THIẾT KẾ, TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG KHÁNG ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT CHALCONE NHẰM SÀNG LỌC THUỐC MỚI HƯỚNG ĐIỀU TRỊ BỆNH ALZHEIMER

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- Nguyễn Thị Cẩm Vi THIẾT KẾ, TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG KHÁNG ACETYLCHOLINESTER

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Nguyễn Thị Cẩm Vi

THIẾT KẾ, TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG KHÁNG ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỘT SỐ

DẪN CHẤT CHALCONE NHẰM SÀNG LỌC THUỐC MỚI

HƯỚNG ĐIỀU TRỊ BỆNH ALZHEIMER

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỮU CƠ

Thành phố Hồ Chí Minh – 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Nguyễn Thị Cẩm Vi

THIẾT KẾ, TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG KHÁNG ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT

CHALCONE NHẰM SÀNG LỌC THUỐC MỚI

HƯỚNG ĐIỀU TRỊ BỆNH ALZHEIMER

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 9.44.01.14

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỮU CƠ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS TS Trần Thành Đạo

2 PGS TS Thái Khắc Minh

Thành phố Hồ Chí Minh – 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS TS Trần Thành Đạo và PGS

TS Thái Khắc Minh Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo

Ngoài ra, trong luận án còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc

Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình

Nguyễn Thị Cẩm Vi

TÓM TẮT LUẬN ÁN

Chalcone là một nhóm phụ của flavonoid, được biết đến như là các chất polyphenol có tác động chống oxy hóa, bắt giữ tốt các gốc tự do, do vậy có khả năng ngăn chặn phản ứng viêm xảy ra trên não Gần đây nhiều dẫn chất chalcone được công bố có tác động bảo vệ gan, và hệ thần kinh, ức chế enzyme AChE, điều này chứng tỏ chalcone là nhóm hợp chất đầy tiềm năng phát triển thuốc sử dụng điều trị Alzheimer trong tương lai.Tuy nhiên việc tổng hợp các chalcone và thử hoạt tính kháng AChE không có định hướng trước sẽ hao phí thời gian và kinh tế Việc áp dụng mô hình mô tả phân tử docking để định hướng các cấu trúc có khả năng kháng AChE tốt trước khi tổng hợp sẽ có ý nghĩa rất lớn về mặt thực tiễn,

Trong phạm vi luận án, mô hình mô tả phân tử docking của 107 dẫn chất chalcone (35 dẫn chất chalcone thông thường, 24 chalcone dị vòng, 32 benzylaminochalcone, 16 promazine chalcone) cùng một số nhóm flavonoid (flavone, isoflavone, aurone) đối với AChE (pdb id: 1dX6) đã được thực hiện để khám phá ra các cấu trúc chalcone có khả năng tác động mạnh lên acetylcholinesterase

64 Dẫn chất chalcone, trong đó có 20 dẫn chất chalcone thông thường, 24 dẫn chất chalcone dị vòng, 10 dẫn chất benzylaminochalcone và 10 dẫn chất promazine chalcone được tổng hợp theo định hướng của kết quả nghiên cứu docking tiền sàng lọc về sự liên quan cấu trúc chalcone và tác dụng kháng acetylcholinesterase Các dẫn chất chalcone tổng hợp được tinh khiết bằng phương pháp kết tinh lại trong dung môi thích hợp hoặc sắc ký cột với chất mang silica gel Tính chất vật lý như: độ tan, nhiệt độ nóng chảy của chúng được khảo sát và ghi nhận Cấu trúc của các chalcone tổng hợp (có định hướng trước về cấu trúc) được xác nhận thông qua các phổ UV, IR, 1H-NMR, 13C-NMR, và MS Trong số các chalcone tổng hợp, có 10 dẫn chất benzylaminochalcone và 9 promazine chalcone

là hợp chất mới chưa được công bố trong tạp chí khoa học trước đây theo kết quả

tra cứu Scifinder (tính đến 10/2017)

Tất cả dẫn chất chalcone tổng hợp được thử nghiệm khả năng kháng AChE

in vitro và đánh giá sự tương quan giữa kết quả kháng AChE in vitro với mô hình docking Một số dẫn chất có khả năng kháng AChE rất tốt như dẫn chất (E)-3-(3,4-

(E)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)-1-(4-((2-hydroxybenzyl)amino)phenyl)prop-2-ene-1-

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy hướng dẫn luận án của tôi, PGS TS Trần Thành Đạo và PGS TS Thái Khắc Minh đã tạo mọi điều kiện, động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành tốt luận án này Trong suốt quá trình nghiên cứu, các thầy đã kiên nhẫn hướng dẫn, trợ giúp và động viên tôi rất nhiều Sự hiểu biết sâu sắc về khoa học, cũng như kinh nghiệm của thầy chính là tiền đề giúp tôi đạt được những thành tựu và kinh nghiệm quý báu

Tôi xin cám ơn Khoa Khoa Học Ứng Dụng, Trường đại học Tôn Đức Thắng

đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong công tác để tôi có thể tiến hành tốt luận án Tôi xin cảm ơn các thầy cô ở bộ môn Hóa Dược, Trường đại học Y Dược TP HCM và Viện Công Nghệ Hóa Học Việt Nam đã hỗ trợ tôi trong nghiên cứu Tôi xin cảm ơn các em sinh viên thực hiện khóa luận tốt nghiệp đã đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian qua

Tôi cũng xin cảm ơn bạn bè và gia đình đã luôn bên tôi, cổ vũ và động viên tôi những lúc khó khăn để có thể vượt qua và hoàn thành tốt luận án này

Nghiên cứu sinh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ii

TÓM TẮT LUẬN ÁN iii

LỜI CẢM ƠN v

MỤC LỤC vi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ xiv

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ xviii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Bệnh Alzheimer 3

1.1.1 Khái quát về bệnh Alzheimer 3

1.1.2 Đặc điểm bệnh Alzheimer 4

1.1.3 Nguyên nhân bệnh Alzheimer 5

1.1.4 Thuốc điều trị Alzheimer 6

1.1.4.1 Các thuốc ngăn chặn, ức chế sự hình thành amyloid 6

1.1.4.2 Các thuốc bảo vệ tế bào thần kinh 7

1.1.4.3 Các thuốc kháng acetylcholinesterase 7

1.2 Enzyme acetylcholinesterase 10

1.3 Chalcone 13

1.3.1 Khái quát về chalcone 13

1.3.2 Các phương pháp tổng hợp chalcone 15

1.4 Mô hình mô tả phân tử docking 17

1.4.1 Giới thiệu về docking 17

1.4.2 Các dạng docking 18

1.5 Khảo sát khả năng kháng AChE bằng phương pháp Ellman 21

1.6 Mô hình chống suy giảm trí nhớ ngắn hạn 22

1.7 Các nghiên cứu trước đây của một số tác giả khác trong và ngoài nước 22

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu 26

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Nội dung nghiên cứu 26

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3 Mô tả tiến trình thí nghiệm 28

