gen chịu hạn Ở Việt Nam, chuyển gen liên quan đến tính chịu hạn vào ngô tập trung nghiên cứu năm gần Tuy nhiên, nghiên cứu biểu gen chuyển gen chịu hạn cịn đề cập đến Xuất phát từ lý đề tài “Nghiên cứu biểu gen mã hoá nhân tố phiên mã ZmDREB2A nhằm tăng cường tính chịu hạn số dịng ngơ Việt Nam” thực Mục tiêu đề tài (1) Tạo dịng ngơ chuyển gen mang cấu trúc gen ZmDREB2A; (2) Xác định có mặt, ổn định qua hệ biểu gen ZmDREB2A vật liệu chuyển gen mức phân tử; (3) Đánh giá khả chịu hạn dịng ngơ chuyển gen mang cấu trúc gen ZmDREB2A điều kiện hạn nhân tạo Đóng góp luận án (1) Luận án cơng trình nghiên cứu có hệ thống từ biến nạp cấu trúc vector chứa gen ZmDREB2A vào ba dịng ngơ K1, K3, K7 đến đánh giá biểu gen ZmDREB2A liên quan đến tính chịu hạn ngơ Việt Nam; (2) Ứng dụng kỹ thuật PCR, RT-PCR, southern blot, đánh giá hạn nhân tạo, phân tích sinh lý, sinh hố…đã đánh giá có mặt, tính ổn định biểu gen chuyển chuyển gen bước đầu tạo dịng ngơ chuyển gen mang gen ZmDREB2A; (3) Kết đạt luận án có giá trị khoa học thực tiễn tiếp cận nghiên cứu tạo dịng ngơ chịu hạn kỹ thuật chuyển gen thực vật Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án 4.1 Về mặt khoa học (1) Những sở khoa học việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm cải thiện đặc tính chịu hạn trồng khẳng định thông qua việc tăng cường protein tái tổ hợp ZmDREB2A biểu chức sinh học gen chuyển ZmDREB2A ngô (2) Kết tạo ngô chuyển gen mở hướng nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chuyển gen việc cải thiện khả chịu hạn ngô Việt Nam 4.2 Về mặt thực tiễn (3) Việc tạo dịng ngơ chuyển gen có khả chịu hạn tốt so với dòng đối chứng mở hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen loại trồng khác nhằm nâng cao tính chịu hạn (4) Các dịng ngơ chuyển gen có khả chịu hạn nguồn vật liệu khởi đầu cho việc tạo giống ngô chuyển gen chịu hạn nước (5) Bố cục luận án Luận án gồm 179 trang bao gồm: Phần mở đầu (04 trang); Tổng quan tài liệu (44 trang); Vật liệu phương pháp nghiên cứu (22 trang); Kết nghiên cứu thảo luận (77 trang); Kết luận đề nghị (02 trang); Các cơng trình khoa học tác giả liên quan đến luận án (01 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang): 193 tài liệu gồm thứ tiếng tiếng Việt (23) tiếng Anh (170); Phụ lục (13 trang); luận án có 33 bảng, 59 hình CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1.1 Tác động hạn đến sinh trưởng phát triển ngô Trong điều kiện hạn, phản ứng ngơ có số thay đổi như: i) nảy mầm chậm tỷ lệ mọc thấp; ii) giảm kích thước cây, số phận phát triển khơng đầy đủ; iii) khí khổng đóng, q trình quang hợp giảm, trí ngừng trệ hệ thống enzyme bị phá huỷ; iv) giảm q trình đồng hố dinh dưỡng, kéo dài thời gian chênh lệch tung phấn phun râu, ngô phát triển vô hiệu, giảm suất; v) điều kiện hạn nhẹ tăng tỷ lệ rễ/chồi, điều kiện hạn nặng, hệ rễ phát triển, trình hấp thụ dinh dưỡng trở nên khó khăn, q trình vận chuyển thân bị ngừng trệ, tích luỹ dinh dưỡng hạt 1.6 Một số nghiên cứu giới Việt Nam nhóm gen mã hóa yếu tố phiên mã Dreb2A phản ứng chịu hạn trồng Nghiên cứu hoạt động gen nhóm nhân tố phiên mã DREB2 khẳng định rằng, chế thúc đẩy biểu xảy điều kiện bất thuận mơi trường Phân tích cấu trúc protein DREB2A cho thấy tồn vùng điều hịa âm tính ức chế hoạt động DREB2A Khi vùng cắt bỏ, DREB2ACA hình thành có khả hoạt động nhân tố phiên mã [138] Tiến hành biểu DREB2A-CA Arabidopsis giúp cải thiện khả chịu hạn lại gây tượng cịi cọc khơng cải thiện khả chịu lạnh Sử dụng promoter cảm ứng stress RD29A để biểu gen DREB2A-CA giúp trì khả chống chịu tốt có tượng cịi cọC Phân tích khác biệt hai nhóm nhân tố phiên mã DREB1A DREB2A cho thấy khác biệt vùng trình tự liên kết với ADN điều dẫn đến việc có đáp ứng khác với điều kiện stress hạn khác biệt việc gen chống chịu điều hòa biểu hai gen Việc biểu gen DREB2A-CA Arabidopsis ngồi điều hịa biểu gen chống chịu hạn mặn mà cịn có gen liên quan đến chống chịu sốc nhiệt nhóm Heat shock protein (HSP)C Điều cho thấy việc biểu gen DREB2A có khả nâng cao tính chống chịu thực vật với nhiều stress khác Vì DREB2A nhà khoa học quan tâm vai trò cải thiện chống chịu hạn nhiệt độ cao Phân tích Microarray xác định gen chống chịu nhiệt độ cao điều hòa DREB2A cho thấy gen HSP70, HSFA3 Nhân tố phiên mã DREB2A có khả gắn với trình tự DRE promoter gen AtHSFA3 hoạt hóa biểu Ở ngơ, năm 2007, nhóm nghiên cứu Qiu phân lập cDNA ZmDREB2A từ ngơ ZmDREB2A mã hố phân tử protein gồm 318 amino acid chứa vùng gắn với ADNERP/AP2 đặc trưng cho DREB ZmDREB2Atồn hai dạng cấu trúc mRNA ZmDREB2A-L ZmDREB2A-S Dạng ZmDREB2AL có chiều dài 1336 bp, mã hóa cho đoạn peptide có chiều dài 89 acid amin, chuỗi peptide khơng có domain ERF/AP2 gắn với ADN dẫn đến hình thành dạng khơng có chức ZmDREB2A-S có chiều dài 1283bp, mã hóa cho protein gồm 318 acid amin có domain ERF/AP2 điển hình loại DREB nên dạng có chức Dạng S ngắn dạng L 53 bp Khi có stress mRNA ZmDREB2A-L bị cắt 53bp để thành dạng ZmDREB2A-S có hoạt tính bình thường đa phần mRNA ZmDREB2A khơng bị cắt 53bp dạng ZmDREB2A-L [128] Thơng qua thí nghiệm biểu Arabidopsis, protein ZmDREB2A chứng minh có khả tăng cường sức chống chịu với điều kiện hạn cho 1.7.3 Nghiên cứu sản xuất ngô biến đổi gen Việt Nam Vấn đề nghiên cứu ứng dụng trồng chuyển gen Việt Nam đặc biệt quan tâm năm gần Mặc dù nhiều ý kiến khác nhau, song Việt Nam đánh giá cao vai trò tầm quan trọng trồng biến chuyển gen việc cải tiến suất trồng, từ đặt kế hoạch phát triển lĩnh vực công nghệ gen đến năm 2020 đồng thời ban hành số thông tư sách trồng chuyển gen nhằm khuyến khích công tác nghiên cứu phát triển ứng dụng trồng biến đổi gen Việt Nam Đó quy định an toàn sinh học sinh vật biến đổi