Xác định hàm lượng PHTHALATES trong dầu ăn bằng phương pháp sắc ký khí ghép nối hai lần khối phố GC MSMS

Nghiên cứu phương pháp xác định 10 phthalate trong dầu thực vật sử dụng kĩ thuật sắc ký khí ghép nối hai lần khối phổ. Nghiên cứu và đánh giá khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và định lượng của phương pháp, độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp. Tối ưu phương pháp xử lý mẫu dầu thực vật Áp dụng phương pháp nghiên cứu vào xác định hàm lượng của 10 phthalate trong 3 nhóm dầu thực vật được bán trên thị trường Hà Nội: dầu thực vật hỗn hợp, dầu đậu nành và dầu oliu.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

MỞ ĐẦU

Phthalates (PAEs) là các este của axit phthalic, được sử dụng phổ biến trong ngành công nghiệp polyme Phthalates được đưa vào sản xuất công nghiệp từ những năm 1920 với tư cách là chất làm dẻo nhựa PVC và sản lượng DEHP - một phthalate phổ biến nhất - đã bùng nổ trong năm 1931 Kể từ đó, PAEs tồn tại trong nhiều vật dụng hằng ngày như đồ vật bằng nhựa, nylon, đồ chơi trẻ em, hóa mỹ phẩm, thiết bị y tế [7] Trong năm 2010, sản lượng PAEs toàn cầu ước tính 4,9 triệu tấn PAEs không bền và bị thôi nhiễm trong quá trình lão hóa của vật liệu do chúng không tạo liên kết cộng hóa trị với nền [34] Chúng có thể hấp thụ qua da do tiếp xúc, qua đường hô hấp do hít phải và qua đường tiêu hóa do ăn uống PAEs hiện diện ở khắp nơi: nước mưa, nước mặt, đất, trầm tích, không khí, bụi trong nhà, thực phẩm, đặc biệt là thực phẩm béo [15] Mortensen và cộng sự (2005) tìm thấy sự có mặt của PAEs trong sữa mẹ và nước tiểu của trẻ sơ sinh [20] Theo dữ liệu từ Scopus, chỉ với từ khóa ―phthalate‖ đã cho ra kết quả hơn 8000 tài liệu liên quan từ năm 2010 đến 2018, điều này cho thấy tầm quan trọng và sự quan tâm của các nhà khoa học đến nhóm chất đặc biệt này

PAEs không tích lũy sinh học, nhưng sản phẩm oxy hóa của chúng là mono este phthalate gây ra nhiều tác hại đối với cơ thể con người và môi trường [37] Chúng bị nghi ngờ gây ung thư gan, thận, cơ quan sinh sản, gây dị dạng, quái thai, biến đổi nội tiết trong cơ thể, …[32, 34] Mức độ phơi nhiễm phthalate ở trẻ sơ sinh cao hơn đáng kể so với người trưởng thành khi so sánh tương quan theo trọng lượng cơ thể Nghiên cứu nước tiểu của trẻ sơ sinh dưới 3 tháng tuổi cho thấy 80% mẫu phân tích chứa 7/9 monophthalate (thường có mặt trong các loại kem dưỡng

da, bột talc dùng cho trẻ sơ sinh) [26] Năm 2009, Cơ quan bảo vệ môi trường Hoa

Kỳ USEPA 2009 [3] đã thêm 8 loại phthalate vào danh sách hóa chất đáng lo ngại, riêng DEHP ở nhóm các chất có khả năng gây ung thư mức độ 2 [47] Ngày càng nhiều các quốc gia trên thế giới đã ban hành luật cấm lưu hành vật liệu có chứa phthalate tùy mức độ Luật Hóa chất (REACH) của Hội đồng Châu Âu đã đưa 03 phthalate bao gồm DEHP, DBP và BzBP vào mục 52, phụ lục XVII từ năm 2007

nhằm hạn chế sản xuất, buôn bán và sử dụng chúng Danh sách các phthalate bị cấm không ngừng tăng lên theo các năm Chỉ thị RoHS 2 EU/65/2011 ban hành năm 2016 đã nhắc lại luật hạn chế về hàm lượng của DEHP, BzBP, DBP và DiBP

< 0,1% (công bố từ 2011) và sẽ bị cấm trong tất cả các thiết bị điện và điện tử tính

từ ngày 22/7/2019

Theo dự báo của Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam có mức tiêu thụ dầu thực vật tính đến năm 2020 là 18,5 - 20 kg/người/năm và sẽ tăng theo các năm do xu thế phát triển nhanh của kinh tế và nhu cầu xã hội Nhập khẩu dầu thô và dầu tinh luyện tính đến 2011 là gần 800 nghìn tấn, trong đó dầu cọ, dầu đậu nành chiếm đa

số (70%) Việc xác định đồng thời nhiều loại phthalate trong dầu thực vật tại Việt Nam gần như chưa có, các nghiên cứu hầu hết chỉ tập trung vào một số phthalate điển hình như DEHP, DEP, DBP Nhận thấy sự cấp thiết của việc tìm hiểu PAEs, các nghiên cứu đã được phát triển và ứng dụng trên nhiều nền mẫu khác nhau [1,

11, 27, 35, 38, 39]

Phương pháp phân tích sắc kí khí ghép nối hai lần khối phổ GC - MS/MS cho phép xác định trực tiếp các phthalate dựa trên sự khác biệt về cấu trúc và tính

ổn định nhiệt của từng phthalate, được coi là phương pháp phân tích có độ nhạy và

độ chọn lọc rất cao Độ chọn lọc cao của detector MS/MS cho phép giảm nhẹ việc chuẩn bị mẫu, phép tích phân peak dễ dàng và nhanh hơn, từ đó đơn giản hóa việc

xử lý dữ liệu, loại bỏ nhiễu có trong chế độ SIM và Scan, tăng hiệu quả phân tích cho GC, đưa ra kết quả tin cậy hơn Độ nhạy cao khiến MS/MS có thể phân tích được những mẫu mà GC - MS không làm được, nền mẫu phức tạp càng thể hiện tính năng vượt trội so với GC - MS, đồng thời cho phép phân tích lượng mẫu bơm

ít hơn vào cột, chu kỳ phân tích nhanh hơn

Xuất phát từ tính cấp thiết của xã hội và tính ưu việt của phương pháp phân tích này, chúng tôi thực hiện đề tài: ―Xác định hàm lượng phthalates trong dầu ăn bằng phương pháp sắc kí khí ghép nối hai lần khối phổ GC - MS/MS‖

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về các phthalate

1.1.1 Cấu trúc, phân loại các phthalate

Phthalates (este axit phthalic - PAEs) là các este của axit 1, 2 - benzen đicacboxylic Công thức cấu tạo chung của các phthalate như sau:

Hình 1 Cấu trúc hóa học chung của phthalate PAEs được điều chế dễ dàng thông qua phản ứng giữa phthalic anhydrit và ancol mạch thẳng hoặc mạch nhánh (từ metanol, ancol chứa một đến hai cacbon cho đến ancol chứa nhiều cacbon như tridexy ancol) Hai nhóm R và R’ có thể giống hoặc khác nhau tùy thuộc ancol tham gia phản ứng, từ đó dẫn đến tính chất vật lý, hóa học, hoạt tính sinh học của các phthalate có sự khác biệt [33, 49]

PAEs được chia thành thấp và cao tùy thuộc khối lượng phân tử Phthalate cao bao gồm những phân tử có từ 7 - 13 nguyên tử cacbon ở R và R’, có độ bền cao, phổ biến là diisononyl phthalate (DiNP), diisodecyl phthalate (DiDP), dipropylheptyl phthalate (DPHP) Phthalate thấp bao gồm những phân tử có 3 - 6 nguyên tử cacbon ở R và R’, phổ biến nhất là di (2-etylhexyl) phthalate (DEHP) và dibutyl phthalate (DBP)

1.1.2 Tính chất lý hóa của các phthalate

PAEs là những chất lỏng dạng dầu, thường không màu, không mùi, dễ bay hơi, ít tan trong nước và CCl4 nhưng tan tốt trong các dung môi: metanol, acetonitrin, hexan, dầu thực vật, chất béo Chúng cũng có thể tan trong máu và những dịch cơ thể có chứa lipoprotein

