Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu được tiến hành nhằm đánh giá hiệu quả bảo vệ cá bớp khỏi bệnh mù mắt do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra ở cá bớp của vaccine bất hoạt.
Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Số 1/2020 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA VACCINE BẤT HOẠT PHÒNG BỆNH MÙ MẮT DO LIÊN CẦU KHUẨN GÂY RA Ở CÁ BỚP NI TẠI KHÁNH HỊA EVALUATION OF THE PROTECTIVE EFFICACY OF INACTIVATED VACCINES FOR PREVENTING STREPTOCOCCOSIS IN COBIA (Rachycentron canadum) CULTURED IN KHANH HOA Trần Vĩ Hích¹, Nguyễn Thị Kim Cúc² ¹ Trung tâm Nghiên cứu Giống Dịch bệnh Thủy sản ² Viện Công nghệ sinh học mơi trường Tác giả liên hệ: Trần Vĩ Hích (Email: tranhich@gmail.com) Ngày nhận bài: 21/11/2019; Ngày phản biện thông qua: 25/03/2020; Ngày duyệt đăng: 30/03/2020 TÓM TẮT Nghiên cứu tiến hành nhằm đánh giá hiệu bảo vệ cá bớp khỏi bệnh mù mắt vi khuẩn Streptococcus iniae gây cá bớp vaccine bất hoạt Kết thí nghiệm cho thấy vaccine hồn tồn an tồn với cá bớp (khơng có khác biệt chiều dài khối lượng cá thí nghiệm cá đối chứng, khơng có dấu hiệu bất thường quan sát xoang bụng cá tiêm vaccine) Trong thí nghiệm cơng cường độc, vaccine bảo vệ cho cá khỏi bệnh S iniae gây với hệ số bảo hộ (RPS) 85,19% tương ứng với liều tiêm 104 CFU/cá Hiệu giá kháng thể trung bình huyết cá tiêm vaccine 19,7 cá đối chứng Từ khóa: Cá bớp, vaccine, hiệu giá kháng thể, S iniae ABSTRACT The study was conducted to evaluate the effectiveness of inactivated vaccines against Streptococcus iniae bacteria causing blindness in cobia The test results showed that inactivated vaccine was completely safe for cobia (There was no difference in length and weight between experimental and control fish, no abnormalities were observed in intraperitoneal of immunized fish) In challenging trials, the inactivated vaccine effectively protected the cobia from S iniae with a Relative Survival Rate (RPS) of 85.19% corresponding to the injection dose of 104 CFU / fish The antibody titre of immunized fish was 19.7 while in control fish it was Key words: Cobia, vaccine, antibody titre, S iniae I GIỚI THIỆU Những nghiên cứu gần cho thấy gia tăng bệnh vi khuẩn gây cá bớp nuôi Bốn loại bệnh thường xuyên nhắc đến vibriosis, mycobacteriosis, furunculosis streptococcosis (Liao ctv, 2004; Liu ctv, 2003; Liu ctv, 2004; Lopez ctv, 2002; Lowry and Smith, 2006, Rajan ctv, 2001, Rajan ctv, 2003) Trong bệnh liên cầu khuẩn (Streptococcus) bệnh xảy phổ biến cá bớp nuôi Đài Loan (Liao ctv, 2004) Cá bị nhiễm liên cầu khuẩn thường thể dấu hiệu bệnh lý lâm sàng màu sắc 54 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG thể tối, bơi lội thất thường, xuất huyết xung quanh mắt hậu môn, giác mạc mờ đục Tỷ lệ tử vong cao cá bị mù Nhiều phương pháp phòng trị bệnh Streptococcus gây áp dụng như: dùng kháng sinh, probiotic hay chất kích thích đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu… Thực tế việc sử dụng kháng sinh phương pháp trị bệnh chủ yếu điều trị bệnh mù mắt cá bớp nuôi mà người dân lựa chọn Hiệu việc lựa chọn phương pháp sử dụng kháng sinh việc điều trị bệnh mù mắt cho cá bớp nuôi chứng rõ ràng tác nhân vi khuẩn Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản việc gây bệnh mù mắt cá bớp Tuy nhiên lúc việc sử dụng kháng sinh mang lại hiệu Nếu không kể đến trường hợp bệnh mù mắt xuất tác