NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÂN TAY SẮC KÝ LỚP MỎNG CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI DÂY THÌA CANH (Gymnema R.Br)

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học năm 2020, đề tài: NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÂN TAY SẮC KÝ LỚP MỎNG CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI DÂY THÌA CANH (Gymnema R.Br) - Tóm tắt nội dung chính: Nghiên cứu xây dựng bộ dữ liệu vân tay sắc ký lớp mỏng từ một số mẫu thuộc 04 loài Dây thìa canh thu được tại Việt Nam (Gymnema sylvestre, Gymnema latifolium, Gymnema inodorum và Gymnema yunnanense), từ đó xây dựng cây phân loại hóa học bằng cách mã hóa sự xuất hiện và màu sắc các vết trên sắc ký đồ giúp đánh giá sự gần gũi về hóa học giữa các loài nghiên cứu. Từ lượng dữ liệu xây dựng được bước đầu nhận biết một số mẫu Dây thìa canh thu được trên thị trường khi phân tích trên cùng điều kiện sắc ký.

Trang 1

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VIỆT CƯỜNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÂN TAY SẮC KÝ LỚP MỎNG CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI DÂY THÌA CANH

(Gymnema R.Br)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2020

Trang 2

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VIỆT CƯỜNG

Mã sinh viên: 1501069

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÂN TAY SẮC KÝ LỚP MỎNG CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI DÂY THÌA CANH

(Gymnema R.Br)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

ThS Phạm Thị Linh Giang Nơi thực hiện:

Bộ môn Thực vật

Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2020

Trang 3

Lời cảm ơn

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân

thành tới ThS Phạm Thị Linh Giang, người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ

bảo và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này Cô vừa là người thầy, vừa là người chị đi trước đã luôn động viên

và cho tôi những lời khuyên chân thành trong công tác nghiên cứu khoa học lẫn trong cuộc sống, giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nhất có thể

Bên cạnh đó, trong quá trình thực hiện khóa luận tôi còn nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo của nhiều thầy cô, anh chị em khác Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn tới:

PGS.TS Trần Văn Ơn, người thầy đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi thu

mẫu tại xã Yên Ninh, huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên và cho tôi những lời khuyên quý báu trong nghiên cứu; các thầy cô giảng viên tại Bộ môn Thực vật:

TS Hoàng Quỳnh Hoa, TS Phạm Hà Thanh Tùng, ThS Nghiêm Đức Trọng, ThS Lê Thiên Kim cùng các chị kỹ thuật viên đã luôn giúp đỡ, chỉ bảo nhiệt tình

cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận này

Các em sinh viên nghiên cứu khoa học: Vương Thị Ngân Hà (A8K73), Nguyễn Thị Ngọc Ánh (A3K72), Đinh Thùy Dương (A1K72) cùng các bạn thực

hiện khóa luận tốt nghiệp tại Bộ môn Thực vật, những người đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong thời gian nghiên cứu

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô và bạn bè tại Trường Đại học Dược Hà Nội, những người tôi luôn học hỏi trong suốt 5 năm vừa qua

Cuối cùng, tôi gửi lời tri ân đến gia đình tôi– nơi là chỗ dựa và nguồn động lực mỗi khi tôi khó khăn

Hà Nội, ngày 22 tháng 6 năm 2020

Nguyễn Việt Cường

Trang 4

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Chi Gymnema R Br 2

1.1.1 Vị trí phân loại thực vật chi Gymnema R.Br 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố và các loài trong chi trên thế giới 2

1.1.3 Tác dụng sinh học của một số loài thuộc thuộc chi Gymnema R.Br 3

1.2 Chi Gymnema R.Br ở Việt Nam 3

1.2.1 Loài Gymnema sylvestre (Retz) R Br Ex Schult 4

1.2.2 Loài Gymnema latifolium Wall Ex Wight 6

1.2.3 Loài Gymnema inodorum (Lour.) Decne 8

1.2.4 Loài Gymnema yunnanense Tsiang 9

1.3 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao 10

1.3.1 Sắc ký lớp mỏng 10

1.3.2 Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao 10

1.4 Vân tay sắc ký thực vật 11

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 14

2.1.1 Mẫu nghiên cứu 14

2.1.2 Trang thiết bị nghiên cứu 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.2.1 Khảo sát một số thông số của quy trình phân tích vân tay sắc ký các mẫu nghiên cứu 16

Trang 5

2.2.2 Xây dựng vân tay hóa học của một số loài thuộc chi Gymnema R.Br 16

2.2.3 Xây dựng cây phân loại dựa trên thành phần hoá học (sắc ký đồ) của các mẫu nghiên cứu 16

2.2.4 Ứng dụng phân tích sắc ký đồ của một số mẫu Dây thìa canh thu được trên thị trường 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Chuẩn bị mẫu phân tích 17

2.3.2 Lựa chọn điều kiện triển khai sắc ký 19

2.3.3 Tiến hành phân tích vân tay sắc ký các dịch chiết một số loài trong chi Gymnema R.Br theo quy trình đề xuất 20

2.4 Phương pháp xử lý kết quả 20

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 22

3.1 Kết quả khảo sát một số thông số của quy trình phân tích vân tay sắc ký các mẫu nghiên cứu 22

3.1.1 Với dịch chiết toàn phần 22

3.1.2 Với dịch chiết sau thủy phân 22

3.2 Kết quả xây dựng vân tay hóa học một số loài thuộc chi Gymnema R.Br 23

3.2.1 Với dịch chiết toàn phần 23

3.2.2 Với dịch chiết sau thủy phân 27

3.3 Kết quả xây dựng cây phân loại dựa trên kết quả sắc ký lớp mỏng của các mẫu Gymnema nghiên cứu 31

3.4 Kết quả phân tích sắc ký đồ của một số mẫu Dây thìa canh thu được trên thị trường 34

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 37

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Trang 6

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

H2SO4 Acid sulfuric

HPTLC High performance thin-layer chromatography – Sắc ký lớp

mỏng hiệu năng cao ITS Internal Transcribed Spacer

G inodorum Gymnema inodorum (Lour.) Decne

G latifolium Gymnema latifolium Wall ex Wight

G reticulatum Gymnema reticulatum (Moon) Alst

G sylvestre Gymnema sylvestre (Retz) R Br Ex Schult

G yunnanense Gymnema yunnanense Tsiang

Rf Ratio frequency - Hệ số di chuyển

TLC Thin-layer chromatography – Sắc ký lớp mỏng

UPGMA Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Averages

UV Ultra violet – Ánh sáng tử ngoại

UV 366-TT Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 366nm sau khi phun thuốc

thử VIS-TT Quan sát dưới ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử

Trang 7

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số tác dụng sinh học đã công bố của các loài thuộc chi Gymnema R.Br.

3

Bảng 1.2 Khóa phân loại các loài của chi Gymnema ở Việt Nam [2] 4

Bảng 1.3 Tổng hợp sự khác biệt về cấu trúc khung chất chính của các loài trong chi

Gymnema R.Br 13

Bảng 2.1 Danh mục và ký hiệu các mẫu trong nghiên cứu (i và ii)……….14

Bảng 3.1 Sự xuất hiện các vết trên sắc ký đồ dịch chiết toàn phần mẫu nghiên cứu nhóm

1 khi quan sát ở bản mỏng sau phun thuốc thử……… 26 Bảng 3.2 Tổng hợp Rf và màu sắc các vết trên sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân các

mẫu thuộc loài G sylvestre quan sát ở VIS-TT hoặc UV 366-TT 28

Bảng 3.3 Tổng hợp Rf và màu sắc các vết trên sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân các

mẫu thuộc loài G latifolium quan sát ở VIS-TT hoặc UV 366-TT 29

Bảng 3.4 Tổng hợp Rf và màu sắc các vết trên sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân các

mẫu thuộc loài G yunnanense và G inodorum quan sát ở VIS-TT hoặc UV 366-TT

31 Bảng 3.5 Bảng hệ số tương đồng cặp đôi giữa các mẫu nghiên cứu, sử dụng chỉ số Nei&Li 33

Trang 8

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Khung cấu trúc phần aglycon của các acid gymnemic phân lập được từ

Gymnema sylvestre (Retz) R Br Ex Schult [52] 5

Hình 1.2 Khung cấu trúc phần aglycon của các acid dạng C-4 gem-dimethylat olean phân lập được từ Gymnema sylvestre (Retz) R Br Ex Schult nguồn gốc Việt Nam [37] 6

Hình 1.3 Khung cấu trúc phần aglycon của các 3β-hydroxy oleaan triterpenoid phân lập được từ Gymnema latifolium Wall Ex Wight [38] 7

Hình 1.4 Khung cấu trúc của một số chất phân lập được từ loài Gymnema inodorum (Lour.) Decne [44] 8

Hình 1.5 Khung cấu trúc chung của các aglycon C21 phân lập được từ Gymnema yunnanense Tsiang [28], [62] 9

Hình 2.1 Quy trình chiết - thủy phân các mẫu nghiên cứu……….…18

Hình 3.1 Sắc ký đồ khai triển dịch chiết toàn phần của các mẫu Gymnema nhóm 1……… 24

Hình 3.2 Kết quả chồng phổ sắc ký dịch chiết toàn phần tại VIS-TT các mẫu thuộc nhóm 1 25

