Luận văn nghiên cứu biến dị tế bào soma và xử lý tia gamma trong chọn tạo các dòng đậu nành (glycine max (l ) merrill) chống chịu mặn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH KHOA HỌC CÂY TRỒNG MÃ NGÀNH: 62 62 01 10 NGHIÊN CỨU BIẾN DỊ TẾ BÀO SOMA VÀ XỬ LÝ TIA GAMMA TRONG CHỌN TẠO CÁC DÒNG ĐẬU NÀNH (Glycine max (L.) Merrill) CHỐNG CHỊU MẶN Cán hƣớng dẫn PGS TS Nguyễn Bảo Toàn Thực Lê Hồng Giang 2019 i LỜI CẢM TẠ Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Bảo Tồn, ngƣời thầy tận tình dìu dắt, giúp đỡ tơi cơng tác, nhƣ truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu để hƣớng dẫn tơi hồn thành luận án tiến sĩ Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: - Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Cần Thơ, Ban Chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp, Khoa Sau đại học đơn vị phòng ban - Quý thầy cô giảng dạy môn học nghiên cứu sinh, quý thầy cô tham dự hội đồng bảo vệ đề cƣơng, tiểu luận chuyên đề nghiên cứu sinh - Quý thầy cô, anh chị em công tác Bộ môn Sinh lý Sinh hóa, Bộ mơn Khoa học Cây trồng, Bộ môn Khoa học đất, Khoa Nông nghiệp, Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ sinh học động viên, tƣ vấn nhiệt tình giúp đỡ - TS Nguyễn Phƣớc Đằng cô Thái Kim Tuyến, Bộ môn Di truyền chọn giống trồng, Khoa Nông nghiệp nhiệt tình giúp đỡ, cung cấp giống đậu nành phục vụ cho thí nghiệm - Cơng ty Vạn Đức (Ấp Đơng Hòa, Xã Song Thuận, Huyện Châu Thành, Tỉnh Tiền Giang) cung cấp giống đậu nành phục vụ cho thí nghiệm - Viện Nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt giúp đỡ thực chiếu xạ tia gamma mẫu cấy - TS Đỗ Tấn Khang hỗ trợ thực phân tích kỹ thuật sinh học phân tử - Các em sinh viên Huỳnh Văn Hải, Võ Quang Tiếp, Huỳnh Thị Ý Nhi, Nguyễn Thị Cẩm Tiên, Nguyễn Thị Minh Thi, Trần Thị Tuyết Lan em sinh viên lớp Sinh học K37, Công nghệ rau hoa Cảnh quan K42 nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ thực thí nghiệm Xin trân trọng ghi nhớ công ơn cha mẹ gia đình ln bên cạnh động viên, chia sẻ, giúp đỡ để yên tâm học tập công tác Xin chân thành cảm ơn động viên, chia sẻ, hỗ trợ thầy cô, anh chị, em bạn bè bên lúc khó khăn, dành tình cảm tốt đẹp tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu ii TÓM TẮT Cây đậu nành thực phẩm có giá trị cao, cải tạo đất tốt nhƣng giống nhạy cảm với mặn Đề tài “Nghiên cứu biến dị tế bào soma xử lý tia gamma chọn tạo dòng đậu nành (Glycine max (L.) Merrill) chống chịu mặn” đƣợc thực nhằm mục tiêu xác định phƣơng pháp chọn tạo dòng đậu nành có khả chống chịu mặn Nội dung nghiên cứu bao gồm xác định khả chống chịu mặn số giống đậu nành phổ biến ĐBSCL, xác định môi trƣờng ni cấy mơ đậu nành thích hợp để tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho phƣơng pháp chọn lọc đánh giá khả chọn tạo dòng đậu nành chống chịu mặn phƣơng pháp tạo biến dị soma chiếu xạ tia gamma Kết cho thấy giống đậu nành đƣợc canh tác phổ biến ĐBSCL, giống MTĐ 748-1, ĐH MTĐ 720 có khả chịu mặn cao nồng độ muối NaCl g/L đánh giá phƣơng pháp thủy canh Giống MTĐ 878-3 nhạy cảm với mặn giống MTĐ 760-4 chết hoàn toàn nồng độ muối Trong chọn lọc tính chống chịu mặn, giống không chịu mặn MTĐ 760-4 tạo dòng mơ sẹo chịu mặn Trong phƣơng pháp chọn lọc dòng đậu nành chống