2.3.1 Mô hình mô tả phân tử docking 28

2.3.1.1 Đối tượng 28

2.3.1.2 Các phần mềm hỗ trợ nghiên cứu 28

2.3.1.3 Quy trình tiến hành mô hình mô tả phân tử docking 28

2.3.2 Tổng hợp 35

2.3.2.1 guyên v t liệu h a ch t 35

2.3.2.2 Trang thiết bị 35

2.3.2.3 Tổng hợp chalcone 35

2.3.2.4 Phương pháp xác định c u trúc h a học 3551

2.3.3 Khảo sát hoạt tính kháng AChE 52

2.3.3.1 guyên v t liệu trong khảo sát hoạt tính kháng AChE 52

2.3.3.2 Trang thiết bị trong khảo sát hoạt tính kháng AChE 52

2.3.3.3 Các bước tiến hành phương pháp Ellman 52

2.3.4 Khảo sát khả năng chống suy giảm trí nhớ ngắn hạn in vivo 54

2.3.4.1 guyên v t liệu khảo sát khả năng chống suy giảm trí nhớ ngắn hạn in vivo 54

2.3.4.3 Khảo sát khả năng chống suy giảm trí nhớ ngắn hạn 55

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 59

3.1 Mô hình mô tả docking 59

3.1.1 Re-docking ligand đồng kết tinh 59

3.1.1.1 Kiểu liên kết của galantamine trong c u trúc tinh thể của phức hợp TcAChE - Galantamine 59

3.1.1.2 Re-docking ligand đồng kết tinh 59

3.1.2 Docking các dẫn chất chalcone 60

3.1.2.1 Docking 35 dẫn ch t chalcone thông thường 60

3.1.2.2 Docking các dẫn ch t chalcone dị vòng 64

3.1.2.3 Docking các dẫn ch t benzylaminochalcone 70

3.1.2.4 Docking các dẫn ch t promazine chalcone 76

3.2 Tổng hợp các dẫn chất chalcone 80

3.2.1 Tổng hợp các dẫn chất chalcone thông thường 80

3.2.2 Tổng hợp các dẫn chất chalcone dị vòng 88

3.2.3 Tổng hợp các dẫn chất benzylaminochalcone 91

3.2.4 Tổng hợp các dẫn chất promazine chalcone: 97

3.2.5 Bàn luận kết quả tổng hợp 104

3.2.5.1 Cơ chế phản ứng tổng hợp 104

3.2.5.2 Xác định c u trúc chalcone tổng hợp 108

3.3 Khảo sát khả năng kháng acetylcholinesterase của các dẫn chất chalcone 121

3.3.1 Khảo sát khả năng kháng acetylcholinesterase của các dẫn chất chalcone thông thường 121

3.3.2 Khảo sát khả năng kháng acetylcholinesterase của các dẫn chất chalcone dị vòng 128

3.3.3 Khảo sát khả năng kháng acetylcholinesterase của các dẫn chất

benzylaminochalcone 130

3.3.4 Khảo sát khả năng kháng acetylcholinesterase của các dẫn chất promazine chalcone 135

3.4 Kết quả khảo sát tác dụng chống SGTN ngắn hạn in vivo của dẫn chất benzylaminochalcone 138

3.4.1 Mô hình mê cung chữ Y 138

3.4.2 Mô hình khám phá vật thể 140

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 143

TÀI LIỆU THAM KHẢO 145

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 152

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ABCG2 : ATP-binding cassette sub-family G member 2

ESIMS : Electrospray ionization mass spectra

ERAB : Endoplasmic-reticulum associated binding protein

IR : Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại)

Par-4 : Prostate apoptosis response - 4

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tỷ lệ người mắc bệnh Alzheimer sau 65 tuổi 4

Bảng 2.1 Danh sách các phần mềm 29

Bảng 2.2 Các hóa chất sử dụng để tổng hợp chalcone 36

Bảng 2.3 Trang thiết bị sử dụng trong tổng hợp, tinh chế và kiểm nghiệm 37

Bảng 2.4 Nguyên liệu, điều kiện phản ứng tổng hợp 20 dẫn chất chalcone thông thường 38

Bảng 2.5 Nguyên liệu, điều kiện phản ứng tổng hợp 24 dẫn chất chalcone dị vòng 42

Bảng 2.6 Nguyên liệu, điều kiện phản ứng tổng hợp 10 dẫn chất benzylaminochalcone 447

Bảng 2.7 Nguyên liệu, điều kiện phản ứng tổng hợp 10 dẫn chất promazine chalcone49 Bảng 2.8 Nguyên liệu sử dụng trong khảo sát khả năng kháng AChE 51

Bảng 2.9 Trang thiết bị sử dụng trong khảo sát khả năng kháng acetylcholinesterase 52

Bảng 2.10 Thành phần các hóa chất chứa trong mỗi loại mẫu đo của phương pháp Ellman 52

Bảng 3.1 Kết quả docking lại ligand đồng kết tinh 60

Bảng 3.2 Hiệu suất tổng hợp, tính chất vật lý, phổ IR của 20 dẫn chất chalcone thông thường 81

Bảng 3.3 Phổ 1 H-NMR (500 MHz, DMSO–d 6) của 20 dẫn chất chalcone thông thường 84

Bảng 3.4 Hiệu suất tổng hợp, tính chất vật lý, phổ IR của 24 chalcone dị vòng 88

Bảng 3.5 Hiệu suất tổng hợp, tính chất vật lý, phổ UV và MS của 10 dẫn chất benzylaminochalcone 92

Bảng 3.6 Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO–d 6) của 10 dẫn chất benzylaminochalcone 94

Bảng 3.7 Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6, δ ppm) của 10 dẫn chất

benzylaminochalcone 96

Bảng 3.8 Hiệu suất tổng hợp, tính chất vật lý, phổ MS của 10 dẫn chất promazine chalcone 98

Bảng 3.9 Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO–d 6) của 10 dẫn chất promazine chalcone 100

Bảng 3.10 Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6, δ ppm) của 10 dẫn chất promazine chalcone 103

Bảng 3.11 Tóm tắt phân tích phổ 1H-NMR và 13C-NMR của A6 115

Bảng 3.12 Tóm tắt phân tích phổ 1H-NMR và 13C-NMR của AC1 120

Bảng 3.13 Giá trị IC50 kháng AChE của 20 dẫn chất chalcone thông thường 121

Bảng 3.14 Điểm số docking của 20 dẫn chất chalcone tổng hợp 124

Bảng 3.15 Giá trị IC50 và điểm số docking của các dẫn chất chalcone theo nhóm thế126 Bảng 3.16 Giá trị IC50 kháng AChE của 24 dẫn chất chalcone dị vòng 128

Bảng 3.17 Giá trị IC50 kháng AChE của 10 benzylaminochalcone 130

Bảng 3.18 Giá trị IC50 kháng AChE của 10 promazine chalcone 136

Bảng 3.19 Tỷ lệ (%) tổ hợp khi chuột di chuyển vào các nhánh A, B, C trong thử nghiệm mê cung chữ Y giữa các nhóm thử nghiệm 139

Bảng 3.20 Phần trăm khám phá vật thể của từng nhóm trong thử nghiệm mô hình khám phá vật thể 140

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Cấu tạo vỏ não của người bình thường và người bị bệnh Alzheimer 3

Hình 1.2 Mảng protein dạng bột amyloid bám trên tế bào thần kinh 6

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử memantine 7

Hình 1.4 Cấu trúc các thuốc ức chế acetylcholinesterase 8

Hình 1.5 Cấu trúc 3D của acetylcholinesterase 10

Hình 1.6 Trung tâm hoạt động của acetylcholinesterase 10

Hình 1.7 Cấu trúc và qui tắc đánh số của chalcone 14

Hình 1.8 Các phần của ligand sắp xếp vào vị trí phù hợp trong các quả cầu xếp chồng lên nhau ở vùng tác động 19

