Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu một số cơ sở khoa học nhằm bảo tồn, phát triển và sử dụng bền vững một số loài trong chi kim tuyến (anoectochilus blume) ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT PHAN XUÂN BÌNH MINH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CƠ SỞ KHOA HỌC NHẰM BẢO TỒN, PHÁT TRIỂN VÀ SỬ DỤNG BỀN VỮNG MỘT SỐ LOÀI TRONG CHI KIM TUYẾN (Anoectochilus Blume) Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT PHAN XUÂN BÌNH MINH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CƠ SỞ KHOA HỌC NHẰM BẢO TỒN, PHÁT TRIỂN VÀ SỬ DỤNG BỀN VỮNG MỘT SỐ LOÀI TRONG CHI KIM TUYẾN (Anoectochilus Blume) Ở VIỆT NAM Chuyên ngành : Thực vật Mã số : 42 01 11 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Minh Hợi TS Phạm Hƣơng Sơn HÀ NỘI - 2019 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Tiếng việt CTPT : Công thức phân tử KBTTN : Khu bảo tồn thiên nhiên KLPT : Khối lượng phân tử LSNG : Lâm sản gỗ VQG : Vườn Quốc gia v/v : Tỉ lệ thể tích Tiếng Anh BAP : 6- Benzylaminopurine DEPT : Distortionless enhancement by polarization transfer FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations HY : Hypronex IBA : Indol butyric acid IUCN : International Union for Conservation of Nature Knud : Knudson LED : Light Emitting Diode (Điốt phát quang) MS : Murashige & Skoog NAA : α- Naphthaleneacetic Acid NMR : Nuclear Magnetic Resonance TDZ : Thidiazuron TLC : Thin layer chromatography VW : Vacin& Went WHO : World Health Organization WWF : World Wide Fund For Nature LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin cảm ơn tới giúp đỡ, bảo tận tình hai thầy hướng dẫn khoa học PGS TS Trần Minh Hợi - Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TS Phạm Hương Sơn Viện Ứng dụng Công nghệ, Bộ Khoa học & Công nghệ Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Trung tâm Sinh học Thực nghiệm, Viện Ứng dụng Công nghệ, Ban lãnh đạo, phòng đào tạo Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật tạo điều kiện thuận lợi để tơi học tập nghiên cứu Tơi xin cảm ơn giúp đỡ tận tình ý kiến đóng góp PGS TS Nguyễn Tiến Đạt, TS Dương Đức Huyến, động viên giúp đỡ tận tình tồn thể cán Trung tâm Sinh học Thực nghiệm- Viện Ứng dụng Cơng nghệ, phịng Hoạt chất Sinh học – Viện Hố sinh biển, phịng Tài nguyên Thực vật – Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật Tôi xin gửi lời cảm ơn đến cácVQG, KBTTN địa phương tạo điều kiện thuận lợi để thực nghiên cứu khảo sát điều tra thu thập mẫu vật Tôi xin cảm ơn nhiệm vụ bảo tồn phát triển nguồn gen “Khai thác phát triển nguồn gen Lan Kim tuyến (Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.) Bạch Tật Lê (Tribulus terrestris L.) làm nguyên liệu sản xuất thuốc, đề tài nghiên cứu khoa học mã số 106 – NN 99- 2013 41 toàn thể nhà khoa học thuộc nhiệm vụ đề tài nói hỗ trợ kinh phí, cung cấp mẫu vật giúp tơi hồn thành luận án Sau khơng thể khơng nhắc tới, động viên khích lệ giúp đỡ gia đình, bạn bè đồng nghiệp giúp tơi có thêm nghị lực để hoàn thành đề tài luận án Một lần nữa, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới tất giúp đỡ Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Nghiên cứu sinh Phan Xuân Bình Minh LƠI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận án trung thực, chưa