nhan giong vo tinh dong vat

I. LỜI MỞ ĐẦU Mục đích của công tác chọn giống và nhân giống là cải tiến tiềm năng di truyền của cây trồng, vật nuôi .nhằm nâng cao năng suất, hiệu quả sản xuất nông nghiệp. Trong công tác cải tạo giống cổ truyền chủ yếu sử dụng phương pháp lai tạo và chọn lọc để cải tạo nguồn gen của sinh vật. Tuy nhiên, do quá trình lai tạo tự nhiên, con lai thu được qua lai tạo và chọn lọc vẫn còn mang luôn cả các gen không mong muốn do tổ hợp hai bộ nhiễm sắc thể đơn bội của giao tử đực và giao tử cái. Một hạn chế nữa là việc lai tạo tự nhiên chỉ thực hiện được giữa các cá thể trong loài. Lai xa, lai khác loài gặp nhiều khó khăn, con lai thường bất thụ do sai khác nhau về bộ nhiễm sắc thể cả về số lượng lẫn hình thái giữa bố và mẹ, do cấu tạo cơ quan sinh dục, tập tính sinh học . giữa các loài không phù hợp với nhau. Gần đây, nhờ những thành tựu trong lĩnh vực DNA tái tổ hợp, công nghệ chuyển gen ra đời đã cho phép khắc phục những trở ngại nói trên. Nó cho phép chỉ đưa những gen mong muốn vào động vật, thực vật .để tạo ra những giống vật nuôi, cây trồng mới ., kể cả việc đưa gen từ giống này sang giống khác, đưa gen của loài này vào loài khác. Bằng kỹ thuật tiên tiến nêu trên của công nghệ sinh học hiện đại, vào năm 1982 Palmiter và cộng sự đã chuyển được gen hormone sinh trưởng của chuột cống vào chuột nhắt, tạo ra được chuột nhắt “khổng lồ“. Từ đó đến nay hàng loạt động vật nuôi chuyển gen và nhân bản vô tính đã được tạo ra như thỏ, lợn, cừu, dê, bò, gà, cá .Trong hướng này các nhà nghiên cứu tập trung vào những mục tiêu: tạo ra động vật chuyên sản xuất protein quí phục vụ y học; tạo ra động vật có sức chống chịu tốt (chống chịu bệnh tật, sự thay đổi của điều kiện môi trường .); tạo ra các vật nuôi có tốc độ lớn nhanh, hiệu suất sử dụng thức ăn cao, cho năng suất cao và chất lượng sản phẩm tốt. Ðộng vật chuyển gen và động vật nhân bản vô tính còn được sử dụng làm mô hình thí nghiệm nghiên cứu các bệnh ở người để nhanh chóng tìm ra các giải pháp chẩn đoán và điều trị các bệnh hiểm nghèo như ung thư, AIDS, thần kinh, tim mạch II. NỘI DUNG 1. Công nghệ tạo động vật chuyển gen 1.1. Khái niệm Ðộng vật chuyển gen là động vật có gen ngoại lai (gen chuyển) xen vào trong DNA genome của nó. Gen ngoại lai này phải được truyền lại cho tất cả mọi tế bào, kể cả các tế bào mầm. Việc chuyển gen ngoại lai vào động vật chỉ thành công khi các gen này di truyền lại cho thế hệ sau. 1.2. Lịch sử phát triển Vào thập kỷ 1970, các thí nghiệm nghiên cứu đã được thực hiện với các tế bào ung thư biểu bì phôi và các tế bào ung thư quái thai để tạo nên chuột thể khảm (Brinster,1974; Mintz và Illmensee, 1975; Bradley, 1984). Trong các động vật thể khảm này, các tế bào nuôi cấy lấy từ một dòng chuột được đưa vào phôi của một dòng chuột khác bằng quần tụ phôi trực tiếp (direct embryo aggregation) hoặc bằng cách tiêm vào phôi ở giai đoạn phôi nang (blastocyst). Bước phát triển tiếp theo của kỹ thuật chuyển gen được thực hiện bằng cách tiêm retrovirus vào các phôi chuột đã được nuôi cấy trước (Jeanish và Mintz, 1974; Jeanish, 1976). Thông tin di truyền của virus được chuyển một cách hiệu quả vào genome của động vật nhận và sau đó ít lâu kỹ thuật sử dụng retrovirus làm vector cho các đoạn DNA ngoại lai đặc biệt đã được phát triển (Stuhmann, 1984). Sử dụng retrovirus như là vật truyền trung gian đối với việc chuyển gen đã tạo nên hiện tượng khảm ở mức độ cao. Trong những năm gần đây, một số kỹ thuật tạo động vật chuyển gen