Hình 1.9 Nguyên lý docking bằng phân mảnh cấu trúc sử dụng 20

Hình 2.1 Cấu trúc phức hợp 1dX6 biểu diễn 3D nhờ phần mềm BioSolveIT LeadIt 29

Hình 2.2 Chuẩn bị cấu trúc 2D và 3D của dẫn chất S28 bằng phần mềm ChemBioOffice 2008 30

Hình 2.3 Tối thiểu hóa năng lượng dẫn chất S28 bằng phần mềm SYBYL-X 1.1 31

Hình 2.4 Động lực học phân tử dẫn chất S28 bằng phần mềm SYBYL-X 1.1 32

Hình 2.5 Docking dẫn chất S28 vào 1dX6 bằng phần mềm BioSolveIT LeadIt 33

Hình 2.6 Phân tích tương tác giữa dẫn chất S28 và 1dX6 bằng phần mềm MOE 2008.10 34

Hình 2.7 Cấu trúc tổng quát của benzylaminochalcone 45

Hình 2.8 Cấu trúc tổng quát của promazine chalcone 48

Hình 2.9 Mô hình mê cung chữ Y 54

Hình 2.10 Mô hình khám phá vật thể 54

Hình 2.11 Mô hình khám phá vật thể ngày thứ nhất 56

Hình 2.13 Mô hình khám phá vật thể ngày thứ ba 57

Hình 3.1 Kiểu liên kết của galantamine trong cấu trúc tinh thể của phức hợp TcAChE - Galantamine 59

Hình 3.2 Gióng hàng các ligand đồng kết tinh được re-dock so với các ligand có sẵn trong phức hợp 60

Hình 3.3 Tương tác của phân tử dẫn chất S32 và S33 với AChE (pdbid: 1dX6) 61

Hình 3.4 Tương tác của dẫn chất S23 với AChE 63

Hình 3.5 Những vị trí nhóm thế của chalcone làm tăng khả năng kháng AChE 64

Hình 3.6 Những vị trí nhóm thế của chalcone làm giảm khả năng kháng AChE 64

Hình 3.7 Các tương tác của dẫn chất D1 và D2 và AChE (pdb id: 1dX6) 65

Hình 3.8 Mô hình mô tả phân tử docking của D5 67

Hình 3.9 Mô hình mô tả phân tử docking của D8 68

Hình 3.10 Mô hình mô tả phân tử docking của D20 và D21 69

Hình 3.11 Cấu trúc của chalcone dị vòng làm tăng khả năng kháng AChE 70

Hình 3.12 Biểu đồ thể hiện điểm số docking của 32 dẫn chất benzylaminochalcone 71

Hình 3.13 Tương tác của phân tử dẫn chất B5 với các amino acid trong vùng tác động của AChE 71

Hình 3.14 Tương tác của phân tử dẫn chất B10 với các amino acid trong vùng tác động của AChE 72

Hình 3.15 Tương tác của phân tử dẫn chất B8 với các amino acid trong vùng tác động của AChE 73

Hình 3.16 Tương tác của phân tử dẫn chất B6 với các amino acid trong vùng tác động của AChE 73

Hình 3.17 Tương tác của phân tử dẫn chất B9 với các amino acid trong vùng tác động của AChE (pdb id: 1dX6) 75

Hình 3.18 Những vị trí nhóm thế của benzylaminochalcone làm tăng khả năng

kháng AChE 75

Hình 3.19 Tương tác của phân tử dẫn chất C7 với các amino acid trong vùng tác động của AChE (pdb id: 1dX6) 76

Hình 3.20 Tương tác của phân tử dẫn chất C6 với các amino acid trong vùng tác động của AChE (pdb id: 1dX6) 78

Hình 3.21 Tương tác của phân tử dẫn chất C8 với các amino acid trong vùng tác động của AChE (pdb id: 1dX6) 78

Hình 3.22 Những vị trí nhóm thế của promazine chalcone làm tăng khả năng kháng AChE (pdb id: 1dX6) 79

Hình 3.23 Những vị trí nhóm thế của promazine chalcone làm giảm khả năng kháng AChE (pdb id: 1dX6) 79

Hình 3.24 Phổ MS của A6 109

Hình 3.25 Cấu trúc của A6 111

Hình 3.26 Phổ 1H-NMR dãn rộng của A6 113

Hình 3.27 Phổ 13C-NMR dãn rộng của A6 114

Hình 3.28 Phổ MS của AC1 116

Hình 3.29 Cấu trúc của AC1 118

Hình 3.30 Mô hình mô tả phân tử docking của dẫn chất 2'-hydroxy-2,4-dichlorochalcone (ST3) với AChE (pdb id: 1dX6) dạng 2D và 3D 124

Hình 3.31 Sự tương quan giữa điểm số docking và hoạt tính sinh học của các dẫn chất chalcone 125

Hình 3.32 Mô hình tương tác giữa ST1 và ST2 với AChE (pdb id: 1dX6) 126

Hình 3.33 Mô hình tương tác 2D và 3D giữa ST17 và AChE (pdb id: 1dX6) 127

Hình 3.34 Giá trị IC50 kháng AChE của galantamine và 24 dẫn chất chalcone dị vòng trong nghiên cứu 129

Hình 3.35 Tương quan giữa điểm số docking và hoạt tính sinh học của các dẫn chất

benzylaminochalcone 132

Hình 3.36 Mô hình tương tác 2D giữa A3 và AChE (pdb id: 1dX6) 133

Hình 3.37 Mô hình tương tác 2D giữa A6 và AChE (pdb id: 1dX6) 134

Hình 3.38 Mô hình tương tác 2D giữa donepezil và AChE (pdb id: 1dX6) 134

Hình 3.39 Tương quan giữa điểm số docking và hoạt tính sinh học của các dẫn chất promazine chalcone 137

Hình 3.40 Tỷ lệ (%) tổ hợp khi chuột di chuyển vào các nhánh A, B, C trong thử nghiệm mê cung chữ Y giữa các nhóm thử nghiệm 139

Hình 3.41 Phần trăm khám phá vật thể của từng nhóm trong thử nghiệm mô hình khám phá vật thể 141

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Sơ đồ xúc tác thủy phân acetylcholine 13