cơng bố cơng trình Các số liệu tham khảo có trích dẫn nguồn rõ ràng Nghiên cứu sinh Phan Xuân Bình Minh MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU 15 Tính cấp thiết đề tài luận án .15 Mục tiêu nghiên cứu đề tài luận án 16 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án 16 Những điểm luận án 16 Bố cục luận án 17 CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 18 1.1 Khái quát chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) .18 1.1.1.Vị trí phân loại chi Kim tuyến 18 1.1.2 Điều kiện sống vùng phân bố 21 1.1.3 Giá trị chi Kim tuyến: 22 1.2 Tình hình nghiên cứu chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) giới 24 1.2.1 Đa dạng loài 24 1.2.2 Thành phần hoạt chất giá trị dược liệu chi Kim tuyến .27 1.2.3 Nhân giống, ni trồng bảo tồn lồi thuộc chi Kim tuyến 33 1.3 Tình hình nghiên cứu chi Kim tuyến Việt Nam 40 1.3.1 Đa dạng loài 40 1.3.2 Giá trị dược liệu 42 1.3.3 Tình hình nhân giống nuôi trồng bảo tồn Việt Nam 43 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46 2.1 Đối tượng địa điểm nghiên cứu 46 2.1.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 46 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 46 2.2 Nội dung nghiên cứu .47 2.3 Phương pháp nghiên cứu 48 2.3.1 Phương pháp thu thập số liệu thực địa 48 2.3.1.1 Điều tra thực địa thu thập mẫu vật 48 2.3.1.2 Phương pháp vấn người cung cấp thông tin quan trọng 48 2.3.1.3 Phương pháp đánh giá nhanh nông thôn (PRA) 48 2.3.2 Phương pháp phân loại giám định tên loài 48 2.3.3 Phương pháp xác định hợp chất có hoạt tính sinh học 48 2.3.3.1 Phương pháp chiết tổng 48 2.3.3.2 Phương pháp phân lập .49 2.3.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học .51 2.3.4 Phương pháp nhân giống nuôi cấy in vitro .51 2.3.4.1 Phương pháp nhân giống in vitro từ chồi 51 2.3.4.2 Phương pháp nhân giống in vitro từ hạt 52 2.3.4.3 Phương pháp lựa chọn điều kiện ni cấy thích hợp .52 2.3.4.4 Phương pháp xử lý thống kê số liệu 53 2.3.5 Phương pháp nuôi trồng ex vitro .53 2.3.5.1 Phương pháp nuôi trồng nhà lưới 53 2.3.5.2 Phương pháp nuôi trồng tán rừng 53 2.3.5.3 Phương pháp xử lý thống kê số liệu 54 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .55 3.1 Đặc điểm hình thái, phân bố chi Kim tuyến Việt Nam 55 3.1.1 Đặc điểm hình thái .55 3.1.1.1 Đặc điểm hình thái Kim tuyến trung (A annamensis Aver.) 57 3.1.1.2 Hình thái Kim tuyến đá vôi (A calcareus Aver.) 59 3.1.1.3 Đặc điểm hình thái Giải thuỷ tím (Anoectochilus elwesii C.B Clarke ex Hook.) .62 3.1.1.4 Đặc điểm hình thái Lan sứa (A lylei Rolfe ex Downie.) .64 3.1.1.5 Đặc điểm hình thái Kim tuyến tơ (A setaceus Blume) 68 3.1.2 Khảo sát phân bố loài thuộc chi Kim tuyến 71 3.1.2.1 Phân bố Kim tuyến trung (A annamensis Aver.) 73 3.1.2.2 Phân bố Kim tuyến đá vôi (A calcareus Aver.) 74 3.1.2.3 Phân bố Giải thuỳ tím (A elwesii C.B Clarke ex Hook.) 74 3.1.2.4 Phân bố Kim tuyến lyle (A lylei Rolfe ex Downie) 74 3.1.2.5 Phân bố Kim tuyến tơ (A setaceus Blume) 75 3.2 Thành phần hố học hai lồi Kim tuyến (A setaceus Blume A annamensis Aver.) 77 3.2.1 Phân lập xác định cấu trúc hoá học hợp chất Kim tuyến tơ ( A setaceus) 78 3.2.1.1 Phân lập hợp chất 78 3.2.2 Phân lập xác định cấu trúc hoá học chất Kim tuyến trung ( A annamesis) 89 3.2.2.1 Các hợp chất phân lập 89 