khác đã được công bố: phương pháp chuyển gen bằng cách sử dụng tế bào gốc phôi (Grossler,1986), phương pháp chuyển các đoạn nhiễm sắc thể nguyên (ví dụ như chuột “transomic“, Richa và Lo, 1988), chuyển gen trực tiếp vào tinh trùng kết hợp với thụ tinh in vitro (Lavitrano, 1989). Tuy nhiên, phương pháp vi tiêm DNA vào tiền nhân của hợp tử là phương pháp có hiệu quả nhất, được sử dụng rộng rãi nhất để tạo động vật chuyển gen. Sử dụng phương pháp này, các gen chuyển có chiều dài trên 50 kb của virus, sinh vật tiền nhân , thực vật, động vật không xương sống hoặc động vật có xương sống có thể được chuyển vào genome của động vật có vú và chúng có thể được biểu hiện ở cả tế bào sinh dưỡng và tế bào sinh sản. Ở Việt Nam, ghép gene vào động vật khó khăn hơn nhiều so với thực vật. Việc ghép gene vào trứng động vật chỉ tiến hành được khi trứng vừa thụ tinh trong vòng 2-3 giờ. Với các loài cá là nhóm thụ tinh ngoài, người ta có thể chủ động thực hiện việc thụ tinh nhân tạo và bổ sung gene. Còn trên các động vật khác, việc này rất khó. Một buồng trứng cá có thể có hàng vạn trứng để thí nghiệm, nhưng với bò, không thể kích thích hàng nghìn con cùng rụng trứng để thí nghiệm được. Do đó, công nghệ này hiện tại chỉ áp dụng trên cá, và bước đầu trên chuột mà thôi. 1.3. Các phương pháp tiến hành 1.3.1. Tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật 1.3.1.1. Tách chiết, phân lập gen mong muốn Một gen ngoại lai trước khi được chuyển vào genome của tế bào vật chủ để tạo ra động vật chuyển gen phải được phân lập và tinh chế hay nói cách khác là nó phải được tạo dòng. Các công cụ sử dụng để tạo dòng bao gồm các enzyme đặc biệt có hoạt tính cắt và nối DNA (enzyme hạn chế và ligase), các mẫu dò (probe), vector và tế bào vật chủ. Tế bào vật chủ thường được sử dụng là tế bào vi khuẩn E.coli và vector thường được sử dụng là plasmid. Việc tách chiết một gen riêng lẻ là rất phức tạp bởi vì DNA mẫu chứa hàng triệu gen. Do đó để thực hiện điều này, DNA mẫu chứa gen mong muốn và vector plasmid phải được cắt bởi cùng một loại enzyme hạn chế. Các đoạn DNA mẫu sau khi được cắt có mang gen mong muốn sẽ được xen vào vector plasmid và các đầu của các đoạn DNA mẫu này và các đầu của vector plasmid sẽ được nối với nhau nhờ ligase tạo thành plasmid tái tổ hợp. Sau đó các plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào các tế bào vi khuẩn E.coli và các tế bào vi khuẩn tiến hành sinh trưởng. Vào thời điểm này, các tế bào vi khuẩn chứa plasmid mang gen mong muốn sẽ được phát hiện bằng mẫu dò. Chúng được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để sinh trưởng phát triển tạo ra hàng triệu bản sao của vector chứa gen này. Vector chứa gen này sẽ được tách ra khỏi tế bào vi khuẩn và gen mong muốn sẽ được tách chiết. Phương pháp này có thể tạo ra hàng triệu bản sao của gen mong muốn mà không bị nhiễm bởi các gen khác. Gen chuyển có nguồn gốc từ genome này chứa các đoạn exon mã hoá và các đoạn intron không mã hoá. Người ta cũng có thể phân lập được gen mong muốn từ sản phẩm biểu hiện của nó như mRNA hoặc protein. Từ mRNA dưới tác động của enzyme sao chép ngược sẽ tổng hợp ra DNA bổ sung mạch đơn (single strand complement DNA-ss cDNA), tiếp theo là DNA bổ sung mạch kép (double strand complement DNA- ds cDNA). DNA bổ sung (complement DNA- cDNA) này khác với DNA gốc là không chứa các intron mà chỉ bao gồm các exon. Hoặc từ sản phẩm protein, có thể suy ra trình tự nucleotid của gen cấu trúc trên cơ sở trình tự các axit amin trong phân