STAPHYLOCOCCUS AUREUS

• Tụ cầu thường không có vỏ, không có lông, không di động • Không sinh nha bào • Bắt màu Gram dương ĐẶC TÍNH NUÔI CẤY • Hiếu khí, kỵ khí tuỳ tiện, mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấ

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

HÌNH THÁI

• Vi khuẩn hình cầu, đường kính 0.8-1.0 μ

• Đứng riêng rẽ, thành đôi, hoặc tụ thành đám như chùm nho

• Tụ cầu thường không có vỏ, không có lông, không di động

• Không sinh nha bào

• Bắt màu Gram dương

ĐẶC TÍNH NUÔI CẤY

• Hiếu khí, kỵ khí tuỳ tiện, mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường

• Phát triển được trong điều kiện nhiệt độ và pH chênh lệch nhiều (từ

10 – 45oC)

• Trong môi trường canh thang, sau 5 – 6 giờ vi khuẩn đã làm đục môi trường, sau 24 giờ, môi trường đục rõ, vi khuẩn phát triển nhiều nhưng nếu để lâu, canh thang trở nên trong, bề mặt có váng mỏng,

dễ lắng xuống

• Trên môi trường thạch thường, sau 24 giờ vi khuẩn đã phát triển mạnh, khuẩn lạc dạng S, trơn, lồi, sáng bóng, bờ đều, có sắc tố vàng nhạt hoặc vàng thẫm Sắc tố có thể thay đổi khác nhau, nhiều chủng màu da cam, những chủng kháng kháng sinh sắc tố thường màu vàng, mọc nhiều trên thạch, đục, trơn, ẩm ướt và trắng, vàng hoặc da cam

• Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc đục, dạng S, thường gây tan máu và có sắc tố vàng

TÍNH CHẤT SVHH

• Lên men sinh acid các đường glucoza, lactoza, maltoza và manitol

• Không lên men sinh axit các đường arabinoza, inositol, raffinoza, rhamnoxa hoặc xyloza

• Không thủy phân Esculin và tinh bột, khử nitrat, thuỷ phân arginin, gluamat và khử nhóm cacboxyl của lysin (có men lysin

decacboxylase)

• Sinh ra proteaza, lipaza, phosphataza, Một số chủng sinh ra

lecithinaza

• Tất cả các chủng đều sinh ra coagulaza, ít nhất có 3 yếu tố tan huyết (α, β và δ)

• Thường gặp tan máu β bởi các chủng phân lập từ động vật

• Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phát triển là 30-37oC, pH là 7.0-7.5.

Enzym

• Coagulase: làm đông huyết tương người và thỏ Nó là một protein vững bền với nhiệt độ, tính chất kháng nguyên yếu, có thể gây thành huyết cục trong tĩnh mạch, yếu tố để tạo nên nhiễm khuẩn huyết

• Fibrinolysin: đặc trưng cho các chủng gây bệnh ở người Men này làm tan các cục máu, tạo nên sự rời chỗ và hình thành những vật tắc mạch nhỏ tạo ra nhiễm khuẩn di căn

• Desoxyribonuclease: là men có thể thuỷ phân AND, có thể gây ra tổn thương các tổ chức

• Hyaluronidase: gây tan vỡ chất cơ bản của mô liên kết bởi sự thuỷ phân của acid hyaluronic

• Penicillinase: tụ cầu gây bệnh có thể tiết ra men này làm mất tác dụng của Penicillin

ĐỘC TỐ

Độc tố tan máu (hemolysin) có ba loại chính:

- Độc tố tan máu α, gây tan hồng cầu thỏ ở nhiệt độ 37oC độc tố này gây hoại tử da và gây chết, là ngoại độc tố, có tính kháng nguyên cao và có thể trở thành giải độc tố

- Độc tố tan máu β có tác dụng làm tan hồng cầu cừu ở 40C, ít độc hơn độc tố α

- Độc tố tan máu δ có tác dụng lên hồng cầu người đã rửa và gây hoại

tử da

- Độc tố diệt bạch cầu(Leucocidin): làm bạch cầu mất tính di động và

bị phá huỷ nhân

- Các độc tố ruột: các độc tố này gây nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp Các độc tố ruột chỉ do một số chủng tụ cầu tiết ra, gồm bốn loại, trong đó mới có hai loại được biết rõ là: độc tố ruột A do chủng gây nhiễm độc thức ăn, độc tố ruột B do chủng gây viêm ruột sinh ra

KHẢ NĂNG GÂY BỆNH

• Các bệnh ngoài da: gây viêm nhiễm các vết xước tạo thành mụn, nhọt đầu đinh, đinh râu…

