Ứng dụng kỹ thuật di truyền nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp rapamycin của streptomyces rapamycinicus

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - LÃ THỊ HƯƠNG HUYỀN ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP RAPAMYCIN CỦA STREPTOMYCES RAPAMYCINICUS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - LÃ THỊ HƯƠNG HUYỀN ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP RAPAMYCIN CỦA STREPTOMYCES RAPAMYCINICUS Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN HỒNG MINH TS PHẠM THẾ HẢI Hà Nội – Năm 2020 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hồng Minh, Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội trực tiếp hướng dẫn em tận tình trình thực đề tài động viên, quan tâm, giúp đỡ em vượt qua khó khăn để hồn thành tốt luận văn Em xin cảm ơn tới TS Phạm Thế Hải – Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên bảo, giúp đỡ để em làm tốt cơng việc hồn thành đề tài Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo Khoa Sinh học, trường Đại Học Khoa học Tự nhiên nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn cung cấp cho em kiến thức bổ ích suốt hai năm học vừa qua giúp đỡ em nhiều việc nắm bắt kiến thức động viên em lớn mặt tinh thần Em xin cảm ơn Ban lãnh đạo, anh chị em Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội chia sẻ, giúp đỡ tạo điều kiện lớn suốt trình em thực luận văn Em xin cảm ơn TS Vittorio Venturi Th.S Iris Bertani, Trung tâm Quốc tế Kỹ thuật di truyền Công nghệ sinh học, Ý giúp đỡ em thực thí nghiệm lai Southern Blot Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình tất bạn bè, người bên động viên, giúp đỡ em suốt thời gian học tập thực luận văn Hà Nội, ngày 05 tháng 02 năm 2020 Học viên Lã Thị Hương Huyền MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Chương - TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .4 1.1 Xạ khuẩn 1.1.1 Giới thiệu chung xạ khuẩn 1.1.2 Ứng dụng xạ khuẩn .5 1.1.3 Vai trò xạ khuẩn sản xuất chất y học 1.1.4 Streptomyces rapamycinicus 1.2 Rapamycin 10 1.2.1 Tính chất cấu trúc hóa học 10 1.2.2 Vai trò rapamycin đáp ứng miễn dịch .10 1.2.3 Sinh tổng hợp rapamycin chế điều hòa 11 1.3 Kỹ thuật di truyền 13 1.3.1 Giới thiệu chung 13 1.3.2 Một số phương pháp thường sử dụng kỹ thuật di truyền 14 1.3.3 Ứng dụng 14 1.4 Tình hình nghiên cứu tăng hiệu suất tổng hợp rapamycin 15 1.4.1 Các nghiên cứu nhằm tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng xạ khuẩn .15 1.4.2 Các nghiên cứu tạo chủng xạ khuẩn đột biến làm tăng lượng rapamycin 18 Chương - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .20 2.1 Vật liệu 20 2.1.1 Chủng vi sinh vật môi trường nuôi cấy 20 2.1.2 Vector oligonucleotide 21 2.1.3 Hóa chất thiết bị 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu .22 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu chung 22 2.2.2 Phương pháp tách ADN .24 2.2.3 Phương pháp biến nạp .25 2.2.4 Phương pháp tạo dòng vector pSET152/ rapG 26 2.2.5 Phương pháp tiếp hợp 27 2.2.5 Phương pháp sàng lọc chủng xạ khuẩn chuyển gen 28 2.2.