PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG VÀ CẤU TRÚC CỦA HOẠT CHẤT BORTEZOMIB TỔNG HỢP ĐƯỢC LÀM NGUYÊN LIỆU THUỐC ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐA U TUỶ XƯƠNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN TUẤN ANH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG VÀ CẤU TRÚC CỦA HOẠT CHẤT BORTEZOMIB TỔNG HỢP ĐƯỢC LÀM NGUYÊN LIỆU THUỐC ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐA U TUỶ XƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ : HOÁ HỌC Hà Nội 2019 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN TUẤN ANH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG VÀ CẤU TRÚC CỦA HOẠT CHẤT BORTEZOMIB TỔNG HỢP ĐƯỢC LÀM NGUYÊN LIỆU THUỐC ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐA U TUỶ XƯƠNG CHUYÊN NGÀNH: HOÁ HỌC MÃ SỐ: 8440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ : HOÁ HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS ĐẶNG THỊ TUYẾT ANH Hà Nội 2019 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sỹ: “Phân tích hàm lượng cấu trúc hoạt chất Boterzomib tổng hợp làm nguyên liệu điều trị bệnh đa u tuỷ xương” thực với hướng dẫn TS.Đặng Thị Tuyết Anh Đây chép cá nhân, tổ chức Các kết thực nghiệm, số liệu, nguồn thông tin luận văn tơi tiến hành, trích dẫn, tính tốn đánh giá.Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung mà tơi trình bày luận văn Hà Nội, Ngày tháng năm 2019 HỌC VIÊN Nguyễn Tuấn Anh ii LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS.Đặng Thị Tuyết Anh Phó phòng Hóa Dược - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam dành nhiều thời gian, tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu giúp em hoàn thành luận văn tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn anh, chị đồng nghiệp phòng Hóa dược - Viện hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện để em học tập hoàn thành tốt luận văn Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Hoá Học ,tập thể thầy cô, anh chị bạn Viện Hoá Học tạo điều kiện giúp đỡ em suốt q trình hồn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn Học Viện Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho em trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Em xin gửi lời cảm ơn đến đề tài chương trình Hố Dược Mã số: CNHD.ĐT.076/17-19 để em tham gia thực luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Học viên Nguyễn Tuấn Anh iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1.1 TỔNG QUAN VỀ BORTEZOMIB 1.1.1 Cấu trúc hoá học 1.1.2 Hoạt tính Bortezomib 1.2TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP HOÁ LÝ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI 1.2.1 Phương pháp sắc ký cột 1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 1.2.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 1.2.5 Phương pháp phổ khối lượng (MS) 1.3 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 10 1.3.1 Tính đặc hiệu 10 1.3.2 Độ xác 10 1.3.3 Độ 11 1.4.4 khoảng tuyến tính 11 1.4.5 Miền giá trị 12 1.4.6 Giới hạn phát 13 1.4.7 Giới hạn định lượng 13 CHƯƠNG II 15 THỰC NGHIỆM 15 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 15 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.2.1Chuẩn bị mẫu Bortezomib tổng hợp 15 2.2.2 Phương pháp phân tích cấu trúc 18 2.2.2.1 Phương pháp đo phổ hồng ngoại 18 iv 2.2.2.2 Phương pháp phổ MS 19 2.2.2.3 Phương pháp phổ NMR 19 2.2.3 Phương pháp phân tích định lượng HPLC 19 2.2.