Khi tham gia vào thành phần của vật liệu polyme, phthalate cho phép các phân tử polyvinyl dài có thể trượt trên mặt của các phân tử polyvinyl khác, làm thay đổi tính chất của vật liệu: tăng độ bền, độ linh động, chịu được một số tác động môi

trường Bảng 1 chỉ ra một số PAEs điển hình với tên gọi, cấu tạo và tính chất vật lý của chúng

Bảng 1.Tên gọi, cấu tạo và tính chất của một số PAEs điển hình

Tên gọi Viết

tắt

KLPT (g/mol) CTCT

Nhiệt hóa hơi ( o C)

Độ tan trong nước

Số hiệu CAS

(25oC)

85-68-7

1930, nhất là di (2-ethylhexyl) phthalate (DEHP), diisodecyl phthalate (DIDP), và diisononyl phthalate (DINP) DEHP là chất làm mềm dẻo được sử dụng trên toàn cầu trong PVC do chi phí thấp Benzyl butyl phthalate (BBP) được sử dụng trong sản xuất PVC bọt, hay các phthalate với mạch ngắn được sử dụng làm dung môi trong nước hoa và thuốc trừ sâu Hiện nay, trong ngành công nghiệp sản xuất nhựa,

tiêu biểu như trong polyvinyl clorua (PVC), polyethylene terephthalate (PET), polyvinyl acetates (PVA) và polyethylene (PE), PAEs chiếm từ 10 - 60% trọng lượng

Các nhóm cacboxyl phân cực đóng góp tạo nên tính chất vật lý của phthalate, đặc biệt trong các PAEs có mạch cacbon (ở R và R’) ngắn, nhờ đó tạo nên tính dẻo của vật liệu polyme thông qua cơ chế tương tác lưỡng cực giữa các trung tâm phân cực của phthalate (nhóm C = O) và các vùng tích điện dương của của chuỗi vinyl (trong PVC, thường nằm trên nguyên tử cacbon của liên kết C - Cl Để cho tương tác này được thiết lập, các polyme thường được nung nóng chảy trong sự có mặt của chất làm dẻo Từ đó tạo ra một hỗn hợp đồng nhất giữa polyme và chất làm dẻo,

và cho phép những tương tác phân cực này xảy ra Trong khi các PAEs tương tác với các phân tử polyme qua những liên kết lưỡng cực lỏng lẻo, PAEs liên kết với nhau bằng những liên kết hydro và lực liên kết Van der Walls Do không hình thành liên kết cộng hóa trị với vật liệu nền, PAEs có thể dễ dàng bị đào thải trong quá trình lão hóa của vật liệu và gây ra những tác hại lớn cho con người và môi trường khi phân tán vào nước, đất, bầu khí quyển

Các PAEs mạch ngắn, như dimethyl phthalate (DMP), diethyl phthalate (DEP) và dibutyl phthalate (DBP) thường được sử dụng trong mỹ phẩm, các sản phẩm chăm sóc cá nhân, nhựa epoxy, và các este xenlulo để làm tăng độ kết dính của sản phẩm Các PAEs mạch dài như butyl benzyl phthalate (BBP), dicyclo hexyl

phthalate (DCHP), di - n - octyl phthalate (DnOP), di - n - nonyl phthalate (DnNP),

di - iso - decyl phthalate (DiDP) và diethyl hexyl phthalate (DEHP) được sử dụng

rộng rãi như một hoạt chất làm dẻo trong ngành công nghiệp polyme để cải thiện độ mềm dẻo của vật liệu polyme tùy thuộc vào yêu cầu của vật liệu

Bảng 2 Ứng dụng của các phthalate điển hình trong cuộc sống

PAEs Sử dụng Các sản phẩm

dầu gội, sáp nến

DEP

Chủ yếu làm dung môi, chất

cố định hương trong nước

hoa

Mỹ phẩm, nước hoa, kem dưỡng da, sáp nến, dầu gội đầu, thuốc trừ sâu

Mỹ phẩm, nước hoa, kem dưỡng da, sáp nến, dầu gội đầu, chất kết dính, sơn, sàn vinyl, keo dán, sản phẩm chăm sóc xe hơi

DnOP Chủ yếu được sử dụng như

một chất làm dẻo cho PVC

Sàn, nắp chai, băng tải, ống nước, đồ chơi, giày dép, quần áo, thiết bị y tế (ống nhựa và chai đựng dịch tiêm tĩnh mạch)

DEHP Chủ yếu được sử dụng như

một chất làm dẻo cho PVC

Da bọc ô tô, thiết bị điện tử, hệ thống ống nước, gạch lát sàn, mô hình, đồ chơi, găng tay, ống hút uống, chất kết dính, mực

DiNP Chủ yếu được sử dụng như

một chất làm dẻo cho PVC

Sơn và sơn mài, bao bì thực phẩm, quần áo, giày dép, da làm nội thất xe hơi, ván sàn

DiDP Chủ yếu được sử dụng như

một chất làm dẻo cho PVC

Dây điện, da cho nội thất xe hơi, ván sàn, nhựa PVC

Ngoài ra do tính chất không tan trong nước nên chúng còn được sử dụng làm chất tạo đục trong các sản phẩm nước như thạch rau câu, sữa, nước ngọt điển hình như DEHP và DINP được sử dụng trong thực phẩm thay cho dầu cọ Tuy nhiên, lượng phthalate có trong thực phẩm còn có một lượng nhỏ là do bị thôi nhiễm từ vỏ bao bì bằng nhựa Trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, phthalate có mặt trong sơn móng tay, keo vuốt tóc, dầu gội, kem dưỡng da, thuốc nhuộm tóc, son môi, phấn Những chất này được thêm vào để tạo độ tươi mới, tạo độ mịn, hấp dẫn, sáng bóng hơn, bền lâu hơn, bám dính hơn Chất DEP còn được dùng như một chất định hương trong nước hoa, giúp nước hoa giữ mùi thơm được lâu hơn và mùi không bị biến đổi trong các điều kiện thời tiết khác nhau Trong ngành sản xuất các loại dụng

cụ, thiết bị y tế, các phthalate thường có trong những túi nhựa đựng máu, dây truyền nước và hóa chất, ống thông tiểu, ống súc dạ dày, DEP được dùng như một chất trị bệnh ghẻ vì có tính diệt khuẩn (hiện không còn sử dụng để điều trị nữa), làm chất hóa dẻo trong bao phim viên thuốc, nhưng lớp phim bao này thường rất mỏng cộng với việc sử dụng hàng ngày chỉ một lượng nhỏ nên coi như lượng vào cơ thể không đáng kể

1.1.3.2 Nguồn gốc phát tán các phthalate vào thực phẩm

Phthalates trong thực phẩm chủ yếu là do bị nhiễm trong quá trình sản xuất

và do thôi nhiễm PAEs hay được thêm vào trong nhựa cũng sẽ có mặt một lượng nhỏ trong các mẫu thực phẩm như DBP, BBP, DINP, DNOP, DIDP, khi dùng vỏ hộp nhựa đựng đồ ăn nóng và nhiều dầu mỡ, hoặc cho quay nóng trong lò vi sóng Tsumura (2001) đã chỉ ra rằng hàm lượng DEHP tăng lên trong thịt gà từ 80 µg/kg trước khi nấu đến 13,100 µg/kg sau khi rán trong chảo được tráng Teflon, và còn cao tới 16,900 µg/kg sau khi đóng gói [58] Làm nóng thực ăn trong các vỏ bọc trực tiếp của đồ ăn nhanh tạo điều kiện rất lớn cho sự thôi nhiễm PAEs từ vật liệu bọc thức ăn Trong khi kiểm tra các bữa ăn được chuẩn bị tại 3 bệnh viện tại Nhật cũng cho thấy việc sử dụng găng tay cao su cũng đóng góp 600 µg PAEs mỗi ngày Các bữa ăn ở bệnh viện đó chứa trung bình khoảng 160 µg DEHP; 12,5 µg DEHA; 4,7µg DINP và 3,4µg BBP một ngày