chịu mặn phƣơng pháp gây biến dị soma mẫu trục phơi đậu nành MTĐ 760-4 đạt đƣợc 01 dòng đậu nành có khả chống chịu mặn nồng độ NaCl g/L Có khác biệt di truyền cấu trúc DNA mẫu chồi chống chịu mặn so với mẫu đối chứng không xử lý mặn phân tích thị phân tử ISSR22 Cây đậu nành MTĐ 760-4 sau chọn lọc mặn với muối NaCl g/L sinh trƣởng bình thƣờng sau tuần dƣỡng điều kiện tƣới mặn nhà lƣới Cả hai phƣơng pháp gây biến dị soma phƣơng pháp chiếu xạ tia gamma Co60 kết hợp chọn lọc mặn với muối NaCl mẫu mô sẹo thu đƣợc dòng mơ sẹo có khả chịu mặn với nồng độ g/L mẫu không chiếu xạ mẫu chiếu xạ liều 10 Gy Phân tích di truyền với thị ISSR22 cho thấy hai mẫu mô sẹo khơng có xuất băng DNA khoảng 450 bp so với mẫu đối chứng Đối với mẫu trục phôi xử lý chiếu xạ tia gamma kết hợp chọn lọc mặn chƣa thu đƣợc dòng chống chịu mặn Kết nghiên cứu đề xuất áp dụng phƣơng pháp gây biến dị soma mẫu trục phơi để tạo dòng đậu nành có khả chống chịu mặn, tiếp tục nhân dòng chịu mặn trồng thử nghiệm điều kiện tự nhiên để đánh giá ổn định di truyền tính chống chịu mặn nhƣ quan sát thêm đặc tính nơng học khác Từ khóa: Biến dị soma, chiếu xạ tia gamma, chống chịu mặn, đậu nành, Glycine max (L.) Merrill, ISSR iii ABSTRACT Soybean is one of food crops that have high value and considerably improve soil, but also is sensitive to salt The PhD thesis “Study on somaclonal cell variation and gamma treatment in selection for salt tolerant soybean lines (Glycine max (L.) Merrill)” was carried out to determine the method to select the soybean line that is salt tolerant Study contents included determing the salt tolerance ability of some soybean varieties which were popular in the Mekong Delta, the tissue culture medium of soybean suitale for obtaining initial sources for selection methods and evaluating the ability of selection for salt tolerant soybean lines by somaclonal cell variation creating and gamma irradiation method The results showed that among soybean varieties popularly cultivated in the Mekong Delta, MTD 748-1, DH and MTD 720 had the high salt tolerant ability at g/L NaCl when evaluated by hydroponic method MTD 878-3 variety was sensitive to salt and MTD 760-4 completely died at this salt concentration In selection for salt tolerance, the intolerant variety which was MTD 760-4 formed salt tolerant callus and plantlet lines In selection methods to achieve salt tolerant soybean lines, creating somaclonal variation on embryo axes of MTD 760-4 soybean obtained one soybean plantlet line that was salt tolerant at NaCl of g/L There was genetic difference in DNA structure of the salt tolerant shoot compared to the control with non-salt treatment when analyzed by molecular marker of ISSR22 MTD 760-4 soybean plantlets after selected with g/L NaCl normally grew after weeks acclimatized under saline water irrigating condition in the greenhouse Both methods of creating somaclonal variation and Co60 gamma irradiation combined with NaCl salt selection on callus achieved two salt tolerant callus lines to NaCl dose of g/L at none irradiated explants and irradiated explants with gamma dose of 10 Gy Genetic analysis with ISSR22 marker in these two callus explants showed that there was no appearance of DNA band 450 bp compared to control explants To embyro axes which were gamma irratiated and salt selected, there was not obtained salt tolerant lines The study results suggested that the method of creating somaclonal variation can be applied to form salt tolerant soybean lines and these should be constinuously multiplied and cultivated in the field to evaluate the genetic stability of salt tolerance as well as observe further other agronomical characteristics Key words: ISSR, gamma irradiation, Glycine max (L.) Merrill, salt tolerant, somaclonal variation, soybean iv CAM KẾT KẾT QUẢ Tôi xin cam kết luận án đƣợc hoàn thành dựa kết nghiên cứu kết nghiên cứu chƣa đƣợc dùng cho luận án cấp khác Ngƣời hƣớng dẫn Tác giả luận án PGS TS Nguyễn Bảo Toàn Lê Hồng Giang v MỤC LỤC Nội dung Trang Lời cảm tạ ii Tóm tắt iii Abstract vi Cam kết kết v Mục lục vi Danh sách bảng xi Danh sách hình xiv Danh mục từ viết tắt xvi CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung nghiên cứu 1.4 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 1.4.1 Đối tƣợng nghiên cứu 1.4.2 Phạm vi nghiên cứu 1.5 Ý nghĩa luận án 1.5.1 Ý nghĩa khoa học 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn 1.6 Những điểm luận án CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nguồn gốc phân loại đậu nành 2.1.1 Nguồn gốc 2.1.2 Phân loại 2.2 Đặc điểm thực vật 2.2.1 Rễ 2.2.2 Thân 2.2.3 Lá 2.2.4 Hoa 2.2.5 Trái hạt 2.3 Yêu cầu sinh thái đậu nành 2.3.1 Đất 2.3.2 Nhiệt độ 2.3.3 Nƣớc 2.3.4 Ánh sáng 2.4 Đất mặn tình hình xâm nhập mặn Đồng sông Cửu Long 10 2.4.1 Khái niệm đất mặn 10 vi 2.4.2 Tình hình xâm nhập mặn Đồng sông Cửu Long 11 2.5 Sự chống chịu mặn đậu nành 12 2.5.1 Ảnh hƣởng mặn đậu nành 12 2.5.2 Các nghiên cứu chống chịu mặn đậu nành 14 2.5.3 Cơ chế chống chịu mặn đậu nành 15 2.6 Sơ lƣợc nuôi cấy mô tế bào thực vật 19 2.7 Phƣơng pháp chọn lọc biến dị tế bào soma dòng trồng chống chịu mặn 21 2.7.1 Khái niệm biến dị soma 21 2.7.2 Cơ sở biến dị soma 21 2.7.3 Phƣơng pháp chọn lọc biến dị tế bào soma tính chống chịu mặn 23 2.7.4 Một số ƣu khuyết điểm phƣơng pháp chọn lọc biến dị tế bào soma24 2.7.4.1 Ƣu điểm 24 2.7.4.2 Khuyết điểm 24 2.7.5 Đặc điểm chịu mặn chọn lọc in vitro 25 2.8 Một số kết nghiên cứu chọn lọc biến dị tế bào soma dòng trồng chống chịu mặn giới nƣớc 26 2.9 Phƣơng pháp gây đột biến trồng in vitro 28 2.9.1 Khái niệm đột biến 28 2.9.2 Sự phát sinh đột biến 28 2.9.3 Ƣu điểm phƣơng pháp tạo đột biến thông qua nuôi cấy mô 29 2.9.4 Phƣơng pháp tạo đột biến in vitro xử lý tia gamma 29 2.9.4.1 Bức xạ gamma (γ) 29 2.9.4.2 Một số đặc trƣng chất phóng xạ 30 2.9.4.3 Phƣơng pháp thực 30 2.9.5 Kết nghiên cứu tạo đột biến in vitro xử lý tia gamma giới nƣớc 32 2.10 Ứng dụng thị phân tử chọn giống trồng 36 CHƢƠNG 3: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 3.1 Phƣơng tiện 38 3.1.1 Vật liệu 38 3.1.2 Hóa chất 38 3.1.3 Thiết bị 38 3.1.4 Thời gian địa điểm nghiên cứu 39 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 40 3.2.1 Nội dung 1: Xác định khả chống chịu mặn số giống đậu nành phổ biến ĐBSCL 40 3.2.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng muối NaCl lên sinh trƣởng giống đậu nành MTĐ 176, MTĐ 748-1, MTĐ 760-4, Nhật 17A OMĐN 2940 vii 3.2.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng muối NaCl lên sinh trƣởng giống đậu nành ĐH 4, MTĐ 720, MTĐ 860-1, MTĐ 878-3 MTĐ 885-2 41 3.2.2 Nội dung 2: Xác định mơi trƣờng ni cấy mơ đậu nành thích hợp để tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho phƣơng pháp chọn lọc 41 3.2.2.1 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng 2,4-D BA lên hình thành mô sẹo từ tử diệp đậu nành MTĐ 760-4 41 3.2.2.2 Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng NAA khống đa lƣợng đến tạo rễ từ đoạn thân đậu nành MTĐ 760-4 42 3.2.2.3 Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng giá thể đến dƣỡng đậu nành in vitro điều kiện nhà lƣới 43 3.2.3 Nội dung 3: Đánh giá khả chọn tạo dòng đậu nành chống chịu mặn phƣơng pháp tạo biến dị soma chiếu xạ tia gamma 43 3.2.3.1 Thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng muối NaCl lên sinh trƣởng mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 43 3.2.3.2 Thí nghiệm 7: Ảnh hƣởng muối NaCl lên tạo chồi sinh trƣởng chồi từ trục phôi đậu nành MTĐ 760-4 46 3.2.3.3 Thí nghiệm 8: Ảnh hƣởng chiếu xạ tia gamma Co60 muối NaCl lên sinh trƣởng mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 48 3.2.3.4 Thí nghiệm 9: Ảnh hƣởng chiếu xạ tia gamma Co60 muối NaCl lên tạo chồi sinh trƣởng chồi từ trục phôi đậu nành MTĐ 760-4 49 3.2.3.5 Đánh giá sai khác di truyền dòng đậu nành chống chịu mặn50 3.2.3.6 Thí nghiệm 10: Đánh giá khả sinh trƣởng phát triển dòng đậu nành chống chịu mặn điều kiện nhà lƣới 52 3.2.3.7 Xử lý số liệu 53 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 55 4.1 Nội dung 1: Xác định khả chống chịu mặn số giống đậu nành phổ biến ĐBSCL 55 4.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng muối NaCl lên sinh trƣởng giống đậu nành MTĐ 176, MTĐ 748-1, MTĐ 760-4, Nhật 17A OMĐN 2955 4.1.1.1 Tỉ lệ sống 55 4.1.1.2 Chiều cao 57 4.1.1.3 Số lóng thân 59 4.1.1.4 Chiều dài rễ 60 4.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng muối NaCl lên sinh trƣởng giống đậu nành ĐH 4, MTĐ 720, MTĐ 860-1, MTĐ 878-3 MTĐ 885-2 64 4.1.2.1 Tỉ lệ sống 64 4.1.2.2 Chiều cao 66 4.1.2.3 Số lóng thân 67 4.1.2.4 Chiều dài rễ 69 viii 4.2 Nội dung 2: Xác định môi trƣờng nuôi cấy mô đậu nành thích hợp để tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho phƣơng pháp chọn lọc 71 4.2.1 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng 2,4-D BA lên hình thành mơ sẹo từ tử diệp đậu nành MTĐ 760-4 71 4.2.1.1 Tỉ lệ tạo mô sẹo 71 4.2.1.2 Tỉ lệ tạo rễ 73 4.2.2 Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng NAA khoáng đa lƣợng đến tạo rễ từ đoạn thân đậu nành MTĐ 760-4 75 4.2.2.1 Tỉ lệ tạo rễ 75 4.2.2.2 Số rễ 76 4.2.2.3 Chiều dài rễ 77 4.2.2.4 Chiều cao chồi 78 4.2.2.5 Số 79 4.2.3 Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng giá thể đến dƣỡng đậu nành in vitro điều kiện nhà lƣới 81 4.2.3.1 Tỉ lệ sống 81 4.2.3.2 Chiều cao gia tăng 82 4.2.3.3 Số gia tăng 83 4.3 Nội dung 3: Đánh giá khả chọn tạo dòng đậu nành chống chịu mặn phƣơng pháp tạo biến dị soma chiếu xạ tia gamma 84 4.3.1 Thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng muối NaCl lên sinh trƣởng mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 84 4.3.1.1 Thí nghiệm 6a: Ảnh hƣởng muối NaCl lên sinh trƣởng mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 lần chọn lọc 84 4.3.1.2 Thí nghiệm 6b: Ảnh hƣởng muối NaCl lên sinh trƣởng mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 lần chọn lọc 86 4.3.1.3 Thí nghiệm 6c: Ảnh hƣởng muối NaCl lên sinh trƣởng mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 lần chọn lọc 86 4.3.1.4 Thí nghiệm 6d: Ảnh hƣởng muối NaCl lên sinh trƣởng mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 lần chọn lọc 87 4.3.2 Thí nghiệm 7: Ảnh hƣởng muối NaCl lên tạo chồi sinh trƣởng chồi từ trục phôi đậu nành MTĐ 760-4 89 4.3.2.1 Thí nghiệm 7a: Ảnh hƣởng muối NaCl lên tạo chồi sinh trƣởng chồi lần chọn lọc 89 4.3.2.2 Thí nghiệm 7b: Ảnh hƣởng muối NaCl lên sinh trƣởng chồi lần chọn lọc 91 4.3.2.3 Thí nghiệm 7c: Ảnh hƣởng muối NaCl lên sinh trƣởng chồi lần chọn lọc 93 ix 4.3.3 Thí nghiệm 8: Ảnh hƣởng chiếu xạ tia gamma Co60 muối NaCl lên sinh trƣởng mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 97 4.3.3.1 Thí nghiệm 8a: Ảnh hƣởng chiếu xạ tia gamma Co60 muối NaCl lên sinh trƣởng mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 lần chọn lọc 97 4.3.3.2 Thí nghiệm 8b: Ảnh hƣởng chiếu xạ tia gamma Co60 muối NaCl lên sinh trƣởng mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 lần chọn lọc 99 4.3.3.3 Thí nghiệm 8c: Ảnh hƣởng chiếu xạ tia gamma Co60 muối NaCl lên sinh trƣởng mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 lần chọn lọc 101 4.3.3.4 Thí nghiệm 8d: Ảnh hƣởng chiếu xạ tia gamma Co60 muối NaCl lên sinh trƣởng mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4 lần chọn lọc 103 4.3.4 Thí nghiệm 9: Ảnh hƣởng chiếu xạ tia gamma Co60 muối NaCl lên tạo chồi sinh trƣởng chồi từ trục phôi đậu nành MTĐ 760-4 107 4.3.4.1 Thí nghiệm 9a: Ảnh hƣởng chiếu xạ tia gamma Co60 muối NaCl lên tạo chồivà sinh trƣởng chồitrong lần chọn lọc 107 4.3.4.2 Thí nghiệm 9b: Ảnh hƣởng chiếu xạ tia gamma Co60 muối NaCl lên sinh trƣởng chồi lần chọn lọc 112 4.3.4.2 Thí nghiệm 9c: Ảnh hƣởng chiếu xạ tia gamma Co60 muối NaCl lên sinh trƣởng chồi lần chọn lọc 113 4.3.5 Đánh giá sai khác di truyền dòng đậu nành chống chịu mặn115 4.3.5.1 Sự sai khác di truyền dòng mơ sẹo đậu MTĐ 760-4 chống chịu mặn sau chọn lọc biến dị soma chiếu xạ tia gamma Co60 115 4.3.5.2 Sự sai khác di truyền dòng đậu nành MTĐ 760-4 chống chịu mặn sau chọn lọc biến dị soma 117 4.3.6 Thí nghiệm 10: Đánh giá khả sinh trƣởng phát triển dòng đậu nành chống chịu mặn điều kiện nhà lƣới 117 4.3.6.1 Chiều cao chồi gia tăng 117 4.3.6.2 Số lóng gia tăng 119 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 124 5.1 Kết luận 124 5.2 Đề xuất 124 TÀI LIỆU THAM KHẢO 125 PHỤ LỤC 140 PHỤ LỤC 142 PHỤ LỤC 145 PHỤ LỤC 147 x ... lý tia gamma chọn tạo dòng đậu nành (Glycine max (L. ) Merrill) chống chịu mặn đƣợc thực nhằm mục tiêu xác định phƣơng pháp chọn tạo dòng đậu nành có khả chống chịu mặn Nội dung nghiên cứu bao... phƣơng pháp chọn lọc Nội dung 3: Đánh giá khả chọn tạo dòng đậu nành chống chịu mặn phƣơng pháp tạo biến dị soma chiếu xạ tia gamma - Tạo biến dị tế bào soma từ mô sẹo trục phôi cách nuôi cấy... phôi xử lý chiếu xạ tia gamma kết hợp chọn lọc mặn chƣa thu đƣợc dòng chống chịu mặn Kết nghiên cứu đề xuất áp dụng phƣơng pháp gây biến dị soma mẫu trục phơi để tạo dòng đậu nành có khả chống chịu