gen, mẫu vật di truyền sản phẩm sinh vật biến đổi gen; quy định việc xác nhận sản phẩm biến đổi gen đủ điều kiện sử dụng làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, quy định khảo nghiệm đánh giá rủi ro đa dạng sinh học môi trường trồng biến đổi gen Những nghiên cứu phân lập, tuyển chọn gen quý, thiết kế vector… thúc đẩy Tuy nhiên nghiên cứu lĩnh vực khởi đầu hầu hết sản phẩm nghiên cứu đánh giá, phân tích trì điều kiện phịng thí nghiệm, nhà kính, nhà lưới Cho đến nay, Việt Nam chưa tạo giống trồng biến đổi gen cấp độ chấp nhận cho sản xuất thương mại hóa Một số nghiên cứu lĩnh vực chuyển gen tiến hành phạm vi phịng thí nghiệm, nhà kính/nhà lưới số viện nghiên cứu Một số gen chịu hạn, chịu lạnh, kháng sâu bệnh phân lập, tách chiết thiết kế vector hiệu việc chuyển nạp vào trồng phương pháp chuyển gen khác CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Vật liệu thực vật 20 dịng ngơ gồm: V64, K2, K5, C502N, C88N, M67, C433, K10, K1, K3, K7, 952-TG1, 2224-TG1, N3-TG1, K4, K8, K9, K17, 1257-TG1, N18-TG13 Viện Nghiên cứu Ngô chọn tạo dung làm vật liệu đánh giá khả tái sinh; có 03 dịng ngơ K1, K3, K7 dùng làm vật liệu nhận gen Các dịng ngơ có khả tái sinh cao có tính trạng nông sinh học tốt 2.1.2 Chủng vi sinh vật Các chủng vi khuẩn sử dụng nghiên cứu cung cấp từ Viện nghiên cứu Hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam gồm: vi khuẩn E.coli chủng DH5α; vi khuẩn A tumefaciens chủng LBA4404 2.1.3 Vector oligonucleotide Vector tách dòng pUC57 mang gen ZmDREB2A tổng hợp từ hãng Genscript Vector pRTRA7/3 GS.TS Udo Conrad - Phịng thí nghiệm Kháng thể thực vật thuộc Viện Di truyền thực vật Nghiên cứu trồng (IPK) Gatersleben, Cộng hòa Liên bang Đức cung cấp Vector pBY Trường Đại học Michigan (Mỹ) cung cấp Vector biểu thực vật pCAMBIA1300 Trung tâm ứng dụng sinh học phân tử vào Nông nghiệp Quốc tế (CAMBIA) Australia cung cấp/gửi tặng Các cặp oligonucleotide (Bảng 2.1) sử dụng làm mồi cho PCR mà mẫu dị cho thí nghiệm lai ADN thiết kế dựa trình tự cơng bố GenBank đặt mua từ hãng Invitrogen (Mỹ) Sigma (Mỹ) 2.2 Nội dung nghiên cứu Nội dung Đánh giá khả tái sinh đặc điểm nông sinh học số dịng ngơ; Nội dung Thiết kế biến nạp vector biểu thực vật mang gen ZmDREB2A thông qua vi khuẩn A.tumefaciens vào số dịng ngơ Việt Nam; Nội dung Phân tích đánh giá ổn định dịng ngơ mang gen ZmDREB2A hệ T1, T2, T3; Nội dung Xác định hàm lượng chlorophyll, proline, cacbonhydrate đánh giá khả chịu hạn dịng ngơ chuyển gen 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp xác định dịng ngơ có khả tái sinh cao (Armstrong, 1985) 2.3.2 Phương pháp theo dõi đặc điểm nông sinh học, chọn tạo dòng làm vật liệu chuyển gen Các tiêu theo dõi q trình thí nghiệm tiến hành theo QCVN 01-56: 2011/BNNPTNT 2.3.3 Phương pháp thiết kế vector biểu gen ZmDREB2A (Sambrook, 2001) 2.3.4 Phương pháp tạo chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens (Frame, cs (2002, 2006, 2011) Ishida Yuji cs (2003,2007) 2.3.5 Phân tích đánh giá ổn định dịng ngơ mang gen ZmDREB2A kỹ thuật PCR (Sambrook, 2001) 2.3.6 Đánh giá biểu gen thông qua RT-PCR, lai Western (Joyce, (2002) (Sambrook, 2001) 2.3.7 Xác định hàm lượng Chlorophyll (Porra, 2006), proline (Bates cs, 1973), cacbonhydrate (Zheng, 2010) chuyển gen 2.3.8 Đánh giá khả chịu hạn chuyển gen (Camacho, 1994 Zaidi, 2002) CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá khả tái sinh đặc điểm nông học số vật liệu 3.1.1 Đánh giá khả tái sinh số vật liệu nghiên cứu Nhằm xác định vật liệu có khả tái sinh cao, 20 dịng ngô trồng, thu bắp non sau thụ phấn 12 ngày Áp dụng quy trình tái sinh ngô từ phôi non xây dựng để đánh giá khả tạo mô sẹo tái sinh cho nguồn vật liệu Kết khả tái sinh nguồn vật liệu thể bảng 3.1: khả tạo mô sẹo, tái sinh tạo hoàn chỉnh phụ thuộc vào kiểu gen Dịng K5 có khả tạo mơ sẹo lớn (73,5%) tiếp đến dịng K8 (68,7%) Dịng C88N có khả tạo mơ sẹo thấp (3,2%) Các dịng cịn lại có tỷ lệ tạo mơ sẹo từ 13,3% - 63,2% Khả tái sinh tạo hoàn chỉnh: Dịng K3 có tỷ lệ tái sinh cao (48,7%), cao dịng K2 (29,5%) song lại có tỷ lệ tạo hoàn chỉnh thấp nguồn K2 (68,5%) Các dịng có tỷ lệ tái sinh cao là: K3 (48,7%) tỷ lệ tạo hoàn chỉnh cao (45,9%); Dòng K7 (35,8%; 45,7%) K1 (36,8%; 52,8%); 1257 –TG1 (45,7%; 44,8%)… Dịng C88N khơng có khả tạo mơ sẹo, tái sinh tạo hồn thiện Dịng C433 có tỷ lệ tái sinh khơng thấp (21,0%) tỷ lệ tạo hoàn chỉnh thấp (5,3%) Bảng 3.1 Tỷ lệ tạo tái sinh từ phôi non mô ̣t số dòng ngô Việt Nam Tỷ lệ tạo Số tạo Số Số phôi cấy mơ sẹo phơi hồn TT Tên dịng tái sinh (%) hoá (%) thiện (%) V64 1800 23,1 12,4 21,5 K2 2550 63,2 29,5 68,5 K5 3700 73,5 22,4 33,3 C502N 1800 23,4 12,1 13,3 C88N 2500 3,2 5 M67 C433 K10 K1 1300 690 1000 600 24,4 29,8 13,3 76,4 31,3 21,0 21,4 36,8 13,2 5,3 15,4 52,8 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 K3 952-TG1 2224-TG1 N3-TG1 K4 K7 K8 K9 K17 1257-TG1 N18-TG1 600 300 300 300 600 600 600 600 600 300 300 75,9 68,9 61,9 60,8 48,9 77,5 68,7 34,6 32,9 55,8 56,9 48,7 34.1 33.6 28.7 38,9 35,8 31,5 12,8 23,9 45,7 41,5 45,9 37.3 44.8 34.8 44,8 45,7 40,4 24,6 25,8 44,8 38,5 Tóm lại, qua kết đánh giá khả tạo mô sẹo, tái sinh tạo hồn chỉnh, xác định 12 dịng có khả tái sinh cao K2, K5, K1, K3, 952TG1, 2224-TG1, N3-TG1, K4, K7, K8, 1257-TG1, N18-TG1 Bên cạnh dịng có tỷ lệ tái sinh cao, dịng đánh giá đặc điểm hình thái, khả sinh trưởng phát triển, khả kết hợp dịng nhằm mục đích lựa chọn nguồn vật liệu ưu tú nhận gen cho thí nghiệm chuyển gen sau 3.1.2 Đặc điểm nơng, sinh học dịng có tỷ lệ tái sinh cao Kết đánh giá thời gian sinh trưởng, đặc điểm hình thái, khả chống chịu suất dòng cho thấy: Các dịng có thời gian sinh trưởng từ ngắn đến trung bin ̀ h, có khả