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký 19 2.2.3.2 Chuẩn bị mẫu 19 2.2.3.3 Tính thích hợp hệ thống 20 2.2.3.4 Khoảng tuyến tính miền giá trị 20 2.2.3.5 Độ khoảng xác định phương pháp 20 2.2.3.6 Giới hạn phát Giới hạn định lượng 21 2.2.3.7 Độ xác 21 2.2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu 22 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 PHÂN TÍCH XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC BORTEZOMIB 23 3.1.1 Xác định cấu trúc hợp chất 23 3.1.2 Xác định cấu trúc hợp chất 24 3.1.3 Xác định cấu trúc hợp chất 25 3.1.4 Xác định cấu trúc hợp chất Bortezomib 26 3.2 PHÂN TÍCH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BORTEZOMIB 29 3.2.1 Tính thích hợp hệ thống 29 3.2.2 Khoảng tuyến tính 30 3.2.3 Độ khoảng xác định phương pháp 31 3.4.4 Giới hạn phát giới hạn định lượng 32 3.4.5 Độ xác 33 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC 39 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt IR Infrared Spectrometry MS Mass Spectrometry NMR H-NMR 13 Tên gọi Nuclear Magnetic Resonance H-Nuclear Magnetic Resonance Spectrocopy C-NMR 13 HPLC High-performance Liquid Chromatography LDA lithium diisopropylamide THF Tetrahydrofuran C-Nuclear Magnetic Resonance Spectrocoy MECN Acetonitrile MeOH Methanol EtOAc Ethyl acetate EDCI 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimide HBTU 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3tetramethyluronium hexafluorophosphate TBTU 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3tetramethyluronium tetrafluoroborate TFA Trifluoroacetic acid HOBt Hydroxybenzotriazole vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Quy trình phân tách chất sắc ký cột Hình 2: Các bước tiến hành sắc ký mỏng Hình 3: Cách tính giá trị Rf Hình 4: Sơ đồ hệ thống HPLC Hình 5: Sơ đồ cải tiến tổng hợp Bortezomib 16 Hình 6: 1H-NMR hợp chất 23 Hình 7: Phổ 13C- NMR chất 24 Hình 8: Phổ 1H-NMR hợp chất 24 Hình 9: Phổ IR hợp chất 25 Hình 10: Phổ 1H-NMR hợp chất 26 Hình 11: Phổ FTIR hợp chất 26 Hình 12: Phổ 1H-NMR hợp chất 27 Hình 13: Phổ 13C NMR hợp chất 28 Hình 14: Phổ HRMS hợp chất Bortezomib 28 Hình 15: Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ Bortezomib diện tích pic 31 Hình 16: Sắc ký đồ HPLC Bortezomib điều kiện tối ưu chất chuẩn 34 Hình 17: Sắc ký HPLC Bortezomib mẫu tổng hợp 34 vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống 29 Bảng 2: Kết khảo sát độ tuyến tính Bortezomib 30 Bảng 3: Kết khảo sát độ Bortezomib 31 Bảng 4: Kết khảo sát độ lặp lại tạo LOD 32 Bảng 5: Kết khảo sát độ lặp lại Bortezomib 33 MỞ ĐẦU Bortezomib có tên thương mại velcade thuốc kháng ung thư hệ dùng điều trị bệnh đa u tuỷ xương, đa u tuỷ bệnh ung thư tương bào tuỷ xương Bệnh chiếm khoảng 10% tổng số ca bệnh máu ác tính tồn giới, với khoảng 15.200 trường hợp mắc năm, đứng hàng thứ số bệnh máu ác tính, chi phí điều trị bệnh đa u tuỷ xương Việt Nam thuốc