PAEs có trong thực phẩm không chỉ do thôi nhiễm từ vật chứa hoặc tiếp xúc Những sản phẩm giàu chất béo như bơ, phomai, mayonaise đều được thêm một lượng nhỏ PAEs vào để làm chúng trông tươi ngon và mịn hơn PAEs ít tan trong các dạng thức ăn ít béo, chứa nước mà tạo thành dạng nhũ tương giữa hai hay nhiều pha trong một dạng thức ăn Vì vậy PAEs thường được thêm vào nước hoa quả hoặc đồ uống có cồn để làm tăng độ đục và tạo cảm giác tự nhiên hơn cho các loại thực phẩm đó Thực tế mặc dù PAEs bị cấm sử dụng trong các trường hợp như vậy, tuy nhiên theo Cục quản lý Thực phẩm và Thuốc Đài Loan, vẫn có những cơ sở sản xuất sử dụng PAEs để làm chất tạo đục để giảm giá thành so với các sản phẩm tự nhiên như dầu cọ, gum arabic và tạo độ ổn định trong sản phẩm Chủ yếu phthalate được dùng trong trường hợp này là DEHP và DINP Thường thì các nhà sản xuất nếu có dùng các phthalate này trong thực phẩm thì cũng khó có thể ghi nó lên thành phần của thực phẩm đó vì nhiều lý do

đó có sự khác biệt cả về liều lượng cũng như con đường xâm nhập vào cơ thể sinh vật

Chưa có nhiều thử nghiệm về tác hại của PAEs đối với cơ thể con người Tuy nhiên đối với những nghiên cứu trên động vật (cụ thể là chuột ở cả hai giới tính) đã cho ta thấy những kết quả đáng ngại về PAEs Bell và cộng sự đã chỉ ra độc tính của PAEs này trên những con chuột được tiêm vào một lượng nhất định và nhận thấy tác hại đến hệ sinh sản từ năm 1982 [2] PAEs càng thấp thì càng độc hơn

so với PAEs cao (gốc ancol từ C6-C9) Khi tiêm vào tĩnh mạch chuột, PAEs tích tụ lại trong phổi, gan và lá lách với những lượng khác nhau và dần làm mất chức năng của các bộ phận đó PAEs gây xáo trộn nội tiết do can thiệp vào hệ nội tiết trong cơ thể [6] Tiếp xúc với PAEs lâu dài sẽ làm tăng tỷ lệ mắc các đột biến như hở hàm ếch, dị tật xương và tăng tỉ lệ thai lưu ở vật thí nghiệm có thai [10, 12, 51]

Trẻ sơ sinh có nguy cơ phơi nhiễm PAEs ngay khi còn trong bụng mẹ [17]

và đã có nhiều nghiên cứu về tác hại của phthalate đối với trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ bao gồm hệ thần kinh và sinh sản [4, 30] Các dẫn xuất phthalate được xác định là các xenoestrogen, do đó chúng sẽ là những chất làm rối loạn nội tiết (endocrine disruptors), cụ thể là làm rối loạn hệ thống hoóc môn giới tính và gây ra dậy thì trước tuổi ở cả bé gái lẫn trai [56] Ở phụ nữ, nhiều nghiên cứu cho thấy các phthalates làm tăng nguy cơ lạc nội mạc tử cung (endometriosis) cũng như ung thư

vú [21, 29, 31] Trong một số nghiên cứu trước đây các nhà nghiên cứu đã chứng minh được rằng: DnBP, BBP, DEHP và DiNP có thể ảnh hưởng bất lợi đến hệ thống sinh sản nam giới [13, 48], DEP có thể gây tổn thương DNA trong nhân tinh trùng và các thông số tinh dịch của con người [9], DEHP có thể phá vỡ hệ thống nội tiết và gây ra sinh non ở người [8, 41], nồng độ cao của DEHP trong bụi nhà sẽ làm tăng tỷ lệ mắc bệnh hen suyễn và mức BBP cao làm tăng tỷ lệ viêm mũi và eczema

ở trẻ em [5] Tổ chức nghiên cứu về ung thư (IARC, 1982) đã công bố phthalate là một chất có thể gây ung thư cho con người như ung thư gan, tụy bởi khả năng kích hoạt, làm tăng chiều dài các chuỗi PPAR - α [18, 42]

Bảng 3 Các cấp độ rủi ro do phơi nhiễm PAEs theo thống kê của Heudorf [49]

PAEs Quốc gia Tổ chức

Mức độ (mg/kg/

PAEs Quốc gia Tổ chức

Mức độ (mg/kg/

BBzP

0,048 TDI nói chung, trừ trẻ sơ sinh và

nhũ nhi< 12 tháng, phụ nữ ở độ

PAEs Quốc gia Tổ chức

Mức độ (mg/kg/

Chú thích: ATSDR (Agency for Toxic Substances and Disease Registry): Cơ quan đặc trách các chất độc hại và theo dõi bệnh tật, Bộ Y Tế Hoa Kỳ CSTEE (Scientific Committee on Toxicity, Ecotoxicity and the Environment): Ủy ban khoa học về độc tính, độc tính sinh thái và môi trường ECB (European Chemicals Bureau): Cục hóa chất châu

Âu EPA (Environmental Protection Agency): Cơ quan bảo vệ môi trường châu Âu MRL (minimal risk level): cấp độ rủi ro nhỏ nhất; TDI (tolerable daily intake): mức dung nạp hàng ngày; RfD (reference dose): liều tham chiếu

1.2 Mục tiêu nghiên cứu và đối tƣợng nghiên cứu

 Mục tiêu của bản luận văn này bao gồm các mục tiêu cụ thể sau:

- Xây dụng quy trình phân tích đồng thời 10 phthalate trong mẫu dầu thực vật bằng phương pháp sắc kí khí ghép nối 2 lần khối phổ Nội dung bao gồm việc khảo sát điều kiện tối ưu trên thiết bị GC - MS/MS, quy trình xử lý mẫu (dung môi, thời gian chiết, làm giàu mẫu) và thẩm định phương pháp (xác định đường chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng, độ đúng và độ chụm)

- Áp dụng quy trình đã tối ưu để xác định các phthalates trong một số mẫu dầu thực vật bán trên thị trường ở Hà Nội

 Đối tượng được nghiên cứu trong bản luận văn này gồm có:

- 10 phthalate: DMP, DEP, DPP, DiBP, DBP, DnHP, BzBP, DCHP, DEHP và DnOP

- 18 mẫu dầu thực vật, phân loại thành 3 nhóm: dầu tổng hợp, dầu đậu nành và dầu oliu Các mẫu dầu tổng hợp và dầu đậu nành được đóng gói trong chai nhựa, mẫu dầu oliu đựng trong chai thủy tinh

1.3 Các phương pháp xác định phthalate

Phương pháp phân tích PAEs trong thực phẩm gặp khó khăn do việc ô nhiễm PAEs có thể diễn ra ở khắp mọi nơi, ngay cả trong phòng thí nghiệm: dung môi, thuốc thử, dụng cụ nhựa, thủy tinh đều có chứa hoặc nhiễm PAEs Hầu hết các loại thực phẩm đều tìm thấy lượng nhỏ PAEs Do đó việc đánh giá mức độ ô nhiễm PAEs trong thực phẩm cần áp dụng biện pháp thích hợp để hạn chế tối đa nguồn ô nhiễm, đảm bảo chất lượng kết quả phân tích

Nhiều tài liệu cung cấp phương pháp đánh giá PAEs cụ thể đã được công bố [33] Quá trình phân tích PAEs được chia làm hai bước: (1) xử lý mẫu thực phẩm và (2) phân tích PAEs trong mẫu Các PAEs sẽ được chiết xuất khỏi mẫu thực phẩm sau đó được làm giàu trước khi đi vào hệ thiết bị phân tích Dụng cụ, hóa chất, thiết

bị thí nghiệm được lựa chọn, sử dụng, bảo quản, làm sạch cẩn thận để giảm thiểu tối

đa bị nhiễm PAEs từ bất kì nguồn nào khác có thể dẫn tới sai số thực nghiệm (kể cả những dụng cụ từ các khâu thu thập mẫu, xử lý đến các thiết bị phân tích) Phòng thí nghiệm phân tích PAEs cũng như các dụng cụ vật dụng trong phòng hay không khí, nhiệt độ phòng, cũng cần được kiểm soát nghiêm ngặt Dụng cụ thí nghiệm cần được bảo quản trong bao bì (được làm bằng vật liệu không có chứa PAEs) Trước khi phân tích, các mẫu thường được chia thành các aliquots (tối đa 300 mL) đối với mẫu dạng lỏng Mẫu dạng rắn được xay, nghiền đồng nhất, được bổ sung nước hoặc dung môi hữu cơ phân cực để PAEs di chuyển hết từ mẫu sang dung môi sau đó được chia nhỏ từ 0,1-10,0 g, tùy theo hàm lượng chất béo