nhân kí sinh trùng virus khu vực khác độ nhạy vi khuẩn loại kháng sinh khác Đồng thời với phát triển dịch bệnh dụng kháng sinh bừa bãi làm gia tăng dòng kháng kháng sinh, việc kiểm tra độ nhạy kháng sinh tác nhân gây bệnh cần thiết quan trọng Vì để kiểm soát tốt bệnh mù mắt cá bớp vi khuẩn gây ra, giải pháp vaccine lựa chọn tốt Sử dụng vaccine việc phòng bệnh cá hướng an toàn, hiệu bền vững cho nghề nuôi thủy sản II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chủng vi khuẩn thử nghiệm Chủng vi khuẩn thử nghiệm chủng liên cầu khuẩn VN180517 phân lập từ cá bớp mắc bệnh mù mắt nuôi Vạn Ninh Vi khuẩn gốc nuôi cấy tăng sinh môi trường TSB bổ sung 2% NaCl đặt tủ ấm lắc đảo (180 vòng/phút) nhiệt độ 28ºC 24 Tế bào vi khuẩn sau thu hoạch rửa lần dụng dịch muối sinh lý đệm phosphate (phosphate buffered saline-PBS pH 7,4) pha loãng trở lại PBS để đạt mật độ 107 CFU/ml Bất hoạt hóa vi khuẩn cách thêm formalin vào hỗn dich để đạt nồng độ formalin cuối 0,5% bảo quản nhiệt độ 4ºC Kiểm định tính an tồn vaccine 2.1 Kiểm định tính vơ khuẩn vaccine Cho 100 µl dịch huyền phù vi khuẩn bất hoạt đĩa thạch chứa môi trường TSA TCBS, cấy trang ủ nhiệt độ 28ºC Sau 48 giờ, kiểm tra xuất khuẩn lạc vi khuẩn đĩa thạch 2.2 Kiểm định tính an tồn vaccine cá bớp Cá bớp có chiều dài thân trung bình từ 10 – 12cm, chưa nhiễm liên cầu khuẩn tiêm vaccine với liều 0,2ml/cá vào xoang bụng Cá đối chứng tiêm dung dịch nước muối Số 1/2020 sinh lý với liều tương tự Cá tiêm vaccine cá đối chứng nuôi riêng biệt bể ciment 1000L chứa 700L nước biển độ mặn khoảng 30ppt cho ăn thức ăn UP ngày lần theo nhu cầu cá Theo dõi ghi chép bất thường cá thí nghiệm liên tục sau bố trí thí nghiệm Ghi chép số lượng cá chết hàng thứ 21 sau tiêm Trong thời gian này, cá cho ăn hàng ngày theo nhu cầu thay 100% lượng nước bể theo quy trình chăm sóc cá Trung tâm Nghiên cứu Giống Dịch bệnh Thủy sản Mọi cá chết thu được kiểm tra phân lập vi khuẩn từ não thận Ghi nhận biến đổi bất thường trong/trên thể cá có liên quan đến việc tiêm vaccine Kiểm tra hiệu bảo vệ vaccine phòng bệnh mù mắt liên cầu khuẩn gây cá bớp 3.1 Gây miễn dịch cho cá bớp Thí nghiệm bố trí tương tự Phần II khác chỗ liều tiêm giảm nửa 28 ngày sau tiêm vaccine lần đầu tiên, cá bớp lại tiêm nhắc lại lần tuần sau tiêm nhắc lại, cá sử dụng để đánh giá hiệu vaccine 3.2 Kiểm định kháng thể Lượng kháng thể huyết cá bớp cần xác định theo phương pháp ngưng kết (agglutinating antibody titre) Plumb and Areechon (1990), theo đó, đĩa 96 giếng đáy sử dụng cho phương pháp Lấy 100 µL huyết cá bớp cần kiểm tra cho vào giếng A1 Từ giếng A2 đến A8, cho vào giếng 50 µL PBS Sau lấy 50 µL dung dịch giếng A1 cho vào giếng A2, trộn lấy 50 µL dung dịch giếng A2 cho vào giếng A3 Tiếp tục đến giếng A8 lấy 50 µL dung dịch giếng A8 bỏ ngồi Cho 50 µL dung dịch huyền phù vi khuẩn Streptococcus iniae vào giếng, lắc nhẹ quan sát, ghi lại xuất ngưng giếng có nồng độ huyết thấp 3.3 Xác định hiệu bảo vệ vaccine bất hoạt Thí nghiệm cơng cường độc cá thí nghiệm tiến hành cá tiêm chủng vi khuẩn VN180517 vào xoang bụng cá thí nghiệm TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 55 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2020 với liều 0,1ml/cá Mật độ vi khuẩn liều công gồm mức 105 106 CFU/ml Số lượng cá đơn vi thí nghiệm 20 cá lặp lại lần Thường xuyên theo dõi cá thí nghiệm ghi nhận cá chết bể lần Cá thí nghiệm