chống chịu với loại sâu bệnh hại, suất ổn định vụ Bảng 3.6 Hình thái bắp, yếu tố cấu thành suất suất thực thu dịng thí nghiệm năm 2014 T T Dịng Số hàng hạt/bắp X T Số hạt/hàng X T Khối lượng 1000 hạt (gram) X T K1 13,3 14 26,5 25,7 235,5 227,8 K2 12,0 12,0 25,4 25,4 241,3 234,6 K3 10,0 10,6 28,7 27,2 242,5 241,5 K4 12,7 12,0 28,3 26,4 235,4 238,4 952TG1 12,0 12,0 27,6 26,5 225,6 231,4 Tỉ lệ hạt/bắp (%) X T 69, 71,2 67, 68,5 68, 68,1 65, 66,6 66, 67,4 Năng suất (tạ/ha) X T 25,5 24,8 25,3 23,6 27,2 25,4 27,1 25,3 25,6 22,3 2224 -TG1 12,0 12,4 24,5 25,4 235,5 241,3 K7 12,0 12,0 27,5 26,5 241,5 237,6 K8 14,7 14 26,3 27,3 224,6 231,5 N3TG1 10,0 10,8 26,4 26,5 234,2 242,3 K5 12,7 12 27,1 26,7 243,5 245,2 13,3 14 26,3 25,6 237,6 241,4 12,0 12,7 25,6 26,3 234,5 236,5 10 11 12 1257 -TG1 N18TG1 CV% LSD 0.05 Ghi chú: X: vụ xuân; T: vụ Thu 67, 71, 69, 65, 68, 66, 67, 66,9 25,4 23,4 70,5 27,5 26,1 70,1 26,5 24,5 67,8 26,1 23,4 70,2 25,2 22,5 68,7 24,1 21,7 66,5 22,8 21,5 7,32 6,58 3,55 4,05 Qua theo dõi, số hàng hạt/bắp vật liệu vụ Xuân dao động từ 10,0 14,7 hàng Thu từ 10,6 - 14 hàng Các dịng có số hàng hạt/bắp cao vụ Xuân Hè thu gồm K1, K8 1257-TG (13,3 - 14,7 hàng/bắp) Đối với tính trạng số hạt/hàng, nhìn chung dịng có chiều dài bắp dài có số hạt/hàng nhiều hơn, nhiên phụ thuộc vào dạng hạt dòng Số hạt/hàng dòng dao động từ 24,5- 28,7 hạt/hàng vụ Xuân từ 25,4 – 27,3 hạt/hàng vụ Hè thu Nhìn chung, số hạt/hàng dòng vụ Xuân cao so với vụ Thu (Bảng 3.6) Khối lượng 1000 hạt vụ Xuân dao động từ 224,6 - 243,5 gam, vụ Thu từ 227,8 - 245,2 gam Trong đó, dịng có khối lượng 1000 hạt cao K5 (243,5 – 245,2 gam) Tỷ lệ hạt/bắp dịng có khác đáng kể, dao động từ 65,4 – 71,2% vụ Xuân 66,6 – 71,2% vụ Thu (Bảng 3.6) Năng suất xem tiêu quan trọng hạng đầu đánh giá vật liệu, dự đốn tiềm năng suất dịng/giống.Tính trạng suất đa gen quy định bị tác động nhiều yếu tố môi trường điều kiện canh tác Đặc biệt, suất bị ảnh hưởng rõ rệt yếu tố bất thuận hạn, úng, hay sâu bệnh hại Kết tính tốn suất lý thuyết nguồn vật liệu bảng 3.6 cho thấy: Trong vụ Xuân, có biến động suất nguồn vật liệu khác với giá trị độ biến động CV% =7,32%, đạt yêu cầu độ biến động thí nghiệm đồng ruộng Các dịng có suất lý thuyết vụ Xuân dao động từ 22,8- 27,2 tạ/ha vụ Thu từ 21,5 - 26,1tạ/ha Năng suất dịng vụ Thu có xu hướng thấp vụ Xuân, điều lý giải thời tiết lạnh thiếu ánh sáng cuối vụ Thu tác động đến trình quang hợp vận chuyển dinh dưỡng vào hạt dịng Ngồi đặt tính tốt khả chống chịu sâu bệnh hại cho suất ổn định, 12 dịng ngơ trì lai tạo nhiều năm qua Viện Nghiên cứu Ngơ Nhìn chung chúng cho khả kết hợp tốt, dòng bố mẹ số tổ hợp lai triển vọng… Căn kết nghiên cứu khả tái sinh 20 nguồn vật liệu kết theo dõi thí nghiệm đồng ruộng 12 nguồn vật liệu vụ Xuân Thu năm 2014, đồng thời dựa vào đánh giá khả kết hợp dịng, chúng tơi lựa chọn các dòng K1, K3, K7 dùng làm vật liệu chuyển gen 3.2 Thiết kế biến nạp vector biểu thực vật mang gen Zm Dreb2A vào vi khuẩn agrobacterium tumefaciens 3.2.1 Thiết kế vector biểu thực vật mang gen ZmDREB2A Ở ngô, tồn hai dạng mARN ZmDREB2A-L ZmDREB2A-S Dạng ZmDREB2A-L có chiều dài 1.336 bp, mã hóa cho đoạn peptide có chiều dài 89 axit amin, chuỗi peptide khơng có domain ERF/AP2 gắn với ADN dẫn đến hình thành dạng khơng có chức ZmDREB2A-S có chiều dài 1.283 bp, mã hóa cho protein gồm 318 axit amin có domain ERF/AP2 điển hình loại DREB nên dạng có chức Dạng S ngắn dạng L 53 bp, gặp điều kiện bất thuận xảy trình xử lý sau phiên mã mARN dạng ZmDREB2A-L bị cắt 53 bp để thành dạng ZmDREB2A-S có hoạt tính bình thường đa phần mARN ZmDREB2A không bị cắt 53 bp dạng ZmDREB2A-L [128] Do vậy, dạng ZmDREB2A-S có vai trị việc chống chịu hạn cho ngô xuất điều kiện môi trường hạn hán Tuy nhiên, điều kiện hạn hán xuất trì mARN ZmDREB2A dạng S diễn nhanh nên việc phân lập đoạn gen mẫu bị hạn gặp nhiều khó khăn, vậy, việc tổng hợp nhân tạo đoạn gen ZmDREB2A dạng S khắc phục khó khăn Do đó, chúng tơi tiến hành tổng hợp nhân tạo hãng Genscript đoạn gen ZmDREB2A-S đưa vào vector tách dòng pUC57 Gen ZmDREB2A dạng S gắn vào cấu trúc có ubiquitin promoter 35S terminator vùng T-ADN vector pCAMBIA1300, vector chứa gen thị chọn lọc thực vật hygromycin Sơ đồ cấu trúc vector pCAMBIA1300 ubi:: ZmDREB2A-S:: 35S 3.2.2 Kết biến nạp cấu trúc vector chứa gen ZmDREB2A-S vào số dịng ngơ Việt Nam thơng qua vi khuẩn A tumefaciens Ba dịng ngơ K1, K3, K7 dùng làm vật liệu chuyển gen Chúng dịng ưu tú, có đặc điểm sinh học tốt đặc biệt chúng có tỷ lệ tái sinh cao so với nguồn vật liệu khác mà nghiên cứu số thí nghiệm trước Trong thí nghiệm này, phơi non sau thụ phấn 12 ngày tách sử dụng làm mơ đích để lây nhiễm với vi khuẩn A tumefaciens chứa vector mang gen Bảng 3.8 Sự hình thành chồi tái sinh dịng ngơ thí nghiệm Đồng ni cấy Tái sinh N (CCM) (TS1) Nguồn Số phôi Số mẫu % S T T Tái sinh tạo chồi (TS2) Số mẫu % Cây tái sinh Tỷ lệ (%) K1 8430 2400 28,47 1995 23,67 291 3,45 K3 2670 810 30,34 690 25,84 64 2,40 K7 5310 735 13,84 675 12,71 92 1,73 đạt 0,18% Trong trình theo dõi đánh giá cho thấy, bị đột biến nhiều, xuất râu cờ, nhiều có cờ khơng có bắp ngược lại Một số khơng phân nhánh thân, có bắp có đốt cây, bị chết sớm trình sinh trưởng Một số bắp trước cờ nên râu dài phấn chưa có, bắp chúng tơi cứu cách lấy phấn K1 không chuyển gen (dịng nền) thụ vào Bên cạnh đó, hai dịng K3, K7 có tỉ lệ đột biến hơn, dẫn đến hiệu suất chuyển gen cao hẳn, đạt 0,49 % nguồn K3 0,34% nguồn K7 B C Hình 3.22 Một số dạng đột biến A Đột biến râu cờ; B Đột biến hạt ngô thụ cờ; C.