Hình 3.3 Sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân của các mẫu Gymnema nhóm 1 30

Hình 3.4 Cây phân loại dựa trên phân tích UPGMA hệ số tương đồng giữa sắc ký đồ của các mẫu 33

Hình 3.5 Kết quả chồng phổ sắc ký đồ các mẫu GX2, GX3 và sắc ký đồ GS1 34

Hình 3.6 Kết quả chồng phổ sắc ký đồ mẫu GX4 và sắc ký đồ GI 35

Hình 3.7 Kết quả chồng phổ sắc ký đồ mẫu GX1 và sắc ký đồ GS1, GL1 36

Trang 9

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong nền y học cổ truyền Ấn Độ Ayurveda, Dây thìa canh (Gymnema sylvestre

(Retz) R Br Ex Schult) đã được sử dụng từ hơn 2000 năm nay để điều trị đái tháo đường [56], [61] Dựa trên kinh nghiệm này, hàng loạt các nghiên cứu đã được tiến hành

để chứng minh cơ chế tác dụng hạ đường huyết của cây và xác định các acid gymnemic

là nhóm hoạt chất chính liên quan đến tác dụng này [49], [53] Dựa trên nguyên lý là các loài cùng bậc taxon thực vật thường có các thành phần hóa học tương tự nhau do đó

có xu hướng có tác dụng sinh học giống nhau [3], một số nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh được tác dụng hạ đường huyết tương tự trên các loài cùng chi như:

Gymnema montanum Hook.f., Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema yunnanense Tsiang,…[18], [40], [46], [47], [58]

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết mới được thực hiện

trên chủ yếu 2 loài là Gymnema sylvestre (Retz) R Br Ex Schult và Gymnema latifolium

Wall Ex Wight [12], [16] Bên cạnh một số sản phẩm thực phẩm chức năng như Diabetna (Nam Dược), DK-betics (DK-Pharma),…còn rất nhiều trà thảo dược – dược liệu khô của dây thìa canh được bán rộng rãi cùng một số sản phẩm có tên gọi “Dây thìa canh” được sử dụng nhưng không thuộc hai loài đã nghiên cứu

Vì vậy, việc nghiên cứu sự đa dạng vân tay sắc ký TLC của một số loài thuộc chi Dây thìa canh giúp bước đầu phân biệt nhanh về hóa học, làm cơ sở cho việc kiểm

nghiệm và sử dụng đúng các loài trong chi Gymnema R.Br.; đề tài “Nghiên cứu xây dựng vân tay sắc ký lớp mỏng của một số loài thuộc chi dây thìa canh - Gymnema

R.Br” được thực hiện với các mục tiêu sau:

- Xây dựng dấu vân tay sắc ký của một số loài thuộc chi Gymnema R.Br bằng

phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao từ đó xây dựng cây phân loại dựa trên thành phần hóa học (sắc ký đồ) của các mẫu nghiên cứu

- Ứng dụng kết quả nghiên cứu phân tích sắc ký đồ của một số mẫu Dây thìa canh thu được trên thị trường

Trang 10

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Chi Gymnema R Br

1.1.1 Vị trí phân loại thực vật chi Gymnema R.Br

Theo hệ thống phân loại của Armen Takhtajan trong “Flowering Plants” (2009),

chi Gymnema R.Br được sắp xếp theo thứ tự phân loại như sau:

1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố và các loài trong chi trên thế giới

Các loài thuộc chi Gymnema R.Br là cây leo, không có rễ phụ trên thân Lá mọc

đối, không nạc Cụm hoa xim, dạng tán hoặc chùm Hoa nhỏ Thùy đài nhỏ, hình trứng, đầu tù, gốc đài có tuyến, ít khi không có tuyến Tràng hình bánh xe, thùy tràng không gập trong nụ, tiền khai vặn phải Tràng phụ đơn, vảy tràng phụ dính ở tràng, thường có các hàng lông xếp dọc theo tràng Chỉ nhị dính nhau, bao phấn 2 ô, có phần phụ ở đỉnh, hạt phấn dính thành khối phấn và có sáp bao bên ngoài vách khối phấn, khối phấn không có mỏm ở đỉnh, cơ quan truyền phấn có gót đính và 2 chuôi, khối phấn hướng lên, chỉ có một khối phấn trong mỗi ô phấn Đầu nhụy phình lên hình trứng, đỉnh bầu không thót lại thành dạng vòi nhụy Cột nhị - nhụy hình ống nhọn đầu [21], [23]

Phân bố của chi Gymnema R.Br khá rộng, ở vùng Tây châu Phi đến

Australia, châu Á [7] Trong thực vật chí Trung Quốc, Tsiang và cộng sự đã mô tả và xây dựng khóa phân loại chi Gymnema R.Br [21] Năm 2011,

Jingyun Fang và cộng sự đã công bố bản đồ phân bố của 7 các loài Gymnema

R.Br tại Trung Quốc [29] Các tài liệu thực vật, Thái Lan ghi nhận có 3 loài, Ấn Độ có

2 loài, Indonesia 2 loài và Lào [27], Đài Loan có 1 loài [32]

Theo dự án “The plant list” thực hiện bởi Royal Botanic Gardens, Kew và Missouri

Botanical Garden khởi động từ năm 2010 đã xác định được 120 loài thuộc chi Gymnema

R.Br thu thập từ các cơ sở dữ liệu khác nhau trên thế giới trong đó có 52 tên khoa học được chấp nhận (43,3%), 50 tên được xác định là tên đồng nghĩa (41,67 %), và 18 tên

Trang 11

chưa xác định được chính xác thông tin (15,0 %) [64] Danh sách 52 loài thuộc chi

Gymnema R.Br đã được chấp nhận theo “The plant list” [64] được trình bày trong phụ

lục 2

1.1.3 Tác dụng sinh học của một số loài thuộc thuộc chi Gymnema R.Br

Nhiều loài thuộc chi Gymnema R.Br đã được nghiên cứu về hoạt tính sinh học

bao gồm tác dụng của dịch chiết toàn phần, của cao phân đoạn và của các hoạt chất được

phân lập từ cây Tác dụng sinh học nổi bật của các loài thuộc chi Gymnema R.Br gồm

hạ đường huyết, chống béo phì, chống oxy hóa và bảo vệ gan Các thống kê và tài liệu

đi kèm thể hiện trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số tác dụng sinh học đã công bố của các loài thuộc chi Gymnema

R.Br

Loài Tác dụng sinh học Tài liệu tham khảo

Gymnema sylvestre (Retz) R Br

Gymnema latifolium Wall Ex

Gymnema inodorum (Lour.)

Decne

Hạ đường huyết [14]

Gymnema yunnanense Tsiang Hạ đường huyết [14]

1.2 Chi Gymnema R.Br ở Việt Nam

Theo các tác giả Phạm Hoàng Hộ (2000) [7], Võ Văn Chi (2004) [4], Trần Thế

Bách (2007) [2], chi Gymnema R.Br phân bố ở Việt Nam có 6 loài là Gymnema albiflorum Cost., Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema latifolium Wall Ex Wight, Gymnema yunnanense Tsiang, Gymnema reticulatum (Moon) Alst và Gymnema sylvestre (Retz) R Br Ex Schult Để xác định các loài này, TS Trần Thế Bách (2007)

đã xây dựng khóa phân loại cho chi Gymnema R.Br ở Việt Nam (bảng 1.2) sử dụng các

Trang 12

đặc điểm phân loại chính của quả và hạt, bao gồm: kích thước quả, kích thước mào lông

và độ dài hạt [2]

Bảng 1.2 Khóa phân loại các loài của chi Gymnema ở Việt Nam [2]

1A Quả dài hơn 12 cm………1.G inodorum

1.B Quả ngắn hơn 10 cm

2.A Mào lông ngắn hơn 2,6 cm……….…… 2.G yunnanense 2.B Mào lông dài hơn hay bằng 3 cm

3.A Chiều dài hạt ngắn hơn 0,9 cm……… … ………… 3.G sylvestre

3.B Chiều dài hạt lớn hơn 1 cm

4.A Chiều dài quả ngắn hơn 6 cm; mào lông ngắn hơn 3,5 mm……… 4.G latifolium 4.B Chiều dài quả dài hơn 6 cm; mào lông dài hơn 3,5 mm……… 5.G reticulatum Các đặc điểm thực vật của 4 loài Gymnema sylvestre (Retz) R Br Ex Schult, Gymnema latifolium Wall Ex Wight, Gymnema inodorum (Lour.) Decne và Gymnema yunnanense Tsiang cũng đã được mô tả chi tiết trong nghiên cứu của tác giả Phạm Hà

Gân bên 4-5 cặp, uốn cong về phía mép lá Cụm hoa xim ở nách lá thường ngắn hơn rất

nhiều so với lá, có nhiều lông Trục cụm hoa 2-5mm, cuống hoa rụng để lại những vết sẹo xoắn ốc xếp sát nhau Đài 5, rời, hình trứng, có lông tơ Tràng 5 hàn liền hình chuông, màu trắng, vàng kem hoặc đỏ Thùy tràng hình trứng, nhẵn, thường có vành màu trắng