1.3.1 Xử lý mẫu trong phân tích PAEs

Việc loại bỏ nền mẫu béo trước khi tiến hành phân tích PAEs là điều bắt buộc Hầu hết các thí nghiệm đều sử dụng chiết lỏng - lỏng để phân tách PAEs ra khỏi nền mẫu do có ưu điểm đơn giản, chính xác, LOD nhỏ, độ thu hồi cao, tiết

kiệm chi phí [25] Dung môi chiết thường dùng là n - hexan, n - heptan, ACN, diclometan hoặc iso - octan, trong đó tối ưu nhất là n - hexan [27] Trường hợp thực

phẩm giàu chất béo dạng rắn thì dùng dung môi diclometan, hỗn hợp diclometan

với cyclohexan, n - hexan, hỗn hợp n - hexan với aceton hoặc ACN để tăng độ chọn

lọc từ thực phẩm, dựa trên khả năng tan kém của các chất béo vào trong ACN

Trước khi đưa vào hệ sắc ký để phân tích hàm lượng PAEs, mẫu phải được đồng nhất, loại nền và làm giàu Với mẫu lỏng có thể dùng biện pháp chiết, lắc, trộn lẫn hay khuấy Đối với mẫu rắn thường sử dụng máy trộn để làm đều hoặc có thể cho thêm dung môi hữu cơ phân cực hoặc nước cất Bước loại nền có thể sử dụng chiết pha rắn để tách lấy PAEs Nhiều nghiên cứu đã tách PAEs khỏi chất béo bằng cột chiết Biobeads SX3 hoặc PL - gel, rửa giải bằng hỗn hợp diclomethan - cyclohexan [45, 53, 57]; hoặc dùng cột florisil, silica gel [52]

PAEs thường được chiết xuất từ nền mẫu lỏng như nước, đồ uống có cồn

hoặc không cồn, dung môi chiết là clorofom, n - hexan, n - heptan hoặc iso - octan,

sau đó thực hiện phân tích trực tiếp mà không cần xử lý làm sạch hay làm giàu Hỗn hợp ACN hoặc ACN/H2O chủ yếu được sử dụng trong quá trình chiết xuất PAEs từ thức ăn rắn không béo Trong trường hợp thực phẩm có chất béo, PAEs được chiết

xuất cùng với chất béo trong diclo metan, hoặc trong hỗn hợp của n - hexan với

aceton hoặc ACN để quá trình chiết xuất PAEs chọn lọc hơn Chiết xuất có thể được thực hiện bằng cách lắc mẫu với dung môi chiết xuất hoặc hỗn hợp, hoặc bằng cách áp dụng siêu âm hoặc lò vi sóng

Việc chiết xuất làm sạch các mẫu thực phẩm lỏng không béo thường được thực hiện bởi quá trình chiết lỏng/lỏng (L/L) Phương pháp chiết này cũng có thể được áp dụng với việc làm sạch các mẫu thực phẩm rắn [16, 33, 58] Trong trường hợp mẫu thực phẩm có chứa chất béo [33] có đề cập tới các phương pháp như sắc

ký gel thẩm thấu (GPC) làm một phương pháp được sử dụng rộng rãi Quá trình được thực hiện trên cột silica, sử dụng Biobeads S-X3 (Phòng thí nghiệm Bio-Rad, Hercules,CA, USA) và diclometan/cyclohexan (1: 1 v/v) hoặc cyclohexan/ etyl axetat (tỷ lệ 1: 1 v/v) được sử dụng làm dung môi rửa giải

Các phương pháp chiết PAEs và các công trình liên quan trên các nền mẫu

đa dạng được công bố từ những năm 2010, chủ yếu thực hiện trên các phương pháp như chiết pha rắn thông thường (SPE), chiết pha rắn phân tử đánh dấu (MISPE), chiết pha rắn từ tính (MSPE) chiếm hơn 60% các kĩ thuật chiết tách thường được sử dụng, theo sau đó là chiết lỏng lỏng (10%), QuEChERs (8%) và chiết pha rắn vi sóng (SPME, 7%) Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp chiết lỏng lỏng để tách các phthalate ra khỏi nền mẫu dầu thực vật Quy trình chiết tách sau khi tối ưu từng thông số được áp dụng vào xử lý các mẫu thực

1.3.2 Phương pháp phân tích PAEs trên hệ sắc ký

Sắc ký là một trong những phương pháp phân tích hiện đại được ứng dụng rộng rãi nhất hiện nay nhờ độ nhạy cao và khả năng định lượng tốt, phù hợp để xác định nhiều đối tượng khác nhau như các chất khó bay hơi, chất phân cực/ ít phân cực Kỹ thuật phân tích này có ứng dụng rộng rãi trong xác định chất phụ gia, thuốc diệt cỏ, thuốc bảo vệ thực vật trong thực phẩm và môi trường như phương pháp sắc

ký khí, sắc ký lỏng sử dụng các detector kết hợp khác nhau: detector UV, DAD, huỳnh quang, detector bắt điện tử Thiết bị GC/MS được cấu tạo thành 2 phần: phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối

PAEs là este của axit phthalic với hai hoặc một rượu nào đó, do đó tính chất

và cấu tạo của chúng có tính tương đồng cao Vì là các este nên có thể sử dụng cả sắc ký khí và sắc ký lỏng để phân tích Sắc ký khí ghép nối với detector khối phổ khi phân tích PAEs cho hiệu quả cao Ngoài ra có thể sử dụng sắc kí khí ghép nối với các detector khác để xác định PAEs như detector bắt điện tử (ECD), hay ion hóa ngọn lửa (FID) tuy nhiên độ nhạy kém hơn Sắc ký lỏng kết hợp sử dụng detector

UV cũng có thể định lượng cũng như định tính được PAEs, tuy nhiên dùng HPLC -

UV thì khi phân tích mẫu thực, kết quả phải được kiểm chứng lại bằng một phương pháp mạnh hơn như ghép nối với MS Sự kết hợp 2 kỹ thuật này (GC/MS - Gas Chromatography Mass Spectometry) khi phân tích PAEs giúp đánh giá, phân tích định tính và định lượng tốt

1.3.2.1 Các phương pháp sắc kí khí ghép nối detector khối phổ

Phương pháp sắc ký khí phổ biến để xác định các phthalate là kết hợp với detector khối phổ hoặc hai lần khối phổ (GC - MS, GC - MS/MS) Các yếu tố cơ bản quyết định phép tách sắc ký PAEs bao gồm khí mang (loại khí mang, tốc độ khí mang), cột tách (thành phần pha tĩnh, độ phân cực pha tĩnh, bề dày lớp phim pha tĩnh, chiều dài cột tách) và chương trình nhiệt độ lò

Loại khí mang được sử dụng phổ biến nhất để tách PAEs là khí hiếm Heli,

độ tinh khiết trên 99,99%, thường được duy trì ở chế độ đẳng dòng với tốc độ dòng

từ 1,0 - 1,5 mL/phút

Bảng 4 Một số nghiên cứu PAEs bằng sắc ký khí ghép nối detector khối phổ

đã được kiểm tra đối chiếu lẫn nhau Kết quả cho thấy chế độ EI - MS/MS cung cấp dữ liệu tốt nhất Đặc biệt,

so sánh với phương pháp SIM phổ biến hơn đã chứng minh khả năng của detector MS/MS có độ nhạy và độ chọn lọc đều tăng Kết hợp kỹ thuật GPC với detector MS/MS cho độ thu hồi từ 71,7% đến 112,2%; RSD < 9% cho thấy tính hiệu quả của phương pháp khi xác

định hàm lượng phthalates trong nền mẫu phức tạp Barp,

- Hệ thiết bị GC - MS PAEs được chiết ra khỏi đối

tượng bằng dung môi THF và n - hexan Với điều kiện

và DIDP (m/z=307) ra sau phút 10,8 Có phân tích mẫu chuẩn CRM để xác nhận giá trị của phương pháp Hao-

- 07 phthalate (DEHP, DOP, DEP, DPP, DBP, BBP) và

04 paraben (Metyl paraben, Etyl paraben, Propyl paraben và butyl paraben)