• Nhiễm khuẩn huyết do tụ cầu: thường xảy ra ở những người đề

kháng yếu hoặc trẻ em Bệnh thường nặng, có thể gây chết người hoặc trở

thành mạn tính gây nên viêm xương, viêm khớp, viêm phổi, viêm cơ…

• Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp tính: bệnh thường xảy ra

nhanh, trầm trọng với các dấu hiệu nôn mửa dữ dội

NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM

• Do độc tố

• Triệu chứng: là nôn mửa, đau quặn bụng, mệt lả và đi ỉa lỏng

Những triệu chứng này thường có trong một vài giờ và ít trường hợp kéo nhiều ngày Thường bệnh nhân hồi phục không có biến chứng

• Liều gây bệnh: < 1,0 µg (>100 000CFU/g) Độc tố của tụ cầu rất bền vững với nhiệt độ, không bị phá huỷ khi đun sôi ở 100oC trong 30 phút nên vẫn có thể gây ngộ độc khi các tế bào sinh dưỡng đã bị tiêu diệt trong quá trình chế biến

• Độc tố của tụ cầu rất bền vững với nhiệt độ, không bị phá huỷ khi đun sôi ở 100oC trong 30 phút nên vẫn có thể gây ngộ độc khi các tế bào sinh dưỡng đã bị tiêu diệt trong quá trình chế biến

• Thời gian ủ bệnh: từ 1 -7h, thông thường 3 – 6h

• Thức ăn thích hợp cho tụ cầu phát triển và sinh độc tố: loại có độ ẩm cao

• Những thực phẩm có nguy cơ cao ô nhiễm do tụ cầu là thịt và sản phẩm thịt, gia cầm và trứng, các món xalat, rau trộn, sữa và sản

phẩm sữa…

NƠI CƯ TRÚ VÀ NGUỒN LÂY NHIỄM

• Trong đất, nước, các dụng cụ sản xuất, chế biến, cư trú ở người và động vật (nguồn lây nhiễm quan trọng nhất)

• 50% người bình thường mang vi khuẩn này ở trong mũi họng Vì thế đầu móng tay thường nhiễm những vi khuẩn này

• Trong quá trình chế biến, thực phẩm có thể bị ô nhiễm tụ cầu có thể qua tiếp xúc trực tiếp, đặc biệt là khi tay người chế biến có những vết trầy xước hoặc có mụn mủ Nếu những thực phẩm này để hàng giờ ở 6.6oC, tụ cầu sẽ phát triển và sinh độc tố

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG S.AUREUS

1.Nguyên lý phương pháp

Dựa trên khả năng sinh Lecithinase phân giải Lecithin của

Staphylococcus aureus trên môi trường chọn lọc có bổ sung lòng đỏ trứng và Kali tellurit, nuôi cấy ở 35- 37oC/24 – 48h Số lượng

Staphylococcus aureus trong một ml hoặc một g mẫu kiểm nghiệm được tính bằng số khuẩn lạc điển hình trên môi trường chọn lọc và có phản ứng đông huyết tương dương tính

2 Phạm vi áp dụng: Định lượng Staphylococcus aureus trong thực phẩm

và thức ăn chăn nuôi

NỘI DUNG

1.Thiết bị, dụng cụ

- Tủ sấy 180 – 200oC

- Nồi hấp áp lực

- Tủ ấm 25 ±1oC

- Đĩa petri đường kính 90 – 100mm

- Pipet có vạch đã vô trùng loại 1,5,10 ml

- Nồi cách thuỷ, nhiệt độ 45 ±1oC

- Máy đếm khuẩn lạc

- Bình thuỷ tinh vô trùng, dung tích 250 – 500ml

- Ống nghiệm vô trùng 16 – 18 mm

- pH met hoặc giấy đo pH

2.Dung dịch pha loãng, môi trường, hoá chất

• Nước đệm pepton

• Môi trường Bair parker

• Dung dịch Kali Tellurit 1%

• Dung dịch sulphamezatin (sulphadimidin, INH) 0,2%

• Dung dịch Natri pyruvat 20%

• Dung dịch lòng đỏ trứng

• Canh thang tim óc ( Brain Heart Infusion)

• Huyết tương thỏ

3.Các bước tiến hành

3.1 Chuẩn bị mẫu thử và đậm độ pha loãng ban đầu:

Sản phẩm dạng lỏng: Hút 10ml mẫu thử cho vào bình 90ml nước đệm pepton(đậm độ 10-1) Từ đậm độ này pha loãng các đậm độ tiếp theo tùy từng mẫu thử

• Sản phẩm dạng khác: caan 10g mẫu thử cho vào 90 ml nước đệm pepton (đậm độ10-1) Từ đó pha loãng các đậm độ tiếp theo tùy từng mẫu thử

3.2 Cấy mẫu

• Sản phẩm dạng lỏng: cấy vào 2 đĩa thạch Bair parker, mỗi đĩaa 0,1ml mẫu thử ban đầu Lặp lạii với các đậm độ pha loãng khác