Sơ đồ 1.2 Tổng hợp chalcone dựa vào phản ứng ngưng tụ Claisen-Schmidt 15

Sơ đồ 1.3 Tổng hợp chalcone theo phương pháp Suzuki 16

Sơ đồ 1.4 Tổng hợp chalcone dựa vào phản ứng Heck 16

Sơ đồ 1.5 Tổng hợp chalcone dựa vào phản ứng acyl hóa Friedel-Crafts 17

Sơ đồ 1.6 Sơ đồ phản ứng tạo sản phẩm màu của phương pháp Ellman 21

Sơ đồ 2.1 Phản ứng ngưng tụ Claisen - Schmidt 27

Sơ đồ 2.2 Quy trình tiến hành mô hình mô tả phân tử docking 35

Sơ đồ 2.3 Phản ứng tổng hợp các benzylaminochalcone 45

Sơ đồ 2.4 Phản ứng tổng hợp promazine chalcone 45

Sơ đồ 2.5 Quy trình thử nghiệm in vivo 55

Sơ đồ 3.1 Sự tạo thành enolate trong môi trường kiềm 104

Sơ đồ 3.2 Cơ chế phản ứng tạo chalcone trong môi trường kiềm 104

Sơ đồ 3.3 Cơ chế phản ứng tạo imin từ 4'-aminoacetophenone 107

Sơ đồ 3.4 Cơ chế phản ứng khử hóa imine tạo amine 107

MỞ ĐẦU

Từ những năm 70, các nhà khoa học tìm thấy rằng mức độ của chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine giữ vai trò quan trọng trong tiến trình hình thành trí nhớ ở vùng dưới đồi và não tủy, giảm rõ rệt ở những bệnh nhân Alzheimer.[1] Do đó, chất kháng acetylcholinesterase, làm chậm trễ sự phân hủy ACh, sẽ làm tăng lượng ACh xung quanh điểm tiếp hợp của tế bào thần kinh kết quả giúp cải thiện tình trạng suy giảm trí nhớ Vì lợi ích đó, các chất kháng AChE vẫn đang là đề tài để các nhà nghiên cứu tiếp tục tìm kiếm và khám phá

Mặc dù chưa hiểu rõ cơ chế gây bệnh, nhưng trong vòng 5 năm gần đây

đã có nhiều tiến bộ trong điều trị suy giảm trí nhớ nói chung và bệnh Alzheimer nói riêng Theo phát đồ điều trị được áp dụng phổ biến nhất hiện nay, thuốc kháng acetylcholinesterase đóng vai trò chủ lực, bên cạnh các thuốc chống oxy hóa, các thuốc kháng viêm và thuốc bảo vệ thần kinh.[1]

Đến nay chưa có thuốc nào sở hữu đồng thời nhiều tác động dược lý vừa kháng AChE, vừa kháng viêm, chống oxy hóa… Do vậy, tìm kiếm phân tử thể hiện đa tác động dược lý, trong dó có tác động chủ lực kháng acetylcholinesterase và chống oxy hóa là một ý tưởng mới cần nghiên cứu

Chalcone là một nhóm phụ của flavonoid, được biết đến như là các chất polyphenol có tác động chống oxy hóa, bắt giữ tốt các gốc tự do, do vậy có khả năng ngăn chặn phản ứng viêm xảy ra trên não Gần đây nhiều dẫn chất chalcone được công bố có tác động bảo vệ gan, và hệ thần kinh, ức chế enzyme AChE, điều này chứng tỏ chalcone là nhóm hợp chất đầy tiềm năng phát triển thuốc sử dụng điều trị Alzheimer trong tương lai.[2-4] Tuy nhiên việc tổng hợp các chalcone và thử hoạt tính kháng AChE không có định hướng trước sẽ hao phí thời gian và kinh tế Việc áp dụng mô hình mô tả phân tử docking để định hướng các cấu trúc có khả năng kháng AChE tốt trước khi tổng hợp sẽ có ý nghĩa rất lớn về mặt thực tiễn,

đánh giá tác động kháng acetylcholinesterase của một số dẫn ch t chalcone nhằm sàng lọc thuốc mới hướng điều trị bệnh Alzheimer" được thực hiện

Mục tiêu của đề tài

Sử dụng mô hình docking để dự đoán các cấu trúc chalcone có khả năng kháng AChE tốt Tổng hợp chọn lọc các chalcone dựa theo docking và thử hoạt tính sinh học kháng AChE để tìm ra dẫn chất tiềm năng trong điều trị bệnh Alzheimer

Nội dung đề tài

- Sử dụng mô hình mô tả phân tử docking để tìm ra cấu trúc chalcone có ưu thế trong việc kháng acetylcholinesterase

- Tổng hợp chọn lọc các dẫn chất chalcone theo định hướng của nghiên cứu mô hình docking

- Thử nghiệm khả năng kháng AChE của các dẫn chất chalcone đồng thời đánh giá

mối tương quan giữa kết quả kháng AChE in vitro và mô hình docking

- Dẫn chất có khả năng kháng AChE mạnh nhất được khảo sát tác dụng chống suy

giảm trí nhớ ngắn hạn in vivo

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Thông qua mô hình docking phân tử hướng đến tìm kiếm mối liên hệ giữa cấu trúc và tác động kháng acetylcholinesterase của các dẫn chất chalcone để định hướng tổng hợp chọn lọc các dẫn xuất chalcone có hoạt tính tốt trong điều trị bệnh

Alzhemer Từ đó tìm ra các dẫn chất mới tiềm năng trong điều trị bệnh Alzheimer

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh Alzheimer

1.1.1 Khái quát về bệnh Alzheimer

Alzheimer là bệnh thoái hóa cả não bộ không hồi phục, gây nên chứng sa sút trí tuệ ở người cao tuổi Tổn thương tế bào thần kinh ở vỏ não và những cấu trúc xung quanh làm sa sút trí nhớ, giảm phối hợp vận động, giảm cảm giác, nhận cảm sai , cuối cùng là mất trí nhớ và chức năng tâm thần.[5]

Bệnh Alzheimer mang tên bác sĩ người Đức Alois Alzheimer Bác sĩ Alzheimer khám phá sự thay đổi mô não của một người phụ nữ chết vì bệnh thần kinh bất thường và quan sát thấy những mảnh protein dạng bột amyloid “bất thường” và các sợi mảnh protein hỗ trợ neuron “TAU” bị xoắn lại trong não Những mảng protein dạng bột amyloid và đám rối protein “TAU” trong não hiện nay được xem là điểm chính của bệnh Alzheimer Ở các bệnh nhân Alzheimer, các neuron thần kinh chết một cách từ từ đồng thời cũng suy giảm nồng độ các chất dẫn truyền sung thần kinh acetylcholine và rối loạn các tín hiệu trrong não.[6]

Hình 1.1 Cấu tạo vỏ não của người bình thường và người bị bệnh Alzheimer[5]

Bệnh Alzheimer là bệnh thường gặp ở người cao tuổi và số lượng bệnh nhân ngày càng gia tăng Nghiên cứu mới đây cho thấy số lượng bệnh nhân Alzheimer trên toàn cầu là hơn 37 triệu trong đó 16 triệu ở Mỹ, 1,5 triệu ở Nhật Bản Khu vực

lượng mắc bệnh mất trí nhớ tuổi già Alzheimer chiếm tỷ lệ lớn Theo ước tính chi phí tối thiểu tiêu tốn năm 2007 (trực tiếp và gián tiếp) cho bệnh nhân Alzheimer riêng ở Hoa kỳ là 100 tỷ USD.[7]

Tổ chức Y tế Thế giới ước tính rằng trong năm 2015 có 0,441% người trên thế giới mắc bệnh, và tỷ lệ sẽ tăng lên 0,556% vào năm 2030.[5] Các nghiên cứu khác cũng cho kết luận tương tự Các yếu tố sau đây góp phần tăng khả năng mắc bệnh Alzheimer: tuổi, giới tính, dân tộc, bệnh liên quan về huyết áp, tăng cholesterol máu, hội chứng Down… Trong đó, tuổi là yếu tố có nguy cơ cao nhất như trình bày ở bảng 1.1 Bắt đầu từ tuổi 65 thì mỗi 5 năm có gấp đôi số ca bị Alzheimer và tuổi 85 thì có phân nửa số người bị bệnh Alzheimer