- Sử dụng cả hai phương pháp là sắc ký khí ghép nối detector khối phổ và sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ghép nối detector DAD Sau khi đã được làm sạch với cột chiết pha rắn C18, độ thu hồi 85-108%, RSD 4,2 - 8,8% Điều kiện tối ưu khi sử dụng GC - MS: mảnh cơ bản m/z = 149 để định lượng các phthalate, còn m/z =

121 để định lượng các paraben Thiết bị Agilent 6890N, bơm mẫu tự động ghép với detector MS, cột

HP - 5MS 30 m × 0,25 ID × 0,25 µm, cột mao quản 5% diphenyl, 95% dimetyl polysiloxane, khí mang He Chạy với gradient nhiệt: 1000C giữ trong 0,5 phút tăng

từ từ 50C mỗi phút cho đến 2200C, tăng tiếp 100

C một tới 2750C, giữ 5 phút Tốc độ khí mang ở 1,0 ml/min Tiêm mẫu ở 2500C Khoảng tuyến tính của các chất phân tích nằm từ 0,54-100 mg/l Các điều kiện khác như đồng nhất mẫu, lắc, rung đều được tối ưu

- Chiết pha rắn kết hợp với sắc ký khí ghép nối detector

khối phổ Các mẫu được chiết bằng n - hexan hoặc

acetonitril, làm sạch bằng cột chiết pha rắn ProElut PSA Việc xác định và định lượng PAEs được thực hiện bằng chế độ chạy SIM trong GC - MS Khoảng tuyến tính của PAEs từ 0,05 - 5,0 mg/L với hệ số tương quan R2 = 0,989 - 0,999(6) Giới hạn phát hiện PAEs

trong khoảng 0,005 - 0,05 mg/kg (S/N = 3) và giới hạn định lượng dao động từ 0,02 - 0,2 mg/kg (S/N = 10) Hiệu suất thu hồi (n = 10) từ 77 - 112% với độ lệch chuẩn tương đối RSD = 4,1% cho thấy tính phù hợp của phương pháp để định tính và định lượng 23 PAEs trong nền mẫu thực phẩm

Phương pháp sắc ký khí có ưu điểm là ngoài yếu tố thời gian lưu như trong phương pháp sắc ký dùng detetor ECD, việc sử dụng detector MS còn cung cấp thêm thông tin quan trọng khác cho việc định danh là khối phổ của hợp chất phân tích Một lợi điểm quan trọng khác là trong trường hợp có sự trùng lặp một phần hoặc toàn phần, hai hay nhiều peak được rửa giải ra cột thì việc chọn lại mảnh ion

có thể giúp ta xác nhận lại hợp chất cần xác định và đồng thời cho phép định lượng được chúng Chính vì vậy chúng tôi chọn phương pháp này để xác định phthalate trong dầu thực vật Quá trình phân tích trên thiết bị GC - MS/MS được chia thành hai giai đoạn:

- Giai đoạn tách các chất xảy ra trên cột sắc ký khí: Mẫu được bơm vào trong

và theo dòng khí mang (He) đưa đến cột sắc ký (pha tĩnh) Mẫu khi qua cột này sẽ được hấp phụ lên trên pha tĩnh đó Sau đó, các chất lần lượt tách khỏi cột theo dòng khí ra ngoài được ghi nhận bởi detector (detector)

- Giai đoạn nhận biết, đo lường xảy ra trên detector khối phổ và bộ phận xử

lý số liệu Các cấu tử được tách khỏi cột sắc ký sẽ lần lượt được đưa vào các nguồn ion của máy khối phổ Tại đây, tùy thuộc vào bản chất của chất cần phân tích, sẽ diễn ra quá trình ion hóa với các kiểu ion hóa khác nhau (CI, PI, EI, FI, FD,…), sau

đó các ion được ghi nhận bởi bộ nhân quang để chuyển hóa thành tín hiệu điện Ứng với mỗi peak trên sắc ký đồ sẽ nhận được một khối phổ đồ riêng biệt và hoàn chỉnh

Chế độ ion hóa - phân tách trong sắc ký khí có cơ chế là bớt hay thêm một electron, một proton, thêm hay bớt ái lực điện tử âm hay dương và tạo nhóm cũng như hướng tới tạo thành các ion khác Ion hóa một phân tử là một quá trình tiêu hao năng

lượng, năng lượng này có thể được cung cấp bằng các electron gia tốc hay gia nhiệt (va chạm electron hay bắt giữ electron), bằng các photon (dưới tác động của bức xạ điện từ, chùm tia laze, hay quá trình phóng điện tích corona), bằng các nguyên tử hay các ion được gia tốc bằng việc biến đổi trường tĩnh điện cao hoặc va chạm nhiệt

Ion hóa điện tử (EI) là kỹ thuật phổ biến nhất, được ứng dụng nhiều nhất trong sắc

ký khí ghép nối detector khối phổ Quá trình tương tác xảy ra khi bắn phá một electron với electron của phân tử Các electron có thể dễ dàng thu nhận bằng cách cho dòng điện đi qua điện cực âm/dây tóc, thêm vào đó năng lượng của electron có thể điều chỉnh với nguồn điện dương với năng lượng tiêu chuẩn trung bình là 70eV Ion hóa hóa học (CI) là phương pháp ion hóa nhẹ nhàng hơn, sử dụng để ion hóa các phân tử dễ bay hơi, bền nhiệt nhưng không ổn định và không có ion phân tử nào được ghi trong thư viện phổ khối Quá trình này dùng electron trong điều kiện áp suất thấp hoặc chân không

Cả hai phương pháp ion hóa điện tử (EI) và ion hóa hóa học (CI) đều được dùng trong kỹ thuật sắc kí khí ghép nối khối phổ GC - MS Tuy nhiên, việc sử dụng CI đòi hỏi sự thay đổi thể tích ion (buồng ion hóa) do áp suất dư được sử dụng trong CI cao hơn rất nhiều (lên tới 1 mm Hg) so với áp suất sử dụng trong EI (10-5

- 10-7Torr) Với đối tượng nghiên cứu là các phthalate có khối lượng phân tử khá lớn, kém phân cực, nhiệt hóa hơi khá cao nên nguồn ion hóa được lựa chọn trong nghiên cứu này từ nguồn ion hóa điện tử EI với năng lượng va chạm tối đa 70eV

1.3.2.2 Các phương pháp sắc ký khác xác định phthalates

Một số tác giả cũng đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với detector UV để xác định các phthalate trong nhiều đối tượng khác nhau Knauer đưa ra quy trình tách 08 phthalate là benzylbenzoat, benzylbutyl phthalate,

dibutyl phthalate, dihexyl phthalate, di (2 - etylhexyl) phthalate, di - n - octyl phthalate, di - iso - nonyl phthalate, di - iso - decyl phthalate trên hệ HPLC pha đảo,

cột Eurospher II 100-3 C18 H, 250×3,0 mm ID [19] Hệ dung môi là ACN - nước với gradient với hai kênh A gồm H2O/ACN là 15:85 (thể tích/thể tích), kênh B là

ACN Gradient từ 0 - 3 phút từ 0% kênh B, từ 3,0 - 6,5 phút tăng từ 0% B đến 100%

B, phút thứ 6,5 đến 19,5 phút chạy 100% kênh B Tốc độ dòng 0,6 ml/phút, nhiệt độ cột 300C, detector UV đặt ở bước sóng 225 nm Kết quả cho thứ tự của các chất ra khỏi cột là BB - BBP - DBP - DnHP - DEHP - DNOP - DINP và cuối cùng là DIDP Tổng thời gian chạy một mẫu là 22 phút

Ting Wu và cộng sự đã tách 12 phthalate trên hai hệ UPLC và HPLC, để so sánh hiệu quả tách của hai hệ máy trên [36] Các phthalate được tách: DMGP, DPP, DIBP, DMP, DEP, DBP, BBP, DCHP, DEHP, DNOP, DAP, DHP Dung môi sử dụng là metanol, các dung dịch chuẩn các phthalate cũng được pha trong dung môi này, detector sử dụng là PDA đặt ở bước sóng 225 nm Với hệ UPLC là một hệ có hiệu quả tách cao, cỡ hạt nhỏ, cột ngắn, áp suất cao, đường kính nhỏ Cột sử dụng là cột phenyl 50 mm × 2,1 mm × 1,7 µm, nhiệt độ cột 450C, sử dụng hai dung môi kênh A là MeOH, kênh B là Nước Kênh A tăng trong 1,5 phút từ 50 - 78%, được giữ trong một phút, sau đó tăng đều lên 100% trong vòng 1 phút, giữ trong vòng 1 phút ở tỷ lệ 100% kênh A trước khi đưa về trạng thái ban đầu và được giữ cân bằng