Đột biến khơng có bắp Các T0 hữu thụ mang gen chuyển trồng đất tiếp tục cho sinh trưởng điều kiện nhà lưới để thu hạt phục vụ thí nghiệm phân tích T1 3.3 Phân tích đánh giá ổn định dịng ngô mang gen ZmDreb2A hệ T1, T2, T3 3.3.1 Phân tích có mặt gen ZmDREB2A dịng ngơ chuyển gen hệ T1 phương pháp PCR Kết PCR kiểm tra có mặt gen chuyển ZmDREB2A chuyển gen hệ T1 từ 10 T0 thuộc nguồn chuyển gen K1, K3 K7 thể qua bảng 3.12 Trong đó, nguồn K1 có 71 có gen, nguồn K3 K7 có 123 128 mang gen Kích thước đoạn gen đích ZmDREB2A chuyển không bị thay đổi so với thiết kế ban đầu (948 bp, Hình 3.23) đảm bảo cho việc đoạn gen đích khơng có đột biến chèn đoạn hay đoạn A Bảng 3.12 Kết phân tích PCR dịng ngơ hệ T1 Số Tỉ lệ Chi Số có Tỷ lệ % Tên có kết phân ly square kết mang dòng T1 gen value PCR (-) gen (χ2) PCR (+) chuyển Dòng K1 K1-1 16 1:4 20 K1-2 18 10 K1-3 15 1:3 25 K1-4 14 1:2 30 11 10 10 10 K1-5 K1-6 K1-7 K1-8 K1-9 K1-10 Tổng số Dòng K3 K3-1 K3-2 K3-3 K3-4 K3-5 K3-6 K3-7 K3-8 K3-9 K3-10 Tổng số Dòng K7 K7-1 K7-2 K7-3 K7-4 K7-5 K7-6 K7-7 K7-8 K7-9 K7-10 Tổng số 8 10 11 71 12 12 10 11 12 129 2:3 2:3 1:1 1:1 1:1 1:1 40 40 50 55 45 40 35,5 0,0 0,20 0,20 0,80 10 12 15 16 18 10 11 13 123 10 11 10 11 77 1:1 3:2 3:1 3:1 15:1 1:1 1:1 1:1 1:1 3:1 50 60 75 80 90 45 50 55 45 65 61,5 0,00 0,00 0,26 0,054 0,20 0,00 0,20 0,20 1,06 12 15 16 13 18 14 15 13 11 11 3:2 1:3 3:1 3:1 3:1 1:1 15:1 3:1 1:1 3:1 60 35 75 80 65 45 90 70 45 0,00 0,26 1,06 0,20 0,054 0,26 0,2 0,00 128 72 75 64 Hình 3.23 Một số kết điện di sản phẩm PCR nhân gen ZmDReb2A ( 948bp) dòng K3 hệ T1 gel agarose 1% L: thang ADN 1kb,(+): đối chứng dương (PCR từ plasmid), (-): đối chứng âm (PCR khơng có ADN khn); wt: PCR từ không mang gen, 1- 74: PCR từ chuyển gen hệ T1 12 3.3.2 Phân tích có mặt gen ZmDREB2A dịng ngơ chuyển gen hệ T2, T3 phương pháp PCR Thế hệ T2, hai nguồn K3 K7 có dịng đánh giá, phân ly theo tỉ lệ 3:1 là: K3-3.1, K3-4.18, K7-5.5 K7-8.10 Một dòng K7-4.12 có 100% T2 mang gen (Bảng 3.13) Các T2 có gen T1 lựa chọn để tự thụ thu bắp, kết hợp với đặc điểm nông học để tiến hành gieo đánh giá hệ T3 Bảng 3.13 Kết phân tích PCR dịng ngơ hệ T2 STT 3 Tên dòng T2 Dòng K3 K3-3.1 K3-4.18 K3-10.10 Tổng số Dòng K7 K7-3.3 K7-4.12 K7-5.5 K7-8.10 Tổng số Số có kết PCR (+) Số có kết PCR (-) 65 75 82 222 27 31 14 103 3:1 3:1 - 70,7 70,8 85,4 68,3 92 108 81 67 348 14 21 21 56 100 3:1 3:1 86,8 100,0 79,4 76,1 86,1 Tỉ lệ phân ly gen chuyển Tỷ lệ % mang gen Kiểm định chi bình phương (χ2;3:1) 0.93 1,11 0,00 1,05 0,06 Tỉ lệ phân ly gen chuyển ZmDREB2A hệ T3 tiếp tục tính tốn, Ở nguồn K3, dịng K3-3.1.96 có tỉ lệ phân ly gen chuyển T3 3:1, với số χ2 0.21, tuân theo định luật phân ly độc lập Mendel với copy gen chuyển Dịng K3-4.18 có tỉ lệ 100% có gen hệ T3, giả thuyết dịng K3-4.18.32 có kiểu gen đồng hợp tử gen chuyển ZmDREB2A, nhiên để khẳng định xác cần thực thí nghiệm lai Souhthern Blot để kiểm tra Với hai dòng K3-3.1.96 K3-4.18.32 phân ly theo quy luật Mendel hệ T1 T2 T3 giả thuyết hai dịng có tồn copy gen chuyển ZmDREB2A Hai dòng nguồn K3 lựa chọn thực hiển phản ứng Southern Blot, sinh lý sinh hóa đánh giá chịu hạn nhân tạo Nguồn K7 có bắp T2 chọn để gieo hệ T3, dòng K7-4.12.25 tiếp tục có tỉ lệ phân ly 100% hệ T3, tương tự hệ T2, điều thể đồng hợp tử gen chuyển Tuy nhiên cần thực thí nghiệm để có kết xác Dịng K7-5.5.19 có tỉ lệ phân ly 3:1, theo định luật Mendel với copy gen chuyển, hệ thứ dòng K7-5 phân ly theo tỉ lệ 3:1 Cây K7-8.10.65 có tỉ lệ phân li 9:1, không tuân theo quy luật phân li nào, 13 dù hai hệ trước dòng K7-8 phân li theo tỉ lệ Mendel, điều việc gen chuyển tồn không ổn định genome ngô chuyển gen [194], vị trí gen chuyển xuất trao đổi chéo làm thay đổi tỉ lệ gen chuyển qua hệ sau, di truyền yếu gen Qua đánh giá kết PCR kết đánh giá tỉ lệ phân ly qua hệ, thấy nguồn K3 có hai dịng K3-3 K3-4, nguồn K7 có hai dịng K7-4 K7-5 có chứa gen chuyển có phân ly gen chuyển ZmDREB2A theo định luật phân ly độc lập Mendel qua hệ Kích thước gen chuyển qua hệ không thay đổi so với thiết kế ban đầu Các có gen dòng chọn để thực thí nghiệm (Bảng 3.15) Bảng 3.15 Kết phân tích PCR dịng ngơ hệ T3 STT 2 Tên dòng T3 Dòng K3 K3-3.1.96 K3-4.18.32 Tổng số Dòng K7 K7-4.12.25 K7-5.5.19 K7-8.10.65 Tổng số Số có kết PCR (+) Số có kết PCR (-) Tỉ lệ phân ly gen chuyển Tỷ lệ % mang gen Kiểm định chi bình phương (χ2 ;3:1) 77 99 176 22 22 3:1 100 77,8 100 0.21 0.00 100 71 92 263 29 37 100 3:1 9:1 100 71,0 92,0 0.00 0.05 - 3.3.5 Xác định có mặt gen chuyển ZmDREB2A kỹ thuật lai Southern Kết xác định tín hiệu lai Southern ngô chuyển gen ZmDREB2A thuộc hệ T3 thể hình 3.37c Đối chứng dương (plasmid mang gen ZmDREB2A) cho băng tín hiệu rõ ràng Trong số chuyển gen ZmDREB2A, chuyển gen hai nguồn K3 (2 cây: K3-3.1.96, K3-4.18.32) K7 (3 cây: K7-4.12.25, K7-5.5.19, K7-8.10.65) dương tính với lai Southern Tất nguồn K3 (2 cây: K3-3.1.96, K3-4.18.32), K7 (3cây: K74.12.25, K7-5.5.19, K7-8.10.65) cho băng tín hiệu lai khơng có tín hiệu lai khác Đối với lai Southern, số lượng băng tín hiệu lai số lượng đoạn gen quan tâm hệ gen Như vậy, gen ZmDREB2A tích hợp vào hệ gen từ nguồn K3(2 cây: K3-3.1.96, K3-4.18.32) K7 (3 cây: K7-4.12.25, K7-5.5.19, K7-8.10.65) Trên giới, giống trồng biến đổi gen phải đánh giá số gen chuyển, đảm bảo số lượng nhất, trước cho phép phân 14 phối thị trường [93] Cá thể có nhiều gen chuyển phức tạp để đánh giá, xác định tác động đoạn chèn khác hệ gen Đó lý mà phương pháp biến nạp vi khuẩn Agrobacterium ưu tiên sử dụng so với súng bắn gen Hình 3.37a Kết Hình 3.37b Điện di Hình 3.37c Kết Lai điện di kiểm tra sản ADN tổng số sau Southern với nguồn phẩm PCR gen đích xử lý với enzyme giới dòng chuyển gen ZmDREB2A hạn ZmDREB2A sử dụng mồi M: marker 1Kb;(-): (+): plasmid mang probe đặc hiệu PCR khơng chuyển gen gen ZmDREB2A; đoạn gen đích ZmDREB2A (wild-type); 1,5: chuyển gen ZmDREB2A (+): Đối chứng dương ZmDREB2A từ nguồn (+): plasmid mang gen (PCR từ plasmid); 1-2: K3 (2 cây: K3-3.1.96, ZmDREB2A; 1,5:cây chuyển gen K3-4.18.32) chuyển gen ZmDREB2A từ ZmDREB2A từ nguồn 2,3,4: chuyển gen nguồn K3 (2 cây: K3K3(2 cây: K3-3.1.96, K3- ZmDREB2A từ nguồn 3.1.96, K34.18.32);3-5: chuyển K7 (3cây: K7-4.12.25, 4.18.32);2,3,4:cây chuyển gen ZmDREB2A từ K7-5.5.19, K7- gen ZmDREB2A từ nguồn nguồn K7 (3cây: K7- 8.10.65) K (3 cây: K7-4.12.25, 4.12.25, K7-5.5.19, K7K7-5.5.19, K7-8.10.65) 8.10.65) Kết lai Southern chuyển gen ZmDREB2A chứng tỏ q trình biến nạp thành cơng thuộc nguồn K3(2 cây: K3-3.1.96, K34.18.32), K7 (3 cây: K7-4.12.25, K7-5.5.19, K7-8.10.65) Đây sở để tiếp tục chọn lọc, trì phát triển nguồn vật liệu mang gen ZmDREB2A trình tạo giống 3.3.6 Xác định có mặt sản phẩm phiên mã gen chuyển ZmDREB2A ngô chuyển gen kỹ thuật RT-PCR Như vậy, kết phân tích RT-PCR nhân đoạn gen ZmDREB2A từ cDNA ngô chuyển gen mẫu thí nghiệm M1, M4, M5, M6, M7 nguồn K3-4.18.32 tương đương với giếng số 5, 11, 13, 15, 17 (Hình 3.37A) Tương ứng với kích thước đối chứng dương (giếng 1: sản phẩm PCR từ plasmid chứa vector chuyển gen Ubi-ZmDEB2A) Như vậy, có ngô chuyển gen từ nguồn ban đầu K3 mang gen ZmDREB2A biểu mức độ phiên mã Ở hình 3.37B, giếng số 5, 7, 11,15, 17, 19 tương đương với mẫu thí nghiệm M9, M10, M12, M14, M15, M16 dịng K7-4.12.25 chứng tỏ có mặt 15 cảc gen chuyển ngô chuyển gen bước đầu gen hoạt động thông qua phiên mã tổng hợp mRNA Kích thước băng DNA xuất tương đương với đối chứng dương (giếng 1) Điều chứng tỏ, ngô chuyển gen từ nguồn K7 bước đầu hoạt động thơng qua phiên mã tổng hợp mRNA Hình 3.37A Ảnh điện di RT-PCR mồi ZmDREB2A nguồn K3-4.18.32 M: Maker chuẩn 1kb; Giếng 1: ĐC dương (PCR từ plasmid); giếng 2: đối chứng âm (PCR khơng có ADN khn); giếng 3: wildtype (PCR không chuyển gen); giếng 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 sản phẩm PCR từ ARN Giếng 5, 7, 9, 11, 13, 17, 19: sản phẩm PCR từ cDNA dòng K3-4.18.32 (Giếng 4,5: PCR mẫu M1; 6,7: PCR mẫu M2; 8,9: PCR mẫu M3; 10, 11: PCR mẫu M4; 12, 13: PCR mẫu M5; 14, 15: PCR mẫu M6; 16, 17: PCR mẫu M7; 18, 19: PCR mẫu M8) Hình 3.37B Ảnh điện di RT-PCR mồi ZmDREB2A nguồn K74.12.25 M Maker chuẩn 1kb; Giếng 1: ĐC dương (PCR từ plasmid); giếng 2: đối chứng âm (PCR khơng có ADN khn); giếng 3: wildtype (PCR không chuyển gen); giếng 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 sản phẩm PCR từ ARN Giếng 5, 7, 9, 11, 13, 17, 19: sản phẩm PCR từ cDNA dòng K7-4.12.25 (Giếng 4,5: PCR mẫu M9; 6,7: PCR mẫu M10; 8,9: PCR mẫu M11; 10, 11: PCR mẫu M12; 12,13: PCR mẫu M13; 14, 15: PCR mẫu M14; 16, 17: PCR mẫu M15; 18, 19: PCR mẫu 16) Các giếng lại sản phẩm PCR từ mẫu RNA tương ứng, kết qủa điện di agarose 1% cho ta thấy, không thấy đoạn gen nhân lên, điều chứng tỏ, RNA tách chiết không bị lẫn tạp DNA Các cặp sản phẩm PCR từ RNA cDNA lại (6-7) (8-9) (18-19) dịng K3-4.18.32 (Hình 3.37A) cặp (8-9) (12-13) dịng K7-4.12.25 (Hình 3.37B) khơng thấy đoạn gen nhân lên Điều chứng tỏ ngô PCR để kiểm tra có mặt gen chuyển ngơ chuyển gen biểu gen khơng có 3.3.7 Kiểm tra protein ZmDREB2A thẩm tách miễn dịch (Western Blot) Kết lai Western (Hình 3.38) cho thấy, ngô chuyển gen giếng 3, dịng ngơ K3 ngơ chuyển gen dịng ngô K7 (giếng 6,7) màng lai nitrocellulose xuất băng màu vị trí kích thước khoảng 37 kDa Điều chứng tỏ, ngơ chuyển gen có protein ngoại lai nên xảy phản ứng tạo màu enzym kháng thể với chất Giếng điện di protein ngô không chuyển gen ngô chuyển gen không mang gen (giếng 1,2,5) khơng có protein gắn nên khơng xảy phản ứng tạo màu Kết này, tương ứng với kích thước protein ZmDREB2A tái tổ hợp nghiên cứu trước 16 [128][95] Như thấy, gen ZmDREB2A hoạt động biểu tổng hợp protein tương ứng ngơ dịng K3, K7 mang gen Hình 3.38 Kết lai Western blot ngô chuyển gen ZmDREB2A hệ T3 (M): thang chuẩn protein; (1): protein ngô không chuyển gen; (2): Proten ngô chuyển gen K3 không mang gen ZmDRB2A hệ T3; (3,4): Protein ngô chuyển gen K3 mang gen ZmDRB2A hệ T3; (5): Protein ngô chuyển gen K7 không mang gen ZmDRB2A hệ T3; (6,7) Protein ngô chuyển gen K7 mang gen ZmDRB2A hệ T3) 3.4 Xác định hàm lượng Chlorophyll, Proline, Cacbonhydrate chuyển gen đánh giá khả chịu hạn dòng ngô chuyển gen 3.4.1 Xác định hàm lượng chlorophyll chuyển gen ZmDREB2A Hình 3.39 Hàm lượng chlorophyll a thí nghiệm điều kiện thường điều kiện hạn nhân tạo Hình 3.40 Hàm lượng chlorophyll b thí nghiệm điều kiện thường điều kiện hạn nhân tạo Hình 3.41 Tỉ lệ chlorophylla/chlorophyllb thí nghiệm điều kiện thường điều kiện hạn nhân tạo Từ giá trị hàm lượng chlorophyll a (Hình 3.39) chlorophyll b (Hình 3.40), tương quan hai loại sắc tố phân tích hình 3.41 Tỉ lệ Chl a/Chl b điều kiện hạn cao so với điều kiện bình thường Cụ thể, tỉ lệ Chl a/Chl b mẫu K3, K3-CG khoảng điều kiện thường tăng lên 5,4 điều kiện hạn Tỉ lệ Chl a/Chl b mẫu K7, K7-CG tăng từ 3,4 điều kiện thường lên 5,3 5,9 điều kiện hạn Điều cho thấy ngô phải đối mặt với điều kiện hạn, hàm lượng chlorophyll b giảm mạnh so với chlorophyll a Các kết có tương đồng với nghiên cứu khác sinh lý trồng điều kiện hạn Hàm lượng chl nói chung giảm xuống tỉ lệ Chl a/Chl b tăng tượng mà nhóm nghiên cứu khác quan sát gây hạn nhân tạo ngô sorbitol điều kiện in vitro [83] 3.4.2 Xác định hàm lượng proline, carbohydrate chuyển gen ZmDREB2A 17 Kết phân tích hàm lượng proline chuyển gen ZmDREB2A thể hình 3.42 Ở điều kiện tưới nước đầy đủ, hàm lượng proline tự mẫu đạt xấp xỉ 0,2 μg/mg Tuy nhiên, xử lý hạn nhân tạo, hàm lượng proline tự tăng 2,5 - 4,5 lần so với điều kiện thường Cụ thể, mẫu K3 K3-CG điều kiện hạn có hàm lượng proline tăng 2,5 lần lần so với điều kiện