tử protein. Sau đó có thể thiết kế cặp mồi (primer) để dò tìm đoạn gen mong muốn. 1.3.1.2. Tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế bào động vật Ðể tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế bào động vật, các vùng chức năng khác nhau của gen có nguồn gốc từ các loài khác nhau có thể được kết hợp lại với nhau trong ống nghiệm bằng cách sử dụng enzyme hạn chế và ligase. Tất cả các thành phần của gen có thể được tách chiết và tái tổ hợp để tạo thành một cấu trúc gen chuyển biểu hiện. Ở các đầu của cấu trúc đầy đủ này có thể được sửa đổi bằng cách bổ sung các trình tự polylinker chứa một số vị trí nhận biết các enzyme hạn chế khác nhau. Trình tự polylinker cho phép có thể xen vào cấu trúc này một vector để kiểm tra và tạo dòng. Gen chuyển được đi kèm với các trình tự không mã hoá có vai trò điều hoà sự biểu hiện của gen. Các yếu tố điều hoà cũng có thể nằm ở trong đoạn intron. Yếu tố điều hoà ở gần đầu 5’ của gen là promoter, có vai trò quyết định trong việc điều hoà sự biểu hiện của gen. Promoter ở tế bào động vật có nguồn gốc hoặc từ động vật như methallothionein (MT), thymidine kinase, ß-actin, amylase, insulin, ß- lactoglobulin, adiposite P2 . hoặc từ virus động vật như Simian virus (SV40), Rous sarcoma virus (RSV) . enhancer: gen tăng cường. 1.3.2. Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen. Ở động vật có vú thì giai đoạn biến nạp gen thích hợp nhất là trứng ở giai đoạn tiền nhân (pronucleus), giai đoạn mà nhân của tinh trùng và trứng chưa dung hợp (fusion) với nhau. Ở giai đoạn này tổ hợp gen lạ có cơ hội xâm nhập vào genome của động vật nhờ sự tái tổ hợp DNA của tinh trùng và của trứng. Do tế bào phôi chưa phân chia và phân hoá nên tổ hợp gen lạ được biến nạp vào giai đoạn này sẽ có mặt ở tất cả các tế bào kể cả tế bào sinh sản của động vật trưởng thành sau này. Ðối với động vật có vú, trứng chín được thu nhận bằng phương pháp sử dụng kích dục tố theo chương trình đã được xây dựng cho mỗi loài hoặc bằng phương pháp nuôi cấy trứng trong ống nghiệm. Sau đó thụ tinh nhân tạo để tạo ra trứng tiền nhân. Ðối với cá, giai đoạn biến nạp thích hợp là phôi ở giai đoạn 1-4 tế bào. Giai đọan này được tạo ra bằng thu nhận trứng, tinh dịch bằng phương pháp sử dụng kích dục tố (kích thích tố trong nhau thai của người (HCG) hoặc não thuỳ thể cá chép .), rồi thụ tinh nhân tạo. 1.3.3. Chuyển gen vào động vật. Hiện nay có nhiều phương pháp khác chuyển gen nhau đang được sử dụng để tạo động vật chuyển gen: vi tiêm, chuyển gen bằng cách sử dụng các tế bào gốc phôi, chuyển gen bằng cách sử dụng vector virus . 1.3.4. Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm (đối với động vật bậc cao) Tế bào trứng tiền nhân sau khi vi tiêm được nuôi cấy trong ống nghiệm để phát triển đến giai đoạn phôi dâu (morula) hoặc túi phôi (blastocyst). Ở giai đoạn này màng trong (pellucida) bị bong ra và phôi có thể làm tổ được ở dạ con. Những phôi này được cấy chuyển vào con nhận đã được gây chửa giả (pseudopregnant) để phát triển thành cá thể con. Ðối với động vật bậc thấp như cá không cần giai đoạn này. Tuy nhiên ở cá, trứng sau khi thụ tinh màng thứ cấp (chorion) dày lên, rất dai và dính gây trở ngại cho việc định vị chính xác mũi kim tiêm vào vị trí mong muốn để có thể đưa được DNA vào trứng. Mặt khác giai đoạn phôi một tế bào ở cá rất ngắn trong khi đó việc vi tiêm đòi hỏi nhiều thao tác tỉ mỉ và chính xác. Ðể khắc phục các nhược điểm này, người ta có thể tiến hành loại màng thứ cấp, kéo dài giai