ở điều kiện đó 2 phút Tổng thời gian chạy một mẫu là khoảng 7 phút, tốc độ pha động 0,4 ml/phút Còn đối với hệ HPLC của Agilent 1100, ghép nối với hệ bơm, bộ phận tự động bơm mẫu và lò cột Nhiệt độ cột đặt ở 250C, cột phenyl 250 mm × 4,6

mm × 5 µm Pha động cũng gồm hai kênh MeOH (kênh A) và nước (kênh B) Chế

độ gradient kênh A tăng trong 5 phút từ 70 - 85%, sau đó tăng đều trong 4 phút tới 100%, giữ trong 4 phút trước khi trở về điều kiện đầu sau đó giữ cân bằng 4 phút Tổng thời gian 18 phút một mẫu Tốc độ dòng 1,0 ml/phút Kết quả cho thấy đường nền khi chạy trên thiết bị UPLC rất ổn định, thẳng đều, không bị trôi hay bị dâng nền Còn đối với thiết bị HPLC, nền bị dâng đều theo lượng MeOH, tuy rằng hiệu quả tách đều tốt, độ phân giải giữa các pic đạt được tốt nhưng rõ ràng khi phân tích mẫu thực hệ UPLC sẽ cho kết quả phân tích chính xác hơn, thời gian phân tích nhanh hơn

Một phương pháp sắc ký lỏng được áp dụng để tách và định lượng các phthalate trong mẫu sơn móng tay D De Orsi và cộng sự [22] đã tách 07 phthalate:

DMP, DEP, DIBP, BBP, DBP, DEHP trên hệ HPLC - UV đặt ở bước sóng 254 nm Cột Zorbax Eclipse XDB C18 (Agilent) 150 mm × 4,6 mm × 3,5 µm Chế độ gradient bắt đầu với tỷ lệ 50:50 % thể tích etanol/nước, tăng dần đến 95% etanol trong 30 phút Thành phần này được giữ đến cuối cùng sau khi giữ cân bằng 10 phút, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, van bơm 10 µl, nhiệt độ cột 350C Phương pháp này thân thiện với môi trường bởi vì nó sử dụng dung môi etanol trong quá trình tách, thay cho các dung môi thường dùng khác trong HPLC như: ACN hay MeOH Các phthalate cũng được tách ra khỏi nhau, tổng thời gian lưu một mẫu chạy là 40 phút Phthalate được chiết ra khỏi nền mẫu bằng hỗn hợp 90/10 % thể tích etanol/nước Phân tích mẫu thực có sử dụng chất nội chuẩn DPP, nồng độ 50 ppm

Hyun Jung Koo và cộng sự đã nghiên cứu và ứng dụng phương pháp

HPLC-UV để xác định 04 phthalate (DEP, DBP, BBP, DEHP) trong các mẫu mỹ phẩm [50] Sử dụng hệ máy HPLC của Hitachi (model L-700, Tokyo), bộ phận bơm mẫu

tự động, cột Supecol LC - 18 5µm (250 mm×4,6 mm), nhiệt độ cột 200C ± 20C Pha động tỷ lệ 88:12 (88% ACN và 12% dung dịch đệm trietylamine 0,08%, pH 2,8 được điều chỉnh bằng axit photphoric 1mol/L) Tốc độ dòng 0,7 mL/phút, tổng thời gian chạy là 50 phút Đường chuẩn dựng từ 10 - 400 ppm, nội chuẩn DnHP Kết quả thu được, phát hiện 19/21 mẫu sơn móng tay và 11/42 mẫu nước hoa chứa DBP, 24/42 mẫu nước hoa chứa DEP với hàm lượng khá cao Trong nghiên cứu còn chỉ ra mức nhiễm phthalates khi sử dụng mỹ phẩm hàng ngày dựa trên lượng các phthalate phát hiện được trên các đối tượng mẫu

Nhìn chung, việc áp dụng phương pháp phân tích phthalate tùy thuộc vào từng đối tượng nền mẫu Quy trình xử lý mẫu chứa PAEs bao gồm các bước: tách chiết PAEs, làm sạch loại bỏ nhiễu nền, làm giàu mẫu trước khi đưa vào hệ phân tích

Bảng 5 Một số phương pháp xác định PAEs tùy theo nền mẫu

STT Nền

mẫu

Nghiên cứu

Đối tượng phân tích Xử lý mẫu Phương pháp phân tích

Phương pháp định lượng

Siêu chiết pha rắn

Ion - trap (IT); MS; ZB - 5MS (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)

Nội chuẩn (benzyl benzoat)

Chiết màng rắn

HPLC - UV/VIS 230 nm; cột sắc ký C18 (25 cm × 4.6 mm

× 5 μm)

Ngoại chuẩn

0.02 - 0.15 ng/mL; 85,92 – 101,03%

TD - GC - MS, cột DB - 5(

5% diphenyl, 95% dimethyl polysiloxane)

Ngoại chuẩn % RSD < 3%

DEP, DIBP, DBP, DEHP

Chiết với etanol;

Chiết lỏng lỏng siêu tới hạn bằng khí CO2

GC - MS; SGL - 5 (60 m ×

Serôdio và Nogueira (2006)

DBP, DEHP

Thanh khuấy từ được phủ poly dimethyl siloxan (PDMS) (20 × 0.5 mm)

LVI - GC - MS; TRB 5MS (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)

3 – 40ng/L,;< 98,5%

metan để chiết DEHP

DBP: GC-ECD; cột silica DB-1 (30 m × 0.32 mm × 0.25 μm), DEHP: GC-MS; cột silica DB - 5MS (30 m × 0.32

mm × 1.8 μm)

Ngoại chuẩn

8 Nước

Amiridou

và Voutsa (2011)

dimethyl polysiloxane (30 m

× 0.25 mm × 0.25 μm)

Nội chuẩn DnOP – d4

2- 30ng/L; 70 – 94%

0.64–0.79 ng/g; 93,2 – 105,7%

Lee (2013)

DMP,DEP,D

BP, BBP,DEHP,DnOP

Siêu chiết lỏng lỏng với dung môi toluen

GC-FID; CP-Sil 8 CB (30 m

0,06 - 0,08 μg/L

12 Rượu

vang

Cinelli vcs (2013)

DMP,DEP,DBP,BBP,DIB

P, DEHP

Rung siêu âm kết hợp siêu chiết lỏng lỏng

GC-FID và IT/MS; SE – 54

≥0.022 μg/L (≥0.075 μg/L); 85 – 100%

Casajuana

và Lacorte (2004)

DEHP

Chiết pha rắn (C18), dung môi diclometan/hexa

μg/kg; 73 – 119%

(2015)

DMP,DEP,DIBP,BBP, DBP, DCHP, DEHP,

0.013–0.022 μg/mL; 75,8 – 107,5%

0.005–0.095 μg/g (0.016–0.295 μg/g);

DMP, DBP, DEP, DEHP, etc

Chiết lỏng lỏng với dung môi clorofom/metan

ol 2:1 v/v, NaCl

GC-FID và MS; cột sắc ký

DB -5 MS (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)

Ngoại chuẩn

µg/g; %RSD

< 15%

Chương 2 THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Thực phẩm chứa PAEs có thể do hai nguyên nhân, do thôi nhiễm từ vỏ bao bì được làm bằng các loại nhựa hoặc do chúng được thêm vào trong quá trình sản xuất Thôi nhiễm từ bao bì thực phẩm có thể nhiều hoặc ít tùy thuộc loại thức ăn được chứa hoặc cách bảo quản, chế biến thức ăn trong bao bì đó Vì vậy đối tượng nghiên cứu trong nghiên cứu này bao gồm:

- 10 phthalate: DMP, DEP, DPP, DiBP, DBP, DnHP, BzBP, DCHP, DEHP và DnOP Đây là các phthalate được sử dụng nhiều nhất