tưới đầy đủ, chuyển gen cao 37% điều kiện hạn Mẫu K7 K7-CG điều kiện hạn có hàm lượng proline cao gấp 3,55 lần 4,5 lần so với điều kiện thường, chuyển gen cao 20% so với điều kiện hạn Kết phân tích hàm lượng cacbohydrate khơng cấu trúc ngô chuyển gen ZmDREB2A thể hình 3.43 Ở điều kiên tưới nước đầy đủ, hàm lượng NSC mẫu chuyển gen khơng chuyển gen khơng có khác biệt đáng kể, đạt khoảng 3,6 μg/mg Khi xử lý hạn nhân tạo, hàm lượng NSC mẫu K3 K3-CG đạt 5,27 μg/mg 6,76 μg/mg Hàm lượng NSC mẫu K7 K7-CG điều kiện hạn 5,6 μg/mg 7,55 μg/mg So sánh với không chuyển gen điều kiện hạn nhân tạo, chuyển gen ZmDREB2A có hàm lượng NSC cao 1,49 μg/mg tương đương 28,3% nguồn K3 1,95 μg/mg tương đương 34,8% nguồn K7 K7-CG… K7 Hạn K7 μg/m Hàm lượng NSC g 10 K7-CG K3-CG… K3 Hạn K3 K3-CG μg/m Hàm lượng proline g Hình 3.42 Hàm lượng proline chuyển gen ZmDREB2A không chuyển gen điều kiện thường điều kiện hạn nhân tạo Hình 3.43 Hàm lượng carbohydrate khơng cấu trúc nhóm thí nghiệm Kết phân tích tiêu sinh lý, sinh hóa cho thấy chuyển gen ZmDREB2A có tiêu sinh lý liên quan đến chống chịu tốt so với đối chứng Trong hai nguồn dịng thí nghiệm, mẫu thuộc dịng K7 có biểu chống chịu, thể qua đặc điểm sinh lý tốt so với mẫu thuộc dòng K3 Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa phân tích sở để kết hợp với đánh giá kiểu hình, từ chọn dịng ngơ có khả chống chịu tốt ổn định, phục vụ cho công tác phát triển giống 3.4.4 Đánh giá khả chịu hạn ngô chuyển gen hệ T3 gây hạn nhân tạo 3.4.4.1 Đánh giá số tiêu liên quan đến khả chịu hạn nhân tạo dòng chuyển gen ZmDREB2A thời kỳ Thí nghiệm công thức xử lý hạn tiến hành ngừng tưới 14 ngày, đồng thời công thức tưới nước cung cấp nước đầy đủ Theo dõi đặc điểm độ cuộn 18 ngô thấy rằng, giai đoạn ngày sau xử lý hạn, ngô công thức tưới nước đẩy đủ phát triển bình thường cơng thức xử lý hạn có biểu cuộn với mức độ khác dịng ngơ chuyển gen ZmDREB2A dịng ngơ Đồng thời ngô sinh trưởng chậm lại so với ngô đối chứng Ở giai đoạn 14 ngày sau xử lý hạn, có khác biệt rõ ràng đặc điểm ngơ Đánh giá độ cuộn hai dịng ngơ chuyển gen dịng ngơ cho điểm ngơ bắt đầu có biểu chết khơ tầng đỉnh (Hình 3.45) Hình 3.45 Giai đoạn trước phục hồi (A): K3: Dịng K3 khơng chuyển gen; K3-CG: Dịng K3 chuyển gen ZmDREB2A (B): K7: Dịng K7 khơng chuyển gen; K7-CG: Dòng K7 chuyển gen ZmDREB2A Ghi chú: chậu: bên trái dòng chuyển gen;3 bên phải dịng tương ứng; CT1: cơng thức tưới nước đầy đủ CT2: công thức xử lý hạn Sau tiến hành gây hạn nhân tạo 14 ngày, ngô thí nghiệm tưới nước phục hồi bón phân Sau ngày phục hồi, tỷ lệ sống sau phục hồi theo dõi: dịng K7-ZmDREB2A có tỷ lệ sống 86.6% tương đương 13/15 sống cao dòng K7 33.3% tương đương 5/15 sống Dòng K3-ZmDREB2A có tỷ lệ sống 66.6% tương đương 10/15 sống, dịng K3 có tỷ lệ sống 26.6% tương đương 4/15 sống Công thức tưới nước đầy đủ, dịng ngơ chuyển gen dịng sinh trưởng bình thường, khơng có khác biệt, tỷ lệ sống 100% Ở công thức xử lý hạn, hai dịng ngơ mang gen chuyển ZmDREB2A có khả phục hồi sinh trưởng sau xử lý hạn tốt hơn, có tỷ lệ sống cao so với dịng ngơ nền, nhiên trải qua thời kỳ hạn nên sinh trưởng chậm, thấp so với ngô đối chứng công thức tưới nước đẩy đủ (Hình 3.46) Hình 3.46 Giai đoạn sau phục hồi (A): K3: Dịng K3 khơng chuyển gen; K3-CG: Dòng K3 chuyển gen ZmDREB2A (B): K7: Dòng K7 khơng chuyển gen; K7-CG: Dịng K7 chuyển gen ZmDREB2A Ghi chú: chậu: bên trái dòng chuyển gen;3 bên phải dòng tương ứng; CT1: công thức tưới nước đầy đủ CT2: công thức xử lý hạn 19 Ngoài ra, tiêu theo dõi giai đoạn gồm: Chiều dài thân lá, chiều dài rễ, thể tích rễ, khối lượng thân tươi, khối lượng rễ tươi, khối lượng thân khô, khối lượng rễ khô kết thể bảng 3.20 Chiều dài thân chiều dài rễ, thể tích rễ: Khi hạn xảy giai đoạn con, ngô bị ảnh hưởng đến khả kéo dài lóng Tình trạng ngơ giảm chiều cao trải qua thời kỳ hạn báo cáo nhiều nghiên cứu trước Ngược lại với phát triển chiều cao cây, điều kiện hạn rễ ngô phát triển theo hướng tăng chiều dài rễ nhằm tăng khả lấy nước đồng thời giảm phát triển rễ nhánh hạn nặng xảy Kết đánh giá tiêu chiều dài thân chiều dài rễ cho bảng 3.20 cho thấy công thức tưới nước đầy đủ, chiều dài thân lá, chiều dài rễ thể tích rễ hai dịng ngơ chuyển gen K7-ZmDREB2A K3-ZmDREB2A có khác so với dịng ngơ tương ứng khơng có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% Bảng 3.20 Các tiêu thân lá, rễ dịng ngơ thí nghiệm trong chậu Chiều Cơng dài Chiều thức thân dài rễ thí (cm) nghiệm (cm) Vật liệu Khối Thể lượng tích rễ thân (mm3) tươi (g) Khối lượng rễ tươi (g) Khối Khối lượng lượng thân rễ khô khô (g) (g) Tổng sinh khối khô (g) K7ZmDR EB2A CT2 63,2 23,6 2,09 7,359 0,888 1,72 0,22 1,94 CT1 78,8 26,2 4,65 11,96 1,963 5,779 0,598 6,377 Dòng K7 CT2 56,7 19,5 1,13 2,06 0,344 0,74 0,14 0,88 CT1 77,8 26,26 4,636 11,97 1,964 5,762 0,589 6,351 K3ZmDR EB2A CT2 56,5 20,6 1,91 7,038 0,842 1,53 0,16 1,69 CT1 73,5 23,2 4,534 11,86 1,943 5,629 0,548 6,177 Dòng K3 CT2 51,7 16,08 1,01 1,968 0,324 0,588 0,091 0,68 CT1 72,8 4,2 1,99 23,2 5,7 0,92 4,518 0,9 0,013 11,87 2,8 0,168 1,944 5,622 2,2 0,8 0,02 0,019 0,537 4,7 0,0124 6,169 0,0279 CV% LSD CT1 CT2 CT2 CT1 CT1 CT2 CT2 CT1 Hình 3.47 Rễ dịng ngơ sau xử lý phục hồi ngày A: nguồn K3; B: nguyền K7 Chú thích: CT1: cơng thức tưới nước đầy đủ CT2: công thức xử lý hạn 20 Ở công thức xử lý hạn, chiều dài thân lá, chiều dài rễ, thể tích rễ hai dịng ngơ chuyển gen K7-ZmDREB2A K3-ZmDREB2A có khác so với dịng ngơ tương ứng K7, K3 có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% Chiều dài thân dịng ngơ K7-ZmDREB2A 63,2 cm dịng ngơ K7 56,7 cm Chiều dài rễ dòng ngơ K7-ZmDREB2A 23,6 cm dịng K7 19,5 cm (Hình 3.47, bảng 3.20) Thể tích rễ dịng ngơ K7-ZmDREB2A 2,09 mm3 dịng K7 1,13 mm3 Chiều dài thân dịng ngơ K3-ZmDREB2A 56,5 cm dịng ngơ K3 51.7 cm Chiều dài rễ dịng ngơ K3-ZmDREB2A 20.6 cm dịng K3 16,08 cm (Hình 3.47, Bảng 3.20) Thể tích rễ dịng ngơ K3-ZmDREB2A 1,91 mm3 dịng K3 1,01mm3 Bộ rễ phát triển tốt cho phép ngô hút nhiều nước điều kiện khô hạn Kết phù hợp kết luận [46], [13] điều kiện hạn nhẹ tỷ lệ rễ/thân có xu hướng tăng Khối lượng thân tươi khối lượng rễ tươi: Khi ngô trải qua giai đoạn hạn nghiêm trọng, tế bào bị tổn thương, chết khơng phục hồi Vì sau giai đoạn xử lý phục hồi, nguồn gen chống chịu tốt với điều kiện hạn, hoạt động tế bào khơi phục lại trạng thái bình thường Tế bào thời kỳ hạn trạng thái nước, giảm sức trương quay lại trạng thái no nước khối lượng thân tươi khối lượng rễ tươi tăng lên đáng kể Khối lượng thân tươi khối lượng rễ tươi dịng ngơ thí nghiệm thể bảng 3.20 Kết bảng 3.20 cho thấy khối lượng thân tươi khối lượng rễ tươi hai dịng ngơ K7-ZmDREB2A K3-ZmDREB2A khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với dịng ngơ K7, K3 tương ứng độ tin cậy 95% công thức tưới nước đầy đủ Ngược lại có khác có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% khối lượng thân tươi khối lượng rễ tươi dịng ngơ K7ZmDREB2A K3-ZmDREB2A so sánh với dịng ngơ công thức xử lý hạn Điều sau xử lý phục hồi tế bào có khả sống, sinh trưởng bình thường trở lại dịng so với dòng chuyển gen bị chết Trong công thức xử lý hạn, khối lượng thân tươi dịng K7ZmDREB2A 7,395g dịng ngơ K7 2,06g Khối lượng rễ tươi dòng K7-ZmDREB2A 0,888g dịng ngơ K7 0,344g Khối lượng thân tươi dòng K3-ZmDREB2A 7,308g dòng ngô K3 1,968g Khối lượng rễ tươi dịng K3-ZmDREB2A 0,842g dịng ngơ K3 0,324g Khối lượng thân khô, khối lượng rễ khô, tổng sinh khối khô: Khối lượng khô phản ánh hoạt động sinh trưởng phát triển cây, sinh trưởng phát triển tốt, trình quang hợp diễn mạnh lượng vật chất khơ tích lũy lớn Số liệu khối lượng thân khô, khối lượng rễ khô tổng sinh khối khơ dịng ngơ thí nghiệm cho bảng 3.20: Số liệu bảng 3.20 cho thấy công thức tưới nước đầy đủ khối lượng 21 thân khô, khối lượng rễ khô, tổng sinh khối khơ hai dịng ngơ chuyển gen K7ZmDREB2A, K3-ZmDREB2A khác khơng có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% so với khối lượng thân khô, khối lượng rễ khơ tổng sinh khối khố dịng ngô Trong công thức xử lý hạn khối lượng thân khô, khối lượng rễ khô, tổng sinh khối khô hai dịng ngơ chuyển gen ZmDREB2A khác có ý nghĩa so với dịng ngơ tương ứng với độ tin cậy 95% Khối lượng thân khơ dịng ngơ K7-ZmDREB2A 1,72g cao 0,98g so với dịng ngơ K7 0,74g Khối lượng rễ khơ dịng ngô K7-ZmDREB2A 0,22g cao 0,08 so với với dịng ngơ K7 0,14g Khối lượng thân khơ dịng ngơ K3ZmDREB2A 1,53g cao 0,942g so với dịng ngơ K3 0,588g Khối lượng rễ khơ dịng ngơ K3-ZmDREB2A cao 0,069g so với với dịng ngơ K3 0,091g Tổng sinh khối khô: Đối với hoạt động sống thực vật nói chung tổng sinh khối khơ tiêu quan trọng để đánh giá sinh trưởng Cây ngô sinh trưởng điều kiện thuận lợi có trình quang hợp diễn mạnh, vật chất khơ tích lũy nhiều sinh trưởng điều kiện không thuận lợi (thiếu nước, lạnh, sâu bệnh ) Trong điều kiện xử lý hạn nhân tạo tổng sinh khối khơ của dịng ngơ K7-ZmDREB2A K3-ZmDREB2A cao có ý nghĩa thống kê so với dịng ngô K7 K3 với độ tin cậy 95% Tổng sinh khối dịng ngơ K7-ZmDREB2A 1.94g cao 1.06g so với tổng sinh khối khố dòng ngô K7, tương đương 16,6% so với tổng sinh khối khơ dịng ngơ K7-ZmDREB2A cơng thức tưới nước đầy đủ Tổng sinh khối dịng ngơ K3-ZmDREB2A 1,69g cao 1,01g so với tổng sinh khối khố dịng ngơ K3 0,68g, tương đương 16,3% so với tổng sinh khối khơ dịng ngơ K3-ZmDREB2A công thức tưới nước đầy đủ Các tác giả nghiên cứu khả chịu hạn ngô giai đoạn Việt Nam [13],[14] giới [46],[59],[190] kết luận tầm quan trọng sinh trưởng rễ điều kiện hạn, tức giống trồng có rễ phát triển tốt thiếu nước thời kỳ con, dịng/giống có khả tận dụng nước sâu – có khả chịu hạn tốt Do vậy, giai đoạn hai dòng K3 K7 chuyển gen ZmDREB2A có khả chịu hạn tương đối tốt so với dòng tương ứng 3.4.4.2 Đánh giá dòng chuyển gen dòng tương ứng giai đoạn sinh trưởng khác khả chịu hạn nhân tạo Thí nghiệm thực với công thức: Công thức (Tưới đủ); Công thức (Gây hạn); Trong công thức 2, hạn được bố trí cơng thức nhỏ để đánh giá, công thức nhỏ ký sau: I – Gây hạn thời kỳ ngơ chín sữa đến thu hoạch; II – Gây hạn thời kỹ ngô trỗ cờ, thụ phấn đến thu hoạch; III – Gây hạn trước trỗ ngày (Xoáy nõn đến sau thụ phấn 10 ngày); IV – Gây hạn từ thời điểm ngô 10 đến sau thụ phấn 10 ngày[189] 22 Các yếu tố cấu thành suất suất dòng Các yếu tố cấu thành suất dịng gồm chiều dài bắp, đường kính bắp, số hàng hạt, số hạt/hàng, tỷ lệ khối lượng hạt/bắp, khối lượng hạt Năng suất kết cộng gộp yếu tố cấu thành suất Dịng ngơ có số yếu tố cấu thành suất cao có tiềm năng suất dịng cao Bảng 3.26 So sánh suất cá thể dịng ngơ chuyển gen ZmDREB2A thời kỳ hạn khác nhà lưới Dòng K7-ZmDREB2A K7 K3-ZmDREB2A K3 CV% LSD0,05 CT TN CT2 CT1 CT2 CT1 CT2 CT1 CT2 CT1 I 87,5 86,2 90,4 86,4 4,5 8,9 Năng suất cá thể (g/cây) II III 67,4 27,6 95,5 62,4 23,4 92,4 78,5 26,6 93,2 86,0 23,5 90,1 6,7 4,7 6,6 4,4 IV 20,6 15,6 16,4 16,0 6,5 4,5 CT2: công thức xử lý hạn, CT1: công thức tưới nước đầy đủ I, II, III, IV: thời điểm gây hạn Do điều kiện thí nghiệm chậu, nhà lưới nên tính tỷ lệ hạt/bắp cơng thức thí nghiệm khối lượng 100 hạt Kết yếu tố cấu thành suất dòng ngơ thí nghiệm bảng 3.26 cho thấy: Tỷ lệ hạt/bắp có tương quan chặt chẽ đến suất ngơ Khi hạn nặng vào giai đoạn 10 - xoắn nõn - sau trỗ (tương ứng với thời điểm gây hạn IV, III, II) gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng phát triển ngô, chênh lệch thời gian tung phấn - phun râu kéo dài, làm giảm