Bảng 1.1 Tỷ lệ người mắc bệnh Alzheimer sau 65 tuổi[7]

Tuổi Số ca nhiễm bệnh trong 1000 người/năm

Các giai đoạn của bệnh:

Thời kỳ đầu: Một phần nhỏ trong số những bệnh nhân gặp khó khăn về ngôn ngữ, khó khăn về chức năng điều hành, nhận thức, hoặc chức năng thực hiện các

Thời kỳ giữa: Người bệnh dần dần mất các khả năng thực hiện những vận động sinh hoạt hàng ngày, ngôn ngữ bị xáo trộn, mất khả năng đọc viết.[8]

Thời kỳ cuối: Trong giai đoạn cuối, bệnh nhân hoàn toàn phụ thuộc vào người chăm sóc Ngôn ngữ giảm thiểu chỉ còn các cụm từ đơn giản hoặc thậm chí là những từ đơn, cuối cùng dẫn đến mất tiếng nói và liệt toàn thân Người bị bệnh Alzheimer sau đó thường sẽ chết bởi các tác nhân bên ngoài như nhiễm trùng, viêm phổi … [8]

1.1.3 Nguyên nhân bệnh Alzheimer

Nguyên nhân của bệnh Alzheimer được cho là do sự hiện diện của các mảng protein dạng bột beta amyloid- bám ở não được trình bày trong hình 1.2 và các đám rối của protein “TAU” làm cho não bị tổn thương và chết các tế bào thần kinh.[5, 7]

Nguyên nhân đầu tiên kể đến là sự xuất hiện của một protein beta amyloid, chúng không hòa tan nên tích tụ thành những mảng keo Ở bệnh nhân Alzheimer, những chất này nằm xung quanh các tế bào thần kinh chết, một loại protein có tên amyloid precursor cũng tồn tại ở đây giúp cho hoạt động hủy hoại tế bào thần kinh của beta amyloid Sự có mặt quá nhiều của beta amyloid sẽ làm giảm chất trung gian dẫn truyền thần kinh ACh cần thiết cho trí nhớ Beta amyloid cũng ngăn chặn sự vận chuyển ion K+, Na+, Ca2+ qua màng tế bào Ngoài ra còn có vai trò của một số chất protein khác như ERAB (endoplasmic-reticulum associated binding protein), mảng AMY (giống beta amyloid), Par-4 (prostate apoptosis response - 4).[7, 9]

Hình 1.2 Mảng protein dạng bột amyloid bám trên tế bào thần kinh[7]

Đồng thời, ở bệnh nhân Alzheimer có sự hiện diện của nhiều AChE sẽ làm thiếu hụt chất trung gian dẫn truyền thần kinh ACh cần thiết cho trí nhớ.[8]

Một số yếu tố khác đã được xác định có liên quan Alzheimer là yếu tố gene, homocystein, sự thiếu hụt vitamin nhóm B, trầm cảm, chấn thương đầu, nhóm người có điều kiện kinh tế kém và học vấn thấp, và một số yếu tố môi trường khác [8]

1.1.4 Thuốc điều trị Alzheimer

Cho đến gần đây vẫn chưa có phương pháp nào thực sự điều trị cho bệnh Alzheimer Thuốc và chăm sóc bệnh nhân là những biện pháp chủ yếu Hiện nay chưa có thuốc để điều trị bệnh Alzheimer nhưng có một số thuốc được cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) và cơ quan quản lý thuốc châu Âu (EMA) công nhận có khả năng kháng AChE nhằm trì hoãn hoặc ngăn chặn sự tiến triển của bệnh.[6]

1.1.4.1 Các thuốc ngăn chặn, ức chế sự hình thành amyloid

Đây là hướng được nghiên cứu nhiều nhưng vẫn chưa có thuốc nào chứng tỏ thật hữu hiệu Đã có nghiên cứu bào chế vaccin sử dụng kháng thể kháng amyloid Hoặc có nghiên cứu sử dụng các statin (nhóm thuốc trị rối loạn lipid máu) hoặc sử dụng thuốc chống viêm không steriod (NSAID) để làm giảm sự hình thành amyloid.[6]

1.1.4.2 Các thuốc bảo vệ tế bào thần kinh

 Chất chống oxy hoá

Có 3 vitamin: vitamin C, vitamin E và beta-carotene (tiền vitamin A) và chất khoáng là selen được xem là chất chống oxy hoá chống lại gốc tự do gây hại tế bào

Ngoài ra còn có dược thảo Ginkgo biloba (chứa flavonoid), trà xanh (chứa

polyphenol) cũng có tác dụng chống oxy hoá Tuy nhiên, sử dụng chất chống oxy hoá chỉ có tác dụng hỗ trợ chứ không thể điều trị sa sút trí tuệ.[6]

 Thuốc đối kháng thụ thể N - methyl - D - aspartate (NMDA)

Trong các bệnh lý thoái hóa thần kinh có hiện tượng tăng hoạt hóa các thụ thể glutamate, trong đó có thụ thể NMDA Memantine là thuốc đầu tiên có tác dụng bảo vệ tế bào chống lại sự gia tăng hoạt tính của hệ thống glutamate bằng cách ức chế thụ thể này Thuốc được cho phép sử dụng tại Châu Âu từ năm 2002 để điều trị các trường hợp bệnh Alzheimer mức độ trung bình và nặng (điểm MMSE 3-14).[6]

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử memantine

1.1.4.3 Các thuốc kháng acetylcholinesterase

Cho tới nay thuốc kháng acetylcholinesterase được xem là nhóm thuốc chính trong điều trị bệnh Alzheimer và các bệnh sa sút trí tuệ khác Nhóm thuốc này đã được chứng minh là có hiệu quả hơn Placebo trong việc điều trị các triệu chứng của bệnh Alzheimer và các bệnh sa sút trí tuệ khác khi được sử dụng ở giai đoạn bệnh mức độ nhẹ và trung bình (điểm MMSE 10-24), tuy nhiên các thuốc này không ngăn chặn được hoàn toàn diễn tiến tự nhiên của bệnh

Các thuốc kháng acetylcholinesterase sẽ bảo tồn hệ cholinergic giúp hoạt động thần kinh tốt hơn, cải thiện được trí nhớ và nhận thức

Có 4 thuốc được FDA chấp thuận cho sử dụng điều trị bệnh Alzheimer nhẹ và vừa: tacrine (1993), donepezil (1996), rivastigmine (2000), galantamine (2001)

Các thuốc kháng enzyme cholinesterase được khuyến cáo sử dụng trong hướng dẫn điều trị của NICE (National Institute of Clinical Exellence) 2006 và của Hội Thần Kinh Hoa Kỳ nhưng không được khuyến cáo sử dụng trong điều trị các bệnh lý sa sút trí tuệ khác.[6]

 Tacrine

Là thuốc kháng enzyme cholinesterase được FDA chấp thuận cho sử dụng đầu tiên (1993), thuốc được chứng minh làm giảm tình trạng suy giảm nhận thức trên bệnh nhân Alzheimer và làm chậm thời gian bệnh nhân phải có người chăm sóc Tuy nhiên hiện nay thuốc ít được sử dụng do độc tính của thuốc trên chức năng gan.[6]

nghiệm gan Nhưng nó có thể làm chậm nhịp tim dẫn đến hôn mê ở một số bệnh nhân khi sử dụng thuốc này.[6]