• Sản phẩm dạng khác: cấy vào 2 đĩa thạch Bair parker, mỗi đĩaa

0,1ml đậm độ pha loãng ban đầu (đậm độ 10 –1) Lặp lại với các đậm

độ pha loãng khác

• Dùng que cấy gạt thuỷ tinh dàn đều mẫu trên mặt thạch, lưu ý làm càng nhanh càng tốt để mẫu không bị khô

• Để 15 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó lật ngược đĩa thạch và để vào

tủ ấm 35-37 ± 1oC/ 24-48h

3.3 Đếm khuẩn lạc

• Chỉ tính những đĩa có từ 15-150 khuẩn lạc

• Đếm tất cả những khuẩn lạc điển hình (màu đen, bóng, lồi, đường kính từ 1-1,5 mm, bao quanh bởi một vùng đục sát khuẩn lạc và vùng trong phía bên ngoài) và không điển hình (không có vùng

trong)

3.4 Thử khẳng định

• Từ mỗi đĩa chọn 5 khuẩn lạc điển hình để làm phản ứng sinh hóa, mỗi khuẩn lạc cho vào một ống canh thang tăng sinh BHI, nuôi ở 35-37oC/20 -24h

• Cho 0,1ml môi trường đã nuôi cấy vào 0,3ml huyết tương thỏ, để ở 35-37oC / 4-6h Phản ứng được coi là dương tính khi phần đông huyêt tương chiếm 1/2 thể tích dung dịch

Số lượng S.aureus có phản ứng dương tính với coagulase

đã nhận dạng trên mỗi đĩa

bc bnc

a = - Cc + - Cnc

Ac Anc

• Ac là số lượng khuẩn lạc điển hình đã qua phép thử coagulase

• Anc là số lượng khuẩn lạc không điển hình đã qua phép thử

coagulase

• bc số lượng khuẩn lạc điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với coagulase

• bnc số lượng khuẩn lạc không điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với coagulase

• Cc là tổng số khuẩn lạc điển hình nhìn thấy trên đĩa

• Cnc là tổng số khuẩn lạc không điển hình nhìn thấy trên đĩa

Số lượng S.aureus có phản ứng dương tính với coagulase

đã nhận dạng trên có mặt trong mẫu thử

Σa

N =

• Σa là tổng số khuẩn lạcc Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase được nhận dạng có mặt trong mẫu thử

• V là thể tích của chất cấy trên mỗi đĩa, tính bằng ml

• n1 là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ nhất

• n2 là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ hai

• d là độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng thứ nhất đã chọn (huyền phù ban đầu là một độ pha loãng)

4 Biểu thị kết quả

• Độ pha loãng 10-2

Đĩa 1: 65 KLĐH, 5KL có coagulase(+), a=65

Đĩa 2: 85 KLĐH, 5KL có coagulase(+), a=85

• Độ pha loãng 10-3

Đĩa 1:3 KLĐH, 3KL có coagulase(+), a=3

Đĩa 2: 7 KLĐH, 5KL có coagulase(+), a=7

N= 65+85+3+7/0,1(2+ 0,1x2) 10-2 = 57272

= 5,7 x 104 CFU/g(ml)

CHUẨN BỊ DUNG DỊCH LÒNG ĐỎ TRỨNG

• Dung dịch Kali Tellurit

- Kali Tellurit 1g

- Nước cất VT 100ml

Làm ấm để hòa tan, bảo quản 0-5oC/vài tháng

• Dung dịch Natri Pyruvat

- Natri Pyruvat 20g

- Nước cất VT 100ml

Cho Natri Pyruvat vào một phần nước, sau đó thêm cho đủ 100ml, hòa tan, lọc vô trùng, bảo quản ở 0-5oC/1 tháng

• Rửa sạch vỏ trứng

• Ngâm trong cồn 70o/5-10 phút

• Tách đôi vỏ trứng, đổ từ vỏ nọ sang vỏ kia để loại phần lớn lòng trắng

• Dùng pipet hút hết lòng rắng còn lại

• Hút lòng đỏ trứng, pha với nước cất VT theo tỷ lệ ¼

• Dùng ngay hoặc để cách thủy ở 45oC/2h rồi để ở 0-5oC/18-24h, lấy phần dung dịch nổi phía trên Bảo quản ở 0-5oC/72h

MÔI TRƯỜNG BAIR-PARKER LÒNG ĐỎ TRỨNG

• Môi trường BP 90ml

• Dung dịch Kali Tellurit 1ml

• Dung dịch Natri pyruvat 5ml

• Dung dịch lòng đỏ trứng 5ml

Đun tan thạch, để nguội khoảng 50oC, thêm các thành phần, trộn đều (không tạo thành bọt)

Đổ đĩa, làm khô mặt thạch trước khi sử dụng