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính rapamycin 30 Chương - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .33 3.1 Tạo dòng vector pSET 152/rapG 33 3.2 Tạo chủng Streptomyces rapamycinicus chuyển gen 37 3.2.1 Sàng lọc chủng xạ khuẩn chuyển gen môi trường chọn lọc 37 3.2.2 Kiểm tra chủng xạ khuẩn chuyển gen phương pháp lai Southern Blot 38 3.3 Tối ưu hóa điều kiện sinh rapamycin 39 3.3.1 Ảnh hưởng axit shikimic đến khả sinh rapamycin 42 3.3.2 Ảnh hưởng glycerol đến khả sinh rapamycin .44 3.3.3 Ảnh hưởng hàm lượng axit shikimic đến khả sinh rapamycin 46 KẾT LUẬN .48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 56 DANH MỤC HÌNH Chương Hình 1.1 Streptomyces rapamycinicus mơi trường thạch ISP2 Hình 1.2 Cấu trúc rapamycin 10 Hình 1.3 Con đường sinh tổng hợp rapamycin 12 Chương Hình 2.1 Phương pháp tạo chủng đột biến .23 Hình 2.2 Phương pháp định lượng khả sinh rapamycin 23 Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế vector pSET152/rapG 26 Hình 2.4 Chuyển ADN biến tính lên màng 30 Chương Hình 3.1 Sản phẩm PCR gen rapG agarose 33 Hình 3.2 Các khuẩn lạc xanh-trắng mang vector pGEM/rapG .34 Hình 3.3 Sản phẩm PCR mồi M13F M13R khuẩn lạc trắng .34 Hình 3.4 Sản phẩm cắt plasmid pGEM/rapG (A) pSET152 (B) 35 Hình 3.5 (A) Ảnh chụp khuẩn lạc trắng mang vector pSET152/rapG khuẩn lạc xanh mang vector pSET 152 đóng vịng mơi trường thạch LB/apramycin/X-gal (B) Sản phẩm PCR vùng liên gen 04 khuẩn lạc trắng 36 Hình 3.6 Sản phẩm cắt plasmid pSET152/rapG 37 Hình 3.7 Khuẩn lạc chủng xạ khuẩn chuyển gen mơi trường có kháng sinh 38 Hình 3.8 ADN tổng số gel sau điện di 38 Hình 3.9 Kết lai Southern blot chủng xạ khuẩn chuyển gen 39 Hình 3.10 Đường chuẩn rapamycin 40 Hình 3.11 Vịng kháng nấm C albicans chủng xạ khuẩn WT WT/rapG môi trường nuôi cấy khác 41 Hình 3.12 Biểu đồ thể lượng rapamycin thu mơi trường gốc 41 Hình 3.13 Biểu đồ thể lượng rapamycin thu môi trường bổ sung acid shikimic .43 Hình 3.14 Biểu đồ thể lượng rapamycin thu môi trường bổ sung Glycerol .45 Hình 3.15 Biểu đồ thể lượng rapamycin thu môi trường bổ sung lượng axit shikimic khác 47 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật 20 Bảng 2.2 Trình tự oligonucleotide sử dụng nghiên cứu 21 Bảng Tỉ lệ hai pha dung môi qua cột HPLC .31 Bảng 3.1 Các giá trị dựng đường chuẩn rapamycin 40 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN : axit deoxyribonucleic DHCHC : 4,5- dihydroxycyclohex- 1- ene carboxylic acid HPLC: hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao IPTG : Isopropyl β- D- 1- thiogalactopyranoside PCR: Phản ứng khuếch đại gen X-gal : 5- bromo- 4- chloro- 3- indodyl- β- galactosidase WT: chủng xạ khuẩn Streptomyces rapamycinicus hoang dại WT/rapG: chủng xạ khuẩn Streptomyces rapamycinicus mang hai gen rapG MỞ ĐẦU Xạ khuẩn nhóm vi sinh vật có khả sinh tổng hợp nhiều chất chuyển hóa thứ cấp khác nhau, đặc biệt chất có hoạt tính sinh học chất kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, chống ung thư, ức chế miễn dịch enzyme Đến nay, có khoảng 23000 chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học tìm thấy có 10000 hoạt chất thu từ xạ khuẩn Trong đó, chất chuyển hóa thứ cấp từ lồi xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces chiếm 68%, cịn lại thuộc nhóm xạ khuẩn hiếmnon-Streptomyces Streptomyces rapamycinicus lồi xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces, trước định danh Streptomyces hygroscopicus, phân lập từ mẫu đất đảo Phục Sinh, Chile Đây lồi xạ khuẩn có khả sinh rapamycin – hợp chất có khả kháng nấm ức chế miễn dịch mạnh Rapamycin 31 macrolide tự nhiên có chứa vịng lacton lớn phân tử, chứng minh có hoạt tính chống nấm, chống u, bảo vệ thần kinh đặc biệt hữu ích ngăn chặn việc thải ghép thận [17] Rapamycin ban đầu nghiên cứu hoạt chất chống nấm chống u Tuy nhiên, đặc tính giảm bạch cầu lymphơ làm cho rapamycin có vai trò ức chế miễn dịch Khả ức chế miễn dịch rapamycin ứng dụng để sản