theo dõi liên tục không xuất cá chết bể thí nghiệm ngày liên tục Tất cá tiêm vaccine lẫn cá đối chứng chết thời gian theo dõi thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm giải phẩu, kiểm tra phân lập vi khuẩn môi trường nuôi cấy chọn lọc (KF Streptococcus) để xác định nguyên nhân gây chết 3.4 Đánh giá hiệu bảo vệ vaccine Hiệu bảo vệ vaccine đánh giá dựa hệ số bảo vệ (RPS) kết thúc thí nghiệm (cá thí nghiệm khơng chết ngày liên tục) Chỉ số RPS tính theo cơng thức: III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Tính an tồn vaccine thử nghiệm 1.1 Tính vơ khuẩn vaccine Kết kiểm tra tính vơ khuẩn vaccine bất hoạt cho thấy dung dịch vaccine hồn tồn vơ khuẩn Khơng có khuẩn lạc xuất môi trường phân lập sau 48h nuôi cấy Kết hứng tỏ nồng độ formalin 0,5% có khả bất hồn tồn vi khuẩn S iniae 1.2 Tính an toàn vaccine thử nghiệm Sau 30 ngày tiến hành thí nghiệm tất cá nghiệm thức vaccine đối chứng khỏe mạnh Khơng có dấu hiệu bất thường trạng thái bơi lội hay hình thái cá thí nghiệm ghi nhận suốt q trình thí nghiệm Khơng có khác biệt chiều dài khối lượng (Bảng 1) cá thí nghiệm cá đối chứng (P>0,05) ngày thí nghiệm, cá tiêm vaccine ăn Bảng Chiều dài khối lượng cá bớp kết thúc thí nghiệm kiểm tra độ an toàn vaccine bất hoạt Lần lặp thứ TB Chiều dài khối lượng cá bớp kết thúc thí nghiệm an tồn vaccine Chiều dài (cm) Khối lượng (g) Cá đối chứng Cá vaccine Cá đối chứng Cá vaccine 12,24 ± 0,77 12,82 ± 0,88 22,12 ± 3,51 23,32 ± 4,44 12,55 ± 0,87 12,44 ± 1,05 23,25 ± 4,81 22,16 ± 5,05 12,39 ± 0,22 12,62 ± 0,27 22,69 ± 0,80 22,73 ± 0,83 Điều chứng tỏ vaccine bất hoạt không làm ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng cá thí nghiệm Mặt khác, kết kiểm tra xoang bụng cá thí nghiệm cho thấy khơng có bất thường quan sát xoang bụng cá thí nghiệm u hạt màng treo nội quan dính kết nội quan vào xoang bụng mà thử nghiệm vaccine dạng nhũ dầu thường báo cáo Khơng có dấu hiệu bất thường vị trí tiêm vaccine Kết cho thấy sản phẩm vaccine bất hoạt an toàn với cá bớp Việc tiêm vaccine bất hoạt không tạo thay đổi bất thường thể cá bớp, không ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng tỉ lệ sống cá Bảng Hiệu giá kháng thể cá bớp kháng lại S iniae Nghiệm thức Hiệu giá kháng thể cá thứ Cá vaccine Cá đối chứng 32 16 16 16 32 64 32 32 16 16 32 0 0 56 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG 10 11 12 13 14 0 15 16 17 18 19 20 16 32 32 16 32 19,7 0 0 0 TB Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Hiệu bảo hộ vaccine bất hoạt bệnh mù mắt liên cầu khuẩn gây cá bớp 2.1 Nồng độ kháng thể đặc hiệu máu bớp sau tiêm vaccine bất hoạt Sự khác biệt nồng độ kháng thể đặc hiệu kháng S iniae huyết cá bớp tiêm vaccine so với nhóm cá đối chứng thể Bảng Kết phân tích 20 mẫu huyết cá đối chứng 20 mẫu huyết cá tiêm vaccine cho thấy 100% huyết cá tiêm vaccine có kháng thể đặc hiệu kháng lại vi khuẩn S iniae Hiệu giá kháng thể kháng huyết đạt từ -64 Trong nhóm cá đối chứng, 90% mẫu huyết khơng có kháng thể kháng lại vi khuẩn S iniae Số 1/2020 2.2 Hiệu bảo hộ vaccine bất hoạt Kết thí nghiệm cho thấy hầu hết cá nhóm đối chứng bỏ ăn sau cơng cường độc 8h nhóm cá tiêm vaccine bắt mồi có giảm Thời điểm cá chết xuất nghiệm thức công cường độc liều cao sau 24h nghiệm thức công liều thấp sau 36h Số lượng cá chết tăng nhanh vòng 60h sau cơng cường độc sau giảm dần dừng hẳn thời điểm 108h sau tiêm