- 18 mẫu dầu thực vật, phân loại thành 3 nhóm: dầu tổng hợp, dầu đậu nành và dầu oliu Các mẫu dầu tổng hợp và dầu đậu nành được đóng gói trong chai nhựa, mẫu dầu oliu đựng trong chai thủy tinh

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát, lựa chọn các thông số của hệ sắc ký khí ghép nối hai lần khối phổ GC – MS/MS phân tích đồng thời 10 phthalate (PAEs) trong dầu thực vật

- Xử lý mẫu bằng phương pháp chiết lòng - lỏng Tối ưu quy trình xử lý mẫu

- Đánh giá phương pháp phân tích trên thiết bị GC – MS/MS:

+ Xây dựng đường chuẩn

+ Xác định giá trị phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp

+ Đánh giá hiệu suất thu hồi, độ lặp lại của phương pháp

- Áp dụng phân tích các mẫu dầu thực vật thực tế

- Xử lý số liệu, thảo luận ý nghĩa các số liệu thu đươc

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thiết bị sắc kí khí ghép nối hai lần khối phổ (GC – MS/MS)

- Hệ thống sắc ký khí – khối phổ của hãng Agilent Technologies, Mỹ

- Phần sắc ký: GC System 7890B

- Bộ phận bơm mẫu tự động: Autosample 7693

- Phần khối phổ: Detector MS – 7890B, TSQ Thermo 8000 Evo, Trace 1310

- Phần mềm xử lý số liệu Xcalibur – Thermo

- Thư viện nhận danh NIST (USA – 2008)

- Cột tách sắc ký mao quản hợp nhất silica DB - 5MS không phân cực (Agilent) với các thông số: thành phần pha tĩnh 5% diphenyl, 95% dimethyl polysiloxan; kích thước chiều dài cột 30m, đường kính trong 0,25 mm và độ dày màng pha tĩnh 0,25 μm; khoảng nhiệt độ làm việc: -600C đến 3250

C

Hình 2 Hệ thiết bị GC - MS/MS

2.3.2 Chất chuẩn, chuẩn trung gian và dung dịch chuẩn làm việc

Các chất chuẩn phthalate bao gồm: dimethyl phthalate (DMP), diethyl phthalate

(DEP), dipropyl phthalate (DPP), di iso butyl phthalate (DiBP), benzyl butyl phthalate (BzBP), di - n - hexyl phthalate (DnHP), di (2-ethylhexyl) phthalate (DEHP), di - n - octyl phthalate (DnOP), dicyclohexyl phthalate (DCHP) và di - n - butyl phthalate

(DBP) với độ tinh khiết > 98% của hãng Sigma - Aldrich (USA) Ba chất chuẩn đồng

vị bao gồm dimethyl phthalate - 3,4,5,6 - d4 (DMP - d4), diisobutyl phthalate - 3,4,5,6 -

d4 (DiBP - d4) và di (2 - ethylhexyl) phthalate - 3,4,5,6 - d4 (DEHP - d4) với độ tinh khiết lớn hơn 98% được mua từ hãng Sigma (St Louis, MO)

Các chất chuẩn gốc của 10 hợp chất phthalate và 3 chất chuẩn đồng vị được chuẩn

bị bằng cách hòa tan hợp chất trong n - hexan để thu được dung dịch gốc của từng hợp

chất có giá trị 1000 mg/L Sau đó, các chất chuẩn này phối trộn và được pha loãng bằng n-hexan để thu được chuẩn trung gian có giá trị là 10 mg/L Chuẩn hỗn hợp làm việc của 10 hợp chất phthalate được chuẩn bị bằng cách hòa tan Tương tự như với chất chuẩn đồng vị thu được dung dịch nội chuẩn đồng vị có giá trị 100 mg/L Đường chuẩn làm việc được chuẩn bị hàng ngày với giá trị điểm chuẩn như 0,1; 1,0; 5,0; 10,0;

20,0; 50,0 và 100,0 µg/L được pha loãng từ chuẩn hỗn hợp bằng n - hexan

2.3.3 Hóa chất sử dụng

Các loại hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm diclometan, n -

hexan (Merck), metanol, acetonitrin (Thermo Fisher), Na2SO4, NACl, NAOH (Merck) đều có độ tinh khiết > 95% Nước siêu tinh khiết được sử dụng từ hệ thống Milli-Q®

Gradient A10 (Merck Millipore, USA)

2.3.4 Thiết bị, dụng cụ

 Máy lắc GFL - 3005 (Gesellschaft für Labortechnik, Đức), cân phân tích (Nhật Bản), hệ thống cô quay chân không (Buchi, Thụy Điển), hệ thống thổi khí nitrogen (Eyela, Nhật Bản)

 Dụng cụ: Ống ly tâm thủy tinh 50 ml Micropipet các loại từ 0 – 1000µL Bình tam giác các loại, cốc thủy tinh các loại, phễu chiết, bình cầu 2L, vial dùng cho GC, …

 Tất cả các dụng cụ thủy tinh đều phải được rửa sạch, tráng bằng nước cất, sau

đó tráng bằng metanol và để khô, sấy ở 1050

C trong vòng 1 giờ, lấy ra để nguội Trước

khi sử dụng tráng n - hexan (đã este hóa) 2 - 3 lần

2.4 Định lƣợng phthalate trên nền mẫu dầu thực vật bằng GC - MS/MS

2.4.1 Xác định các thông số kỹ thuật cho hệ thống GC - MS/MS

Mỗi hợp chất phân tích đều có độ phân cực, khả năng hóa hơi, khả năng ion hóa, độ phân hủy nhiệt khác nhau Việc khảo sát và tối ưu hóa các thông số của hệ

thống GC - MS/MS có ý nghĩa quan trọng, ảnh hưởng lớn đến kết quả phân tích Chúng tôi tiến hành tối ưu hóa hệ thống để xác định PAEs như sau:

- Bơm hỗn hợp chuẩn phthalate 100 µg/L trên máy GC – MS/MS

- Bơm các chất chuẩn đơn 100 µg/L để định tính các phthalate dựa vào thời gian lưu

- Chọn ion định lượng và ion xác nhận cho từng phthalate

- Tối ưu hóa lại ở chế độ SIM

- Xác định tỷ lệ ion xác nhận trên ion định lượng và khoảng dao động

2.4.2 Thông số kỹ thuật ban đầu cho hệ thống GC

Việc tách những cấu tử trên cột mao quản phụ thuộc vào bản chất cấu tử, pha tĩnh và ái lực của cấu tử với pha tĩnh Lợi thế của MS là có thể xác nhận và định lượng thông qua sắc đồ khối và khối phổ, nhưng việc xác nhận và định lượng sẽ trở nên cực

kỳ khó nếu vị trí và cường độ mũi sắc ký chịu ảnh hưởng của nền mẫu Vì vậy, để tăng

độ nhạy, độ đúng, độ chính xác của phương pháp phân tích chúng ta phải tìm cách khử ảnh hưởng nền ngay trên GC

Tham khảo các nghiên cứu xác định phthalate bằng phương pháp GC, chúng tôi lựa chọn chương trình nhiệt của lò như sau: từ 1000C, tăng 100

C/phút đến 2800C Tăng

50C/phút lên 3100C (giữ trong 5 phút) Tổng thời gian phân tích là 20 phút Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 2900C Chế độ tiêm mẫu không chia dòng, thời gian không chia dòng: 1phút Khí mang Heli, tốc độ dòng 1,0 mL/phút Nhiệt độ bộ phận kết nối sắc ký khí và khối phổ: 3100C, thể tích tiêm mẫu 1 μL Kiểm tra tính phù hợp của thông số

GC thông qua sắc ký đồ của 10 phthalate

2.4.3 Thông số kỹ thuật ban đầu cho hệ thống MS

Dựa vào trị số m/z tương ứng của ion sinh ra từ mỗi chất để nhận danh chúng

Như vậy hai chất cùng thời gian lưu nhưng phân mảnh ion khác nhau vẫn có thể nhận biết và định lượng được Detector MS có tính chọn lọc hơn so với các detector khác trong sắc ký khí, tránh được sự nhầm lẫn khi chỉ dựa vào thông số thời gian lưu làm yếu tố nhận danh Chúng tôi tiến hành khảo sát các thông số

của detector MS để tìm ra những thông số tối ưu nhất cho các hợp chất phthalate cần nghiên cứu