ở mép thùy tràng Tràng phụ 5, dài nhô ra ngoài đính ở họng tràng ở gốc có 2 dãy lông màu nâu Đầu nhụy hình nón trắng nhô ra ngoài Bầu 2 lá noãn rời, hình trứng, dài 1 x 0,3 mm [15]

Quả 2 đại thường bị rụng chỉ còn 1, có dạng hình mác rộng, 5-9 × 2 cm, nhẵn,

Trang 13

đáy tròn, đầu nhọn Hạt hình trứng, mép dạng màng, 8 × 4 mm; mào lông màu trắng mượt, dài khoảng 3.5 cm [15]

Tên thường gọi: Dây thìa canh, dây muôi, lõa ti rừng Cây thường mọc hoang dại

ở bờ bụi, hang rào nhiều tỉnh như Hải Dương, Hưng Yên, Bắc Giang, Quảng Bình, Quảng Trị,…[4], [15]

1.2.1.2 Thành phần hóa học

Các nghiên cứu sâu về thành phần hoá học của chi Gymnema R.Br chủ yếu được tập trung vào loài Gymnema sylvestre (Retz) R Br Ex Schult với các nhóm chất

triterpen saponin thuộc 2 nhóm olean và dammaran Saponin khung olean có các acid

gymnemic và các gymnemasaponin [60], [63], trong khi đó các saponin khung

dammarane là các gymnemasid [25] Trong lá Dây thìa canh lá nhỏ còn có resine,

albumin, chlorophyll, carbonhydrat, acid tartric, acid formic, acid butyric, anthraquinon, alkaloid inositol, acid hữu cơ (5,5%), paraben, calci oxalat (7,3%), lignin (4,8%) và cellulose (22%) [48], [49], [50]

Thành phần có tác dụng hạ đường huyết được xác định là các acid gymnemic, là tên chung của các acid hữu cơ thuộc nhóm saponin triterpenoid [24], [33], [34], [49] Các acid gymnemic là các dẫn chất thế acyl (Tiglolyl, Methyltutylrol,…) của acid

deacylgymnemic tương ứng là dẫn xuất thế 3-O-beta-glucoronid của gymnemagenin

[42] Cấu trúc chung phần aglycon của gymnemagenin và 17 loại acid gymnemic được

minh họa trong hình 1.1 và phụ lục 6

Hình 1.1 Khung cấu trúc phần aglycon của các acid gymnemic phân lập được từ

Gymnema sylvestre (Retz) R Br Ex Schult [52]

Tuy nhiên, trong một nghiên cứu mới công bố vào năm 2018 của Phạm Hà Thanh

Tùng và cộng sự cho thấy loài G sylvestre thu tại hai khu vực địa lý khác nhau là Ấn

Trang 14

Độ và Việt Nam có sự khác biệt về thành phần hóa học chính [37] Thành phần hóa học trong Dây thìa canh lá nhỏ Việt Nam gồm các acid dạng C-4 gem-dimethylat olean bao

gồm myrtillogen, chichipegenin, sitakisogenin, maniladiol, gymnemagenol, và 3b, 16b,

28-trihydroxyolean-12-en-29,22b-olid (hình 1.2) Kết quả này tương tự với một số nghiên cứu về Dây thìa canh lá nhỏ tại Trung Quốc và khác biệt với các công bố đã có

về cây Dây thìa canh lá nhỏ có nguồn gốc Ấn Độ [37]

R4

R2OH H

R1

R5

R3

H

Hình 1.2 Khung cấu trúc phần aglycon của các acid dạng C-4 gem-dimethylat

olenan phân lập được từ Gymnema sylvestre (Retz) R Br Ex Schult nguồn gốc

Việt Nam [37]

1.2.2 Loài Gymnema latifolium Wall Ex Wight

1.2.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

Thân leo tới 6m Thân có lỗ vỏ, các nhánh có nhiều lông tơ Cuống lá 1,5 - 4 cm,

có lông tơ dày đặc; phiến lá 8-13 × 5-8 cm, lông dày đặc, càng xa trục càng dày đặc, gốc tròn, ngọn nhọn, gân bên 6-7 cặp Cụm hoa xim dạng đầu thành từng đôi ở mấu, có lông dày Một cụm mang rất nhiều hoa, mùi thơm Cuống cụm hoa 1-1,5 cm, cuống hoa 3-8

mm Đài hình trứng, phủ lông măng Tràng hoa vàng, hình chuông, nhẵn ở mặt ngoài Ống hoa có 5 cặp gờ mang lông ở họng tràng, các thùy hình trứng, khoảng 1,2 × 1,2 mm, phủ lông dày đặc hướng trục, ngắn hơn so với ống tràng Khối nhị nhụy dạng hình trụ, phần phụ nhị dạng màng ngắn hơn so với đầu núm nhụy Khối phấn hình thuôn Đầu núm nhụy hình nón, đỉnh phân đôi [15]

Quả đại hình mác nhọn, 4,5-5,5 × 1,5-2 cm Hạt hình trứng thuôn, dài khoảng 1,1 cm × 5 mm, mép dạng màng; mào lông dài 3 cm [15]

Tên thường gọi: Dây thìa canh lá to, lõa ti lá rộng Loài Gymnema latifolium

Wall Ex Wight được phân bố ở đảo Andaman và Nicobar, Bangladesh, Trung Quốc

Trang 15

(Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam), Ấn Độ (Arunachal Pradesh, Assam, Kerala, Maharashtra, Tamil Nadu), Myanmar, Thailand [57], Việt Nam (Gia Lai, Tây Ninh, Tuyên Quang, Hoà Bình, Thái Nguyên) [15]

Tại Việt Nam, bằng các phản ứng hóa học định tính xác định được trong lá cây

G latifolium có mặt của các nhóm chất chính như: saponin, flavonoid, coumarin, tanin,

chất béo, đường khử, acid amin và acid hữu cơ Trong đó, saponin và flavonoid là 2 nhóm chất chính của dược liệu [5], [11] Hàm lượng saponin trung bình trong dược liệu là: 5,60% ± 0,11 [11]

Dịch chiết G latifolium sau khi thuỷ phân bằng acid và kiềm cho thấy có pic

tương ứng với pic của chất chuẩn gymnemagenin trên sắc ký đồ sau khi triển khai bằng

kỹ thuật HPTLC [15] Điều này phù hợp với nghiên cứu của tác giả Trần Thị Oanh năm

2014 với 2 acid gymnemic đã phân lập được là acid gymnemic I và acid gymnemic IV

(2 chất có cùng khung cấu tạo như khung hình 1.1) [11]

Bên cạnh đó, các nhóm hợp chất khác đã được chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc trong Dây thìa canh lá to bao gồm 3 hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat là:

stigmasterol, lupeol acetat và 3β-acetoxy – 22,23,24,25,26,27 – hexanordammaran – 20

– one [10] Gần đây nhất, năm 2020, Phạm Hà Thanh Tùng và cộng sự đã phân lập được

các 3β-hydroxy olean triterpenoid với khung aglycon là gynemagenin và

longispinogenin [38] (chi tiết trong phụ lục 6)

R4

R6H

Hình 1.3 Khung cấu trúc phần aglycon của các 3β-hydroxy olean triterpenoid

phân lập được từ Gymnema latifolium Wall Ex Wight [38]

Trang 16

1.2.3 Loài Gymnema inodorum (Lour.) Decne

Dây leo tới 10m Thân nhẵn, các nhánh non có màu nâu nhạt, có lỗ vỏ, phủ lông măng Cuống lá 2-6 cm; bề mặt lá nhẵn, hình trứng thuôn hoặc hình trứng rộng, 4-13 × 2-9 cm, nhẵn hoặc phủ lông măng ở dọc gân lá Gốc lá tròn hoặc hình tim nông, ngọn

lá nhọn hoặc nhọn kéo dài, 4-6 cặp gân bên Cụm hoa xim dạng chùm xếp giống như đầu, xếp xoắn ốc, tới 4 cm; Cuống cụm hoa 1-2 cm Cuống hoa 1-1.5 cm Đài thuôn, 2-

3 × 1.4 mm, ngắn hơn ống tràng, có lông măng hoặc lông mịn Tràng hoa màu vàng, 6-

7 mm, có lông mịn dày đặc phía ngoài Ống tràng dạng hình trụ, nhẵn trừ các dãy lông dọc theo phần kẽ ống tràng, xen kẽ với các thùy tràng; Thùy tràng hình chữ nhật, 3-4 × 1.6-1.8 mm, chóp nhọn, nhẵn trừ mép có lông tơ Khối phấn hình chữ nhật Đầu núm nhụy có hình mái vòm, thò lên trên ống tràng [15]

Quả hai đại, hình mác, dài 16x3 cm, vỏ quả dày và hơi có sợi Vỏ quả nhẵn Hạt khoảng 1.5x1 cm; mào lông khoảng 4 cm [15]

Tên thường gọi: Lõa ti không mùi, Lõa ti nhuộm, Rau mỏ, Dây thìa canh lá to Phân bố ở Nam Bộ, Nha Trang, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Hòa Bình, Vĩnh Phúc, mọc rộng khắp trên đất rừng, cạnh suối và lùm bụi [15]