bortezomib(velcade) nhập ngoại đắt giá lọ Velcade 3,5 mg xuất xứ từ Bỉ có giá khoảng 25 triệu đồng / lọ (3,5 mg), từ Pháp - khoảng 22 triệu đồng / lọ 3,5 mg từ Ấn Độ - khoảng 14 triệu đồng Ở nước ta nay, q trình tìm hiểu chưa có nghiên cứu việc tổng hợp phân tích định lượng bortezomib cơng bố, đề tài nghiên cứu cải tiến quy trình tổng hợp sản phẩm bortezomib dựa vào ưu điểm nhược điểm phương pháp tổng hợp công bố giới nhằm mục đích tạo điều kiện cho bệnh nhân sử dụng thuốc với giá thành rẻ Tuy nhiên, để đánh giá độ tinh khiết hàm lượng sản phẩm bortezomib tổng hợp xây dựng phương pháp định lượng HPLC ghép đầu dò UV Theo hướng nghiên cứu này, thực đề tài “ phân tích hàm lượng cấu trúc hoạt chất Bortezomib tổng hợp làm nguyên liệu điều trị bệnh đa u tuỷ xương” với mục tiêu sau: Cải tiến quy trình tổng hợp Bortezomib làm nguyên liệu thuốc điều trị bênh đa U tuỷ xương Xây dựng phương pháp xác định cấu trúc Bortezomib Xác định hàm lượng bortezomib phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ghép detector UV 32 Nhận xét: % thu hồi khoảng 98,0 % – 102,0 % với RSD =0,61% < % Khẳng định Phương pháp định lượng Bortezomib mẫu tổng hợp đạt yêu cầu độ Sự tương quan tuyến tính giữ nồng độ diện tích pic khoảng nồng độ Bortezomib từ 0,025 – 0,075 mg/ml ) tương ứng nồng độ Bortezomib 50% đến 150% so với nồng độ định lượng Kết cho thấy nồng độ Bortezomib 80 % đến 120 % so với nồng độ định lượng có độ đúng, độ lặp lại tốt nằm khoảng tuyến tính Như khoảng xác định phương pháp giới hạn từ 80 % đến 120 % so với nồng độ định lượng 3.4.4 Giới hạn phát giới hạn định lượng Giới hạn phát xác định dung dịch chuẩn có nồng độ ≈ 1,25 µg/ml cho đáp ứng píc gấp khoảng lần độ nhiễu đường Tiến hành sắc ký lần dung dịch cho kết độ lặp lại diện tích pic dung dịch có nồng độ mức giới hạn phát ghi bảng Bảng 4: Kết khảo sát độ lặp lại tạo LOD STT Thời gian lưu (phút) Diện tích pic S/N 7,848 30,6 3,0 7,718 34,5 3,1 7,748 33,1 3,1 7,775 28,9 3,3 7,847 32,0 3,1 7,805 34,1 3,1 T.bình 7,790 32,2 3,1 0,680 6,69 (< 10%) RSD (%) => LOD ≈ 1,25 µg/ml LOQ = 1,25 x 3,3 ≈ 3,75 µg/ml 33 3.4.5 Độ xác Để đánh giá hàm lượng bortezomib xác tiến hành đánh giá độ lặp lại cách tiêm mẫu thử sắc ký cho kết số liệu bảng 5: Bảng 5: Kết khảo sát độ lặp lại Bortezomib stt Lượng cân chuẩn: 25 mg Diện tích pic TB mẫu chuẩn: 1250,1 Lượng cân mẫu thử (mg) Diện tích pic % Hàm lượng 25,71 1253,9 98,6 25,03 1248,4 100,8 25,01 1214,7 98,2 25,04 1218,2 98,5 25,39 1229,6 97,9 25,11 1231,1 99,1 Kết định lượng trung bình (n = 6): 98,9 % RSD (n=12): 1,07 % Nhận xét: RSD (n=6) ≤ 3,0 % => Phương pháp đạt yêu cầu độ lặp lại Qui trình phân đáp ứng yêu cầu độ đặc hiệu, độ tuyến tính khoảng xác định, độ đúng, độ lặp lại, thích hợp để định tính, định lượng nguyên liệu Bortezomib mẫu tổng hợp 34 Hình 16: Sắc ký đồ HPLC Bortezomib điều kiện tối ưu chất chuẩn Hình 17: Sắc ký HPLC Bortezomib mẫu tổng hợp 35 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết Luận: Sau thời gian thực luận văn thu kết nghiên cứu sau: Đã xây dựng quy trình cải tiến tổng hợp bortezomib đạt hàm lượng 98,9% qua bước phản ứng phù hợp với điều kiện thực tế Việt Nam Dựa vào phương pháp phân tích hố lý