xuất thuốc chống thải ghép tên thương mại Sirolimus thường sử dụng điều trị cho bệnh nhân ghép tạng Đây số kháng sinh Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA, Food and Drug Administration) chấp nhận sử dụng (tháng 9/1999) bệnh viện cho trường hợp ghép tạng Rapamycin có nhiều ứng dụng y khoa hiệu sản sinh rapamycin chủng hoang dại cịn nhiều hạn chế Do đó, nghiên cứu làm tăng khả sinh rapamycin chủng có tính thực tiễn, ứng dụng cao tương lai áp dụng cho sản xuất rapamycin lượng lớn cơng nghiệp Với mục tiêu đó, thực đề tài “Ứng dụng kỹ thuật di truyền nhằm tăng khả sinh tổng hợp rapamycin Streptomyces rapamycinicus” Trong nghiên cứu này, sử dụng kỹ thuật di truyền để chèn thêm phiên gen điều hòa dương rapG vào hệ gen chủng Streptomyces rapamycinicus Khi nuôi hai chủng xạ khuẩn WT WT/rapG môi trường MD1, lượng rapamycin thu chủng WT (79,2 mg/L) tương đương với lượng rapamycin chủng WT/rapG (75,1 mg/L) Trong môi trường MD2, chủng WT/rapG cho lượng rapamycin thu (27,4 mg/L) cao gấp lần so với chủng WT (5 mg/L) môi trường MD3 khác biệt lượng rapamycin thu hai chủng Trong ba môi trường MD1, MD2 MD3, nguồn cung cấp lượng ban đầu loại đường Đối với môi trường MD1 sử dụng dextrin, lượng rapamycin thu cao so với MD2 MD3 sử dụng glucose Dextrin chứng minh yếu tố tích cực tới khả sinh rapamycin tốt so với glucose [26] Hàm lượng glucose môi trường MD2 (20 g/L) cao MD3 (6 g/L) lượng rapamycin thu môi trường MD2 cao MD3 Kết chứng tỏ nguồn cung cấp lượng khác có ảnh hưởng tới lượng sản phẩm rapamycin thu Do đó, giả thuyết chúng tơi đặt trình sinh tổng hợp rapamycin gồm hai giai đoạn: giai đoạn đầu, tế bào xạ khuẩn cần nguồn lượng để tổng hợp chất sơ cấp, chất cần thiết cho trình sinh trưởng phát triển; giai đoạn hai giai đoạn sinh tổng hợp rapamycin, yếu tố ảnh hưởng đến lượng rapamycin ảnh hưởng tới giai đoạn hai 3.3.1 Ảnh hưởng axit shikimic đến khả sinh rapamycin Trong thí nghiệm này, chúng tơi bổ sung thêm 10 g/L bột hồi tương đương với 0,8 g/L axit shikimic vào môi trường nuôi cấy MD1, MD2, MD3 Lượng rapamycin thu môi trường thể qua hình 3.13 42 Hình 3.13 Biểu đồ thể lượng rapamycin thu môi trường bổ sung acid shikimic Kết cho thấy axit shikimic có ảnh hưởng tích cực tới q trình sinh tổng hợp rapamycin, cụ thể lượng rapamycin thu từ chủng xạ khuẩn nuôi môi trường bổ sung axit shikimic cao so với môi trường không bổ sung Khi bổ sung axit shikimic vào môi trường gốc MD1, lượng rapamycin thu từ chủng WT/rapG (148,4 mg/L) tăng hai lần so với nuôi môi trường không bổ sung (75,1 mg/L), chủng WT cho lượng rapamycin thu (82,1 mg/L) tương đương với môi trường gốc (72,9 mg/L) khơng có chênh lệch lớn Trong môi trường MD2 bổ sung axit shikimic, lượng rapamycin thu từ chủng WT 35,1 mg/L WT/rapG 89,1 mg/L cao so với môi trường MD2 từ 1-2 lần Trong môi trường MD3 thêm axit shikimic, lượng rapamycin tăng nhẹ (WT – 7,6 mg/L WT/rapG – 8,1 mg/L), không cao nhiều so với môi trường MD3 Lượng rapamycin thu từ chủng xạ khuẩn WT/rapG môi trường MD1 cao so với lượng rapamycin thu nghiên cứu Fang A.và cộng (87 g/L) [14] Fang bổ sung thêm 9,9 g/L acid shikimic vào môi trường nuôi điều kiện tối ưu để thu lượng rapamycin lớn từ chủng xạ khuẩn đột biến ngẫu nhiên S hygroscopicus C9 [14] Trong kết thí nghiệm chúng tôi, bổ sung 43 0,8 g/L axit shikimic vào môi trường nuôi cấy chủng xạ khuẩn chuyển gen WT/rapG cho lượng rapamycin thu 148,4 mg/L, cao hẳn so với thí nghiệm Fang [14] Từ báo trước đây, axit shikimic chứng minh yếu tố tham gia vào trình