3.2.2.2 Cấu trúc hợp chất 91 3.3 Hiện trạng khai thác, sử dụng bn bán lồi thuộc chi Kim tuyến 99 3.3.1 Hiện trạng khai thác 100 3.3.2 Hiện trạng sử dụng buôn bán quản lý loài Kim tuyến địa phương .103 3.4 Giải pháp bảo tồn phát triển loài thuộc chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) 106 3.4.1 Giải pháp nhân giống ni trồng ba lồi Kim tuyến (Kim tuyến tơ, Kim tuyến trung Kim tuyến lyle) .106 3.4.1.1 Giải pháp nhân giống ba loài Kim tuyến Kim tuyến tơ, Kim tuyến trung Kim tuyến lyle phương pháp nuôi cấy in vitro 107 3.4 1.2 Giải pháp nuôi trồng Kim tuyến 133 3.4.2 Giải pháp quản lý tuyên truyền .143 3.4.2.1 Giải pháp quản lý 143 3.4.2.2 Giải pháp tuyên truyền 144 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .146 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 148 TÀI LIỆU THAM KHẢO 149 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Hiện trạng phân bố loài chi Kim tuyến( Anoectochilus Blume) 72 Bảng 3.2: Danh sách chất phân lập từ Kim tuyên tơ (A setaceus) 87 Bảng 3.3: Danh sách chất phân lập từ Kim tuyến trung 97 Bảng 3.4: Sản lượng khai thác thu mua Kim tuyến 16 điểm khảo sát 101 Bảng 3.5: Tỷ lệ hộ khai thác sử dụng loài thuộc chi Kim tuyến 103 Bảng 3.6: Ảnh hưởng môi trường khoáng đến khả sinh mầm Kim tuyến tơ, Kim tuyến trung Kim tuyến lyle sau tuần .107 Bảng 3.7: Ảnh hưởng BAP, TDZ đến giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu hai loài Kim tuyến trung Kim tuyến lyle sau tuần nuôi cấy .109 Bảng 3.8: Ảnh hưởng môi trường khống chất kích đến khả nảy mầm hạt Kim tuyến trung nuôi cấy in vitro 111 Bảng 3.9: Ảnh hưởng mơi trường khống nồng độ BAP đến khả nảy mầm hạt Kim tuyến lyle nuôi cấy in vitro 113 Bảng 3.10: Ảnh hưởng mơi trường khống nồng độ BAP đến khả nảy mầm hạt Kim tuyến tơ nuôi in vitro 115 Bảng 3.11: Ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến giai đoạn nhân nhanh hai loài Kim tuyến trung Kim tuyến lyle sau tuần nuôi cấy .118 Bảng 3.12: Ảnh hưởng điều kiện ni cấy lên q trình sinh nhân nhanh trưởng loài Kim tuyến Kim tuyến trung bộ, Kim tuyến lyle Kim tuyến tơ sau tuần nuôi cấy 121 Bảng 3.13: Ảnh hưởng chế độ chiếu sáng lên sinh trưởng phát triển mầm Kim tuyến trung bộ, Kim tuyến lyle Kim tuyến tơ sau tuần nuôi cấy 124 Bảng 3.14: Ảnh hưởng NAA; IBA đền Kim tuyến trung giai đoạn tạo hồn chỉnh sau tuần ni cấy 128 Bảng 3.15: Ảnh hưởng NAA; IBA đền Kim tuyến lyle giai đoạn tạo hoàn chỉnh sau tuần nuôi cấy 129 Bảng 3.16: Ảnh hưởng điều kiện mơi trường đến q trình rễ ba loài Kim tuyến (Kim tuyến trung bộ, Kim tuyến lyle Kim tuyến tơ) sau tuần nuôi cấy 131 Hình 7b: Phổ 13C NMR hỗ hợp ARW13.7 đƣợc phân lập từ A setaceus Hình 7c: Phổ DEPT hỗ hợp ARW13.7 đƣợc phân lập từ A setaceus Hình 8a: Phổ 1H NMR hợp chất AAH 9.10 (CDCl3, 500 MHz) đƣợc phân lập từ A anamensis Hình 9a: Phổ 1H NMR hợp chất AAE14.18 (CD3OD, 500 MHz) đƣợc phân lập từ A anamensis Hình 9b: Phổ 13C NMR hợp chất AAE14.18 (CD3OD, 150 MHz) đƣợc phân lập từ A anamensis Hình 9c: Phổ 13C NMR hợp chất AAE14.18 (CD3OD, 150 MHz) đƣợc phân lập từ A anamensis Hình 9d: Phổ HSQC hợp chất AAE14.18 (CD3OD, 500 MHz) đƣợc phân lập từ A anamensis Hình 9e: Phổ HMBC hợp chất AAE14.18 (CD3OD, 500 MHz) đƣợc phân lập từ A anamensis Hình 10a: Phổ 1H NMR hợp chất AAH8.2 (CDCl3, 500 MHz) đƣợc phân lập từ A anamensis Hình 10b: Phổ 13C NMR hợp chất AAH8.2 (CDCl3, 150 MHz) đƣợc phân lập từ A anamensis Hình 10c: Phổ DEPT hợp chất AAH8.2 (CDCl3, 150 MHz) đƣợc phân lập từ A anamensis Hình 11a: Phổ 1H NMR hợp chất AAH10.9 (CDCl3, 500 MHz) đƣợc phân lập từ A anamensis Hình 11b: Phổ 13C NMR hợp chất AAH10.9 (CDCl3, 150 MHz) đƣợc phân lập từ A anamensis Hình 11c: Phổ DEPT hợp chất AAH10.9 (CDCl3, 150 MHz) đƣợc phân lập từ A anamensis Hình 12a: Phổ 1H NMR hợp chất AAH8.15 (CDCl3, 500 MHz) đƣợc phân lập từ A anamensis Phụ Lục BẢN GỢI Ý PHỎNG VẤN BÁN CẤU TRÚC Dành cho cán ộ địa phƣơng (cấp xã) Diện tích đất đai, diện tích rừng (Các loại) mà địa phương quản lý? Nếu đất rừng sản xuất trồng loại trồng nào?- Có thể xin Báo cáo xã ……………………………………………………………………………………… …….………………………………………………………………………………… ………… Dân số? Tỷ lệ hộ nghèo (của xã/ tiến hành vấn hộ)?- Có thể xin Báo cáo xã ……………………………………………………………………………………… …….………………………………………………………………………………… ………… Các loại dược liệu mà người dân khai thác? Khai thác để sử dụng hay để bán, giá bán ……………………………………………………………………………………… …….………………………………………………………………………………… ………… Sử dụng hình ảnh lồi Kim tuyến để hỏi địa phương có đối tượng giống tương tự ảnh khơng? Người dân có tham gia khai thác hay ni trồng đối tượng khơng? Nếu có khai thác, ni trồng phục vụ mục đích gì? ……………………………………………………………………………………… …….………………………………………………………………………………… ………… Đánh giá ơng/ bà mức độ phong phú trữ lượng loài Kim tuyến địa phương ……………………………………………………………………………………… …….………………………………………………………………………………… ………… Tốc độ suy giảm mức độ cạn khiệt sao? ……………………………………………………………………………………… …….………………………………………………………………………………… …………… Chính quyền địa phương tham gia vào công tác quản lý bảo vệ tài nguyên đông thực vật theo nghị định số 32/2006/NĐ-CP phủ nào? ……………………………………………………………………………………… …… Địa phương ta có kế hoạch phát triển trồng lồi q hiếm, đặc hữu có giá trị hay khơng? Nếu có, cụ thể gì? Tại sao? Dành cho Cán ộ VQG, KBTTN Ban quản l rừng phòng hộ Thực trạng rừng, kiểu rừng diện tích rừng mà quan/ đơn vị quản lý ……………………………………………………………………………………… ……… ……………………………………………………………………………………… ……… Thực trạng khai thác lâm sản từ năm 2000-2006 từ 2006 đến diện tích rừng đơn vị quản lý? Đối tượng khai thác? Chủng loại ? Số lượng? ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………… Nhưng lồi thuộc chi Kim tuyến có bị khai thác không? Thời gian khai thác? Chủng loại ? Số lượng? ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………… Cơng tác quản lý (Chính sách thực thi) thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp, quý, theo nghị định số 32/2006/NĐ-CP phủ nào? ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………… Hiện phát triển loại cây/ đất rừng mà đơn vị quản lý? (Diện tích, giống, kỹ thuật, người tham gia, thời gian thu hoạch, hiệu kinh tế, phương án tiêu thụ…) ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………… Nhà nước/ địa phương đơn vị hỗ trợ cho quan mình/ người dân địa phương việc khai thác phát triển bền vững lâm sản không? (VD: Định hướng, giống, kỹ thuật nuôi trồng, bao tiêu sản phẩm…) ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………… Dự định phát triển năm tới (phát triển loại sản phẩm gì, kế hoạch phương án phát triển ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………… Có hiểu biết chi Kim tuyến (Phân biệt lồi, giá trị, thực trạng…) Dành cho nhƣng hộ tham gia mua án LSNG địa phƣơng Những thông tin cá nhân (Quê quán, dân tộc, thời gian làm nghề buôn bán LSNG, thu nhập…) ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………… Những thông tin mặt hàng buôn bán (Chủng loại, số lượng thu mua/ năm, giá cả, thị trường tiêu thụ.) ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………… Có tham gia tham gia mua bán Kim tuyến khơng (Chủng loại, số lượng, giá cả, mục đích, hình thức mua bán) ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………… Có hiểu biết loài Kim tuyến (phân biệt chủng loại, giá trị, thị trường tiêu thụ, mức độ cạn kiệt) ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………… Nguyên nhân làm suy giảm loài Kim tuyến? Đâu nguyên nhân lớn nhất? ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………… Chính quyền địa phương quan quản lý có hạn chế hoạt động bn bán LSNG nói chung lồi thuộc chi Kim tuyến nói riêng khơng? Nếu có hoạt động gì? ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………… Anh/chị nghĩ việc có bền vững khơng? ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………… Nếu nguồn LSNG cạn kiệt anh chị làm nghề ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………… Phụ lục PHIẾU ĐIỀU TRA TÌNH HÌNH KHAI THÁC, SỬ DỤNG VÀ BN BÁN KIM TUYẾN • Hộ gia đình ơng/bà (chủ hộ): • Địa chỉ: • Dân tộc: • Số người gia đình: • Số người độ tuổi lao động: • Gia đình thuộc diện : Hộ khá/ Trung bình/ Nghèo/ Đói theo phân loại xã: • Thiếu ăn khơng: Có Nam khơng Nữ Nam Nữ Những tháng thiếu ăn năm: • Cụ thể thu nhập hành năm gia đình ơng bà từ nguồn bao nhiêu? Số Các nguồn Số lượng Mục đích sử Thu nhập Tăng Tại tt thu nhập /năm dụng /trên năm hay tăng/ (dùng/bán) (nghìn giảm giảm đồng) năm gần Trồng nông nghiệp Chăn nuôi Trồng dược liệu Công trồng bảo vệ rừng Khai thác gỗ Khai thác LSNG Khai thác khoáng sản Nghề thủ công Kinh doanh, dịch vụ 10 Làm thuê 11 Khác TỔNG: ……………… • Gia đình có giao đất lâm nghiệp khơng? Được giao……………ha, a, Theo sách nào: b, Thời gia giao quản lý sử dụng: • Hỏi liệt kê cụ thể thông tin loại sản phẩm khai thác từ rừng Tên Nơi Số Mục Ngườ Mùa Cách Nơi Gi Thu sản kha lượng/nă đích i trực khai bảo nhập/nă phẩm i m khai tiếp thác quản sản bá m thác khai (thán , chế phẩ n (bán/ thác g biến m thác sử dụng năm) ) Gỗ Củi Tre, Nứa Song mây Cây cảnh Măn g Rau Dược liệu Kim tuyến • Trong sản phẩm trên, sản phẩm khai thác phổ biến ? Tại sao? • Tại địa phương có chương trình phát triển dược liệu cho người dân địa phương chưa ? Nếu có loại nào? • Nếu có điều kiện vốn, khoa học kỹ thuật, thị trường, Ơng/bà mong muốn trồng ... Vị trí phân loại chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) Chi Kim tuyến (Anoectochilus) Carlvon Blume mô tả lần năm 1825, chi thực vật có hoa thuộc họ Lan (Orchidaceae) Trên giới, chi có khoảng gần... Khái quát chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) Chi Kim tuyến (Anoectochilus) bao gồm khoảng 40 - 50 loài thảo mộc nhỏ mặt đất khác từ dãy Himalaya Ấn Độ đến dãy núi Đông Nam Á, miền nam Trung... Việt Nam 43 Hình 3.1: Hình ảnh mô tả phác hoạ chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) 56 Hình 3.2 : Hình thái Kim tuyến trung (A annamensis Aver.) .58 Hình 3.3 : Kim tuyến trung A annamensis