Có 3 nghiên cứu chứng minh donepezil có hiệu quả ổn định tình trạng nhận thức của bệnh nhân Alzheimer, thuốc dung nạp tốt vì ít tác dụng phụ (trong các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ bệnh nhân bị tác dụng phụ tương đương với Placebo) Donepezil không có độc tính trên chức năng gan và rất ít tương tác với các thuốc khác.[6]

Thuốc sử dụng 1 liều vào buổi tối 5 mg, sau 4-6 tuần có thể tăng tới 10 mg Tác dụng phụ thường gặp là rối loạn tiêu hóa và rối loạn giấc ngủ

 Rivastigmine

Rivastigmine được FDA chấp thuận cho sử dụng từ tháng 4 năm 2000 Rivastigmine không những kháng AChE mà còn ức chế BuChE (butyrylcholinesterase) Có thử nghiệm cho biết hoạt động của AChE giảm bớt trong một vài vùng ở não và hoạt động của BuChE gia tăng ở những vùng đó Tuy nhiên, rivastigmin có thể có tác dụng phụ về tiêu hóa.[16]

Rivastigmine có tác dụng chọn lọc trên vùng vỏ não hồi hải mã và vùng vỏ não mới (neocortex), là nơi bị ảnh hưởng nhiều nhất trên bệnh nhân Alzheimer

Với liều 6-12 mg/ ngày, rivastigmine được chứng minh có hiệu quả trong các trường hợp Alzheimer mức độ nhẹ hoặc trung bình Thuốc được khởi đầu điều trị với liều 1,5 mg/ ngày 2 lần sau khi ăn và tăng dần sau 6-8 tuần để tránh tác dụng phụ về tiêu hóa

 Galantamine

Thuốc được FDA công nhận ngày 28 tháng 2 năm 2001 Galantamine xuất

hiện trong tự nhiên ở củ cây thủy tiên hoa vàng (Narcissus pseudonarcissus)

Galantamine là một alkaloid, được coi như có tác dụng tranh đua và ức chế đảo ngược được AChE Galantamine cũng có những phản ứng phụ như nôn mửa, tiêu chảy, chán ăn, sút cân, mệt mỏi, chóng mặt, nhức đầu, mất ngủ hay trầm cảm.[10]

Galantamine, ngoài cơ chế ức chế enzyme cholinesterase, còn có tác dụng điều hòa thụ thể Nicotine Đã có 3 công trình nghiên cứu tiền cứu (phương pháp mù đôi và đối chứng) xác định thuốc có hiệu quả trong các trường hợp bệnh Alzheimer mức độ nhẹ và trung bình với liều 16, 24 hoặc 32 mg/ngày.[6]

Thuốc được khởi đầu điều trị với liều 4 mg/ngày hai lần uống sau ăn và tăng dần 4 mg sau mỗi 6-8 tuần.[6]

1.2 Enzyme acetylcholinesterase

Hình 1.5 Cấu trúc 3D của acetylcholinesterase[11]

AChE là một trong hai loại enzyme thuộc nhóm cholinesterase xúc tác cho sự thủy phân của các chất truyền thần kinh ACh thành choline và acetate Cấu trúc 3D

của AChE được thể hiện trong hình 1.5

Theo danh pháp quốc tế AChE mang mã số EC 3.1.1.7[11]

Lớp 3: xúc tác phản ứng thủy phân

Phân lớp 1: thủy phân liên kết ester

Nhóm 1: thủy phân liên kết carboxylester

h m phụ 7: vị trí thứ 7 trong nhóm 1 của phân lớp 1, lớp 3

Acetylcholine trong cơ thể được phân hủy bởi acetylcholinesterase để tái lập

tác cho quá trình này được xem là một trong những enzyme tác động nhanh nhất trong tự nhiên, với trung bình 10.000 phân tử cơ chất được phân hủy trong 1 giây.[5]

Trong cấu trúc AChE, hai vùng gắn kết quan trọng đã được nghiên cứu chi tiết là vùng xúc tác và vùng ngoại biên

Hình 1.6 Trung tâm hoạt động của acetylcholinesterase[12]

Vùng xúc tác chịu trách nhiệm thủy phân ACh nằm ở đáy của một khoang tác động rộng khoảng 5 Å và sâu khoảng 20 Å Vùng này có bộ ba xúc tác là các amino acid Ser200, His440 và Glu327 Đây là các amino acid chìa khóa cho việc thủy phân ACh Ser200 cố định phần carboxyl của ACh, His440 tham gia hình thành và thủy phân phức tứ diện trung gian bằng cách tạo 2 liên kết hydrogen với Ser200 và Glu327.[12-13]

Những thành phần cấu tạo khác của vùng xúc tác bao gồm: i/ túi “oxyanion” với các amino acid Gly118, Gly119 và Ala201, đây là nơi ổn định phức hợp trung gian, được hình thành bằng cách tiếp nhận oxy trên nhóm carboxyl của acetylcholine; ii/ túi acyl với các amino acid Phe288 và Phe290, vùng kị nước này

có nhiệm vụ ổn định nhóm methyl của phần acetate trong quá trình xúc tác và đóng

hiệu quả các ester có khả năng định vị chuỗi amino acid kị nước trong túi này Ngoài ra ở vùng xúc tác của AChE còn có vùng anion thứ cấp với các amino acid Trp84, Tyr130, Phe330 và Phe331, đây là vùng đóng góp đáng kể vào việc ổn định điện tích dương của ligand bằng tương tác với electron π của nhân thơm Trp84 và Phe330 Ước tính hơn 50% năng lượng ổn định chất nền đến từ vùng anion thứ cấp của AChE.[12-13]

Vùng ngoại biên (peripheral anionic site - PAS) nằm ở lối vào của khoang tác động, vùng này liên quan đến vai trò non-cholinergic của AChE Trong AD vùng ngoại biên thúc đẩy sự kết tập các mảng β amyloid đồng thời biến đổi chức năng synap của các tế bào thần kinh hải mã Vùng này bao gồm các amino acid Tyr70, Asp72, Tyr121, Trp279 và Tyr334 trong đó Trp279 là thành phần quan trọng nhất Hiện tại vẫn còn nhiều tranh cãi về vai trò của vùng ngoại biên trong việc phân hủy ACh.[12]

Năm 1991, Walo Leuzinger và cộng sự đã phân lập thành công và kết tinh

enzyme AChE từ loài cá đuối Torpedo californica thuộc bộ cá đuối Torpediniformes, tại Đại học Columbia, New York Enzyme AChE của cá đuối Torpedo californica

(TcAChE) có trình tự các amino acid tương tự các amino acid trên enzyme AChE của người.[14] Những hiểu biết trên TcAChE có thể định hướng cho các hiểu biết trên enzyme AChE người Trong phần này, TcAChE được mô tả để giúp biện giải các kết

quả của phần nghiên cứu docking sau này

Trong cơ thể, acetylcholine được tổng hợp từ choline coenzyme A với sự xúc tác của choline - acetyltransferase Sau khi tổng hợp, ACh được lưu trữ trong các nang có đường kính khoảng 300 - 600 Å, ở ngọn sợi thần kinh cholinergic dưới thể phức hợp không có hoạt tính Dưới ảnh hưởng của xung động thần kinh và của ion