tạo tiền chất rapamycin [42] Do đó, bổ sung dịch chiết bột đại hồi chứa axit shikimic vào môi trường giúp tăng cường khả tổng hợp rapamycin hai chủng WT WT/rapG so với môi trường gốc Chủng xạ khuẩn WT/rapG chủng tăng cường biểu gen điều hịa dương rapG nên q trình tổng hợp rapamycin chủng WT/rapG mạnh chủng WT, lượng rapamycin thu từ chủng WT/rapG cao so với WT 3.3.2 Ảnh hưởng glycerol đến khả sinh rapamycin Để đánh giá ảnh hưởng glycerol tới khả sinh rapamycin chủng xạ khuẩn, 15 g/L glycerol bổ sung vào môi trường gốc MD1, MD2, MD3 Kết (Hình 3.12) cho thấy: ba môi trường bổ sung glycerol, chủng WT/rapG cho lượng rapamycin cao so với chủng WT Trong môi trường MD1 thêm glycerol 15g/L, chủng WT/rapG cho lượng rapamycin thu cao (211,36 mg/L), gấp 6.5 lần chủng WT (32,7 mg/L) Trong môi trường MD2 thêm glycerol, lượng rapamycin từ chủng xạ khuẩn WT/rapG 11,29 mg/L cao gấp lần chủng WT (2,2 mg/L) Đối với môi trường MD3 thêm glycerol, lượng rapamycin từ chủng xạ khuẩn WT/rapG 44,9 mg/L cao 1,3 lần so với chủng WT (34,1 mg/L) Trong nghiên cứu Kim cộng (2014), bổ sung 36,2 g/L glycerol vào môi trường lên men chủng xạ khuẩn đột biến UV thu lượng rapamycin lớn (130,4 mg/L) [25] Do đó, chúng tơi cho glycerol có tác động tích cực đến chủng xạ khuẩn môi trường MD3, làm lượng rapamycin tăng lần so với môi trường không bổ sung Tuy nhiên, glycerol tác động tiêu cực môi trường MD2 làm lượng rapamycin thu thấp so với môi trường gốc Trong môi trường MD1 bổ sung glycerol, lượng rapamycin từ chủng xạ khuẩn WT/rapG cao gấp 2,8 lần môi trường gốc, chủng WT lượng 44 rapamycin giảm so với môi trường gốc Ảnh hưởng khác glycerol kết hợp glycerol với nguồn cacbon khác môi trường glucose, dextrin Các nghiên cứu trước kết hợp nguồn Cacbon khác glucose/glycerol, fructose/ mannose ảnh hưởng tới lượng rapamycin thu [7][26] Hình 3.14 Biểu đồ thể lượng rapamycin thu môi trường bổ sung Glycerol Glycerol nguồn cung cấp nguyên liệu cho trình lên men chứng minh có ảnh hưởng tích cực tới lượng rapamycin thu [25] Chúng cho glycerol coi chất xúc tác giai đoạn đầu, có vai trị cung cấp đầy đủ lượng cho trình sinh trưởng sinh tổng hợp chất sơ cấp, tạo tiền chất rapamycin Trong giai đoạn hai, ảnh hưởng glycerol thể gen rapG đóng vai trị hỗ trợ xúc tác trình sinh rapamycin chủ yếu Trong nghiên cứu Kuscer E (2007), chủng xạ khuẩn tăng cường biểu gen rapG cho lượng rapamycin cao gấp 1,2 lần so với chủng hoang dại xóa gen rapG lượng rapamycin thu giảm tới lần so với chủng hoang dại [29] Thí nghiệm cho thấy gen rapG có vai trị tích cực q trình sinh tổng hợp rapamycin Do vậy, chủng xạ khuẩn WT/rapG tăng cường biểu gen rapG 45 nên q trình chuyển hóa giai đoạn hai đẩy mạnh so với chủng WT, lượng rapamycin thu từ chủng WT/rapG cao so với chủng WT Lượng rapamycin thu từ chủng WT/rapG môi trường MD1 bổ sung glycerol thu cao gấp 6,5 lần so với chủng WT cao 1,5 lần so với nuôi chủng WT/rapG môi trường bổ sung axit shikimic 3.3.3 Ảnh hưởng hàm lượng axit shikimic đến khả sinh rapamycin Glycerol axit shikimic có ảnh hưởng tích cực đến khả sinh rapamycin Khi bổ sung glycerol môi trường, lượng rapamycin thu cao so với bổ sung axit shikimic glycerol tác động đến giai đoạn đầu tổng hợp chất sơ cấp chất thứ cấp tổng hợp sau Do đó, chúng tơi nhận định glycerol thành phần thiếu môi trường để thu lượng rapamycin lớn, axit shikimic thành phần tác động giai đoạn sau giá thành rẻ nhiều so với glycerol Do đó, lựa chọn thay đổi lượng axit shikimic môi trường MD1 bổ sung glycerol 15 g/L từ 