khả kết hạt, giảm tỷ lệ hạt/bắp dẫn đến suất ngô bị giảm nghiêm trọng Trong trình gây hạn thời điểm, hạn thời kỳ 10 (thời điểm IV) bị giảm suất mạnh tỷ lệ hạt/bắp giảm mạnh, trung bình bắp ngơ cịn 5-9 hạt/hàng Khối lượng trăm hạt vật liệu thí nghiệm giảm dần theo thứ tự từ thời điểm I - II - IV–III Các dòng chuyển gen K3-ZmDREB2A K7-ZmDREB2A thể khả chịu hạn đánh giá suất cá thể có tỷ lệ giảm tiêu yếu tố cấu thành suất so với điều kiện hạn nhân tạo thấp vật liệu tương ứng Tuy nhiên, có dịng K7 – ZmDREB2A có khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy 95% Bên cạnh ngơ chuyển gen sinh trưởng phát triển tốt dịng ngơ tương ứng K7, K3 điều kiện hạn, trình phát triển bắp tích lũy vật chất khơ hạt cao Kết bảng 3.26 cho thấy, suất vật liệu khác môi trường đủ nước hạn Kết phù hợp với kết luận nghiên cứu Zaidi (2002) Lê Quý Kha (2005): hạn gây thiệt hại nặng đến suất thời gian chín hạt bị rút ngắn, giảm tuổi thọ tăng tốc độ già hoá lá, giảm tổng lượng chất đồng hố, giảm tích luỹ chất khô hạt; đồng thời làm giảm diện tích quang hợp, giảm khả sử dụng xạ mặt trời giảm số thu hoạch[13],[189] 23 Kế t quả của đề tài cho thấ y Viê ̣t Nam hoàn toàn có thể sử du ̣ng cơng nghê ̣ chuyể n gen để ta ̣o các vâ ̣t liê ̣u có các đă ̣c tiń h đă ̣c biê ̣t phu ̣c vu ̣ cho ̣n ta ̣o các giố ng trồ ng có suấ t và chấ t lượng cao KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Xác đinh ̣ được dòng K1, K3, K7 có tỷ lệ tái sinh phơi cao tương ứng 52,8%; 45,9%; 45,7%, có thời gian sinh trưởng trung bình ngắn từ 103 đến 105 ngày vụ Thu, 113 đến 115 ngày vụ Xuân; nhiễm sâu đục thân (1 điểm), bệnh đốm (1-2 điểm), khô vằn (0-1,5 %); chịu hạn (3-4 điểm), suất cao (từ 24,8-27,5 tạ/ha) ổn định làm dòng nhâ ̣n gen 1.2 Thiế t kế được vector pCAMBIA1300 chứa gen thị chọn lọc thực vật hygromycin và gen ZmDREB2A dạng S tổng hợp nhân tạo được gắ n vào cấu trúc có promoter Ubiquitin terminator 35S vùng T-ADN vector Cấu trúc vector pCAMBIA1300 ubi:: ZmDREB2A-S:: 35S chuyển vào dịng ngơ nhờ A.tumefaciens; thu được 77 ngô chuyển gen T0 bao gồm 15 K1, 19 K3 43 K7 với hiê ̣u suấ t chuyể n gen ở nguồ n vâ ̣t liê ̣u 0,17%, 0,71% 0,81% 1.3 Các dịng ngơ K3, K7 ở thế ̣ T0 mang gen chuyển ZmDREB2A trì ổn Tđịnh qua hệ hệ T1, T2, T3 khẳ ng đinh ̣ thông qua đánh giá phương pháp PCR; giải trình tự so sánh với trình tự gốc, lai Southern, RT-PCR hệ T3 Protein ZmDEB2A có kích thước gần 37 kDa biểu từ dòng K3 K7 hệ T3 1.4 Kết phân tích tiêu Chlorophyll a/ chlorophyll b, proline carbon không cấu trúc cho thấy: Tỉ lệ Chl a/Chl b mẫu K3, K3-CG khoảng điều kiện thường tăng lên 5,4 điều kiện hạn, mẫu K7, K7-CG tăng từ 3,4 điều kiện thường lên 5,3 5,9 điều kiện hạn; mẫu K3 K3-CG điều kiện hạn có hàm lượng proline tăng 2,5 lần lần so với điều kiện tưới đầy đủ, K3-CG điều kiện hạn có hàm lượng proline cao 37% điều kiện hạn Mẫu K7 K7-CG điều kiện hạn có hàm lượng proline cao gấp 3,55 lần 4,5 lần so với điều kiện thường, chuyển gen cao 20% so với điều kiện hạn; So sánh với không chuyển gen điều kiện hạn nhân tạo, chuyển gen ZmDREB2A có hàm lượng NSC cao 1,49 μg/mg tương đương 28,3% nguồn K3 1,95 μg/mg tương đương 34,8% nguồn K7 Các dịng chuyển gen chịu hạn ZmDREB2A có khả chịu hạn tốt giai đoạn thể tiêu phân tích: thân, lá, rễ tươi thân, rễ khô, đặc biệt tổng sinh khối ngô dòng K7-ZmDREB2A K3-ZmDREB2A cao 16,6% 16,3 % so với dịng ngơ K7 K3 Hạn giai đoạn ngô ảnh hưởng tới suất hạt Rất nhiều giai đoạn sinh trưởng ngô mẫn cảm với điều kiện hạn, giai đoạn bắt đầu sinh trưởng, trỗ cờ phun râu giai đoạn mẫn cảm Đề nghị - Tiế p tu ̣c phân tić h trì các ngơ chuyển gen hai dịng ngơ K3, K7 nhằm chọn, tạo dịng ổn định có khả chịu hạn cao - Thử nghiê ̣m lai ta ̣o và đánh giá điề u kiê ̣n ̣n các THL có các dòng tham gia - Nghiên cứu chuyể n các gen khác vào ngô phu ̣c vu ̣ chương triǹ h cho ̣n ta ̣o giố ng thời gian tới 24 CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Đồn Thị Bích Thảo, Nguyễn Xuân Thắng, Lê Tuấn Anh, Lê Cơng Tùng, Nguyễn Thị Thu Hồi, Nơng Văn Hải, Bùi Mạnh Cường (2019) “Đánh giá khả chịu hạn số tiêu sinh hóa dịng ngơ chuyển gen ZmDREB2A điều kiện hạn nhân tạo giai đoạn con” Tại chí khoa học Cơng nghệ Việt Nam, 61(5): 55 – 59 Đồn Thị Bích Thảo, Nguyễn Xn Thắng, Lê Cơng Lực, Nguyễn Thị Thu Hồi, Tạ Thị Thuỳ Dung, Lê Công Tùng, Bùi Mạnh Cường, Nơng Văn Hải (2017) “Giải trình tự, xác định tính tương đồng gen ZmDreb2A ngô chuyển gen với gen thiết kế” Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam, (78): 32-37 Đồn Thị Bích Thảo, Nguyễn Xn Thắng, Nguyễn Thị Thu Hồi, Tạ Thị Thuỳ Dung, Lê Công Tùng, Bùi Mạnh Cường, Nông Văn Hải (2016) “Biến nạp gen chịu hạn ZmDreb2A vào số nguồn vật liệu ngô Việt Nam thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens” Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 3(64): 7-12 Huỳnh Thị Thu Huệ, Bùi Mạnh Minh, Đồn Thị Bích Thảo, Nơng Văn Hải, Bùi Mạnh Cường (2015) “Thiết kế vector biểu thực vật mang gen ZmDreb2A tổng hợp nhân tạo biến nạp vào Agrobacterium tumefaciens” Tại chí khoa học Công nghệ Việt Nam, 2(9): 44-48 25 ... lý đề tài ? ?Nghiên cứu biểu gen mã hoá nhân tố phiên mã ZmDREB2A nhằm tăng cường tính chịu hạn số dịng ngơ Việt Nam? ?? thực Mục tiêu đề tài (1) Tạo dịng ngơ chuyển gen mang cấu trúc gen ZmDREB2A; ... thị phân tử; 3) Chuyển gen chịu hạn Ở Việt Nam, chuyển gen liên quan đến tính chịu hạn vào ngô tập trung nghiên cứu năm gần Tuy nhiên, nghiên cứu biểu gen chuyển gen chịu hạn cịn đề cập đến Xuất... chuyển gen việc cải thiện khả chịu hạn ngô Việt Nam 4.2 Về mặt thực tiễn (3) Việc tạo dịng ngơ chuyển gen có khả chịu hạn tốt so với dòng đối chứng mở hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen