NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TRÍCH LYTOCOPHEROL, TOCOTRIENOL VÀ γ-ORYZANOLTRONG MỘT SỐ MẪU CÁM GẠO VIỆT NAM

BÁO CÁO TỔNG KẾTĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TRÍCH LY TOCOPHEROL, TOCOTRIENOL VÀ γ-ORYZANOL TRONG MỘT SỐ MẪU CÁM GẠO VIỆT NAM Mã số đề tài: TSV2014-24 Th

- -BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TRÍCH LY

TOCOPHEROL, TOCOTRIENOL VÀ γ-ORYZANOL TRONG MỘT SỐ MẪU CÁM GẠO VIỆT NAM

Mã số đề tài: TSV2014-24

Thuộc nhóm ngành khoa học: Khoa học Tự nhiên (TN)

Cần Thơ, 12/2014

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TRÍCH LY TOCOPHEROL, TOCOTRIENOL VÀ γ-ORYZANOL TRONG MỘT SỐ MẪU

CÁM GẠO VIỆT NAM

Mã số đề tài: TSV2014-24 Thuộc nhóm ngành khoa học: Khoa học Tự nhiên (TN)

Sinh viên thực hiện: Phạm Cảnh Em Giới tính: Nam

Dân tộc: Kinh Lớp: KH11Y2A1

Khoa: Khoa học - Tự nhiên Năm thứ: 4 /Số năm đào tạo: 4Ngành học: Hóa học (chuyên ngành Hóa dược)

Người hướng dẫn: Ths Nguyễn Văn Đạt

Cần Thơ, 12/2014

TT Họ và tên lĩnh vực chuyên mônĐơn vị công tác và Nội dung nghiên cứu cụ thểđược giao Chữ ký

1 Phạm Cảnh Em Khoa KH-TN

Lớp: Hóa Dược K37

- Xây dựng quy trình trích lycác thành phần trong cám gạobằng phương pháp trích lydung môi trực tiếp và trích lydung môi hỗ trợ của vi sóng

và siêu âm Đánh giá kết quả

- Định lượng các thành phầntrong cám gạo bằng HPLC

- Viết báo cáo nghiệm thu đềtài

2

Trần Minh Quốc

Nguyễn Thị Kim Mơ

Khoa KH-TN Lớp: Hóa Dược K37

- Xây dựng quy trình trích lycác thành phần trong cám gạobằng phương pháp trích lydung môi trực tiếp và trích lydung môi hỗ trợ của vi sóng

3

Lê Thị Tường Vi

Nguyễn Hữu Phong

Khoa KH-TN Lớp:Hóa Dược K37

- Xây dựng quy trình trích lycác thành phần trong cám gạobằng phương pháp trích lydung môi trực tiếp và trích lydung môi hỗ trợ của sóng siêuâm

ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH

Tên đơn vị

trong và ngoài nước Nội dung phối hợp nghiên cứu Họ và tên người đại diện đơn vị

Bộ môn hóa học - Khoa KHTN

Cung cấp máy móc, thiết bị,phòng thí nghiệm phục vụnghiên cứu

Nguyễn Trọng Tuân

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

PHỤ LỤC vi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii

TÓM TẮT xiii

ABSTRACT xiv

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU CHUNG 1

1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1

2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2

3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 3

1 THÀNH PHẦN CỦA CÁM GẠO 3

2 HOẠT TÍNH CỦA TOCOPHEROL, TOCOTRIENOL VÀ γ-ORYZANOL 4

3 CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU TOCOPHEROL, TOCOTRIENOL VÀ γ-ORYZANOL 6

3.1 Dung môi và phương pháp trích ly 6

3.2 Công trình nghiên cứu 8

4 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CÁM GẠO BẰNG HPLC 11

4.1 Giới thiệu RP-HPLC 11

4.2 Một số nghiên cứu phân tích cám gạo bằng HPLC 12

5 PHƯƠNG PHÁP BỀ MẶT ĐÁP ỨNG (RSM) 13

5.1 Giới thiệu 13

5.2 Lý thuyết và các bước ứng dụng RSM 14

5.2.1 Sàng lọc biến 14

5.2.2 Chọn thiết kế thực nghiệm 14

5.2.3 Mã hóa các mức của biến 15

5.2.4 Xác định điều kiện tối ưu 16

5.3 Thiết kế thực nghiệm ứng dụng trong Hóa học 17

5.3.1 Thiết kế nhân tố 3 mức toàn phần 17

5.3.2 Thiết kế phức hợp trung tâm 19

5.3.3 Thiết kế Doehlert 20

CHƯƠNG 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 23

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

PHẦN 2: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ 25

CHƯƠNG 1: THỰC NGHIỆM 25

1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 25

1.1 Hóa chất 25

1.2 Thiết bị và dụng cụ 25

2 XÁC ĐỊNH ĐỘ ẨM 25

3 ĐỊNH LƯỢNG TOCOPHEROL, TOCOTRIENOL VÀ γ-ORYZANOL 26

4 TỐI ƯU DUNG MÔI TRÍCH LY 26

5 TỐI ƯU QUY TRÌNH TRÍCH LY BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỀ MẶT ĐÁP ỨNG 27

6 XỬ LÝ SỐ LIỆU 29

CHƯƠNG 2: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

1 XÂY DỰNG PHƯƠNG TRÌNH ĐƯỜNG CHUẨN Ts, T3s VÀ γ-ORYZANOL 30

2 TỐI ƯU DUNG MÔI TRÍCH LY 31

3 TỐI ƯU QUY TRÌNH TRÍCH LY BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỀ MẶT ĐÁP ỨNG 34

4 TINH CHẾ γ-ORYZANOL 47

PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

1 KẾT LUẬN 50

2 KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 56

Bảng 2.1 Ma trận thực nghiệm dựa trên thiết kế các biến nghiên cứu trong 3 mức 18

Bảng 2.2 Ma trận thực nghiệm trong thiết kế phức hợp trung tâm 20

Bảng 2.3 Ma trận Doehlert 22

Bảng 4.1 Điều kiện pha động trong phân tích HPLC 26

Bảng 4.2 Xác định phạm vi và mức biến đổi của các nhân tố 28

Bảng 5.1 Phương trình đường chuẩn của Ts, T3s, γ-oryzanol 31

Bảng 5.2 Hàm lượng Ts, T3s và γ-oryzanol ở các phương pháp và dung môi khác nhau 33

Bảng 5.3 Ma trận và kết quả thí nghiệm của phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) 35

Bảng 5.4 Phương trình hồi quy của Ts, T3s và γ-oryzanol ở các phương pháp khác nhau 36

Bảng 5.5 Kết quả phân tích R2 và P của các mô hình 36

Bàng 5.6 Phân tích ANOVA của mô hình trích ly dung môi trực tiếp 42

Bàng 5.7 Phân tích ANOVA của mô hình trích ly hỗ trợ của vi sóng 43

Bàng 5.8 Phân tích ANOVA của mô hình trích ly hỗ của sóng siêu âm 44

Bảng 5.9 Tổng kết giá trị tối ưu của mô hình 45

Bảng 5.10 Kết quả trích ly bằng phương pháp hỗ trợ của vi sóng 45

Bảng 5.11 Kết quả trích ly bằng phương pháp trực tiếp và sóng siêu âm 46

Hình 2.1 Cám gạo Nàng Hương 3

Hình 2.2 Thành phần của vitamin E 4

Hình 2.3 Thành phần của γ-oryzanol 5

Hình 2.4 Hệ thống HPLC và cột pha đảo (ODS) 11

Hình 2.5 Đồ thị của mô hình đáp ứng bậc hai 17

Hình 2.6 Thiết kế thực nghiệm dựa trên nghiên cứu nhiều biến trong 3 mức 18

Hình 2.7 Thiết kế trung tâm phức hợp trong tối ưu 2 và 3 biến 19

Hình 2.8 Thiết kế Doehlert trong tối ưu 2 biến 21

Hình 2.9 Thiết kế Doehlert trong tối ưu 3 biến 21

Hình 5.1 Đường chẩn của γ-oryzanol 31

Hình 5.2 Sắc kí đồ phân tích Ts, T3s và γ-Oryzanol bằng RP-HPLC 32

Hình 5.3 Hàm lượng Ts, T3s và γ-oryzanol khi trích ly bằng methanol 33

Hình 5.4 Đồ thị 3D thể hiện sự ảnh hưởng của tỉ lệ methanol/cám gạo (wt/wt) và nhiệt độ trích ly (*) 37

Hình 5.5 Đồ thị 3D thể hiện sự ảnh hưởng của tỉ lệ methanol/cám gạo (wt/wt) và thời gian trích ly (*) 37

Hình 5.6 Đồ thị 3D thể hiện sự ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly và thời gian trích ly (*) 37 Hình 5.7 Đồ thị 3D thể hiện sự ảnh hưởng của tỉ lệ methanol/cám gạo (wt/wt) và nhiệt độ trích ly (**) 38

Hình 5.8 Đồ thị 3D thể hiện sự ảnh hưởng của tỉ lệ methanol/cám gạo (wt/wt) và thời gian trích ly (**) 38

Hình 5.9 Đồ thị 3D thể hiện sự ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly và thời gian trích ly (**) .38

Hình 5.10 Đồ thị 3D thể hiện sự ảnh hưởng của tỉ lệ methanol/cám gạo (wt/wt) và nhiệt độ trích ly (***) 39

Hình 5.11 Đồ thị 3D thể hiện sự ảnh hưởng của tỉ lệ methanol/cám gạo (wt/wt) và thời gian trích ly (***) 39

Hình 5.12 Đồ thị 3D thể hiện sự ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly và thời gian trích ly (***) 39

Hình 5.13 Sự tương quan giữa thực nghiệm và dự đoán của γ-oryzanol (**) 40

Hình 5.14 Sự tương quan giữa thực nghiệm và dự đoán của T3s (**) 40

Hình 5.15 Sự tương quan giữa thực nghiệm và dự đoán của Ts (**) 41

Hình 5.16 Hàm lượng γ-oryzanol ở các phướng pháp khác nhau 46

Hình 5.17 Quy trình tinh chế γ-oryzanol ở quy mô phòng thí nghiệm 47

Hình 5.18 Sự kết tinh của γ-oryzanol 48

Hình 5.19 Tinh thể γ-oryzanol sau khi tinh chế 49

Phụ lục 1: Đường chuẩn của Ts 56 Phụ lục 2: Đường chuẩn của T3s 57 Phụ lục 3: Đồ thị hệ số tương quan r của Ts, T3s và γ-oryzanol trong phương pháp trích

ly dung môi trực tiếp 58 Phụ lục 3: Đồ thị hệ số tương quan r của Ts, T3s và γ-oryzanol trong phương pháp trích

ly hỗ trợ của sóng siêu âm 59 Phụ lục 5: Bảng diện tích peak trong tối ưu dung môi bằng phương pháp trích ly dung môi trực tiếp 60 Phụ lục 6: Bảng diện tích peak trong tối ưu dung môi bằng phương pháp trích ly hỗ trợ của vi sóng 61 Phụ lục 7: Bảng diện tích peak trong tối ưu dung môi bằng phương pháp trích ly hỗ trợ của sóng siêu âm 62 Phụ lục 8: Bảng diện tích peak trong tối ưu quy trình trích ly 63 Phụ lục 9: Bảng diện tích peak ở điều kiện tối ưu của các loại cám gạo khác nhau 64

Dimethyl sulfoxideEthanol

Fatty free acidGam

High density lipoproteinHigh-performance liquid chromatographySulfuric acid

International Business Machines companyIsopropyl alcohol

Liquid chromatographyLow-density lipoproteinAcetonitrile

MethanolMonoglyceridesMegapascalSodium chlorideSodium hydroxideSodium sulfateOctadecylsilaneProbabilityCoefficient of correlationRice bran oil

Reverse phase HPLCResponse surface methodologySupercritical fluid extractionStatistical package for the social sciencesTiêu chuẩn Việt Nam

TocopherolsTocotrienolsTriglycerideTetrahydrofuran

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1 Thông tin chung:

Tên đề tài: “Nghiên cứu quy trình trích ly các thành phần tocopherol, tocotrienol và γ-oryzanol trong một số mẫu cám gạo của Việt Nam”.

Sinh viên thực hiện: Phạm Cảnh Em

Lớp: KH11Y2A1 Khoa: Khoa học - Tự nhiên Năm thứ: 4 Số năm đào tạo: 4Người hướng dẫn: Ths Nguyễn Văn Đạt

2 Mục tiêu đề tài:

Xây dựng quy trình tối ưu để trích ly tocopherol, tocotrienol và γ-oryzanol từ một

số mẫu cám gạo của Việt Nam

4 Kết quả nghiên cứu:

Xây dựng thành công quy trình trích ly tocopherol, tocotrienol và γ-oryzanoltrong cám gạo bằng phương pháp trích ly dung môi trực tiếp, trích ly hỗ trợ của visóng và sóng siêu âm

Xây dựng thành công quy trình tinh chế γ-oryzanol từ dầu cám gạo thông quaphương pháp kết tinh

5 Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc phòng và khả năng áp dụng của đề tài:

Đề tài góp phần nâng cao chất lượng đào tạo bậc học đại học ở trường Đại HọcCần Thơ

Kết quả của đề tài có thể dùng cho các mục đích liên quan đến giáo dục và đàotạo như: giảng dạy và cung cấp kiến thức cơ bản về phương pháp trích ly các hợp chấtthiên nhiên

6 Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài (ghi rõ tên tạp

chí nếu có) hoặc nhận xét, đánh giá của cơ sở đã áp dụng các kết quả nghiên cứu (nếu có):

Cần Thơ, ngày 29 tháng 12 năm 2014

Sinh viên chịu trách nhiệm chính

thực hiện đề tài

(ký, họ và tên)

Nhận xét của người hướng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh viên thực

hiện đề tài (phần này do người hướng dẫn ghi):

Xác nhận của Trường Đại học Cần Thơ

(ký tên và đóng dấu)

Cần Thơ, ngày 29 tháng 12 năm 2014

Người hướng dẫn

(ký, họ và tên)

THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN:

Họ và tên: Phạm Cảnh Em

Sinh ngày: 03 tháng 03 năm 1993

Nơi sinh: xã Châu Phong, thị xã Tân Châu, tỉnh An Giang

Lớp: Hóa Dược (KH11Y2A1) Khóa: 37

Khoa: Khoa học - Tự nhiên

Địa chỉ liên hệ: Số 391, Ấp Vĩnh Lợi II, Châu Phong, Tân Châu, An Giang

Điện thoại: 01698629691 Email: em112009@student.ctu.edu.vn

II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP (kê khai thành tích của sinh viên từ năm thứ 1 đến năm

đang học):

* Năm thứ 1:

Ngành học: Hóa học (Hóa dược) Khoa: Khoa học - Tự nhiên

Kết quả xếp loại học tập: Xuất sắc

Sơ lược thành tích: Khen thưởng trong mùa hè tình nguyện

* Năm thứ 2:

Ngành học: Hóa học (Hóa dược) Khoa: Khoa học - Tự nhiên

Kết quả xếp loại học tập: Xuất sắc

Sơ lược thành tích: Sinh viên toàn diện của Khoa, khen thưởng cấp trường về hoạt động tự quản ngoại trú

* Năm thứ 3:

Ngành học Hóa học (Hóa dược) Khoa: Khoa học - Tự nhiên

Kết quả xếp loại học tập: Xuất sắc

Sơ lược thành tích: Sinh viên toàn diện của Khoa, gửi 2 bài báo nghiên cứu Biodiesel trên tạp chí trường Đại học Cần Thơ (đã thẩm định)

Ảnh 4x6

Ngành học Hóa học (Hóa dược) Khoa: Khoa học - Tự nhiên

Kết quả xếp loại học tập: Xuất sắc

Sơ lược thành tích: Sinh viên toàn diện của Khoa, gửi 1 bài báo nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất Benzimidazol trên tạp chí trường Đại học Cần Thơ Tốt nghiệp xếp loại xuất sắc

Xác nhận của Trường Đại học Cần Thơ

(ký tên và đóng dấu) Cần Thơ, ngày 29 tháng 12 năm 2014Sinh viên chịu trách nhiệm chính

thực hiện đề tài

(ký, họ và tên)

Các hợp chất tocopherol (Ts), tocotrienol (T3s) và γ-oryzanol là các hoạt chất tựnhiên (phytochemical) có hoạt tính kháng oxy hóa và có tiềm năng cải thiện sức khỏe.Thành phần và tỉ lệ các hoạt chất này trong cám gạo khác nhau giữa các giống ở vùngĐồng bằng sông Cửu Long và giống tiềm năng sẽ cho thấy thành phần hoạt chất tựnhiên cao và tỉ lệ ưu đãi hơn Phương pháp có thể tối ưu hóa quy trình trích ly và tinhchế các hoạt chất này là vô cùng cần thiết Do đó, phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)được sử dụng để tối ưu hóa các điều kiện của quá trình trích ly dung môi trực tiếp,trích ly hỗ trợ của vi sóng và sóng siêu âm với methanol là dung môi trích ly Các điềukiện tối ưu để trích ly hoạt chất tự nhiên trong cám gạo được xác định như sau: tỉ lệmethanol/cám gạo 16 (khối lượng/khối lượng); nhiệt độ 51-55ºC và thời gian 9-10phút Ngoài ra, quy trình tinh chế γ-oryzanol cũng được xây dựng và kết quả cho thấy

độ tinh khiết đạt 92%

Từ khóa: Hoạt chất tự nhiên; tocopherol; tocotrienol; γ-oryzanol; phương pháp

bề mặt đáp ứng

Tocopherol, tocotrienol and γ-oryzanol compounds are phytochemicals withantioxidant activities and potential health benefits Their contents and isomer ratios inrice bran vary among Mekong River Delta cultivars, suggesting that breeding forhigher contents or a favorable ratio of these phytochemicals is feasible Methods thatcan optimize of phytochemicals extraction and purification are very necessary.Therefore, Response surface methodology (RSM) was employed to optimize theprocess conditions for the direct solvent, microwave and ultrasonic-assisted extraction

of rice bran extract with methanol as the extraction solvent The optimal conditions forextracting rice bran extract were determined as follows: methanol/rice bran ratio of 16(weight/weight); extraction temperature of 51-55ºC and extraction time of 9-10 min Inaddition, the procedure for purification of γ-oryzanol was also built and the resultshowed that purity of 92%

Key words: Phytochemical; tocopherol; tocotrienol; γ-oryzanol; RSM.

PHẦN 1: MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU CHUNG

1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Trong cám gạo ngoài những thành phần có giá trị dinh dưỡng như protein, lipid,glucoside, cám gạo còn chứa các hợp chất đặc biệt quan trọng đó là Ts, T3s và γ-oryzanol Trong các nghiên cứu trước đây, α-Ts được xem là đồng đẳng của Ts, T3s cógiá trị lớn nhất do có hoạt tính sinh học cao, tuy nhiên gần đây α-T3s được công bố có

hoạt tính làm sạch các gốc tự do gấp ba lần so với α-Ts trong thử nghiệm in vitro [1].

T3s cũng được công bố có hoạt tính ức chế tổng hợp cholesterol, hạ thấp cholesterolhuyết thanh trong các mô động vật, ngăn chặn sự di căn của các tế bào ưng thư và vớiđồng đẳng γ-T3s và δ-T3s thể hiện tiềm năng lớn hơn cả đồng đẳng α-T3s [2] Hoạtchất γ-oryzanol hiện diện gấp 13 đến 20 lần (wt/wt) tổng lượng Ts và T3s trong cámgạo [3] với hoạt tính làm giảm nồng độ cholesterol huyết thanh ở động vật, có tác dụng

chống viêm và có thể ức chế quá trình oxy hóa cholesterol trong thử nghiệm in vitro,

tác dụng chống acid hóa, ngăn chặn sự xâm nhập của tia cực tím, phòng chống nám

da, kháng ung thư [4-6]

Việt Nam là một trong những nước xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới Hàng nămViệt Nam sản xuất khoảng gần 40 triệu tấn gạo Và cám gạo là một sản phẩm phụ củaquá trình xay xát lúa gạo chiếm khoảng 10% trọng lượng của hạt gạo thô Do vậylượng cám gạo tạo ra rất lớn, là nguồn nguyên liệu dồi dào để tách các hợp chất Ts,T3s và γ-oryzanolgiàu tiềm năng phục vụ cho việc cải thiện sức khỏe con người Tuynhiên hiện nay, lượng cám gạo chủ yếu làm thức ăn trong chăn nuôi Một trong nhữngnguyên nhân là còn quá ít các công trình nghiên cứu về lý thuyết cũng như về ứngdụng quy trình công nghệ tách các hợp chất giàu tiềm năng trong cám gạo ở Việt Nam.Trong khi trên thế giới ở những năm gần đây, cám gạo đã được nghiên cứu rộng rãi vềtác dụng kháng oxy hóa và tác nhân trị liệu đa dạng như giảm nguy cơ hình thành ungthư, cải thiện bệnh mạch vành và hạ cholesterol, chống viêm, ức chế quá trình oxy hóacholesterol Chính vì vậy, việc nghiên cứu về cám gạo ở Việt Nam là vô cùng cần thiếtnhằm đem lại lợi ích cho đất nước, cải thiện sức khỏe con người

Đề tài nghiên cứu “Tối ưu quy trình trích ly các thành phần Ts, T3s và γ-oryzanoltrong một số mẫu cám gạo của Việt Nam” được thực hiện nhằm góp phần xây dựngnhững cơ sở lý thuyết và xác định các thông số công nghệ cơ bản của quá trình trích ly

và định lượng các hợp chất Ts, T3s và γ-oryzanol trong cám gạo ở Việt Nam

2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu: cám gạo và các thành phần trong cám gạo

Phạm vi nghiên cứu: các mẫu cám gạo của các giống lúa OM 2514, IR 50404,Nàng Hương Đây là 3 giống lúa phổ biến ở Đồng bằng sông Cửu Long, trong đó IR

50404 được trồng nhiều nhất và Nàng Hương là giống lúa đặc trưng của Việt Nam

3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN

Đề tài hướng đến phát triển quy trình trích ly các thành phần tiềm năng trongcám gạo Đặc biệt, góp phần phát triển các sản phẩm phục vụ sức khỏe con người từcác hoạt chất Ts, T3s và γ-oryzanol, nâng cao giá trị của cám gạo

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

1 THÀNH PHẦN CỦA CÁM GẠO

Hàng năm trên thế giới có khoảng 40-45 triệu tấn cám gạo và 90% tập trung ởchâu Á Cám gạo thường ở dạng bột, mềm và mịn Cám gạo là hỗn hợp lớp vỏ ngoàicủa gạo và lớp aloron Những thành phần được thu hồi khi xay xát và chế biến gạođược gọi chung là cám gạo (Hình 2.1)

Hình 2.1 Cám gạo Nàng Hương

Cám gạo chứa khoảng 20-22% dầu, là nguồn chứa lượng dầu lớn nhất trong cácloại sản phẩm khác từ lúa Dầu cám gạo chứa khoảng 88-89% chất béo trung tính, 3-4% sáp, 0,1-0,14% các thành phần vitamin E và 0,9-2,9% γ-oryzanol Tỉ lệ của cácthành phần trong cám gạo có thể thay đổi tùy theo loại cám gạo từng vùng [7, 8].Theo các nghiên cứu, cám gạo là nơi tập trung nhiều chất dinh dưỡng của hạt gạo(65%) Thành phần các chất dinh dưỡng trong cám gạo rất tốt cho con người Tuynhiên, cám gạo thường được sử dụng làm thức ăn cho gia súc và thủy sản Nguyênnhân là do cám gạo chứa nhiều enzym oxy hóa nhóm chất béo chưa no nên chế biếntạo mùi hôi khó chịu Hơn nữa, công nghệ xay xát gạo trong nước chưa cao và ít đượcđầu tư theo hướng thu cám sạch nên cám thường lẫn rất nhiều tạp chất

Đặc biệt, cám gạo có chứa hàm lượng cao một số hoạt chất tự nhiên(phytochemical) có hoạt tính kháng oxy hóa, có lợi cho sức khỏe con người đã đượccông bố Trong số các hoạt chất tự nhiên, Ts, T3s [9] và γ-oryzanol [10, 11] nhận được

sự quan tâm nghiên cứu nhiều nhất Vitamin E gồm 4 đồng đẳng α, β, γ, δ của Ts vàT3s trong đó γ-T3s có hoạt tính sinh học cao nhất Vitamin E thường có màu vàng, làchất béo nhớt, không tan trong nước nhưng tan tốt trong các dung môi hữu cơ Các yếu

tố như oxy, ánh sáng, nhiệt độ, kiềm và hydroperoxide có thể làm phân hủy các thành

phần vitamin E Tất cả các thành phần của vitamin E đều có cấu trúc amphyphilic với

một phần thân dầu (vòng thơm) và một phần thân nước (chuỗi bên isoprenoid) (Hình2.2)

Hoạt tính giảm cholesterol của cám gạo đã được đánh giá từ các phân đoạn khácnhau của cám gạo như chất sơ tinh sạch, hemicellulose, dầu cám gạo và thành phầnkhông xà phòng hóa So sánh với các dầu thực vật, dầu cám gạo chứa lượng đáng kểcác thành phần không xà phòng hóa (4%) gồm phytosterol, triterpene, alcohol, Ts, T3s

và γ-oryzanol Đặc biệt, γ-oryzanol có hàm lượng khoảng 20-30% thành phần không

xà phòng hóa trong cám gạo và có nhiều hoạt tính dược lý hấp dẫn như thúc đẩy quátrình sinh trưởng, điều hòa quá trình sinh lý, hoạt tính kháng các tác nhân oxy hóa [12,13]

2 HOẠT TÍNH CỦA TOCOPHEROL, TOCOTRIENOL VÀ γ-ORYZANOL

Chất kháng oxy hóa là chất bảo vệ các mô, tế bào khỏi các thoái hóa qua trunggian các gốc tự do và lão hóa Các chất kháng oxy hóa được phân loại theo nhóm thândầu hay thân nước, theo thành phần cấu tạo (protein hay các phân tử nhỏ) hoặc dựatrên chức năng trong huyết tương Trong huyết tương, các chất kháng oxy hóa cơ bản

có khả năng liên kết với các ion kim loại và làm giảm quá trình peroxide hóa lipid haylàm giảm sự truyền và khuếch đại chuỗi peroxide hóa lipid

α: R’ = -CH3, R” = -CH3

β: R’ = -CH3, R” = Hγ: R’ = H, R” = -CH3

δ: R’ = H, R” = H

Nhiều nghiên cứu chứng minh vai trò của các thành phần vitamin E trong việcngăn chặn các bệnh mãn tính, bệnh ở người già như cao huyết áp, xơ vữa động mạch,ung thư, viêm khớp, Alzheimer và Parkinson Các nghiên cứu này cũng xác định mốiliên hệ giữa hoạt động và chức năng của vitamin E cũng như vai trò của nó trong chuỗikháng oxy hóa làm dừng phản ứng của gốc tự do Các nhóm tocopheroxyl,tocotrienoxyl khá bền do điện tử tự do của nguyên tử oxy không định cư trong vòngthơm Độ bền cao của gốc tocopheroxyl, tocotrienoxyl giúp liên kết dễ dàng với cácgốc tự do để hình thành sản phẩm trung hòa hay chuyển về dạng Ts, T3s Các nghiên

cứu cũng cho thấy vitamin E ngăn chặn sự peroxide hóa lipid trong thử nghiệm in

vitro và in vivo [12].

Hình 2.3 Thành phần của γ-oryzanol

γ-Oryzanol là một hỗn hợp các ester ferulate của sterol (Hình 2.3) Đây là mộthoạt chất tự nhiên có giá trị nhất trong cám gạo vì hàm lượng cao, có nhiều hoạt tínhtiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh γ-Oryzanol là chất kháng oxy hóa quan trọng,chống viêm loét đặc biệt là loét dạ dày, có hoạt tính giống như estrogen, cải thiện lưuthông máu, giảm cholesterol trong máu, giảm mỡ cơ thể, ngăn chặn sự xâm nhập củatia cực tím, phòng chống nám da, kháng ung thư,… Hiện nay, γ-oryzanol từ cám gạođược ứng dụng làm nguyên liệu trong sản xuất dược phẩm, mỹ phẩm, sản xuất thựcphẩm chức năng chống lão hóa cho phụ nữ, làm đẹp và mịn da, giúp bảo vệ và tăngcường miễn dịch, giảm quá trình lão hóa Ngoài ra, γ-oryzanol còn được dùng nhưthực phẩm hỗ trợ phát triển thể hình, tăng testosterone, kích thích phát triển endorphin

và sản xuất hormone tăng trưởng cho người, thường dùng làm thực phẩm bổ sung chocác vận động viên thể thao Bên cạnh các tác dụng có lợi cho sức khỏe, γ-oryzanol còn

là chất phụ gia tiềm năng trong các sản phẩm thực phẩm, dược phẩm và thuốc [13, 14]

3 CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU TOCOPHEROL, TOCOTRIENOL VÀ ORYZANOL

γ-3.1 Dung môi và phương pháp trích ly

Nhiều kỹ thuật sử dụng để trích ly, phân lập và tinh chế các hợp chất kháng oxyhóa trong dầu cám gạo đã được nghiên cứu Các hợp chất kháng oxy hóa là thành phầnquan trọng trong suốt quá trình trích ly Nếu cám gạo được giữ ở nhiệt độ cao thì cáchợp chất kháng oxy hóa nội sinh có thể bị phân hủy khi bảo quản trong thời gian dài

Do đó, cám gạo dùng để trích ly cần được xử lý ngay và bảo quản ở nhiệt độ thấp.Cám gạo có thể nhanh chóng bị oxy hóa thành các acid béo tự do làm ảnh hưởngđến chất lượng dầu cám gạo Sau quá trình xay xát, hoạt động của lipase hình thànhacid béo tự do khoảng 5-7% khối lượng dầu cám gạo mỗi ngày Do vậy, xử lý cám gạosau khi xay xát là bước quan trọng trong phân tích thành phần dầu cám gạo Phơi khô

là phương pháp được áp dụng rộng rãi Tăng độ bền của cám gạo bằng cách kiểm soáthoạt động của lipase Ngoài ra còn có các phương pháp khác như bảo quản lạnh và bổsung các chất làm bền Một số nghiên cứu cũng được thực hiện nhằm khảo sát ảnhhưởng của điều kiện bảo quản đến độ bền của các thành phần vitamin E và γ-oryzanol.Nhiệt độ bảo quản và sự thay đổi thành phần của cám gạo thô được khảo sát trong suốt

1 năm Chỉ trong 35 ngày, tổng lượng vitamin E giảm 44% trong đó tốc độ phân hủynhư sau: α-Ts > α-T3s > γ-T3s > γ-Ts > δ-T3s > β-Ts > δ-Ts > γ-oryzanol Dựa vào đó,α-Ts và α-T3s kém bền nhất Ts và T3s bị oxy hóa rất chậm bởi oxy không khí và điềukiện không ánh sáng Trong môi trường không có oxy, Ts và T3s có thể đun đến 200ºC

mà không bị phân hủy [7, 15, 16]

Khi nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi đến quá trình trích ly, độ tan của dầucám gạo trong isopropanol tăng theo nhiệt độ, 30ºC tan 67%, 50ºC tan hoàn toàn.Thậm chí dầu cám gạo tan gần như hoàn toàn trong hexane ở nhiệt độ phòng Nóichung, khi dùng dung môi phân cực, độ tan của dầu cám gạo thay đổi theo nhiệt độ,hiệu suất trích ly cũng bị ảnh hưởng đáng kể bởi nhiệt độ khi so sánh với dùng dungmôi không phân cực Vì vậy, bản chất của dung môi rất quan trọng đối với quá trìnhtrích ly Những alcohol mạch ngắn phân cực là những dung môi thay thế đầy hứa hẹncho dung môi không phân cực trong trích ly dầu và các hợp chất kháng oxy hóa từ cámgạo [17]

Dung môi hexane là dung môi thường dùng để trích ly dầu cám gạo Nhưngtrong các nghiên cứu tối ưu điều kiện trích ly hoạt chất tự nhiên gần đây cho thấydung môi phân cực isopropanol hay isopropanol:hexane (1:1, v/v) trích ly nhiều Ts,T3s và γ-oryzanol từ cám gạo hơn so với hexane mặc dù hexane trích ly nhiều dầucám gạo [16, 18] Ngoài ra, trích ly dầu cám gạo bằng isopropanol sẽ tăng lượngvitamin B, trích ly bằng ethanol tăng lượng Ts và vitamin B Một số nghiên cứu cũngchứng minh rằng lượng dầu cám gạo thô, vitamin E và γ-oryzanol tăng khi tăng tỉ lệdung môi/cám gạo từ 2:1 lên 3:1 (v/wt) và nhiệt độ từ 40ºC đến 60ºC Methanol làdung môi phân cực hơn isopropanol và hexane, cũng được dùng trong phương pháptrích ly dung môi trực tiếp để phân tích hàm lượng hợp chất Ts, T3s và khả năng khángoxy hóa [19] Tuy nhiên, các nghiên cứu liên quan đến trích ly Ts, T3s và γ-oryzanolbằng dung môi methanol chưa có nhiều, do đó cần có thêm các nghiên cứu so sánh cácdạng Ts, T3s và γ-oryzanol trong dịch trích ly của methanol với hexane và isopropanoltrong cùng điều kiện nhiệt độ thông qua các phương pháp trích ly khác nhau.

Phương pháp trích ly cân bằng nhanh được sử dụng để trích ly dầu từ bột đậunành và cám gạo [20-22] Một phút trích ly với hexane ở điều kiện thường thu được98% dầu từ đậu nành và 90% dầu từ cám gạo Khi sử dụng isopropanol làm dung môitrích ly đối chứng với hexane, kết quả là cho cùng lượng dầu trích ly từ cám gạo trongmột phút Nhưng dầu trích ly từ isopropanol ổn định hơn dầu trích ly từ hexane về sựoxy hóa bởi nhiệt, điều đó cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa tốt hơn khi được trích lybằng isopropanol nói riêng hay dung môi phân cực nói chung

Việc định lượng thành phần Ts, T3s và γ-oryzanol trong cám gạo liên quan đếntrích ly dầu cám gạo (RBO), sau đó phân tích thành phần các chất kháng oxy hóa tiềmnăng trong dầu cám gạo bằng HPLC Các phương pháp trích ly dầu cám gạo bao gồmtrích ly lỏng-lỏng, pha rắn, hỗ trợ của vi sóng, sóng siêu âm và trích ly dung môi trựctiếp [16-18] Trong số đó, phương pháp trích ly hỗ trợ của vi sóng, sóng siêu âm vàtrích ly dung môi trực tiếp được sử dụng nhiều nhất

Trích ly hỗ trợ của vi sóng là phương pháp mới có thể thay thế trong trích ly dầucám gạo Hệ thống vi sóng được thiết kế đặc biệt để hoạt động ở nhiệt độ cao và ápsuất được kiểm soát bởi đầu dò quang nhiệt Các thông số cần tối ưu hóa trích ly hỗ trợcủa vi sóng thấp hơn và cài đặt dễ dàng hơn trích ly dung môi siêu tới hạn Bất lợi củatrích ly dung môi siêu tới hạn là thiết bị đắt tiền và sự hiện diện của H2O trong hệthống Các thông số thường được nghiên cứu để tối ưu hóa trong trích ly hỗ trợ của visóng là áp suất hoặc nhiệt độ, thời gian, năng lượng vi sóng, thành phần và thể tíchdung môi

Lựa chọn dung môi là bước quan trọng để có kết quả trích ly tối ưu Dung môitốt nhất cho trích ly hỗ trợ vi sóng phải hấp thụ năng lượng vi sóng tốt, thông thường

là các dung môi có hằng số điện môi cao Nhưng dung môi có hằng số điện môi thấp(hấp thụ năng lượng vi sóng thấp) vẫn dùng trong trích ly hỗ trợ của vi sóng nhằmngăn chặn sự phân hủy của các thành phần kém bền nhiệt Những lợi ích của trích ly

hỗ trợ của vi sóng là có thể hoàn thành trong thời gian ngắn, sử dụng dung môi phâncực hoặc không phân cực, các thông số trích ly được phần mềm kiểm soát với độchính xác cao, độ thu hồi cao khi so sánh với các phương pháp khác và chỉ cần dùnglượng nhỏ dung môi [23, 24]

3.2 Công trình nghiên cứu

Dầu cám gạo là dầu ăn phổ biến ở các nước như Nhật Bản, Ấn Độ, Hàn Quốc,Trung Quốc và Indonesia Điều đó cho thấy rằng dầu cám gạo là loại dầu ăn và dầusalad tốt do nhiệt bay hơi cao và mùi nhẹ Định lượng thành phần và nghiên cứu lợiích sức khỏe của dầu cám gạo được tiến hành từ lâu Đặc biệt là sự quan tâm nghiêncứu các thành phần không xà phòng hóa có kích thước micro trong dầu cám gạo nhưvitamin E, γ-oryzanol, phytosterol, polyphenol và squalene [25-28]

Kato và công sự (1981) đã nghiên cứu dạng ester của Ts và T3s trong dầu cámgạo, dầu đậu nành, dầu vừng được tách ra từ Ts và T3s tự do bằng TLC Sau khi xàphòng hóa ester, Ts và T3s được xác định bằng HPLC Dầu cám gạo thô chứa 40 µg/gα-Ts, 3 µg/g β-Ts, 3 µg/g γ-Ts và 5 µg/g γ-T3s Dầu đậu nành thô chứa 3 µg/g γ-Ts và

3 µg/g δ-Ts Và Ts có khoảng 7 µg/g tồn tại dạng ester trong dầu vừng thương mại.Thành phần lipid trung tính trong dầu cám gạo được nghiên cứu bởi Shimasaki

và Ueta (1983) Sắc ký lỏng được sử dụng để phân lập lipid trung tính từ dầu cám gạo

và các dẫn xuất tương ứng Ngoài ra, γ-oryzanol là thành phần chính thể hiện hoạt tínhsinh học trong dầu cám gạo chiếm 1,1-2,6% được nghiên cứu bởi Seetharamaiad vàcộng sự (1986)

Chakrabarty (1989) đã nghiên cứu tác dụng của dầu cám gạo đối với sức khỏecon người Dầu cám gạo là loại dầu ăn và dầu salad tốt do giá trị dinh dưỡng, lợi íchsức khỏe, nhiệt bay hơi cao và mùi nhẹ Dầu cám gạo giàu các thành phần không xàphòng hóa (4,2%) bao gồm các thành phần dinh dưỡng và kháng oxy hóa như vitamin

E, γ-oryzanol, phytosterol, polyphenol và squalene Sự hiện diện của các thành phầnkháng oxy hóa là yếu tố tốt để so sánh dầu cám gạo với các loại dầu ăn khác Độ nhớtthấp làm giảm lượng dầu hấp thụ trong quá trình nấu ăn do đó làm giảm calo toànphần

Joshi và công sự (1993) nghiên cứu thành công một loại bơ được chuẩn bị từ chấtbéo cơ bản chứa 70% dầu cám gạo được hydro hóa một phần có tinh thể dạng “β” bền

và 30% dầu cám gạo thô Đây là bơ thực vật nên có kết cấu mịn và là nguồn chất béotốt cho sức khỏe

Hiện nay, các loại dầu pha trộn phổ biến trên toàn thế giới do nhiều lợi ích nhưcải thiện ổn định nhiệt, ổn định oxy hóa, lợi ích dinh dưỡng và khả năng tạo ra các đặctính mong muốn theo nghiên cứu của Sharma và cộng sự (1996) Nhưng trong quyđịnh thực phẩm của Ấn Độ không cho phép thêm vào dầu thực vật các thành phần tăngcường sức khỏe (ví dụ như oryzanol, T3s và chất kháng oxy hóa lignan) ở nồng độcao

Taylor và cộng sự (1996) đã chứng minh thành phần quan trọng trong dầu cámgạo là γ-oryzanol có tác dụng tăng HDL, giảm LDL và triglyceride Một số lượng lớnnghiên cứu cũng cho thấy dầu cám gạo làm giảm LDL như Sugano (1997), Nicolosi vàcộng sự (1991), Sharma va Rukmini (1987)

Quy trình hiệu quả làm giàu các hợp chất kháng oxy hóa trong dầu cám gạo thô

đã được công bố bởi Cherukuri và cộng sự (1999) Quá trình này bao gồm trích ly dầucám gạo thô ở 25-77ºC bằng alcohol, tiếp theo là quá trình tinh chế để làm giàu RBO.RBO được làm giàu có chứa các hợp chất kháng oxy hóa nhiều hơn 74-300% so vớiRBO thô

RBO không tạo ra một số phản ứng mẫn cảm, dị ứng khi sử dụng như một số dầuthực vật khác theo nghiên cứu của Crevel và công sự (2000)

Gopala Krishna và cộng sự (2001) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các bước xử lýtinh chế γ-oryzanol trong các giống lúa Ấn Độ Thành phần γ-oryzanol dao động từ1,1-1,74% trong RBO đã xử lý vật lý trong khi RBO đã xử lý kiềm là 0,19-0,20%.RBO đã xử lý vật lý (mẫu thương mại) giữ lại bản chất ban đầu của γ-oryzanol sau khitinh chỉnh là 1,60 và 1,74%, trong khi RBO tinh chế hóa học cho thấy một con số thấphơn đáng kể (0,19%) Như vậy, γ-oryzanol bị mất trong quá trình tinh chế hóa học đãchuyển vào cặn xà phòng Thành phần γ-oryzanol của RBO thô và RBO đã xử lý xàphòng được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao cho tín hiệu như sau: 24-methylenecycloartanyl ferulate (30-38%) và campesteryl ferulate (24,4-26,9%)

Các thành phần của RBO và ba loại dầu thực vật thương mại được khảo sát bởiGopala Krishna và cộng sự (2006) Tinh chế dầu lạc, dầu hạt hướng dương và dầu câyrum, giá trị màu là 1,5-2,0 đơn vị Lovibond, 0,15-1,40% thành phần không xà phònghóa, 30-60% Ts và mức FFA là 0,05-0,10% trong khi mẫu RBO tinh cho thấy giá trịcao hơn 7,6-15,5 đơn vị Lovibond, 2,5-3,2% thành phần không xà phòng hóa, 48-70%

Ts và hàm lượng FFA là 0,14-0,55% Trong số bốn loại dầu, chỉ RBO chứa γ-oryzanoldao động từ 0,14-1,39% Ngoài hàm lượng γ-oryzanol cao, RBO cũng cho thấy giá trịFFA cao hơn so với các loại dầu thực vật khác được nghiên cứu Các phân tích FA vàglyceride cho thấy hàm lượng acid palmitic, oleic và linoleic cao hơn giá trị được công

bố Do đó, mức TG trong RBO là 79,9-92% trong khi trong các loại dầu khác đượcnghiên cứu >95%

Hoed và cộng sự (2006) nghiên cứu ảnh hưởng của tinh chế hóa học đến cácthành phần chính và phụ trong RBO So với các dầu thực vật phổ biến, RBO có chứahàm lượng cao hơn các thành phần có hoạt tính sinh học như γ-oryzanol, T3s vàphytosterol Xử lý trung hòa kiềm làm mất một lượng đáng kể γ-oryzanol Ngoài racòn làm thay đổi trong thành phần phytosterol Do dễ bay hơi, phytosterol và T3s đượctách khỏi dầu cám gạo trong quá trình khử mùi (deodorization) Quá trình này khônglàm bay hơi γ-oryzanol do đó nồng độ γ-oryzanol không thay đổi sau khi khử mùi Saukhi tinh chế loại bỏ được 99,5% thành phần FFA Tùy thuộc vào các điều kiện khửmùi, trans FA có thể được hình thành nhưng tổng hàm lượng trans thường vẫn dưới1%

Zullaikah và cộng sự (2009) đã nghiên cứu cô lập γ-oryzanol từ RBO thô bằngquá trình kết tinh hai bước Trong bước kết tinh đầu tiên, γ-oryzanol được tập trungtrong pha lỏng cùng với acid béo tự do (FFA), monoacylglycerol (MG), squalene,tocol và phytosterol trong khi pha rắn chứa chủ yếu là triacylglycerol (TG) và estersteryl Sản phẩm giàu γ-oryzanol thu được từ bước kết tinh đầu tiên tiếp tục kết tinhlần hai Các sản phẩm giàu γ-oryzanol được giữ ở nhiệt độ phòng (20,5 ± 1,5ºC) trong

24 giờ Hexane được thêm vào như dung môi kết tinh (antisolvent) γ-oryzanol và giữ ở

5 ± 1ºC trong 48 giờ Các thông số ảnh hưởng đến sự kết tinh của γ-oryzanol từ RBOthô được nghiên cứu một cách hệ thống Dưới điều kiện tối ưu thu được γ-oryzanol với

độ tinh khiết và độ thu hồi lần lượt là 93-95% và 59%

Theo nghiên cứu của Sereewatthanawut và cộng sự (2010), cám gạo thô là mộtnguồn γ-oryzanol dồi dào Đây là một hoạt chất tự nhiên có giá trị dinh dưỡng với đặctính kháng oxy hóa Tinh chế γ-oryzanol trong dầu cám gạo được khảo sát thông quadung môi trích ly và lọc nano Một số màng lọc nano bền trong dung môi được sànglọc và áp dụng thành công như màng lọc 2 tầng 39 và 53 L.m-2.h-1 Màng đầu tiên táchcác glyceride và γ-oryzanol, thúc đẩy quá trình làm giàu hoạt chất tự nhiên này trongRBO Màng thứ hai, dầu có thể được tinh chế đến mức đạt tiêu chuẩn tiêu thụ (FFA

<0,20 wt.%) và thành phần γ-oryzanol được tăng cường Nhìn chung, quá trình làmgiàu γ-oryzanol chiếm 0,95-4,1% trọng lượng trong RBO làm tăng khả năng kháng

nano bền trong dung môi hữu cơ như một công nghệ làm phong phú và hoàn thiện cácsản phẩm từ RBO.

Theo nghiên cứu của Jesus và cộng sự (2010), dư lượng từ sự loại acid béo trongdầu cám gạo đã xà phòng hóa (RFAD-RBOS) là một sản phẩm phụ của ngành côngnghiệp dầu cám gạo Nó chứa một lượng lớn các γ-oryzanol, là một chất kháng oxyhóa có giá trị Nghiên cứu khảo sát sự thu hồi γ-oryzanol từ RFAD-RBOS sử dụngphương pháp trích ly dung môi siêu tới hạn (SFE) Sự ảnh hưởng của các thông sốSFE được đánh giá thông qua thành phần γ-oryzanol, tỉ lệ thu hồi γ-oryzanol và thànhphần các acid béo Ở điều kiện 30 MPa/303K, tỉ lệ thu hồi tối đa γ-oryzanol là 31,3%(wt /wt), thành phần γ-oryzanol tương đối cao (3,2%, wt/wt)

Hiện nay, các công trình nghiên cứu về cám gạo ở Việt Nam còn khiêm tốn, chủyếu là nghiên cứu tinh chế γ-oryzanol

4 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CÁM GẠO BẰNG HPLC

4.1 Giới thiệu RP-HPLC

Trong phân tích các thành phần bằng phương pháp HPLC, sắc ký phân bố phađảo được sử dụng nhiều nhất (Hình 2.4) Trong kỹ thuật này, pha tĩnh bao gồm cácnhóm không phân cực như octadecyl (C18), octyl (C8) hay phenyl (C6H5) Pha động lànhững dung môi phân cực như: nước, MeOH, MeCN

Hình 2.4 Hệ thống HPLC và cột pha đảo (ODS)

Khi một peak nhỏ được giải ly sau một peak lớn thì thường rất khó định lượngbằng sắc ký pha thuận Tuy nhiên dãy giải ly có thể đảo ngược bằng cách dùng sắc kýpha đảo Khi đó peak nhỏ có thể được xác định chính xác hơn Do vậy, độ chọn lọccủa kỹ thuật RP-HPLC tốt hơn quá trình tách bằng sắc kí pha thuận

Thành phần đầu tiên của pha động trong sắc ký RP-HPLC thường là nước.Những dung môi hòa lẫn với nước như MeOH, EtOH, MeCN, THF và DMSO để điềuchỉnh độ phân cực của pha động Một số thành phần khác cũng có thể được thêm vàopha động như: acid, base, đệm, chất diện hoạt Cặp dung môi được sử dụng phổ biếnnhất trong sắc ký RP-HPLC là: H2O-MeOH và H2O-MeCN Nhưng MeOH có nhượcđiểm là độ nhớt cao làm giảm hiệu lực cột trong khi MeCN có độ nhớt thấp hơn, thíchhợp hơn với các hợp chất không phân cực vì thế nó thường được dùng nhiều hơnMeOH.

Quá trình định lượng bằng HPLC có thể chia thành 4 bước: pha mẫu, tiến hànhsắc ký, đo tín hiệu detector, phương pháp định lượng Mỗi bước đều có ảnh hưởng trựctiếp đến kết quả định lượng Để giảm sai số, việc pha mẫu phải tôn trọng triệt để cácnguyên tắc đã được qui định đối với từng loại đối tượng mẫu Có thể tiến hành cácphản ứng hoá học trên mẫu thử tạo dẫn chất có độ nhạy cao hơn để có thể đo đượcbằng detector của HPLC Phương pháp này được áp dụng đối với những hợp chất cóđáp ứng rất nhỏ hoặc hoàn toàn không có đáp ứng với detector UV-vis

Dung môi dùng để hoà tan mẫu phải được xem xét cẩn thận Lý tưởng nhất là

sử dụng pha động làm dung môi để hoà tan mẫu Trong trường hợp mẫu thử khó tantrong dung môi pha động thì phải tìm dung môi khác thích hợp hơn Dung môi cần đápứng các yêu cầu sau: độ tinh khiết cao, có thể hoà lẫn được với dung môi pha động,cho đáp ứng rất nhỏ với detector

Detector được dùng phổ biến nhất trong HPLC là detector UV-Vis Ngoài hoạtđộng được ở vùng tuyến tính, detector phải có độ hấp thụ nhỏ đối với dung môi (độnhiễu đường nền thấp) Đặc biệt, cần tránh để không khí vào cột và detector bằng cáchtiến hành đuổi bọt khí trước khi sắc ký Tùy vào chất phân tích có thể chọn phươngpháp phân tích cho phù hợp như chuẩn ngoại, chuẩn nội, thêm chuẩn và chuẩn hóadiện tích peak

4.2 Một số nghiên cứu phân tích cám gạo bằng HPLC

Roger và cộng sự (1993) đã phân tích RBO bằng RP-HPLC với điều kiện phađộng ban đầu là 45% MeCN, 45% MeOH, 5% IsOH và 5% dung dịch acid acetic (1%)

và tốc độ dòng là 0,8 mL/phút trong 6 phút Sau đó, pha động được thay đổi tuyến tínhthành MeCN:MeOH:IsOH 25:75:5 (v/v/v) ở phút thứ 10 và giữ trong 12 phút trướcđiều chỉnh về điều kiện pha động ban đầu Vitamin E (Ts, T3s) được xác định bằngdetector huỳnh quang tại bước sóng 298 và 328 nm và γ-oryzanol được xác định bằngdetector UV-vis tại 325 nm

Adinolfi và cộng sự (2003) đã phát triển kỹ thuật phân tích HPLC sử dụng cộtHypersil silica, đầu dò UV-vis và pha động MeCN:MeOH:IsOH (50:45:5) để phân tíchchất lượng và độ bền nhiệt của dầu cám gạo thương mại khi gia nhiệt ở 100-180ºC từ

15 phút đến 2 giờ Kỹ thuật này cho thấy sự hiện diện 5 peak của γ-oryzanol Từ cáckết quả nghiên cứu đã chứng minh kỹ thuật này có thể được sử dụng để kiểm định chấtlượng của các loại dầu cám gạo thương mại và so sánh với các loại dầu thực vật khácnhư ngô và lúa mì

M H Chen và C J Bergman (2005) đã tiếp tục phát triển điều kiện phân tíchRP-HPLC dựa trên nghiên cứu của Roger và cộng sự (1993) Điều kiện pha động banđầu của phương pháp này là 45% MeCN, 40% MeOH, 5% IsOH và 10% dung dịchacid acetic (1%) được giữ trong 3 phút và sau đó thay đổi tuyến tính ở phút tiếp theothành 45% MeCN, 45% MeOH, 5% IsOH và 5% dung dịch acid acetic (1%) Sau đó,pha động thay đổi tuyến tính thành MeCN:MeOH:IsOH 25:70:5 (v/v/v) trong 10 phúttiếp theo và giữ 11 phút Tổng thời gian giải ly Ts, T3s và γ-oryzanol là 25 phút Cuốicùng, pha động thay đổi tuyến tính thành MeOH: IsOH (95:5) trong 2 phút tiếp theo vàgiữ 1 phút trước khi trở về điều kiện pha động ban đầu

5 PHƯƠNG PHÁP BỀ MẶT ĐÁP ỨNG (RSM)

5.1 Giới thiệu

Tối ưu hóa dùng để nâng cao hiệu quả hoạt động của một hệ thống, một quy trìnhhay một sản phẩm để có được những lợi ích tối đa Thuật ngữ tối ưu hóa được sử dụngphổ biến trong phân tích hóa học như một phương tiện để khảo sát các điều kiện tìm raquy trình ứng dụng tốt nhất [29]

Tối ưu hóa truyền thống trong phân tích hóa học được thực hiện bằng cách khảosát một yếu tố tại một thời điểm qua các thí nghiệm tương ứng Tiến hành thay đổi mộttham số và giữ những tham số còn lại không đổi Kỹ thuật tối ưu hóa này được gọi là

“một biến tại một thời điểm” (one-variable-at-a-time) Nhược điểm chính của tối ưu

truyền thống là không khảo sát sự tương tác giữa các tham số tương ứng Do đó, kỹthuật này không phản ánh chính xác ảnh hưởng của tham số đến quá trình tối ưu [30].Ngoài ra, bất lợi khác của tối ưu truyền thống là sự tăng số lượng các thí nghiệm cầnthiết để tiến hành các nghiên cứu, dẫn đến sự gia tăng thời gian và chi phí nghiên cứu

Để khắc phục vấn đề trên, tối ưu quy trình phân tích được thực hiện thông qua sửdụng kỹ thuật thống kê đa biến Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) là kỹ thuật thống

kê đa biến sử dụng nhiều nhất trong tối ưu quy trình phân tích Phương pháp này là sựkết hợp của toán học và kỹ thuật thống kê dựa trên phương trình đa thức phản ánh dữ

liệu thực nghiệm qua đó đưa ra dự đoán thống kê Hơn nữa, phương pháp này có thểtối ưu đồng thời các mức độ của nhiều biến để tìm ra quy trình tối ưu nhất.

Trước khi áp dụng phương pháp RSM, lựa chọn miền khảo sát để thiết kế thínghiệm nghiên cứu có ý nghĩa vô cùng quan trọng Một số ma trận thực nghiệm đượcphát triển cho mục đích này Để chức năng đáp ứng dữ liệu thực nghiệm tốt nhất, thiết

kế thực nghiệm sử dụng bề mặt đáp ứng bậc hai nên được sử dụng chẳng hạn như 3mức của nhân tố như mô hình Box-Behnken, phức hợp trung tâm (central composite)

và thiết kế Doehlert [31]

5.2 Lý thuyết và các bước ứng dụng RSM

Phương pháp bề mặt đáp ứng được phát triển bởi Box và cộng sự trong nhữngnăm 50 [31, 32] Thuật ngữ này bắt nguồn từ quan điểm đồ họa sau khi hình thành môhình toán học Phương trình đa thức tuyến tính hay bậc lũy thừa sử dụng để mô tả hệthống nghiên cứu và sau đó mô hình hóa điều kiện thí nghiệm để giải quyết bài toántối ưu [33]

Một số giai đoạn trong ứng dụng kỹ thuật tối ưu hóa RSM như sau: (1) lựa chọncác biến độc lập tác động chủ yếu đến hệ thống thông qua các nghiên cứu sàng lọc vàkhoanh định khu vực thực nghiệm theo mục tiêu nghiên cứu và kinh nghiệm của nhànghiên cứu; (2) lựa chọn mô hình thực nghiệm và tiến hành thí nghiệm theo ma trậnthực nghiệm; (3) xử lý toán-thống kê trên dữ liệu thực nghiệm thông qua hàm đa thức;(4) đánh giá mô hình; (5) xây dựng vùng tối ưu và (6) xác định giá trị tối ưu cho từngbiến

5.2.1 Sàng lọc biến

Nhiều biến có thể ảnh hưởng đến sự đáp ứng của hệ thống nghiên cứu Và thực tếkhông thể xác định và kiểm soát từng ảnh hưởng nhỏ từ mỗi biến Vì vậy, sự lựa chọnnhững biến ảnh hưởng lớn là cần thiết Thiết kế sàng lọc được thực hiện để xác địnhmột số biến thực nghiệm có ảnh hưởng lớn đến tương tác thực nghiệm Thiết kế nhân

tố 2 mức từng phần hay toàn phần có thể được sử dụng cho mục tiêu này vì hiệu quả

i i k i



trong đó: k là số biến, β0 là hằng số, βi là các hệ số của tham số tuyến tính, xi làbiến và ε là phần dư liên quan đến thí nghiệm.

Mô hình tuyến tính RSM không thể hiện các đáp ứng độ cong Để đánh giá độcong, mô hình nhân tố 2 mức (cấp độ) được sử dụng Vì vậy, điểm trung tâm trongthiết kế nhân tố 2 mức được xây dựng để đánh giá độ cong Các mức tiếp theo của môhình đa thức cần có các thuật ngữ bổ sung trong đó mô tả sự tương tác giữa các biến sốthực nghiệm khác nhau Mô hình thể hiện tương tác thứ hai được trình bày như sau:

ij 1

0 1

trong đó βij là hệ số thể hiện tương tác của các tham số

Để xác định các điểm quan trọng (tối đa hay tối thiểu), cần xác định phương trình

đa thức bậc hai như sau:

1

2 1

trong đó βii là hệ số của các tham số bậc hai

Để xác định các tham số trong phương trình (3), các thiết kế thực nghiệm phảiđảm bảo tất cả các biến được nghiên cứu ít nhất ở nhân tố 3 mức Các mô hình nhân tố

3 mức là mô hình đối xứng thường được sử dụng trong tối ưu, ví dụ như thiết kế Behnken, thiết kế phức hợp trung tâm và thiết kế Doehlert Những thiết kế đối xứngkhác nhau liên quan đến lựa chọn các điểm thử nghiệm, số mức (cấp độ) của các biếnhay số khối

Box-5.2.3 Mã hóa các mức của biến

Mã hóa các mức của biến bao gồm chuyển đổi từng giá trị thực đã nghiên cứuthành toạ độ trong thang đo với giá trị không thứ nguyên nhưng phải tỉ lệ trong khônggian thử nghiệm Quá trình mã hóa được quan tâm vì nó cho phép nghiên cứu các biếnvới số lượng và mức độ khác nhau

Phương trình được áp dụng để chuyển đổi một giá trị thực (zi) thành một giá trị

mã hóa (xi) theo thiết kế thử nghiệm như sau:

�  �

trong đó z ilà khoảng cách giữa giá trị thực tại điểm trung tâm và giá trị thực ở

mức cao nhất hay thấp nhất của một biến, βd là giá trị giới hạn mã hóa trong ma trậncho mỗi biến và z0 là giá trị thực tại điểm trung tâm

5.2.4 Xác định điều kiện tối ưu

Các bề mặt đáp ứng được tạo nên bởi mô hình tuyến tính có thể sử dụng để chỉ rahướng để thiết kế ban đầu thay đổi nhằm thu được điều kiện tối ưu Tuy nhiên, nếumiền thử nghiệm không thể thay đổi vì lý do vật lý hoặc công cụ thì phải xác định điềukiện thực nghiệm bằng cách kiểm tra trực quan

Đối với mô hình bậc hai, các điểm quan trọng có thể được mô tả như là tối đa, tốithiểu hay yên ngựa (saddle) Có thể tính toán tọa độ của các điểm quan trọng thôngqua các hàm toán học trong đó mô tả bề mặt đáp ứng và tương đương với 0 Các hàmbậc hai thu được cho hai biến như mô tả dưới đây sử dụng để minh họa:

Hình 2.5 thể hiện đồ thị bề mặt đáp ứng bậc hai trong tối ưu hóa 2 biến Hình 2.5(a và b) thể hiện bề mặt mà điểm tối đa nằm trong miền thử nghiệm Một điều cần chú

ý trong Hình 2.5 (b), hệ thống nghiên cứu chỉ thay đổi theo biến x1 và không thay đổitheo x2 Bề mặt của Hình 2.5 (c) cho thấy rằng điểm tối đa nằm bên ngoài miền thửnghiệm và cần thay đổi miền thử nghiệm để tìm được điểm tối ưu Hình 2.5 (d) trìnhbày một điểm tối thiểu và hình 2.5 (e) trình bày một điểm yên ngựa Đây cũng là mộtđiểm quan trọng Điểm yên ngựa là một điểm uốn thể hiện mối quan hệ tương đối giữađiểm tối đa và điểm tối thiểu Do đó, tọa độ điểm yên ngựa không có ý nghĩa cho mụcđích tối ưu hóa hệ thống nghiên cứu

5.3 Thiết kế thực nghiệm ứng dụng trong Hóa học

5.3.1 Thiết kế nhân tố 3 mức toàn phần

Thiết kế nhân tố 3 mức toàn phần là một ma trận thực nghiệm áp dụng hạn chếtrong RSM khi số nhân tố phải cao hơn 2 Vì vậy, số thí nghiệm cần thiết cho thiết kếnày là rất lớn (được tính bằng biểu thức N = 3k, trong đó N là số thí nghiệm và k là sốnhân tố) Một thiết kế nhân tố 3 mức hoàn chỉnh đòi hỏi phải tiến hành thực nghiệmnhiều hơn so với thực tế, gây tốn thời gian và công sức Những thiết kế với số điểmthực nghiệm nhỏ hơn thường được sử dụng như: Box-Behnken, phức hợp trung tâm vàthiết kế Doehlert [31] Tuy nhiên, đối với hai biến số, sự hiệu quả được so sánh vớithiết kế phức hợp trung tâm [32]

Hình 2.5 Đồ thị của mô hình đáp ứng bậc hai

Hình 2.6 thể hiện thiết kế nhân tố 3 mức trong tối ưu 2 và 3 biến tương ứng.Bảng 2.1 trình bày ma trận thực nghiệm trong tối ưu 2 biến sử dụng thiết kế này.

Trong thiết kế Box-Behnken [33, 34], các điểm thử nghiệm được đặt trên mộtmặt siêu cầu (hypersphere) cách đều từ các điểm trung tâm được minh họa trong Hình2.6 (c) Đặc tính chủ yếu của thiết kế là: (1) đòi hỏi số thí nghiệm theo N = 2k(k-1) +

cp, với k là số nhân tố và (cp) là số điểm trung tâm; (2) tất cả nhân tố phải được điềuchỉnh ở 3 mức (-1, 0, 1) với khoảng cách đều nhau giữa các mức

Hình 2.6 Thiết kế thực nghiệm dựa trên nghiên cứu nhiều biến trong 3 mức

(a) thiết kế nhân tố 3 mức cho 2 biến; (b) thiết kế nhân tố 3 mức cho 3 biến; (c) thiết

kế Box-Behnken trong tối ưu 3 biến

Bảng 2.1 Ma trận thực nghiệm dựa trên thiết kế các biến nghiên cứu trong 3 mức

(a) thiết kế nhân tố 3 mức cho 2 biến

(b) thiết kế Box-Behnken cho 3 biến

Hình 2.6 (c) trình bày thiết kế Box-Behnken để tối ưu hóa 3 biến với 13 điểm thửnghiệm So với 27 điểm thử nghiệm của thiết kế nhân tố 3 mức cho 3 biến trong Hình2.6 (b), thiết kế Box-Behnken cho thấy sự hiệu quả và kinh tế hơn Bảng 2.1 (b) trìnhbày các giá trị mã hóa của thiết kế Box-Behnken cho 3 biến Thiết kế này được ápdụng cho quá trình tối ưu hóa một số hóa chất và quá trình vật lý Tuy nhiên, ứng dụngcủa nó trong hóa phân tích vẫn còn nhỏ hơn nhiều so với thiết kế phức hợp trung tâm

5.3.2 Thiết kế phức hợp trung tâm

Thiết kế phức hợp trung tâm được trình bày bởi Box và Wilson [35] Thiết kế nàybao gồm các phần sau: (1) thiết kế nhân tố từng phần hay toàn phần; (2) thiết kế bổsung thường là thiết kế sao trong đó điểm thử nghiệm cách tâm một khoảng α và (3)một điểm trung tâm Hình 2.7 (a và b) trình bày thiết kế phức hợp trung tâm toàn phần

để tối ưu hóa 2 và 3 biến

Hình 2.7 Thiết kế phức hợp trung tâm trong tối ưu 2 và 3 biến

(a) 2 biến (α = 1,41); (b) 3 biến (α = 1,68)

Đặc tính chủ yếu của thiết kế là: số thí nghiệm tuân theo N = k2 + 2k + cp, với k

là số nhân tố và (cp) là số lần lặp lại của điểm trung tâm; giá trị α phụ thuộc vào sốbiến và có thể tính theo α = 2(k-p)/4, ví dụ giá trị α của 2, 3 và 4 biến lần lượt là 1,41,1,68 và 2,00; tất cả nhân tố được nghiên cứu ở 5 mức (-α, -1, 0, 1, α)

Hình 2.7 (a, b) thể hiện thiết kế phức hợp trung tâm trong tối ưu hóa 2 và 3 biếntương ứng Bảng 2.2 (a và b) trình bày các giá trị được mã hoá của ma trận thựcnghiệm cho thiết kế này Nhiều ứng dụng của thiết kế phức hợp trung tâm trong tối ưuhóa quy trình phân tích thể hiện trong các tài liệu và các công trình nghiên cứu trên thếgiới

5.3.3 Thiết kế Doehlert

Thiết kế này được phát triển bởi Doehlert [36], là một sự lựa chọn thực tế và kinh

tế liên quan đến ma trận thực nghiệm bậc hai Thiết kế mô tả miền tròn cho 2 biến,miền cầu cho 3 biến và miền siêu cầu (hypersphere) cho trên 3 biến, qua đó thể hiệntính thống nhất của các biến nghiên cứu trong miền thực nghiệm Mặc dù ma trậnkhông định tuyến như các thiết kế trước đó nhưng chỉ đòi hỏi một số điểm thựcnghiệm giới hạn

Bảng 2.2 Ma trận thực nghiệm trong thiết kế phức hợp trung tâm

(a) 2 biến (b) 3 biến

Đặc tính của thiết kế là: (1) số thí nghiệm tuân theo N = k2 + 2k + cp, với k là sốnhân tố và (cp) là số lần lặp lại của điểm trung tâm; (2) mỗi biến được nghiên cứu ởcác mức khác nhau; (3) khoảng cách giữa các mức đồng đều; (4) thay đổi ma trận thựcnghiệm trong miền thực nghiệm khác bằng cách sử dụng các điểm liền kề

Đối với hai biến, thiết kế Doehlert biểu diễn bởi một điểm trung tâm được baoquanh bởi sáu điểm tạo thành hình lục giác (Hình 2.8) Hình 2.8 cũng cho thấy một sốkhả năng dịch chuyển của các điều kiện thí nghiệm ban đầu

Hình 2.8 Thiết kế Doehlert trong tối ưu 2 biến

Hình 2.9 Thiết kế Doehlert trong tối ưu 3 biến

Đối với ba biến, thiết kế này biểu diễn bởi một khối hình học gọi làcuboctahedron [37], tùy thuộc vào khối này có thể tạo ra một số ma trận thực nghiệmkhác nhau (Hình 2.9) Bảng 2.3 (a) trình bày ma trận thực nghiệm cho 2 biến và Bảng2.3 (b và c) trình bày hai ma trận thực nghiệm cho 3 biến Sự tối ưu tạo ra bởi các mặtkhác nhau của khối hình học cuboctahedron Ứng dụng của thiết kế Doehlert trong hóaphân tích ngày càng tăng trong những năm gần đây chủ yếu là do các đặc điểm thuậnlợi của nó liên quan đến các thiết kế khác

CHƯƠNG 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1.1 Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng quy trình tối ưu để trích ly Ts, T3s và γ-oryzanol từ một số mẫu cámgạo của Việt Nam

1.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu nghiên cứu trên, các nội dung nghiên cứu sau đây sẽ đượctriển khai:

Thu mua cám gạo của các giống lúa OM 2514, IR 50404, Nàng Hương Xác định

độ ẩm Xử lý nguyên liệu: phơi khô, loại các thành phần tạp (trấu,…)

Trích ly Ts, T3s và γ-oryzanol trong cám gạo bằng phương pháp trích ly dungmôi trực tiếp với các dung môi có độ phân cực khác nhau: methanol, ethanol,isopropanol, ethyl acetate, hexane

Trích ly Ts, T3s và γ-oryzanol trong cám gạo bằng phương pháp trích ly hỗ trợcủa vi sóng

Trích ly Ts, T3s và γ-oryzanol trong cám gạo bằng phương pháp trích ly hỗ trợcủa sóng siêu âm

Định lượng các hợp chất Ts, T3s và γ-oryzanol trong cám gạo bằng HPLC

Xây dựng quy trình tinh chế γ-oryzanol từ điều kiện tối ưu

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Để đạt được mục tiêu và nội dung nghiên cứu trên, đề tài đã sử dụng các phươngpháp sau:

Nghiên cứu quy trình trích ly Ts, T3s và γ-oryzanol trong một số mẫu cám gạocủa Việt Nam bằng các phương pháp trích ly dung môi trực tiếp, trích ly hỗ trợ của visóng và sóng siêu âm

Định lượng các hợp chất Ts, T3s và γ-oryzanol trong cám gạo bằng RP-HPLC.Tinh chế γ-oryzanol bằng phương pháp kết tinh

Các yếu tố cần khảo sát cho mỗi giai đoạn tổng hợp bao gồm:

- Tỉ lệ methanol/cám gạo (wt/wt)

- Nhiệt độ trích ly (ºC)

- Thời gian trích ly (phút).

- Dung môi trích ly