Điều kiện khảo sát của MS:

 Nhiệt độ ống chuyển ion 2500

C; nhiệt độ nguồn ion 2000C

 Thời gian cắt dung môi: 4 phút

 Thế ion hoá: 70 eV

 Kỹ thuật ion hóa bắn phá điện tử EI với năng lượng 70 eV

 Thời gian lấy tín hiệu: 0 – 20 phút

Trước khi tiến hành đo đạc, máy được đảm bảo vận hành tốt bằng cách turn máy theo những điều kiện chỉ dẫn bởi nhà sản xuất

Chế độ Auto - SRM, mỗi phthalate có mức năng lượng va chạm khác nhau Thời gian cắt dung môi: 4 phút Nhiệt độ nguồn ion hóa: 2000C Nhiệt độ phần kết nối (interface): 2500C và nhiệt độ phần MS: 2800C

2.4.4 Xử lý nhiễm bẩn trong quá trình phân tích phthalate

Việc xử lý nhiễm phthalate trong dụng cụ thủy tinh và dung môi trước khi thực nghiệm là điều cần thiết, vì phthalate có mặt ở khắp nơi Đối với dụng cụ thủy tinh chúng tôi tiến hành sấy ở 1000C trong 1h Trước khi dùng, dụng cụ được tráng bằng

dung môi n - hexan 3 lần Nếu chưa dùng đến, dụng cụ được bịt kín bằng giấy nhôm

để tránh nhiễm bẩn phthalate từ môi trường

Các dung môi dùng chiết đều của Merck Riêng dung môi n - hexan luôn nhiễm

một lượng nhỏ DEHP, do đó chúng tôi tiến hành tinh chế bằng phương pháp chưng cất Chuyển hóa phthalate trong dung môi thành muối natri phthalate thông

qua phản ứng xà phòng hóa với NaOH, sau đó chưng cất n - hexan để loại bỏ

phthalate

Tinh chế n - hexan: Lấy 2000,0 mL n - hexan vào bình cầu Thêm 400,0 g

NaOH Lắp bình cầu vào hệ thống chưng cất Nâng nhiệt độ lên 500C, duy trì trong 30 phút Tiếp tục nâng lên 780C Bỏ đi 30,0 - 50,0mL n - hexan ban đầu chưng cất Hứng lấy 800,0 - 1000,0 mL n - hexan tiếp theo Kiểm tra lại độ sạch của dung môi bằng GC

- MS/MS

Hình 3 Dung môi n - hexan trước khi chưng cất

Hình 4 Dung môi n - hexan sau chưng cất, este hóa bằng NaOH

Kết quả sau khi đo cho thấy sau khi chưng cất, các peak sắc ký của PAEs đều

hạ thấp đáng kể, chứng tỏ việc este hóa n - hexan có hiệu quả, đã loại bỏ hầu hết

PAEs có trong dung môi Vậy khi đó dung môi đủ độ tinh khiết để thực hiện các phép phân tích phthalates tiếp theo

2.4.5 Quy trình khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn

Pha dung dịch chuẩn gốc: chuyển 1,0 mL dung dịch chuẩn gốc mix 10 PAEs nồng độ 1000,0 mg/L (ppm) vào bình định mức 100,0 mL, định mức đến vạch bằng

dung môi n - hexan được dung dịch chuẩn 10 PAEs 10,0 mg/L (ppm) Bảo quản dung

dịch trong bình định mức, bọc kín bằng giấy bạc và lưu trữ trong tủ lạnh âm sâu

Đường chuẩn mix 10 PAEs được xây dựng gồm 7 điểm chuẩn ở các mức nồng

độ tăng dần từ 0,1 - 100,0 g/L (ppb), được pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc bằng

dung môi n - hexan đã tinh chế

2.4.6 Tối ưu hóa phương pháp xử lý mẫu

2.4.6.1 Dung môi chiết

Khảo sát các loại dung môi chiết PAEs từ nền mẫu dầu ăn đã được trình bày trong nhiều nghiên cứu Kĩ thuật chiết lỏng lỏng mang lại khả năng phân tích cao khi lựa chọn được dung môi chiết phù hợp Dung môi được lựa chọn cho phương pháp cần đáp ứng các điều kiện: có khả năng hòa tan tốt chất phân tích, có ái lực mạnh với chất cần phân tích, hạn chế đồng chiết nền mẫu, dung môi chiết và nền mẫu có khả năng tách hoàn toàn nhau Theo tác giả Long Kai Shi (2016) [27], trong 4 dung môi thường

dùng để chiết PAEs là n - hexan, diclometan, acetonitril và metanol thì n - hexan là

dung môi chiết tối ưu nhất cho DMP, DEP, DBP và BBP Đối với phân tử PAEs có khối lượng phân tử lớn như DEHP thì ACN là dung môi chiết phù hợp nhất Tuy nhiên

sự khác nhau giữa n - hexan và ACN khi chiết DEHP là không đáng kể Trên cơ sở đó, trong nội dung nghiên cứu này, chúng tôi cũng sử dụng dung môi n - hexan làm dung

môi chiết các PAEs trong nền mẫu dầu ăn

2.4.6.2 Số lần chiết

Số lần chiết càng nhiều thì lượng PAEs được chiết ra trong dầu ăn càng tăng đến cực đại Tuy nhiên, chiết nhiều lần làm tăng thể tích dịch chiết dẫn đến thời gian quá trình làm giàu mẫu sẽ kéo dài, dễ bị mất chất trong giai đoạn thổi khô và

cô quay Do đó, chúng tôi tham khảo các quy trình xử lý mẫu trong các nghiên cứu khác và lựa chọn số lần chiết là 2

2.4.6.3 Phương pháp làm giàu mẫu

Hạn chế của kỹ thuật chiết lỏng lỏng là sau khi chiết mẫu, thể tích dung môi chiết thường rất lớn Do đó cần thiết phải áp dụng phương pháp làm bay hơi bớt dung môi đồng thời không làm mất chất phân tích Làm giàu mẫu trước khi đưa vào hệ GC - MS/MS thông thường có 2 phương pháp: cô quay chân không giới hạn nhiệt độ và thổi khô lạnh Cô quay chân không có giới hạn nhiệt độ sẽ làm bay hơi dung môi khá nhanh, tuy nhiên lượng chất phân tích cũng có thể bị mất theo Còn phương pháp thổi khô lạnh bằng khí có ưu điểm là lượng chất phân tích ít bị mất trong quá trình thổi khô, nhưng thời gian thổi khô khá lâu nếu lượng dịch chiết lớn Việc kết hợp hai phương pháp giúp tiết kiệm thời gian phân tích, hạn chế khả năng làm bay hơi dung môi cũng như hạn chế thời gian tiếp xúc giữa chất phân tích với môi trường không khí xung quanh, từ đó làm tang hiệu suất thu hồi các phthalate khảo sát Do đó trong nghiên cứu này, chúng tôi kết hợp cả hai phương pháp trên để tối ưu hóa giai đoạn làm giàu mẫu

2.6.4.4 Thiết kế thí nghiệm

Phương pháp mặt đáp ứng (Respond Surface Methods - RSM) là một trong những phương pháp dùng để đánh giá tổng quát sự ảnh hưởng của các yếu tố độc lập đến mục tiêu nào đó Trong nghiên cứu này, chúng tôi thiết kế thí nghiệm bao gồm 3 biến độc lập liên tục (Tỷ lệ thể tích dung môi/thể tích mẫu,nồng độ dung dịch NaCl và thời gian chiết)được đưa vào hàm mục tiêu ( ) - hiệu suất chiết xuất phtalate trong mẫu(1).Các biến X1, X2, X3 được bố trí thí nghiệm ở năm mức - α, -1, 0, +1 và +α Số thí nghiệm cần thực hiện là 20 (23 thí nghiệm tại mức gốc, 6 thí nghiệm tại điểm sao

và 6 thí nghiệm lặp lại tâm với một hàm mục tiêu là hiệu suất thu hồi PAEs) Phần mềm MODDE 12.1 được sử dụng để thiết kế ma trận thí nghiệm, tính toán các giá trị hồi quy và phân tích phương sai

Bảng 6 Giá trị mã hóa các yếu tố thực nghiệm

- α -1 0 + 1 +α

Thiết kế thí nghiệm với các mức được mã hoá trong bảng 7