5,0-10,0-15,0 g/L bột hồi chứa lượng axit shikimic tương ứng 0,4 – 0,8 – 1,2 g/L để đánh giá ảnh hưởng hàm lượng acid shikimic tới khả sinh rapamycin [18] Kết cho thấy, chủng xạ khuẩn WT/rapG môi trường MD1 bổ sung glycerol 15 g/L axit shikimic với hàm lượng khác thu lượng rapamycin cực đại (± 200 mg/L) Kết gen điều hòa dương rapG nhân tố giúp tăng cường chuyển hóa chu trình sinh tổng hợp rapamycin đạt đến độ bão hịa Do đó, có mặt axit shikimic giúp tăng lượng rapamycin chủng xạ khuẩn WT/rapG Đối với chủng xạ khuẩn WT, có mặt glycerol axit shikimic môi trường làm tăng lượng rapamycin thu so với môi trường gốc, môi trường bổ sung glycerol axit shikimic Tuy nhiên thay đổi lượng axit shikimic môi trường không làm ảnh hưởng nhiều tới lượng rapamycin thu 46 Hình 3.15 Biểu đồ thể lượng rapamycin thu môi trường bổ sung lượng axit shikimic khác Cuối cùng, kết luận rằng: hàm lượng axit shikimic mơi trường ni có ảnh hưởng tích cực đến q trình sinh tổng hợp rapamycin chủng xạ khuẩn hoang dại không tác động đến chủng xạ khuẩn chuyển gen WT/rapG Glycerol có tác động tích cực đến hai chủng xạ khuẩn Trong mơi trường MD1 khơng có axit shikimic glycerol, chủng xạ khuẩn cho lượng rapamycin thấp hẳn so với mơi trường có bổ sung Với lượng glycerol 15 g/L, bột hồi 15 g/L (tương đương 1,2 g/L axit shikimic) môi trường MD1, chủng xạ khuẩn WT/rapG cho lượng rapamycin cực đại Do vậy, kết luận môi trường tối ưu cho chủng xạ khuẩn WT/rapG 47 KẾT LUẬN Đã tạo chủng xạ khuẩn chuyển gen Streptomyces rapamycinicus WT/rapG mang hai gen điều hịa dương rapG, có khả sinh tổng hợp rapamycin cao gấp 6,5 lần chủng hoang dại môi trường MD1 bổ sung glycerol 15 g/L Môi trường tối ưu cho sinh tổng hợp rapamycin hai chủng xạ khuẩn Streptomyces rapamycinicus WT/rapG WT mơi trường MD1 có bổ sung 15 g/L glycerol 15 g/L bột hoa hồi (tương đương 1,2 g/L axit shikimic) 48 KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu sản xuất rapamycin sử dụng chủng WT/rapG môi trường tối ưu MD1 bổ sung glycerol axit shikimic quy mơ cơng nghiệp Có thể áp dụng phương pháp chuyển gen nghiên cứu với đối tượng chủng xạ khuẩn khác gen điều hịa q trình sinh tổng hợp chất khác 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ballou L M., Lin R Z (2008), "Rapamycin and mTOR kinase inhibitors", Journal of Chemistry Biology, 1, pp 27-36 Basavaraj M V., Shivayageeswar E N (2011), "Production and optimisation of tetracycline by various strains of Streptomyces under solid state fermentation using pineapple peel as a novel substrate", Recent Research in Science and Technology, 3(2), pp 01-08 Bérdy J (2005), "Bioactive microbial metabolites: a personal view", The Journal of Antibiotics, 58, pp 1-26 Bhatti A A., Haq S., Bhat R A (2017), "Actinomycetes benefaction role in soil and plant health", Microbial Pathogenesis, 111, pp 458-467 Blagosklonny M (2019), "Fasting and rapamycin: diabetes versus benevolent glucose intolerance", Cell Death and Disease, 10(607), pp 1-10 Chen M., Chang S (2018), "Ahmpatinin iBu, a new HIV-1 protease inhibitor from Streptomyces sp CPCC 202950", Royal Society of Chemistry, 8(10), pp 5138-5144 Chen X S., Ren X D (2012), "Culture medium containing glucose and glycerol as a mixed carbon source improves epsilon-poly-L-lysine production by Streptomyces sp M-Z18", Bioprocess and Biosystems Engineering, 35(3), pp 469-475 Chen X., Wei P (2009), "Generation of high-yield rapamycin-producing strains through protoplasts-related techniques", Applied Microbiology and