Năm 2001, từ lá của G inodorum, tác giả Kazumasa Shimizu đã phân lập được

4 hợp chất thuộc nhóm olean triterpenoid với một nhóm thế methyl anthranilat đặc trưng gồm GiA-1, GiA-2, GiA-5 và GiA-7 [44] Công thức khung chung của các chất này minh họa trong hình 1.4 và phụ lục 6

CH2R4

R3OH

O

CH2R1

O HOOC

O H

OR6 OR5

R2

Hình 1.4 Khung cấu trúc của một số chất phân lập được từ loài Gymnema

inodorum (Lour.) Decne [44]

Trang 17

1.2.4 Loài Gymnema yunnanense Tsiang

Thân bụi leo, cao tới 8m Thân bánh tẻ phình lên thành các rãnh sâu, thân non có nhiều lỗ vỏ, bề mặt phủ lông dày đặc màu vàng sét Toàn thân có nhựa mủ vàng Lá đối, cuống lá 0,8-1,5 cm Phiến lá hình trứng, bầu dục hoặc trứng ngược, kích thước lá 6-13

× 2,5-6 cm, 5-6 cặp gân lông chim Toàn bộ bề mặt phiến lá và gân lá có phủ lông sét nâu Mép lá nguyên, gốc lá tù hoặc tròn, ngọn lá nhọn Cụm hoa xim mọc đối xứng nách

lá, mỗi cụm 12-20 hoa Cuống 3- 4mm Lá đài 5,2x2 mm rời, hình trứng, có lông dày đặc Tràng hàn liền màu vàng, mép thùy tràng có vành màu vàng kem nhạt Ống thùy hình trứng, 4x4mm, có phần phụ ở họng tràng mang lông dày màu vàng nâu Phần phụ của nhị rộng, thò cao lên trên ống tràng nhưng vẫn thấp hơn đầu núm nhụy Khối phấn hình khối chữ nhật, thẳng đứng, Đầu núm nhụy hình cầu, thò ra ngoài Bộ nhụy gồm 2

lá noãn rời nhau Hạt hình trứng thuôn dài 1,3-1,5 cm x 6 mm, mép dạng màng, mào lông dài 2,5 cm [15]

Tên thường gọi: Lõa ti Nam Vân hay Dây thìa canh Vân Nam Phân bố ở Kiên Giang, Kom Tum, Gia Lai và Đắc Lắc [2], [4], [7]

Theo các tài liệu tham khảo, từ dịch chiết sau thủy phân của Dây thìa canh Vân Nam đã xác định được các saponin có 4 khung aglycon C21 steroidal là penupogenin, 20- O-cinnamoylsarcostin, sarcostin và metaplexigenin Bên cạnh đó, một loại aglycon

mới được phát hiện gymnemarsgenin [28]

Năm 1991, từ dịch chiết toàn phần của lá Gymnema yunnanense Tsiang, Zhang

và cộng sự đã phân lập được hai glycosid C21 mới có tên là gymnemarosid A và B [62]

Các khung này (hình 1.5 và phụ lục 6) có cấu trúc khác biệt so với các loài Dây thìa canh khác (hình 1.3)

OH

OR1 OR2

OH OR

R3O

Hình 1.5 Khung cấu trúc chung của các aglycon C 21 phân lập được từ Gymnema

yunnanense Tsiang [28], [62]

Trang 18

1.3 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

1.3.1 Sắc ký lớp mỏng

Quá trình tách hỗn hợp các chất bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) xảy ra khi cho pha động chuyển qua pha tĩnh Trong TLC pha tĩnh được rải thành lớp mỏng trên giá đỡ phẳng Dưới tác động của lực mao quản, pha động thấm theo lớp mỏng đi qua điểm xuất phát – nơi mẫu được đưa lên bản mỏng Trong quá trình di chuyển của pha động qua pha tĩnh, nhờ quá trình hấp phụ và giải hấp phụ được lặp lại nhiều lần và hệ số phân bố khác nhau mà những chất khác nhau sẽ di chuyển theo hướng của pha động với tốc độ khác nhau Kết quả mỗi chất phân tích sẽ được tách riêng ra ở các vị trí khác nhau trên bản mỏng [13]

1.3.2 Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

HPTLC là dạng nâng cao và tự động hóa của TLC và cho phép phun mẫu lên bản mỏng chính xác hơn và đánh giá định lượng các vết được tách Sự cải tiến về kỹ thuật này làm tăng hiệu lực tách và giảm thời gian phân tích Sự khác nhau giữa TLC và HPTLC ở chỗ kích thước và mức độ đồng đều hạt của chất hấp phụ TLC thường có phạm vi kích thước hạt từ 10-15µm, trung bình khoảng 20µm nhưng với HPTLC phạm

vi kích thước hạt nhỏ hơn và kích thước hạt trung bình khoảng 5µm Phương pháp đưa mẫu lên bản mỏng cũng được cải tiến với thiết kế dụng cụ phun mẫu chính xác làm giảm đường kính vết phun ban đầu Những cải tiến này làm giảm đáng kể thời gian và tăng hiệu lực tách của peak [1], [31]

HPTLC là một kỹ thuật đơn giản, trực quan và thực dụng, có khả năng mang lại kết quả đáng tin cậy và có thể tái tạo, dựa trên phương pháp được tiêu chuẩn hóa và sử dụng SST cho chất lượng tấm Những cải tiến được giới thiệu trong Dược điển, đặc biệt

là trong Dược điển Châu Âu và Dược điển Mỹ, cùng với thiết bị và phần mềm cho phép ghi lại hình ảnh điện tử chuẩn hóa của sắc ký đồ (dấu vân tay) và sự biến đổi của chúng thành cấu hình đỉnh (PPI), mở ra cánh cửa để lấy thông tin định lượng từ phân tích được thực hiện để nhận dạng Dựa vào đó, khái niệm về dấu vân tay HPTLC toàn diện đã được giới thiệu Nó cho phép đơn giản hóa các quy trình kiểm soát chất lượng đối với thuốc/ chế phẩm/ sản phẩm thảo dược, bởi vì từ một phân tích HPTLC duy nhất, có thể thu được thông tin về nhận dạng, độ tinh khiết và đặc tính [41]

Trang 19

1.4 Vân tay sắc ký thực vật

Khái niệm dấu vân tay hóa học được đề cập trong phụ lục 12.23 Dược điển Việt Nam V như sau: dấu vân tay hóa học là các thông tin hóa học của dược liệu được biểu thị dưới dạng sắc ký đồ, các phổ và các đồ thị… được ghi bằng các kỹ thuật phân tích (kỹ thuật sắc ký) hay còn được gọi là sắc ký đồ dấu vân tay [8]

Nói cách khác sắc ký đồ dấu vân tay là một hồ sơ sắc ký bao gồm tất cả các vết sắc ký của các thành phần đặc trưng từ dược liệu hoặc thuốc từ dược liệu được nghiên cứu Hồ sơ sắc ký sẽ cung cấp thông tin như tính toàn vẹn, độ đậm nhạt, sự giống hay khác nhau của các chất đặc trưng cho loài Do đó, với dấu vân tay sắc ký thu được có khả năng xác thực cũng như xác định các loài dược liệu một cách hiệu quả ngay cả khi

số lượng và/hoặc nồng độ các thành phần đặc trưng hóa học là không giống nhau giữa các mẫu khác nhau [30]

Như vậy, dấu vân tay có khả năng cung cấp thông tin cho ba cấp độ kiểm soát chất lượng phân tích Những mức độ kiểm soát chất lượng là:

- Xác định thực vật (xác thực loài, tuổi và nguồn gốc);

- Định lượng hoạt chất;

- Phát hiện tạp chất, chất gây ô nhiễm hoặc chất pha trộn [17]

Theo hướng dẫn của WHO về việc lựa chọn các chất đánh dấu của dược liệu để kiểm soát chất lượng thuốc thảo dược [35], tiêu chí lựa chọn các chất tham chiếu và kiểm soát chất lượng thuốc thảo dược nên tính đến các thành phần khác nhau có thể có mức độ ảnh hưởng khác nhau đến chất lượng, an toàn và hiệu quả cuối cùng Do đó, thứ

tự lựa chọn các chất để xác định và định lượng phải tuân theo các quy tắc được trình bày dưới đây:

- Nếu các thành phần có tác dụng đã biết và đã được xác định, chúng nên được sử dụng làm vết đánh dấu

- Nếu không phải là trường hợp 1 nhưng thành phần được công nhận tác dụng dược

lý nên được sử dụng làm vết đánh dấu

- Nếu các trường hợp trên không được áp dụng, danh tính của nguyên liệu thảo dược, chế phẩm và thuốc có thể được xây dựng bằng cách phân tích (các) chất đánh dấu là các thành phần đặc trưng khác

- Ngoài ra cũng có thể dùng dược liệu chuẩn để đối chiếu

Tổ chức Y tế Thế giới WHO cũng đã đưa ra định nghĩa về chất đặc trưng như

Trang 20

sau: “Một thành phần chất tự nhiên có trong một bộ phận của cây có thể được dùng để đảm bảo cho sự nhận biết hoặc đảm bảo chất lượng chế phẩm của cây thuốc đó, không nhất thiết là hoạt chất” [35]

Các phương pháp sắc ký xác định dấu vân tay đang được sử dụng là TLC, HPTLC, HPLC, GC, hoặc sắc ký kết hợp đo phổ LC-MS, GC-MS, HPLC-DAD…[30] Phương pháp sắc ký lớp mỏng và sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao có nhiều ưu điểm so với các phương pháp khác là:

- Có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu, tiết kiệm chi phí, dung môi và thời gian

- Có thể vừa định tính vừa định lượng

- Các mẫu phân tích và các mẫu chuẩn được phun trên cùng một bản mỏng sắc ký, khai triển cùng lúc trong cùng điều kiện dung môi, nhiệt độ, độ ẩm nên có thể so sánh trực tiếp đối chứng nhau, hạn chế sự tác động của môi trường giữa các lần phân tích

- Chuẩn bị mẫu đơn giản, không cần xử lý dung môi trước (lọc hay siêu âm)

* * * * * *

Như vậy, theo các tài liệu ghi nhận được, có 04 loài thuộc chi Gymnema R.Br là

G sylvestre, G latifolium, G inodorum và G yunnanense ở Việt Nam hiện đang được

nghiên cứu đều có tác dụng hạ đường huyết ở các mức độ khác nhau Bên cạnh những đặc điểm tương đối khác biệt về hình thái, các aglycon trong khung cấu trúc saponin của thành phần hóa học bốn loài Dây thìa canh này cũng có sự khác biệt nhất định (bảng 1.3) Chính sự khác biệt về cấu trúc sẽ dẫn đến sự khác biệt về các vết sắc ký trên sắc

ký đồ của từng loài Dây thìa canh

Mặt khác, trên thị trường, khi các chế phẩm đã sử dụng dạng dược liệu khô cắt nhỏ hoặc dạng cao chiết từ Dây thìa canh nên rất khó có thể nhận biết được sự có mặt của loài Dây thìa canh nào trong chế phẩm nhờ cảm quan Do đó, nghiên cứu dự kiến

sử dụng các vết sắc ký điển hình là cơ sở quan trọng để có thể bước đầu phân biệt được các loài trong chi dựa trên bằng chứng hóa học đơn giản

Trang 21

Bảng 1.3 Tổng hợp sự khác biệt về cấu trúc khung chất chính của các loài trong

R1

R5

R3

H

Khung saponin chính trong loài G

sylvestre nguồn gốc Việt Nam

R4

R6H

CH2R1O

HOOC O

Trang 22

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Mẫu nghiên cứu

- Mẫu nghiên cứu xây dựng vân tay sắc ký theo loài (nhóm 1): Các mẫu thuộc

chi Gymnema R.Br thu hái ở Hòa Bình, Quảng Bình, Nam Định và vùng trồng Dây thìa

canh ở Phú Lương, Thái Nguyên; được thu hái trong thời gian gần nhau vào tháng 5 và đầu tháng 6 năm 2020 Các mẫu nghiên cứu đều được giám định tên khoa học và lưu mẫu tại phòng tiêu bản của Trường Đại học Dược Hà Nội (phụ lục 1)

Tên loài, địa điểm, thời điểm thu mẫu, dạng mẫu lúc thu và ký hiệu trong nghiên cứu của từng mẫu được thể hiện trong bảng 2.1-i

- Mẫu nghiên cứu để so sánh sắc ký đồ và xác định loài (nhóm 2): Là các mẫu

thu mua trên thị trường, thông tin mẫu thể hiện trong bảng 2.1-ii

Bảng 2.1 Danh mục và ký hiệu các mẫu trong nghiên cứu (i và ii)

i) Mẫu xây dựng vân tay sắc ký

STT Loài Tên thường

gọi

Thời gian, địa điểm thu mẫu

Dạng mẫu lúc thu

Ký hiệu

Trang 23

STT Loài Tên thường

gọi

Thời gian, địa điểm thu mẫu

Dạng mẫu lúc thu

Ký hiệu

Lá tươi GYa

12 G inodorum T6/2020, Kim Bôi,

ii) Mẫu nghiên cứu để so sánh sắc ký đồ và xác định loài

STT Thời gian, địa điểm thu mẫu Dạng mẫu lúc

thu mua

Ký hiệu trong nghiên cứu

13 T6/2020, sản phẩm Trà dây thìa canh đặc

biệt của công ty DK natura, Thái Nguyên

Dược liệu khô gồm cành và lá

GX1

15 T5/2020, sản phẩm từ công ty Dược liệu

16 T6/2020, mua tại chợ ở Kim Bôi, Hòa

2.1.2 Trang thiết bị nghiên cứu

2.1.2.1 Hóa chất, dung môi

- Hóa chất, dung môi và thuốc thử được sử dụng đều đạt tiêu chuẩn phân tích theo Dược điển Việt Nam V: KOH, toluen, aceton, methanol, ethanol 96%, ethylacetat, acid formic, HCl đặc, H2SO4 đặc, nước cất, thuốc thử hiện màu vanillin-acid sulfuric (pha theo phụ lục 2.1.1 Dược điển Việt Nam V tập 2: Trộn đồng lượng dung dịch vanilin 1% trong ethanol 96% và dung dịch acid sulfuric 5% trong ethanol 96%; pha trước khi dùng [8]),…

- Chất chuẩn: Gymnemagenin (thông số mẫu: lot PRF9072601, cas 22467-07-8,

độ tinh khiết 99,4%), cân 5.32mg hòa tan trong vừa đủ 5.0ml MeOH, lắc đều, bảo quản trong ngắn mát tủ lạnh Nồng độ dung dịch chuẩn 1.064 mg/ml (pha sẵn do Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương cung cấp)

- Bản mỏng chạy TLC Silica Gel GF254 (Merck)

Trang 24

2.1.2.2 Dụng cụ và thiết bị dùng trong thí nghiệm

- Các dụng cụ thí nghiệm thường quy (bình nón nút mài, giấy lọc, cốc có mỏ, bình gạn, ống đong, ống ly tâm, pipet…) và các dụng cụ khác (mao quản, bình khai triển sắc ký…)

- Máy cất quay chân không Büchi B-490 và R-220 (Thụy Sỹ)

- Cân kỹ thuật Sartorius, độ chính xác 0,01 g (Đức)

- Cân phân tích Shimadzu, độ chính xác 0,0001g (Nhật Bản)

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Bể siêu âm Ultrasonic LC60H (Đức)

- Máy li tâm lạnh Centrifuge (Trung Quốc)

- Hệ thống HPTLC CAMAG gồm: bàn tiêm mẫu tự động LIMONAT V, bình khai triển bản mỏng tự động ADC2, buồng chụp sắc ký TLC Visualizer, máy nhúng thuốc thử, máy vi tính với phần mềm điều khiển winCATS và phần mềm phân tích VideoSan (Thụy Sỹ)

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát một số thông số của quy trình phân tích vân tay sắc ký các mẫu nghiên cứu

- Khảo sát điều kiện chạy sắc ký cho dịch chiết toàn phần và dịch chiết phân đoạn ethyl acetat sau thủy phân gồm: hệ dung môi pha động, thể tích tiêm mẫu nhằm lựa chọn được điều kiện ra được sắc ký đồ tách biệt rõ nét nhất khi hiện màu bằng UV 254nm,

UV 366nm và thuốc thử vanilin-acid sulfuric

- Xây dựng quy trình tối ưu từ các yếu tố đã nghiên cứu cho phân tích HPTLC bằng hệ thống CAMAG

2.2.2 Xây dựng vân tay hóa học của một số loài thuộc chi Gymnema R.Br

Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng và phân tích sắc ký đồ dịch chiết trước và sau thủy phân của các mẫu nghiên cứu từ đó xây dựng vân tay sắc ký điển hình của mỗi loài

2.2.3 Xây dựng cây phân loại dựa trên thành phần hoá học (sắc ký đồ) của các mẫu nghiên cứu

Tiến hành phân tích sự đa dạng về thành phần hóa học giữa các loài trong chi

Gymnema dựa trên các thông tin vân tay sắc ký thu được từ đó xây dựng cây phân loại

đến loài theo sự xuất hiện các vết trên sắc ký đồ ở các mẫu nghiên cứu

Trang 25

2.2.4 Ứng dụng phân tích sắc ký đồ của một số mẫu Dây thìa canh thu được trên thị trường

Tiến hành sắc ký và so sánh sắc ký đồ của các mẫu Dây thìa canh trên thị trường với sắc ký đồ của các mẫu nghiên cứu để có kết luận ban đầu về sự xuất hiện của các

loài Gymnema trong các mẫu Dây thìa canh thu được trên thị trường

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chuẩn bị mẫu phân tích

Các mẫu nghiên cứu được chiết đồng thời bằng 2 phương pháp để thu được dịch chiết toàn phần và dịch chiết sau khi thủy phân Trong đó, mẫu GS1a được lựa chọn làm mẫu khảo sát quy trình phân tích

2.3.1.1 Chuẩn bị dược liệu

- Với các mẫu thu được lá tươi: Mẫu được rửa sạch, sấy khô ở 55oC đến hàm ẩm dưới 12% Với các mẫu dược liệu khô: Chọn lấy phần lá làm nguyên liệu nghiên cứu

- Các mẫu sau đó được xay đến bột thô và rây qua rây 0,71mm bảo quản trong túi nilon kín

2.3.1.2 Chuẩn bị dịch chiết toàn phần

Cân chính xác khoảng 2g bột dược liệu vào bình nón nút mài 250ml Tiến hành chiết siêu âm 3 lần, mỗi lần với 50ml ethanol 70% trong 30 phút Lọc, gộp dịch, cô đến cắn Cắn này hòa tan trong 10ml methanol rồi đi ly tâm lấy dịch làm mẫu chấm sắc ký

2.3.1.3 Chuẩn bị dịch chiết sau thủy phân

Dược liệu được thủy phân các liên kết glycosid trong môi trường acid rồi làm lạnh để tủa xuống aglycon dạng muối; kiềm hóa tủa này thu được aglycon dạng base Chiết đồng lượng lỏng-lỏng bằng ethyl acetat (lắc trong bình gạn) dịch nước chứa aglycon base này thu được phân đoạn các aglycon tan trong ethyl acetat, lấy tất cả các chất trong phân đoạn này làm dịch phun sắc ký Quy trình chi tiết thể hiện trong hình 2.1

Trang 26

Hình 2.1 Quy trình chiết - thủy phân các mẫu nghiên cứu

Trang 27

2.3.2 Lựa chọn điều kiện triển khai sắc ký

- Bản mỏng: TLC silicagel 60 F254 (Merck) được hoạt hóa ở 105oC trong vòng

30 phút, sau đó lấy ra để nguội để triển khai sắc ký

- Kích thước bản mỏng: 10x10 cm hoặc 10x20 cm

- Đưa mẫu lên bản mỏng bằng máy tiêm mẫu Linomat V Vị trí tiêm mẫu cách mép dưới bản mỏng là 8,0 mm, khoảng cách giữa vết ngoài cùng và mép ngoài bản mỏng là 15,0 mm Độ rộng của vết là 8 mm

- Khảo sát thể tích tiêm mẫu: tiêm những thể tích khác nhau (dịch chiết toàn phần khảo sát các thể tích tiêm: 0,5µl; 1µl; 1,5µl, 2µl; dịch chiết sau thủy phân khảo sát ở các thể tích: 6µl; 8µl; 10µl, 12µl của cùng dịch chiết mẫu GS1a trên cùng một bản mỏng

silicagel G60F254, khai triển với hệ dung môi được lựa chọn ở dưới Lựa chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp cho vết đủ rõ, gọn

- Hệ dung môi khai triển: Tiến hành khảo sát một mẫu dịch chiết GS1a với lần lượt các hệ dung môi sau:

Hệ 1: Cloroform: methanol: nước (15:5:1)

Hệ 2: n-butanol: acid acetic: nước (4:1:5, lớp trên)

Hệ 3: Ethyl acetat: acid acetic: nước (8:2:1)

Hệ 4: Ethyl acetat: methanol: nước (100:17:13)

Hệ 5: Cloroform: methanol: acid formic (10:1,1:0,02)

Hệ 6: Ehtyl acetat: methanol: acid formic (5:4:0,02)

Hệ 7: Toluen: ethyl acetat: acid formic (5:4:1)

Hệ 8: n-hexan: ethyl acetat: acid formic (5:4:1)

- Điều kiện chạy sắc ký lớp mỏng

+ Điều kiện môi trường: nhiệt độ: 28oC, độ ẩm: 70%

+ Thể tích dung môi bão hòa: 25 ml; thể tích dung môi khai triển: 10,0 ml

+ Thời gian bão hòa dung môi: 15 phút

+ Thời gian sấy bản mỏng: 5 phút

+ Quãng đường di chuyển của dung môi pha động: 80,0 mm

- Bản mỏng được hiện màu bằng cách:

+ Soi dưới đèn UV bước sóng 254 nm và 366 nm

+ Hiện màu bằng dung dịch valinin-acid sulfuric (TT) (chuẩn bị như mục 2.1.2.1) Bản mỏng sau đó được sấy ở 105oC trong 10 phút và quan sát

Trang 28

dưới ánh sáng thường và dưới UV 366nm

Dựa trên kết quả quan sát được, chọn pha động cho các vết sắc ký tách nhau, gọn,

ít bị kéo đuôi và có Rf của các chất nằm trong khoảng tối ưu từ 0,10 - 0,90 cho các nghiên cứu tiếp theo

2.3.3 Tiến hành phân tích vân tay sắc ký các dịch chiết một số loài trong chi Gymnema R.Br theo quy trình đề xuất

- Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu theo mục 2.3.1 ở trên

- Triển khai sắc ký các mẫu theo điều kiện ở mục 2.3.2 với thể tích phun tối ưu

và một hệ dung môi khai triển được chọn có hiệu lực tách tốt nhất

- Chụp ảnh bản mỏng, xác định các vết chính trên sắc ký đồ, tính giá trị Rf và màu sắc của từng vết tương ứng thu được

- Xác định vết đặc trưng của chi và loài:

+ Vết đặc trưng của chi: Vết sắc ký xuất hiện ở tất cả các mẫu nghiên cứu

thuộc chi Gymnema R.Br khi tiến hành phân tích trên cùng điều kiện triển

để tìm ra những vết sắc ký đặc trưng cho chi/loài/giống

Để xây dựng cây phân loại dựa trên hình ảnh sắc ký đồ: Tiến hành thống kê đặc điểm thành phần hóa học của các mẫu qua các kết quả sắc ký đồ thu được Sự có mặt của các “vết” trên sắc ký đồ được mã hóa nhị biến, trong đó “1” là có vết và “0” là không

có vết Mặt khác, những vết có cùng Rf nhưng có màu sắc khác nhau thì được coi là 2 vết khác nhau khi khai biến Hệ số đồng dạng Sij của các mẫu được tính theo công thức của Nei&Li:

Trang 29

Trên cơ sở bảng hệ số đồng dạng vết trên sắc ký đồ của các mẫu nghiên cứu xây

dựng vân tay sắc ký, sử dụng phương pháp phân tích cụm (Cluster Analysis) để xây

dựng cây phân loại đặc điểm thành phần hóa học theo phương pháp khoảng cách liên

kết trung bình UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Averages)

bằng phần mềm NTSYSpc 2.1

(Nguyên tắc: Cluster Analysis là phương pháp sử dụng phương thức liên kết hoàn

chỉnh để phân cụm theo phân cấp mặc định Phương pháp phân cụm này xác định khoảng

cách cụm giữa hai cụm là khoảng cách tối đa giữa các thành phần riêng lẻ của chúng

Trong quá trình kết tụ phân cấp, mỗi quan sát bắt đầu như một nhóm riêng biệt Hai cụm

gần nhất được hợp nhất thành một cụm mới Quá trình được lặp lại cho đến khi toàn bộ

tập dữ liệu được kết tụ thành một cụm duy nhất Đầu ra mang lại một cây phân loại cho

thấy mối quan hệ giữa các quan sát và giữa các cụm mà chúng được hợp nhất liên tiếp

Cây phân loại về thành phần hoá học được xây dựng để xác định quan hệ gần gũi

giữa các mẫu nghiên cứu trong chi Gymnema R.Br ở khu vực nghiên cứu)

Để so sánh và bước đầu nhận dạng các mẫu Dây thìa canh trên thị trường: Tiến

hành so sánh số lượng, màu sắc, Rf của các vết sắc ký trên sắc ký đồ tương ứng và tiến

hành chồng phổ với các mẫu nghiên cứu để so sánh sự tương đồng

Trang 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 3.1 Kết quả khảo sát một số thông số của quy trình phân tích vân tay sắc ký các mẫu nghiên cứu

Đối tượng khảo sát: Mẫu Dây thìa canh lá nhỏ có ký hiệu GS1a

3.1.1 Với dịch chiết toàn phần

Sau khi khảo sát các hệ dung môi pha động (mục 2.3.2), pha động ổn định và có hiệu lực tách tốt nhất đối với dịch chiết toàn phần của mẫu GS1a là hệ dung môi số 4

gồm ethyl acetat: methanol: nước tỷ lệ 100:17:13 Hệ dung môi này cho sắc ký đồ của

mẫu khảo sát GS1a có nhiều vết sắc ký ở các bước sóng UV 254 nm và UV 366 nm Sau khi phun thuốc thử vanilin- acid sulfuric có nhiều vết mới xuất hiện và quan sát được dưới ánh sáng trắng, các vết sắc ký gọn và tách nhau khá rõ

Khảo sát thể tích tiêm mẫu theo quy trình chuẩn bị dịch chiết nhận thấy ở thể tích tiêm 1,5µl sắc ký đồ rõ nét, tách gọn, ít kéo đuôi nhất

Từ kết quả trên, quy trình định tính bằng sắc ký lớp mỏng cho dịch chiết toàn phần được lựa chọn với thể tích tiêm mẫu tiêm mẫu là 1,5µl và hệ dung môi pha động

là ethyl acetat: methanol: nước tỷ lệ 100:17:13, sắc ký đồ được quan sát ở các điều kiện:

bước sóng 254nm, 366nm trước khi phun thuốc thử, ánh sáng thường và bước sóng 366nm sau phun thuốc thử (hình ảnh sắc ký đồ khảo sát thể tích phun trong phụ lục 3)

3.1.2 Với dịch chiết sau thủy phân

Sau khi khảo sát các hệ dung môi pha động (mục 2.3.2), pha động ổn định và có hiệu lực tách tốt nhất đối với dịch chiết sau thủy phân của mẫu GS1a là hệ dung môi số