Ca2+, ACh được giải phóng ở dạng tự do, đóng vai trò quan trọng như một chất trung gian hóa học, tác dụng lên các receptor cholinergic ở hậu synap, rồi bị thuỷ phân rất nhanh dưới tác dụng của AChE để thành choline (lại tham gia tổng hợp ACh) và acetate.[15] Sự xúc tác thủy phân ACh được tóm tắt trong sơ đồ 1.1

Sơ đồ 1.1 Sơ đồ xúc tác thủy phân acetylcholine

AChE xúc tác sự thủy phân các chất truyền xung thần kinh ACh thành choline

và acetate, phản ứng cần thiết để cho phép tế bào thần kinh trở về trạng thái nghỉ ngơi của mình sau khi kích hoạt

Nếu chất dẫn truyền thần kinh này không bị phá vỡ sau khi đã hoàn thành chức năng của nó, các cơ quan sẽ không thể thư giãn, điều này có thể tạo ra co thắt, tê liệt và một số vấn đề khác Nhưng nếu AChE xúc tác thủy phân ACh nhiều hơn mức độ bình thường sẽ dẫn đến sự thiếu hụt ACh, làm giảm chức năng dẫn truyền thần kinh trong một số phần của não Đặc biệt ở người cao tuổi thì sự thủy phân diễn ra nhiều hơn Đây cũng được xem là nguyên nhân gây ra bệnh Alzheimer. [9,15]

Vào giữa thập niên 1970 các nhà khoa học tìm thấy rằng mức độ của ACh, chất dẫn truyền thần kinh giữ vai trò quan trọng trong tiến trình hình thành trí nhớ ở vùng dưới đồi và não tủy, giảm rõ rệt ở những bệnh nhân Alzheimer.[9]

Do đó, chất kháng AChE làm trễ sự phân hủy ACh, sẽ làm tăng lượng ACh chung quanh điểm tiếp hợp của tế bào thần kinh Và vì thế tăng cường sự dẫn truyền thần kinh, giúp cải thiện tình trạng suy giảm trí nhớ.[9,15]

Tên quốc tế: (E)-1,3-diphenylprop-2-en-1-one

Tên gọi khác: chalcone, chalkone, 2-propen-1-one …

Công thức phân tử khung cơ bản: C15H12O

Trọng lượng phân tử: 208,25 [g/mol]

Tỉ trọng: 1,071 g/cm3

Chalcone là một nhóm phụ của flavonoid.[16] Flavonoid là một nhóm hợp chất

tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật Phần lớn flavonoid có màu vàng cam, chalcone có màu từ vàng đậm đến đỏ cam Chalcone được nhận biết bằng phản ứng với ammoniac hoặc sulfuric acid đậm đặc

Chalcone có 2 vòng A và B nối với nhau bởi mạch hở 3 carbon, được đánh số

thứ tự bắt đầu từ vòng B, vòng A đánh số phụ như trong hình 1.7

Hình 1.7 Cấu trúc và qui tắc đánh số của chalcone

Phân bố: chalcone có chủ yếu ở trong một số cây họ Cúc (Asteraceae), tập trung nhiều nhất ở vỏ cây, gỗ lơi (keo, bạch đàn, dẻ, đậu tương, trinh nữ hoàng cung, dương xỉ…)

Hầu hết các chalcone được tìm thấy trong tự nhiên là những chalcone truyền thống có vòng A và B là nhân benzene Trong các thập kỷ gần đây nhiều tác giả đã tổng hợp chalcone với vòng A và B là một nhân thơm dị vòng 5 hoặc 6 cạnh.[17]

Khi

đó các hợp chất này được gọi là chalcone dị vòng

Trong tự nhiên, chalcone là chất trung gian sinh tổng hợp các dẫn chất thuộc

họ flavonoid như flavone, flavanone, flavonol, isoflavone, aurone….[16]

Trong lĩnh

vực hóa học, chalcone là nguyên liệu tổng hợp các flavonoid nêu trên và các dẫn chất

dị vòng như pyrazolin, isoxazolin, pyrimidin có tiềm năng và tác dụng sinh học.[18]

1.3.2 Các phương pháp tổng hợp chalcone

 Phản ứng ngưng tụ Claisen-Schmidt

Mặc dù có nhiều con đường để tổng hợp chalcone nhưng phương pháp phổ biến nhất thường được sử dụng là dựa vào phản ứng ngưng tụ Claisen-Schmidt giữa các dẫn chất của acetophenone và benzaldehyde thích hợp Phản ứng được tiến hành tương đối đơn giản nhưng hiệu quả, cho phép tạo thành liên kết đôi carbon-carbon không phụ thuộc vào độ phức tạp trong cấu trúc các phân tử tham gia ngưng

tụ Vì vậy, phản ứng này vẫn được áp dụng rộng rãi để tổng hợp chalcone

Phản ứng này về bản chất là một phản ứng ngưng tụ giữa các dẫn chất của acetophenone và benzaldehyde thu được các α, β - ketone không no, chất này sẽ được

loại nước để tạo thành chalcone theo Sơ đồ 1.2 Phản ứng thường thực hiện ở nhiệt

độ phòng hay gia nhiệt lên đến 50 oC trong nhiều giờ Chất xúc tác được sử dụng

là hydroxyde kiềm 10-60 % hoặc sodium ethoxide (C2H5ONa).[19]

Các chất xúc tác kiềm khác như magnesium di-tert-butoxide, potassium carbonate, barium hydroxide cũng được sử dụng nhiều trong nghiên cứu Ngoài ra phản ứng ngưng tụ này cũng có thể xúc tác bởi các acid như HCl, AlCl3, BF3, Na2Br2O7, TiCl4… Bên cạnh chất xúc tác, diện tích bề mặt và nhiệt độ

là các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất.[19]

Sơ đồ 1.2 Tổng hợp chalcone dựa vào phản ứng ngưng tụ Claisen-Schmidt[19]

 Phản ứng Suzuki

Có 2 con đường khác nhau để tổng hợp chalcone theo phương pháp Suzuki +

Sơ đồ 1.3 Tổng hợp chalcone theo phương pháp Suzuki[19-20]

a) Phản ứng cộng hợp giữa cinnamoyl chloride đã hoạt h a và phenylboronic acid b) Phản ứng cộng hợp giữa benzoyl chloride đã hoạt h a và phenylvinylboronic acid

 Phản ứng Heck

Một vài phản ứng đã được tổng hợp dựa trên phản ứng Heck Nguyên tắc của phản ứng này dựa trên sự cộng hợp giữa một aryl vinyl ketone với một aryl iodide, được trình bày trong sơ đồ 1.4

Sơ đồ 1.4 Tổng hợp chalcone dựa vào phản ứng Heck[19]

 Phản ứng acyl h a Friedel-Crafts

Các chalcone có thể được tổng hợp bằng cách acyl hóa trực tiếp nhân phenol Trong trường hợp này nhân phenol trở thành vòng A, trong khi tác nhân acyl hóa sẽ trở thành vòng B và nhánh 3C, thí dụ như acyl hóa trimethoxyphenol với cinnamoyl chloride với sự hiện diện của BF3-Et2O làm chất xúc tác sẽ cho ra 2'- hydroxy-3',4',5'-trimethoxychalcone, theo sơ đồ 1.5.[19]

Sơ đồ 1.5 Tổng hợp chalcone dựa vào phản ứng acyl hóa Friedel-Crafts[19]