đoạn phôi 1-4 tế bào và ấp nhân tạo phôi trần để tạo cá bột. 1.3.5. Kiểm tra động vật được sinh ra từ phôi chuyển gen Ðể khẳng định động vật có được chuyển gen lạ vào hay không, người ta phải kiểm tra xem gen lạ có xâm nhập được vào bộ máy di truyền của động vật trưởng thành hay không và sản phẩm của gen lạ có được tổng hợp ra hay không. Ðối với vấn đề thứ nhất người ta sử dụng phương pháp lai phân tử trên pha rắn (Southern blot, Northern blot .) hoặc PCR. Ðối với vấn đề thứ hai, sản phẩm của gen lạ được đánh giá ở hai mức độ: phiên mã và dịch mã. Sản phẩm phiên mã được đánh giá bằng phương pháp RT-PCR, sản phẩm dịch mã được đánh giá bằng phương pháp Western blot, ELISA hoặc kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA) để phát hiện protein lạ trong động vật. Theo dõi các thế hệ sau của động vật chuyển gen (F1, F2, F3, .) để xác định gen lạ có di truyền hay không. 1.3.6. Tạo nguồn động vật chuyển gen một cách liên tục. Sau khi kiểm tra thấy gen ngoại lai đã được di truyền ổn định, tiến hành lai tạo và chọn lọc để tạo dòng động vật chuyển gen. 1.4. Ưu nhược điểm của phương pháp chuyển gen động vật 1.4.1. Ưu điểm: - Tạo ra sản phẩm mong muốn trong thời gian ngắn, mang lại hiệu quả cao. - Rất chủ động để tạo ra giống cây con mang đặc tính mong muốn mà không cần mất nhiều thời gian chọn lọc, theo dõi ở đời con như phương pháp lai tạo thông thường, có thể biết trước một cách khá chính xác các tính trạng cần tạo ra ở đời con - Có thể tạo giống cây trồng từ nhiều nguồn vật liệu rất xa nhau về mặt di truyền mà rất khó thành công bằng phương pháp lai thông thường - Tiết kiệm rất nhiều diện tích thí nghiệm đồng ruộng để duy trì nguồn vật liệu chọn tạo - Nhanh chóng tạo ra sản phẩm ở qui mô công nghiệp 1.4.2. Nhược điểm: - Yêu cầu có kiến thức và hiểu biết sâu sắc về công nghệ gen, công nghệ tế bào. - Chi phí ban đầu tốn kém, thiết bị và hoá chất đắt tiền - Sự hiểu biết của người tiêu dùng về GMO còn rất hạn chế, do đó không nhận được sự ủng hộ của người tiều dùng. - Chính phủ các nước còn có nhiều quan điểm khác nhau về GMO, nhiều quốc gia rất dè dặt trong việc phát triển GMO. - Nhiều tổ chức NGO phản đối GMO 1.4.3. Mục đích: Chuyển gen ở động vật để tạo + Giống mới + Nâng cao chất lượng sản phẩm + Tạo khả năng chống bệnh + Nâng cao khả năng chống chịu và hấp thụ dinh dưỡng tạ năng suất Bò sữa được chuyển gen tạo sữa có hàm lượng protein cao 1.5. Những thành tựu về động vật chuyển gen Năm 1981, Warner và CTV (ĐH. Ohio) đã cấy gen B – globulin của thỏ vào phôi chuột thành công. Từ năm [...]... lợn và bò đã được chèn vào nhiễm sắc thể tế bào cừu, lợn, bò và thỏ Các con vật này cho tăng trưởng nhanh, tăng tỷ lệ nạc/mỡ và tăng chuyển hoá thức ăn… Tuy nhiên, chi phí tương đối cao khi tạo ra các giống vật nuôi chuyển gen Hơn nữa, chúng dễ bị bệnh, như lợn chuyển gen hocmôn tăng trưởng đã lớn rất nhanh nhưng sau chúng bị loét dạ dày, hư thận và gan, nhạy cảm với viêm phổi, dễ bị viêm da và mất... “bản sao” giống hệt một động vật đang tồn tại Kỹ thuật này đã được dùng để nhân bản cừu và các động vật có vú khác 2.1.3 Lịch sử phát triển 1959 - Thỏ ra đời bằng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm 1968 - Edwards và Bavister thụ tinh trứng người trên in vitro 1979 - Karl Illmensee công bố nhân bản được ba con chuột từ một phôi ban đầu 1984 - Steen Willadsen nhân bản thành công cừu từ các tế bào phôi... ban đầu dùng ba loại tế bào: các tế bào Sertoli (tế bào lát ống tinh hoàn), các tế bào não, và các