Biotechnology, 83(3), pp 507-12 Chen Y., Liu R (2017), "Enduspeptides A-F, six new cyclic depsipeptides from a coal mine derived Streptomyces sp.", Tetrahedron, 73(5), pp 527-531 10 Cheng Y R., Hauck L., Demain A L (1995), "Phosphate, ammonium, magnesium and iron nutrion of Streptomyces hygroscopicus with respect to rapamycin biosynthesis", Journal of Industrial Microbiology, 14(5), pp 424427 50 11 Dutta S., Basak B (2014), "Kinetics of rapamycin production by Streptomyces hygroscopicus MTCC 4003", Biotech, 4(5), pp 523-531 12 Dutta S., Basak, B (2017), "Approaches towards the enhanced production of rapamycin by Streptomyces hygroscopicus MTCC 4003 through mutagenesis and optimization of process parameters by Taguchi orthogonal array methodology", World Journal of Microbiology Biotechnology, 33(5), pp 113 13 Emerson R P., Silva I R (2012), "Antibiotics produced by Streptomyces", The Brazilian Journal of Infectious diseases, 16(5), pp 466-471 14 Fang A., Demain A (1995), "Exogenous shikimic acid stimulates rapamycin biosynthesis in Streptomyces hygroscopicus ", Folia Microbiologica, 40(6), pp 607-610 15 Geng H., Liu H., Liu J (2017), "Insights into the metabolic mechanism of rapamycin overproduction in the shikimate-resistant Streptomyces hygroscopicus strain UV-II using comparative metabolomics", World Journal of Microbiology and Biotechnology, 33(6), pp 1-13 16 Gregory M A., Hong H (2006), "Rapamycin biosynthesis: Elucidation of gene product function", Organic and Biomolecular Chemistry, 4(19), pp 3565-3568 17 Harrison D E (2009), "Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice", Nature, 460(7253), pp 392-395 18 Hiroki O., Naota T (2009), "Rapid separation of shikimic acid from Chinese star anise (Illicium verum Hook f.) with hot water extraction", Separation and Purification Technology, 69(1), pp 102-108 19 Hozzein W N., Li W J (2004), "Nocardiopsis alkaliphila sp nov., a novel alkaliphilic actinomycete isolated from desert soil in Egypt", International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54(1), pp 247-252 51 20 J Gatto G (2006), "Biosynthesis of pipecolic acid by RapL, a lysine cyclodeaminase encoded in the rapamycin gene cluster", Journal of the American Chemical Society, 128(11), pp 3838-3847 21 Jakubiec K., Rajnisz A (2018), "Secondary metabolites of Actinomycetes and their antibacterial, antifungal and antiviral properties", Polish Journal of Microbiology, 67(3), pp 259-272 22 Jung W S., Yoo Y J (2011), "A combined approach of classical mutagenesis and rational metabolic engineering improves rapamycin biosynthesis and provides insights into methylmalonyl-CoA precursor supply pathway in Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253", Applied Microbiology and Biotechnology, 91(5), pp 1389-1397 23 Kar A (2008), "Pharmaceutical Microbiology", New Age International, pp 89 – 101 24 Kim Wan S., Sean D (2003), "Nutritional studies on the growth of the rapamycin-producing Streptomyces hygroscopicus", Journal of Microbiology and Biotechnology, 13(4), pp 560-563 25 Kim Y H., Park B S (2014), "Production of rapamycin in Streptomyces hygroscopicus from glycerol-based media optimized by systemic methodology", Journal of Microbiology and Biotechnology, 24(10), pp 13191326 26 Kojima I., Cheng Y (1995), "Carbon source nutrition of rapamycin biosynthesis in Streptomyces hygroscopicus", Journal of Industrial Microbiology, 14(6), pp 436-439 27 Kramer M., Bongaerts J (2003), "Metabolic engineering