7 gồm toluen: ethyl acetat: acid formic với tỷ lệ 5:4:1 Sau khi tiến hành phun thuốc thử

vanilin-acid sulfuric và hiện màu, hệ dung môi này cho sắc ký đồ gồm nhiều vết gọn và

rõ nét nhất

Mặt khác khi tiêm mẫu dịch chiết ở thể tích tiêm mẫu 10µl các vết xuất hiện rõ ràng, tách nhau ít chồng lấn và kéo đuôi, trên 10µl vết sắc ký đậm, phun thuốc thử hiện màu bị kéo đuôi khó quan sát, tiêm dưới 10µl vết mờ hoặc mất vết

Như vậy, hệ dung môi pha động toluen: ethyl acetat: acid formic tỷ lệ 5:4:1 và

thể tích tiêm mẫu 10µl là hệ dung môi và thể tích tiêm mẫu phù hợp nhất cho quá trình phân tích vân tay sắc ký dịch chiết mẫu nghiên cứu GS1a sau thủy phân Nhóm nghiên cứu chọn các điều kiện này cho quá trình phân tích trên các mẫu còn lại (hình ảnh sắc

ký đồ khảo sát thể tích phun trong phụ lục 3)

Trang 31

3.2 Kết quả xây dựng vân tay hóa học một số loài thuộc chi Gymnema R.Br

3.2.1 Với dịch chiết toàn phần

Sau khi triển khai sắc ký dịch chiết toàn phần các mẫu thuộc 4 loài Gymnema

khác nhau với hệ dung môi và thể tích tiêm mẫu đã lựa chọn thu được sắc ký đồ của các mẫu nghiên cứu ở các điều kiện quan sát khác nhau như hình 3.1 – trang 24 Trong các hình ảnh sắc ký đồ thu được, sắc ký đồ ở ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử cho nhiều vết sắc ký nhất, các vết gọn và khá rõ nên đề tài sử dụng hình ảnh sắc ký đồ này

để phân tích sự đa dạng về thành phần hóa học giữa các loài trong chi

Tiến hành phân tích sự xuất hiện/không xuất hiện các vết sắc ký trên sắc ký đồ của các mẫu nhóm 1 quan sát bằng VIS-TT bằng cách mã hóa nhị phân 1/0 (bảng 3.1 – trang 26) nhận thấy sắc ký đồ của các mẫu/loài nghiên cứu khá giống nhau, chỉ có mẫu

loài G inodorum có điểm khác biệt nhiều, cụ thể:

- Có 6 vết xuất hiện sau khi phun thuốc thử ở tất cả các mẫu nghiên cứu, Rf lần lượt là: 0,22-màu nâu dưới ánh sáng thường và xám đậm dưới UV 366nm (trừ mẫu GIa có màu xanh nhạt ); 0,39-màu xanh lá dưới UV 366nm; 0,55; 0,60 (xám nhạt); 0,78 (xám nhạt) và 0,89 (màu xám đậm dưới ánh sáng thường, phát huỳnh quang đỏ dưới đèn UV 366nm) Tại các vết có Rf=0,39; 0,55 và 0,61; trước phun thuốc ở cả bước sóng 254nm và 366nm đều không xuất hiện (trừ mẫu GS2 có vết 0,39 phát huỳnh quang sáng dưới UV 366nm) Như vậy, vết sắc ký có Rf=0,39;

0,55 và 0,60 tương đối đặc trưng cho chi Gymnema R.Br Các vết này được bôi

màu đỏ trong bảng 3.1 – trang 26

- Các mẫu Dây thìa canh lá nhỏ loài G sylvestre (GSx trừ GS2) xuất hiện nhiều

vết chung, ngoài các vết chung của chi còn có thêm tại Rf : 0,11; 0,29 (trừ mẫu GS3); 0,33 (trừ mẫu GS4); 0,49; 0,65; 0,70 và 0,78 (trừ mẫu GS4); trong đó vết 0,70-xám nhạt trên sắc ký đồ VIS-TT chỉ xuất hiện ở loài này

- Các mẫu trong loài Dây thìa canh lá to (GLx) cùng mẫu Dây thìa canh nhập nội (GS2) có sắc ký đồ rất giống nhau sau khi phun thuốc thử, đều có các vết (trừ vết chung của chi) tại Rf: 0,13; 0,17; 0,30; 0,34; 0,43; 0,49; 0,63 Sự khác biệt rõ nhất giữa mẫu GS2 so với các mẫu trong loài Dây thìa canh lá to thể hiện rõ trên sắc

ký đồ trước phun thuốc thử ở UV 366nm: vết Rf=0,39 ở mẫu Dây thìa canh nhập nội và vết 0,55 ở các mẫu Dây thìa canh lá to phát huỳnh quang sáng (đánh dấu màu xanh trên bảng 3.1 – trang 26)

Trang 32

Hình 3.1 Sắc ký đồ khai triển dịch chiết toàn phần của các mẫu Gymnema nhóm 1

Chú thích: a) Quan sát dưới UV 254nm trước khi phun thuốc thử; b) Quan sát dưới UV 366nm trước khi phun thuốc thử

c) Quan sát dưới ánh sáng trắng sau phun thuốc thử; d) Quan sát dưới UV 366nm sau phun thuốc thử.

Trang 33

- Mẫu loài G inodorum quan sát trên sắc ký đồ mẫu GIa ở ánh sáng trắng sau khi

phun thuốc thử nhận thấy mẫu này có sắc ký đồ khác biệt nhất: xuất hiện 2 vết sắc ký ở Rf=0,08 có màu tím đậm, phát huỳnh quang nâu và Rf=0,22 có màu xanh nhạt và phát huỳnh quang xanh khi quan sát dưới UV 366-TT sau phun thuốc thử; các vết tại Rf=0,22; 0,38 và 0,70 phát huỳnh quang sáng chỉ xuất hiện ở mẫu này trên bản trước phun thuốc thử soi dưới UV 366nm (đánh dấu màu xanh trên bảng 3.1 – trang 26)

- Mẫu GYa (loài G yunnanense) có sắc ký đồ nhiều tương đồng các mẫu khác trong chi Gymnena R.Br., chỉ quan sát thấy điểm khác biệt khi soi UV 366nm

trước phun thuốc thử tại Rf=0,28 có xuất hiện vết cho huỳnh quang sáng không xuất hiện trên các mẫu khác (đánh dấu màu xanh trên bảng 3.1 – trang 26)

Tiến hành chồng phổ sắc ký đồ của các dịch chiết mẫu Gymnema nhóm 1 sau khi

phun thuốc thử và quan sát dưới ánh sáng thường nhận thấy phổ từ Rf 0,35 trở lên giữa các loài tương đồng nhau nhiều (hình 3.2)

Hình 3.2 Kết quả chồng phổ sắc ký dịch chiết toàn phần tại VIS-TT các mẫu

thuộc nhóm 1

Dữ liệu sắc ký đồ trước thủy phân chưa thể hiện được rõ sự khác biệt giữa các

mẫu/loài Gymnema nghiên cứu Sắc ký đồ có khá nhiều vết và các vết chưa tách hẳn

nhau nên quá trình phân tích kết quả khó khăn Đề tài đã tiến hành thủy phân các dịch chiết theo mục 2.3.1.3 để tạo dịch chiết chọn lọc hơn và bộc lộ được các khung saponin cấu trúc chính của từng loài, từ đó có những phân tích rõ ràng và chính xác hơn

Trang 34

Bảng 3.1 Sự xuất hiện các vết trên sắc ký đồ dịch chiết toàn phần mẫu nghiên

cứu nhóm 1 khi quan sát ở bản mỏng sau phun thuốc thử

R f x100 GS1a GS2 GS3 GS4 GS5 GL1a GL2a GL3a GL4a GL5a GYa GIa

Trang 35

3.2.2 Với dịch chiết sau thủy phân

Triển khai sắc ký dịch chiết sau thủy phân các mẫu thuộc nhóm 1 (mục 2.1.1) với

hệ dung môi và thể tích tiêm mẫu ở mục 3.1.2 thu được sắc ký đồ của các mẫu nghiên cứu Hình ảnh sắc ký đồ sau thủy phân cho các vết với số lượng vừa phải, tách nhau khá

rõ và gọn dễ quan sát hơn Hình ảnh sắc ký đồ với các điều kiện quan sát bao gồm UV

ở bước sóng 366nm và sánh sáng thường sau khi phun thuốc thử được sử dụng để phân tích các kết quả cụ thể (hình 3.3 – trang 30)