đại xác định cấu trúc hợp chất bortezomib sản phẩm trung gian Đã thẩm định quy trình định lượng bortezomib phương pháp HPLC với đầu dò UV-Vis bước sóng 270nm Quy trình định lượng đạt tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, độ lặp lại, độ đúng, khảo sát tính tuyến tính, giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp Kiến Nghị: Mở rộng nghiên cứu chuyên sâu tổng hợp bortezomib nhằm đạt hiệu suất cao góp phần giảm chi phí điều trị cho bệnh nhân Mở rộng đối tượng nghiên cứu, xác định hàm lượng dược phẩm khác phương pháp HPLC 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bross, P F.; Kane, R.; Farrell, A T.; Abraham, S.; Benson, K.; Brower, M E.; Bradley, S.; Gobburu, J V.; Goheer, A.; Lee, S.-L.; Leighton, J.; Liang, C Y.; Lostritto, R T.; McGuinn, W D.; Morse, D E.; Rahman, A.; Rosario, L A.; Verbois, S L.; Williams, G.; Wang, Y.-C.; Pazdur, R Clin Cancer Res 2004, 10, 3954-3964 Bonvini, P.; Zorzi, E.; Basso, G.; Rosolen, A Leukemia 2007, 21, 838-842 Kisselev, A F.; Goldberg, A L Chem Biol 2001, 8, 739-758 Adams, J Proteasome Inhibitors in Cancer Therapy, Humana: Totowa, NJ, 2004, 17-38 Yannaki, E.; Papadopoulou, A.; Athanasiou, E.; Kaloyannidis, P.; Paraskeva, A.; Bougiouklis, D.; Palladas, P.; Yiangou, M.; Anagnostopoulos, A Arthritis Rheum 2010, 62, 3277-33288 Gerber, F; Krummen, M; Potgeter, H; Roth, A; Siffrin, C; Spoendlin, C “Practical aspects of fast reversed-phase high-performance liquid chromatography using 3μm particle packed columns and monolithic columns in pharmaceutical development and production working under current good manufacturing practice” Journal of Chromatography A 036 ( 2):133 (2004) PMID 15146913 doi:10.1016/j.chroma.2004.02.056 Vụ khoa học đào tạo – Bộ Y tế "Kiểm nghiệm dược phẩm", NXB Y học, (2005), 68-110 Bùi Xuân Vững "Cơ sở Hóa phân tích Định lượng", Trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng (2012), 37 Bilal Yilmaz Emrah Alkan "Spectrofluorometric and Spectrofluorometric and UV Spectrofluorometric Methods for the Determination of Flurbiprofen in Pharmaceutical Preparations", Journal of Pharmaceutical Analysis, 4(4) (2015), 10 McGeer Patrick L, Schulzer Michael, et al "Arthritis and antiinflammatory agents as possible protective factors for Alzheimer's disease A review of 17 epidemiologic studies", Neurology, (1996), 47(2), 425- 432 11 Vikrant Kokane and Sonali Naik "Formulation and evaluation of topical flurbiprofen gel using different gelling agents", World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, (2014), 3(9), 654-663 12 Mei Chenghan, Li Bin, et al "Liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantification of flurbiprofen in human plasma and its application in a study of bioequivalence", Journal of Chromatography (2015), B, 993, 69-74 13 Meister Sabrina, Zlatev Iavor, et al "Nanoparticulate flurbiprofen reduces amyloid-β 42 generation in an in vitro blood–brain barrier model", Alzheimer's research & therapy, (2013), 5(6), 51 14 Murray Kermit K, Boyd Robert K, et al (2013), "Definitions of terms relating to mass spectrometry (IUPAC Recommendations)", Pure and Applied Chemistry, (2013), 85(7), 