1.4 Mô hình mô tả phân tử docking

1.4.1 Giới thiệu về docking

Trong lĩnh vực mô hình phân tử, docking là một phương pháp dự đoán định hướng ưu tiên của một phân tử vào phân tử thứ hai khi chúng được liên kết với nhau

để tạo thành một phức hợp ổn định Các định hướng ưu tiên lần lượt có thể sử dụng

để dự đoán sức mạnh liên kết giữa hai phân tử dựa trên điểm số docking cũng như

vị trí gắn kết.[21]

Docking là phương pháp thiết kế thuốc dựa vào cấu trúc mục tiêu tác động, nghiên cứu khả năng gắn kết một hay nhiều phân tử hợp chất (ligand) vào mô hình điểm gắn kết (binding site - active site) của protein, enzyme, DNA trong không gian ba chiều.[21]

Docking có vai trò quan trọng trong việc dự đoán ái lực và hoạt tính của các dược chất đối với protein, từ đó dự đoán khả năng hoạt hóa hoặc ức chế một protein chức năng Bên cạnh đó docking cũng giúp dự đoán tâm hoạt động và vị trí, cấu hình thuận lợi của cơ chất tham gia phản ứng khi xem xét cơ chế xúc tác của enzyme (cũng là một loại protein chức năng).[22]

Docking trở thành bài toán tối ưu, tìm vị trí và cấu hình phù hợp nhất của một cơ chất gắn kết lên protein Về mặt nhiệt động lực học, mục tiêu của docking là tìm ra cấu hình mà năng lượng tự do của toàn hệ thống thấp nhất Để tìm cấu hình phù hợp nhất cần phải liên hệ không gian cấu hình với các giá trị số đánh giá được khả năng gắn kết của cơ chất lên protein rồi mới áp dụng được các thuật toán tìm kiếm.[22]

Khi cơ chất gắn kết lên một phân tử protein mục tiêu, hai điểm cần chú ý là

protein Ngoài yêu cầu phù hợp về hình dạng, kích thước, giữa cơ chất và enzyme còn những tương tác khác như tương tác Van der Waals, tương tác tĩnh điện… Tuy nhiên, protein thường có kích thước lớn và mềm dẻo nên rất khó để khảo sát hết tất

cả các khả năng tương tác giữa protein và cơ chất Trong docking, phân tử protein thường được đưa vào dưới dạng cấu trúc cứng, cơ chất có thể chuyển động tương đối so với protein và thay đổi cấu hình Một số phần mềm docking cũng cho phép thay đổi cấu hình trên một số đơn vị amino acid.[23]

1.4.2 Các dạng docking

Docking tìm ra các tương tác giữa phân tử hợp chất và điểm tác động theo 3

hướng khác nhau: (i) xem hợp chất và protein đều là những phân tử cứng (docking cứng, phương pháp này bỏ qua tính quan trọng của sự linh động); (ii) xem hợp chất

là phân tử linh động (docking bán linh động, phương pháp này được sử dụng phổ

biến); (iii) xem cả hợp chất và protein đều linh động (docking linh động hoàn toàn),

tuy nhiên phải lưu ý tính linh động ở giới hạn ở những chuỗi bên đặc trưng nào đó của điểm gắn kết.[21] Phương pháp này tính toán rất phức tạp, đòi hỏi phải so sánh với các phương pháp khác

Giai đoạn đầu tiên của phương pháp DOCK liên quan đến việc xây dựng một hình ảnh giả định các vị trí liên kết chứa một loạt các hình cầu chồng chéo có bán kính khác nhau, xuất phát từ bề mặt phân tử của protein

Hình 1.8 Các phần của ligand sắp xếp vào vị trí phù hợp trong các quả cầu xếp

chồng lên nhau ở vùng tác động[24]

Nguyên tử ligand được sử dụng làm trung tâm mặt cầu sao cho khoảng cách giữa các nguyên tử tương đương với khoảng cách giữa các trung tâm hình cầu tương ứng.[25]

Cấu tạo ligand sau đó được định hướng vào các vùng liên kết Sau khi kiểm tra để đảm bảo rằng không có sự tương tác về không gian không thể chấp nhận, tiếp theo là chấm điểm Kiểu tương tác mới được hình thành bằng cách thay đổi các kiểu sắp xếp nguyên tử ligand vào các trung tâm hình cầu Quy trình liên tục cho đến khi tất cả các nối

có thể đã được xem xét.[24]

 Docking bán linh động:

Đa số các chương trình docking như Gold, FlexX, Dock, Autodock sử dụng docking bán linh động.[22] Các chương trình docking này hoạt động bằng cách đặt các ligand trong khu vực mục tiêu tác động, sau đó định hướng các ligand này sao cho các nhóm chức có thể tạo thành liên kết của mục tiêu tác động Có 2 nguyên lý

cơ bản được áp dụng trong docking đó là nguyên lý phân mảnh cấu trúc và phép

Trong phân mảnh cấu trúc, với việc sử dụng thuật toán “xây dựng lớn dần” (Incremental construction algorithm) chương trình docking sẽ chia ligand thành từng mảnh cứng, docking các mảnh cứng vào túi gắn kết của protein, và dần dần lắp ráp lại với nhau để thu được ligand Chương trình sẽ thực hiện tính toán cách gắn kết để thu được cấu dạng ligand bền nhất.[25]

Hình 1.9 Nguyên lý docking bằng phân mảnh cấu trúc sử dụng[25]

(A) thuật toán “xây dựng lớn dần” (incremental construction algorithm) (B) phép tam giác phân (triangle matching) đặt ligand vào điểm gắn kết của protein

Trong phép tam giác phân, mỗi vị trí gắn kết được tạo thành do sự sắp xếp thẳng hàng của bộ ba nguyên tử trên ligand và bộ ba điểm của túi gắn kết mục tiêu Đây là quá trình xác định các trung tâm liên kết và bề mặt liên kết trên cả protein và ligand

(A)

(B)

các trung tâm và bề mặt bổ sung nhau được phủ lên nhau thì sự gắn kết được tạo thành Sau mỗi bước lặp, một cấu dạng bền nhất hay có mức năng lượng thấp nhất

sẽ được lựa chọn và ghi lại Cuối cùng, chương trình docking sẽ tiến hành tổng hợp

và đưa ra những cấu dạng cũng như vị trí gắn kết bền nhất.[25]

1.5 Khảo sát khả năng kháng AChE bằng phương pháp Ellman

Nguyên tắc: Các chất thử có khả năng ức chế hoạt động của AChE làm giảm lượng

AChE tham gia xúc tác phản ứng thủy phân ACh Xác định khả năng này bằng cách định lượng AChE theo phương pháp Ellman, 1961.[26] Đây là phương pháp quang phổ rất nhạy đã được Ellman phát minh để xác định nồng độ AChE trong dịch chiết

mô đồng nhất và dịch huyền phù tế bào

Cơ sở khoa học của phương pháp:

Phương pháp này được tiến hành bằng việc đo độ hấp thụ quang ở bước sóng

405 nm của hợp chất có màu vàng được tạo thành giữa thiocholine (sản phẩm thủy phân cơ chất ATCI bởi AChE) với thuốc thử Ellman (5,5′-Dithiobis(2-nitrobenzoic

acid)- DTNB) theo như Sơ đồ 1.6