for microbial production of shikimic acid", Metabolic Engineering, 5(4), pp 277-283 28 Kurniawan Y N., Kitani, S (2016), "Regulation of production of the blue pigment indigoidine by the pseudo gamma-butyrolactone receptor FarR2 in Streptomyces lavendulae FRI-5", Journal of Bioscience and Bioengineering, 121(4), pp 372-379 52 29 Kuscer E., Coates N (2007), "Roles of rapH and rapG in positive regulation of rapamycin biosynthesis in Streptomyces hygroscopicus", Journal of Bacteriology, 189(13), pp 4756-4763 30 Lake E., K Gunter A B., Su M (1998), "Mutational biosynthesis of novel rapamycins by a strain of Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491 disrupted in rapL encoding a putative lysine cyclodeaminase", Journal of Bacteriology, 180(4), pp 809-814 31 Li J K., Blenis J (2014), "Rapamycin: one drug, many effects", Cell Metabolism, 19(3), pp 373-379 32 Mansour F A., Aldesuquy H S (1994), "Studies on plant growth regulators and enzyme production by some bacteria", Quatar University Science Journal, 14(2), pp 281-288 33 Mariya L., Giulia P (2017), "Penicillin's discovery and antibiotic resistance: Lessons for the future", Yale Journal of Biology and Medicine, 90, pp 135145 34 Mason M G., Ball A S (2001), "Extracellular heme peroxidases in actinomycetes: a case of mistaken identity", Applied and Environmental Microbiology, 67(10), pp 4512-4519 35 Mitra P., Chakrabartty P (2005), "An extracellular protease with depilation activity from Streptomyces nogalator", Journal of Scientific & Industrial Research, 64, pp 978-983 36 MS Lee, Kojima I., Demain A (1997), "Effect of nitrogen source on biosynthesis of rapamycin by Streptomyces hygroscopicus", Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 19, pp 83-86 37 Mukhta S., Zaheer A (2017), "Actinomycetes: A source of industrially important enzymes", Journal of Proteomics & Bioinformatics, 10(12), pp 316-319 38 Nicholl D S T (2008), An Introduction to Genetic Engineering, Cambridge University Press, UK 53 39 Oh D., Poulsen M., Currie C., Clardy J (2011), "Sceliphrolactam, a polyene macrocyclic lactam from a wasp-associated Streptomyces sp.", Organic Letters, 13(4), pp 752-755 40 Olano C., et al (2008), "Improving production of bioactive secondary metabolites in actinomycetes by metabolic engineering", Metabolic Engineering, 10(5), pp 281-292 41 Paiva N L., Demain A L., Roberts M F (1991), "Incorporation of acetate, propionate and methionine into rapamycin by Streptomyces hygroscopicus", Journal of Natural Products, 54, pp 167-177 42 Park S R., et al (2010), "Biosynthesis of rapamycin and its regulation: past achievements and recent progress", Journal of Antibiotic (Tokyo), 63(8), pp 434-441 43 Patrick C., Susan L (2001), "Amphotericin biosynthesis in Streptomyces nodosus : deductions from analysis of polyketide synthase and late genes", Chemistry and Biology, 8(7), pp 713-723 44 Raja A., Prabakarana P (2011), "Actinomycetes and drug - an overview", American Journal of Drug Discovery and Development, 1(2), pp 75-84 45 Raveh A., Delekta, P C (2013), "Discovery of potent broad spectrum antivirals derived from marine actinobacteria", PLoS One, 8(12) 46 Schwecke T., Aparicio J F., Molnar I (1995), "The biosynthetic gene cluster for the polyketide immunosuppressant rapamycin", Biochemistry, 92(1), pp 7839-7843 47 Selman A., W Albert S (1945), "Streptomycin - origin, nature and properties", Journal of the American Pharmaceutical Association, 34(11), pp 273-291 48 Umesh