1515-1609 15 Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm ,"Thẩm định phương pháp phân tích hố học vi sinh vật",NXB Khoa học Kỹ thuật, (2010), 10-59 16 Bộ Y tế ,"Kiểm nghiệm thuốc (dùng cho đào tạo dược sĩ đai học)", Nhà xuất giáo dục Việt Nam, (2012), 135-184 38 17 Smith Graeme ,"European Medicines Agency guideline on bioanalytical method validation: what more is there to say?", Bioanalysis, (2012), 4(8), 865-868 18 Use The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human ,"Validation of analytical procedures: text and methodology", Q2(R1), (2005), 6-13 19 PGS.TS Trần Tử An "Hóa phân tích, Phân tích dụng cụ", Nhà xuất Y học, tập 2.(2007) 20 Adams, J.; ma, Y.; Stein, R.; Baevsky, M.; Grenier, L.; Plamondon, L Patent US 5780454, 1998 21 Ivanov, A S.; Zhalina, A A.; Shishnov, S V Teterhedron 2009, 65, 7105- 7108 22 Pickersgill, I F.; Bishop, J E.; Koellner, C.; Gomez, J -M.; Geiser, A.; Hett, R Patent US 7714159 B2, 2010 23 Henschke, J P.; Xie, A.; Chen, Y F Patent US 0289699 A1, 2012 24 Albert KS, Gillespie WR, et al "Determination of flurbiprofen in human serum by reverse‐phase high‐performance liquid chromatography with fluorescence detection", Journal of pharmaceutical sciences, 73(12), 1823-1825, (1984) 39 PHỤ LỤC Phụ Lục 1: Phổ 1H NMR chất 40 Phụ Lục 2: Phổ 13C- NMR chất Phụ Lục 3: Phổ MS chất 100 99 98 97 96 95 %T 94 701.81cm-1 2870.27 93 92 754.18cm-1 3204.24 3385.66 2927.99 91 3321.23cm-1 90 2954.57cm-1 1294.06cm-1 1020.79cm-1 89 1153.20cm-1 1682.58cm-1 88 1201.33cm-1 87 1516.28cm-1 1403.92cm-1 86 85 4000 3500 3000 2500 2000 1500 cm-1 Phụ Lục 4: Phổ FTIR chất 1000 500 450 41 Phụ Lục 5: Phổ 1H NMR chất 100 98 96 3030.62 94 1054.80 92 %T 2870.98 1453.95cm-1 1030.15cm-1 90 1078.10cm-1 1531.01 88 699.28cm-1 1124.19 86 746.17 1693.24cm-1 2955.49 3323.25cm-1 84 1250.34cm-1 1499.50cm-1 1282.76cm-1 82 1648.58cm-1 2929.19cm-1 1170.24cm-1 1367.77cm-1 80 79 4000 3500 3000 2500 2000 1750 1500 1250 cm-1 Phụ Lục 6: Phổ FTIR chất 1000 750 500 450 42 Phụ Lục 7: Phổ 1H hợp chất 100 98 96 3785.70cm-1 1738.37 94 923.28cm-1 1727.39cm-1 92 744.45cm-1 %T 1579.08 90 1122.84cm-1 88 700.10cm-1 1020.35cm-1 2953.56 3333.78cm-1 1077.74cm-1 1453.67 2870.18 1238.56cm-1 86 1280.79cm-1 1520.03cm-1 1374.68cm-1 2927.86cm-1 84 1466.75cm-1 82 1651.80cm-1 80 79 4000 3500 3000 2500 2000 1750 1500 1250 cm-1 Phụ Lục 8: Phổ FTIR chất 1000 750 500 450 43 100 99 98 97 96 95 %T 94 701.81cm-1 2870.27 93 92 754.18cm-1 3204.24 3385.66 2927.99 91 3321.23cm-1 90 2954.57cm-1 1294.06cm-1 1020.79cm-1 89 1153.20cm-1 1682.58cm-1 88 1201.33cm-1 87 1516.28cm-1 1403.92cm-1 86 85 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 cm-1 Phụ Lục 9: Phổ FTIR hợp chất Phụ Lục 10: Phổ 1H-NMR hợp chất 500 450 44 Phụ Lục 11: Phổ 13C hợp chất A1 #4371 RT: 19.50 AV: NL: 7.00E5 T: FTMS + p ESI Full ms [50.0000-750.0000] 385.2928 100 95 90 85 80 75 70 Relative Abundance 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 384.5 384.6 384.7 384.8 384.9 385.0 385.1 385.2 m/z 385.3 385.4 Phụ Lục 12: Phổ MS hợp chất 385.5 385.6 385.7 385.8 385.9 45 Phụ Lục 13: Phổ HPLC mẫu chuẩn Bortezomib Phụ Lục 14: Phổ HPLC mẫu Bortezomib tổng hợp 46