Qua quan sát sắc ký đồ dưới ảnh sáng thường sau khi phun thuốc thử của các

mẫu nghiên cứu nhận thấy như sau: Mẫu Dây thìa canh Vân Nam G yunnanense có sắc

ký đồ khác biệt rõ rệt so với các mẫu còn lại, mẫu Dây thìa canh nhập nội (GS2) có sắc

ký đồ tương tự các mẫu Dây thìa canh lá to và mẫu Dây thìa canh lá nhỏ có sắc ký đồ

có nhiều điểm tương đồng với mẫu Dây thìa canh G idonorum

3.2.2.1 Sắc ký đồ của các mẫu Dây thìa canh G sylvestre

Khi quan sát sắc ký đồ của các các mẫu Dây thìa canh G.sylvestre nhận thấy các

mẫu chia thành 02 nhóm với sự khác biệt rõ rệt trên sắc ký đồ Các mẫu nhóm 1 là các mẫu Dây thìa canh lá nhỏ có sắc ký đồ tương tự nhau với 12 vết trên sắc ký đồ (bảng 3.2) thì chỉ có 2 vết có sự khác nhau: cụ thể tại vết ở Rf=0,89 không quan sát thấy trên trên SKĐ mẫu GS4; vết 0,15 chỉ quan sát được ở mẫu GS3; vết ở Rf=0,83 mẫu GS3, GS4 phát huỳnh quang khác màu (màu xanh nhạt so với màu nâu của mẫu GS1a và GS4) Các vết còn lại đều xuất hiện với Rf và màu sắc như nhau ở tất cả các mẫu thuộc loài Dây thìa canh lá nhỏ (kết quả tổng hợp thành bảng 3.2)

Nhóm 2 là mẫu Dây thìa canh nhập nội có sắc ký đồ khác biệt các mẫu Dây thìa canh lá nhỏ nhưng lại có nhiều điểm tương tự với sắc ký đồ của các mẫu Dây thìa canh

lá to

Trang 36

Bảng 3.2 Tổng hợp R f và màu sắc các vết trên sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân

các mẫu thuộc loài G sylvestre quan sát ở VIS-TT hoặc UV 366-TT

1 0,04 Xám/nâu nhạt Xám/nâu nhạt Xám/nâu nhạt Xám/nâu nhạt

4 0,22 Xám/vàng nâu Xám/vàng nâu Xám/vàng nâu Xám/vàng nâu

5 0,28 Xám/xanh lá Xám/xanh lá Xám/xanh lá Xám/xanh lá

6 0,32 Xám đậm/nâu Xám đậm/nâu Xám đậm/nâu Xám đậm/nâu

11 0,71 Xám/vàng đậm Xám/vàng đậm Xám/vàng đậm Xám/vàng đậm

12 0,79 Xám/xanh lá Xám/xanh lá Xám/xanh lá Xám/xanh lá

13 0,83 Xám/nâu Xám/xanh lá Xám/xanh lá Xám/nâu

(Chú thích: Bỏ trống là không có vết; màu sắc trước dấu sổ chéo là màu quan sát được

ở VIS-TT, sau sổ chéo là UV 366-TT)

3.2.2.2 Phân tích sắc ký đồ của các mẫu Dây thìa canh lá to

Sắc ký đồ dây thìa canh lá to và Dây thìa canh nhập nội có nhiều vết tương đồng: cùng chung 6 vết: 0,22-màu nâu đậm; 0,31; 0,42; 0,47; 0,53 và 0,89 (cùng màu xám)

Về điểm hác biệt: quan sát thấy trên các mẫu Dây thìa canh lá to tổng cộng 14 vết, có 8 vết chung (gồm 6 vết chung với Dây thìa canh nhập nội và 2 vết tại Rf=0,05; 0,11)

Trong các mẫu thuộc loài G latifolium cũng nhận thấy sự khác biệt: mẫu GL3a xuất

hiện thêm vết màu xám ở Rf=0,62; GL2a, GL3a thêm một vết ở 0,37 (màu xám); GL1a không có vết tại 0,71 và 0,78 Đặc biệt vết ở Rf=0,22; 0,42 tuy xuất hiện cả ở các mẫu

thuộc loài khác nhưng khi soi dưới UV 366nm lại phát huỳnh quang xám khác biệt Ba

vết Rf 0,22-nâu đậm; 0,42-xám và 0,53-xám có thể coi là vết đặc trưng cho loài G latifolium Với mẫu Dây thìa canh nhập nội: quan sát thấy có 14 vết tất cả trên sắc ký

đồ VIS-TT, màu sắc và Rf chi tiết các vết tổng hợp trong bảng 3.3

Trang 37

các mẫu thuộc loài G latifolium quan sát ở VIS-TT hoặc UV 366-TT

STT vết R f GS2 GL1a GL2a GL3a GL4a GL5a

1 0,03 Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu

6 0,22 Tím đen/

nâu đậm Tím đen/ nâu đậm Tím đen/ nâu đậm Tím đen/ nâu đậm Tím đen/ nâu đậm Tím đen/ nâu đậm

7 0,31 Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu Xám/nâu

3.2.2.3 Phân tích sắc ký đồ mẫu Dây thìa canh Vân Nam

Quan sát sắc ký đồ mẫu Dây thìa canh Vân Nam có tất cả 12 vết với Rf và màu sắc được trình bày ở bảng 3.4, trong đó các vết tại Rf=0,10; 0,21; 0,59 và 0,63 đặc trưng

trên sắc ký đồ các mẫu loài G yunnanense: vết 0,10-xám; 0,21-xám đậm; 0,59-xám đậm

chỉ xuất hiện trên trên mẫu GYa; vết 0,63 phát huỳnh quang xanh khi soi dưới UV 366nm khác biệt so với các mẫu khác trong chi Xác định 4 vết này là 4 vết đặc trưng

cho loài G yunnanense (bảng 3.4 – trang 31)

3.2.2.4 Phân tích sắc ký đồ mẫu Dây thìa canh G idonorum

Quan sát trên sắc ký đồ mẫu Dây thìa canh G inodorum có tất cả 12 vết với Rf

và màu sắc được trình bày ở bảng 3.4, trong đó có 3 vết đặc trưng tại Rf=0,22 và 0,71 Vết 0,22 tuy cùng Rf các mẫu GLx và GSx nhưng soi UV 366nm lại phát huỳnh quang vàng nâu khác biệt Vết 0,71 cũng phát huỳnh quang vàng nâu và rất đậm chỉ xuất hiện

ở mẫu này Như vậy, sơ bộ có thể coi 2 vết này là 2 vết đặc trưng cho loài G inodorum

(bảng 3.4 – trang 31)

Trang 38

Hình 3.3 Sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân của các mẫu Gymnema nhóm 1

Chú thích: a) Quan sát dưới ánh sáng trắng sau phun thuốc thử

b) Quan sát dưới UV 366nm sau phun thuốc thử

Trang 39

các mẫu thuộc loài G yunnanense và G inodorum quan sát ở VIS-TT hoặc UV

3.3 Kết quả xây dựng cây phân loại dựa trên kết quả sắc ký lớp mỏng của các mẫu

Gymnema nghiên cứu

Theo vân tay sắc ký thu được từ mục 3.2 Nhận thấy kết sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân khi quan sát ở ánh sáng trắng và so sánh màu ở UV 366nm có sự khác nhau nhiều hơn kết quả quan sát ở dịch chiết toàn phần, do đó nhóm nghiên cứu chọn sắc ký

đồ dịch chiết sau thủy phân để xây dựng cây phân loại các mẫu

Tổng hợp kết quả các bảng 3.2, 3.3 và 3.4 thành bảng mã hóa nhị phân mở rộng: thêm một biến phụ (bên cạnh biến chính trùng Rf) là màu sắc khi quan sát dưới UV 366nm (trùng Rf và màu giống nhau = 1; trùng Rf khác màu nhau = 0) Bảng nhị nhân

mở rộng (trong phụ lục 4) được dùng làm dữ liệu tính toán hệ số Nei&Li và vẽ cây phân

Trang 40

loại

Kết quả thu được hệ số tương đồng giữa các mẫu có giá trị từ 0,41 đến 1,00 (bảng 3.5) Về cây phân loại, các mẫu cơ bản được chia thành 4 nhóm (hình 3.4), cụ thể là:

- Nhóm 1 gồm các mẫu Dây thìa canh lá nhỏ (G sylvestre): GS1a, GS3, GS4, GS5

có hệ số tương đồng với nhau lên đến 0,92 Nhóm này lại gồm 2 nhánh nhỏ có

hệ số tương đồng cao hơn là GS4, GS3 (0,95) và đặc biệt hai mẫu GS1a và GS5 giống nhau 100% hình ảnh sắc ký đồ quan sát được

- Nhóm 2 là mẫu G inodorum (GIa) Cây phân loại cho thấy mẫu GIa và nhóm 1

có chung một gốc lớn, tức là tương đồng nhau hơn các nhánh còn lại; trên bảng

hệ số Nei&Li thấy sắc ký đồ GIa có hệ số tương đồng với các mẫu nhóm 1 từ 0,61 đến 0,64

- Nhóm 3 gồm các mẫu Dây thìa canh lá to (GLx) và mẫu Dây thìa canh nhập nội (GS2) có độ tương đồng nhau trong nhóm từ 0,79 trở lên Nhóm này lại tách ra thành 2 nhóm là GS2 và các mẫu GLx Các mẫu GLx phân ra nhỏ hơn thành 3 nhóm (GL2a cùng GL4a; GL3a cùng GL5a; và GL1a) tuy nhiên có hệ số tương đồng cao >90%

- Nhóm 4 là mẫu GYa loài G yunnanense khác biệt nhất trong các mẫu nghiên

cứu: hệ số tương đồng với các mẫu khác chỉ từ 0,41 đến 0,62 và là nhóm ngoài cùng của cây phân loại (bảng 3.5 và hình 3.4)

Định dạng
Số trang	88
Dung lượng	6,67 MB