L., Nishtha K S., Archana R T (2014), "Optimization of nutrient components for rapamycin production by Streptomycetes hygroscopicus under submerged fermentation using Plackett Burman design carried by response 54 surface methodology", International Journal Of Scientific Research And Education, 2(8), pp 1619-1631 49 Xiang Z., Jin L (2013), "Precursor engineering and cell physiological regulation for high level rapamycin production by Streptomyces hygroscopicus", Annals of Microbiology, 63(4), pp 1371-1378 50 Yang J., Yang Z., Yin Y (2016), "Three novel polyene macrolides isolated from cultures of Streptomyces lavenduligriseus", The Journal of Antibiotics, 69, pp 62-65 51 Yen H., Chen L (2013), "The enhancement of rapamycin production using Streptomyces hygroscopicus through a simple pH-shifted control", Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers, 44(5), pp 743-747 52 Young J Y., Jae-yeon H (2015), "Characterization of negative regulatory genes for the biosynthesis of rapamycin in Streptomyces rapamycinicus and its application for improved production", Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 42(1), pp125-135 53 Zhao S., et al (2013), "Comparative metabolic profiling-based improvement of rapamycin production by Streptomyces hygroscopicus", Applied Microbiology and Biotechnology, 97(12), pp 5329-5341 54 dsmz.de 55 PHỤ LỤC Trình tự gen rapG gắn với plasmid pSET152, gen rapG đoạn trình tự ACCAACGGCGCTGGA đến đoạn trình tự CTGACCGACAGCTGA TGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGG CGCCATTGGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGC GGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAG GCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAA ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGGGCTGCAGGTCGACTCTAGAACCAACG GCGCTGGAGCGGAGGCCGACGGATCGCGCGGGGCGTTCTCCGTGGACTC CACCGTCCCGGGCGCGGCACCACAAGGATTCTTCCAGGCCTTCCAGCGC GGGTGGGACGCGGAGCTCGGCGACGGCTTGCCGCTGCGGAGCTTCAACC GGGATGTGACCGGTGACTTCCGGGTCAGGAGCCGCGCCGCCAAGGTCCG CGACCTGGCGTTCACCGATCTCCACAGCATGTCGGCCATCCGGACCGCA CACGCGCTGGGCGGTGTGGAGGACCGGGTACGGATGTACGTCGTGAAA CGCGGCGCATGGACGTTGGCAGGTTCGCGCGATCGGGACCGGCACACC GTGGCGGCCGGGCAGTTCCTCCTCCGGCACGTCGGGCAGCCGTGGCGCT TCGAGGCGGCGCCGCACACGACGGTGAAGATCCTTCTGCTGCCTCCCGG GCCGCTCACCCCACTGCTGGGAAACCGGGCCGTCACCGGGCCCGCGGAT TCGGCCGAGGTACGCCTGCTGGTGGCCCACGCGAATATGGTGTACGAGA CCATGACCGGCCTGGGCCCGGCCGGTGTGCAAGCCGCCCACAGCACCCT GCTCGAACTGGCCCAGTCGGTGGCGAGGCGTCGGTTCGACGATGTGGAG CCCCGGCTGGCGCCCGCGCTCGCCGGGGCCGCGAAGGACCTCGCGGAC AGCCACCTCACCGACCCCGAGCTCTCCCCCACGATGCTGGCGCGTGAAC TCAACGTCTCCTTACGCACCTTGCAGCGGGCGTTCACCGTGGCGGGAGA GTCGTTGATCGCCTACATCCGTCACCGGCGGCTGGAAGAGGCCCGCCGC GCTCTCATCGCCTCGGCCGGCAGGCTGAGCGTCTCGGAACTCGCCGCCC ACTGGCAGTTCGCCGACAGCAGCCACTTCATCCGGGTCTTCAAGAAGAC CTACGGCCAGACGCCCACCGAGTACGCCCGCTCAACCGGGCTGACCGAC AGCTGACCTCTAGAGGATCCGCGGCCGCGCGCGATATCGAATCGTAA Sơ đồ vector pSET 152 56 ... đó, chúng tơi thực đề tài ? ?Ứng dụng kỹ thuật di truyền nhằm tăng khả sinh tổng hợp rapamycin Streptomyces rapamycinicus? ?? Trong nghiên cứu này, sử dụng kỹ thuật di truyền để chèn thêm phiên gen... NHIÊN - LÃ THỊ HƯƠNG HUYỀN ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP RAPAMYCIN CỦA STREPTOMYCES RAPAMYCINICUS Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN... pháp thường sử dụng kỹ thuật di truyền Một ứng dụng kỹ thuật di truyền vi sinh vật cải biến tạo chủng Đây hướng quan trọng giới để làm tăng khả sinh chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính sinh học tạo