vi khuẩn S iniae Tỉ lệ cá chết tích lũy nhóm cá đối chứng công cường độc liều 104 105 CFU/cá kết thúc thí nghiệm 67,5% 97,5% số nhóm cá tiêm vaccine 10% 35% (Hình 1) Hình Tỉ lệ chết tích lũy nghiệm thức thí nghiệm cơng cường độc chủng vi khuẩn VN180517 (V4, V5: cá vaccine công liều 104 105 cfu/cá; C4, C5: cá đối chứng công liều 104 105 cfu/c IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Vaccine bất hoạt phòng bệnh mù mắt cá bớp vơ khuẩn an tồn cho cá sử dụng Vaccine bất hoạt có tác dụng bảo vệ cá bớp kháng lại bệnh mù mắt S iniae gây Tất cá tiêm vaccine có kháng thể đặc hiệu kháng lại vi khuẩn S iniae huyết với hiệu giá trung bình khoảng 19,7 Hệ số bảo vệ tương đối đạt 85,19% công cường độc với liều 104 CFU/cá Nghiên cứu thử nghiệm hiệu vaccine chủng gốc mà chưa thử với chủng khác, chưa chứng minh ổn định chủng gốc (master seed) thời gian bảo hộ vaccine kéo dài Vì việc nhiệm vụ đặt cho nghiên cứu LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu tài trợ đề tài nghiên cứu khoa học trường Đại học Nha Trang (mã số: TR2017-13-01), công ty Virbac Việt Nam Xin chân thành cảm ơn hỗ trợ quý báu TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 57 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 1/2020 TÀI LIỆU THAM KHẢO Liao I.C, Huang T.S, Tsai W.S, Hsuehd C.M, Chang S.L, Leano E.M 2004 Cobia culture in Taiwan: current status and problems Aquaculture 237:155–165 Liu P.C, Liu J.Y, Lee K.K 2003 Virulence of Photobacterium damselae subsp piscicida in cultured cobia Rachycentron canadum Journal of Basic Microbiology, 43, 499–507 Liu P.C, Lin J.Y, Chuang W, Lee K.K 2004 Isolation and characterization of pathogenic Vibrio harveyi (V carchariae) from the farmed marine cobia fish Rachycentron canadum L with gastroenteritis syndrome World Journal of Microbiology & Biotechnology, 20, (5), 495–499 Lopez C, Rajan P.R, Lin J.H, Kuo T, Yang H 2002 Disease outbreak in seafarmed cobia (Rachycentron canadum) associated with Vibrio spp., Photobacterium damselae ssp piscicida, monogenean and myxosporean parasites Bulletin of the European Association of Fish Pathologists, 22(3): 206–211 Lowry T, Smith S.A 2006 Mycobacterium sp Infection in cultured cobia (Rachycentron canadum) Bulletin of the European Association of Fish Pathologists, 26, 87–92 Rajan P.R., Lin J.H, Ho M.S, Yang H.L 2003 Simple and rapid detection of Photobacterium damselae ssp piscicida by a PCR technique and plating method Journal of Applied Microbiology, 95(6):1375–1380 Rajan P.R, Lopez C, Lin J.H.Y, Yang H.L 2001 Vibrio alginolyticus infection in cobia (Rachycentron canadum) cultured in Taiwan Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 21(6):228– 234 58 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ... NGHỊ Vaccine bất hoạt phòng bệnh mù mắt cá bớp vô khuẩn an toàn cho cá sử dụng Vaccine bất hoạt có tác dụng bảo vệ cá bớp kháng lại bệnh mù mắt S iniae gây Tất cá tiêm vaccine có kháng thể đặc hiệu. .. vaccine Kiểm tra hiệu bảo vệ vaccine phòng bệnh mù mắt liên cầu khuẩn gây cá bớp 3.1 Gây miễn dịch cho cá bớp Thí nghiệm bố trí tương tự Phần II khác chỗ liều tiêm giảm nửa 28 ngày sau tiêm vaccine. .. đổi bất thường thể cá bớp, không ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng tỉ lệ sống cá Bảng Hiệu giá kháng thể cá bớp kháng lại S iniae Nghiệm thức Hiệu giá kháng thể cá thứ Cá vaccine Cá đối chứng 32