tế bào gò trứng (cumulus cells) Bình thường trong cơ thể cả hai loại tế bào Sertoli và tế bào não đã được duy trì ở pha G0 và các tế bào gò trứng hầu như luôn ở pha G0 hoặc G1 (trạng thái ngủ hay tình trạng ẩn dật) Các trứng chuột chưa thụ tinh được dùng để nhận nhân cho Sau khi loại bỏ nhân, đưa nhân... hormone sinh trưởng có tốc độ lớn nhanh hơn đối chứng là 17%, hiệu suất sử dụng thức ăn cao hơn 30% Tuy nhiên, động vật nuôi chuyển gen hormone sinh trưởng có biểu hiện bệnh lý lớn quá cỡ và chưa có ý nghĩa lớn trong thực tiễn VD: Các nhà khoa học ở Granada (Houston, Texas) đã tạo ra được bò chuyển gen tiếp nhận estrogen người (human estrogen receptor) có tốc độ lớn nhanh Các nhà khoa học ở đây đã... thiếu dinh dưỡng (lượng chất dinh dưỡng chỉ vừa đủ giữ cho tế bào không chết) Trong điều kiện này tế bào tắt tất cả các gen hoạt động tế và chuyển vào pha ngủ G0 Loại bỏ nhân của tế bào trứng chưa thụ tinh lấy từ một cừu “mẹ nuôi”, đặt tế bào trứng này sát vách tế bào cho (đã đưa về pha G0) Sau khi rút nhân trứng từ 1 đến 8 tiếng, cho một dòng điện chạy qua hai tế bào này, shock có tác dụng hòa tế bào... nhân được dùng trong nhân bản vô tính động vật 2.2.2 Phương pháp tiến hành Để nhân bản bằng kỹ thuật chuyển nhân cần có hai tế bào, một tế bào trứng và một tế bào cho Qua thực nghiệm thấy trứng chưa thụ tinh phù hợp nhất cho kỹ thuật này vì dường như nó dễ dàng dung nạp nhân cho hơn Tế bào trứng phải được loại bỏ nhân, quá trình này làm mất đi hầu hết thông tin di truyền của trứng Bằng các kỹ thuật khác... cơ thể Đưa nhân tế bào cho vào tế bào nhận bằng shock điện Đưa nhân tế bào cho vào tế bào nhận bằng tiêm trực tiếp Đồng thời với nhận nhân trứng được dòng điện hoạt hóa luôn Trứng sau nhận nhân (“thụ tinh ) được để yên (không có kích thích nào khác) 5-6 giờ để cho phép chấp nhận nhận mới và có thời gian tái lập trình nhân tế bào Hoạt hóa tế bào phân chia phát triển thành phôi bằng shock điện Hoạt hóa... có thể nhân bản chỉ bị hạn chế bởi số lượng trứng có thể chấp nhận nhân chuyển vào và số lượng cơ thể “mẹ nuôi” có sẵn để cấy phôi vô tính đã tạo nên Tuy nhiên, nhân bản phôi đơn thuần từ một phôi thụ tinh nhân tạo dễ làm hơn, tỷ lệ phôi sống và phát triển đạt hầu như 100 phần trăm, trong khi đó để nhân bản vô tính cừu Dolly người ta đã thất bại trên 276 lần nhân bản Với những thành tựu của nhân bản... vươn thú Sandiego (Mỹ) năm 1980 Dê trắng (Úc) Đàn lợn được nhân bản tại Mỹ 3 Ý nghĩa của công nghệ chuyển gen động vật và nhân bản vô tính trong ngành chăn nuôi 3.1 Taọ ra những động vật có tốc độ lớn nhanh, hiệu quả sử dụng thức ăn cao Đưa tổ hợp bao gồm gen cấu trúc của hormone sinh trưởng và promoter methallothionein vào động vật Cho đến nay người ta đa đưa thành công gen này vào thỏ, lợn và cừu... động vật/người) Như vậy, vật liệu của nhân bản bằng kỹ thuật chuyển nhân tế bào là các “phôi vô tính” được tạo ra bằng cách chuyển nhân một tế bào thân sang một tế bào trứng đã hút bỏ nhân Cả phôi thụ tinh nhân tạo và phôi được tạo ra bằng kỹ thuật chuyển nhân tế bào thân đều là các tế bào gốc toàn năng, có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh.Các động vật được nhân bản bằng kỹ thuật chuyển . được khi trứng vừa thụ tinh trong vòng 2-3 giờ. Với các loài cá là nhóm thụ tinh ngoài, người ta có thể chủ động thực hiện việc thụ tinh nhân tạo và bổ sung. chuột “transomic“, Richa và Lo, 1988), chuyển gen trực tiếp vào tinh trùng kết hợp với thụ tinh in vitro (Lavitrano, 1989). Tuy nhiên, phương pháp vi tiêm