Đang tải... (xem toàn văn)
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6189-1-2009 quy định phương pháp thu nhỏ để phát hiện và đếm khuẩn đường ruột chính trong nước mặt và nước thải bằng cách nuôi cấy trong môi trường lỏng. Phương pháp này có thể áp dụng cho tất cá các loại nước mặt và nước thải, đặc biệt là nước có chứa một lượng lớn các chất lơ lửng.
TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 6189-1 : 2009 ISO 7899-1 : 1998 CHẤT LƯỢNG NƯỚC - PHÁT HIỆN VÀ ĐẾM KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT - PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP THU NHỎ (SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT) ĐỐI VỚI NƯỚC MẶT VÀ NƯỚC THẢI Water quality - Detection and enumeration of intestinal enterococci - Part 1: Miniaturized method (Most Probable Number) for surface and waste water Lời nói đầu TCVN 6189-1 : 2009 thay TCVN 6189-1 : 1996 TCVN 6189-1 : 2009 hoàn toàn tương đương với ISO 7899-1 : 1998/Cor : 2000 TCVN 6189-1 : 2009 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn Quốc gia TCVN/TC 147 Chất lượng nước biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ cộng bố TCVN 6189 (ISO 7899) Chất lượng nước - Phát đếm khuẩn đường ruột gồm hai phần sau đây: - TCVN 6189-1 : 2009 (ISO 7899-1 : 1998/Cor : 2000) Phần 1: Phương pháp thu nhỏ (số có xác suất lớn nhất) nước mặt nước thải; - TCVN 6189-2 : 2009 (ISO 7899-1 : 2000) Phần 2: Phương pháp lọc màng Lời giới thiệu Mục đích tiêu chuẩn để đếm số vi khuẩn đường ruột E.faecalis, Ε.faecium, Ε.durans Ε.hirae thường xuất phân người động vật Một số loài vi khuẩn Entorococcus Ε.avium, Ε.columbae Ε.gallinarum đặc biệt chủng Streptococcus bovist/equinus xuất gặp mẫu mơi trường Độ phát vi khuẩn thấp Enterococcus casseliflavus Ε.mundtii lồi khơng có nguồn gốc từ phân xuất mẫu nước (ví dụ ảnh hưởng vật liệu số loại nước thải cơng nghiệp) đếm vi khuẩn đường ruột có nguồn gốc từ phân Các lồi số lồi khác khơng có nguồn gốc từ phân có xu hướng sinh sắc tố màu vàng môi trường nuôi cấy không chọn lọc Do vậy, phải xét đến cản trở lồi Enterococcus khơng có nguồn gốc từ phân diễn giải kết CHẤT LƯỢNG NƯỚC - PHÁT HIỆN VÀ ĐẾM KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT - PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP THU NHỎ (SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT) ĐỐI VỚI NƯỚC MẶT VÀ NƯỚC THẢI Water quality - Detection and enumeration of intestinal enterococci - Part 1: Miniaturized method (Most Probable Number) for surface and waste water Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp thu nhỏ để phát đếm khuẩn đường ruột nước mặt nước thải cách nuôi cấy môi trường lỏng Phương pháp áp dụng cho tất cá loại nước mặt nước thải, đặc biệt nước có chứa lượng lớn chất lơ lửng Phương pháp khơng thích hợp cho nước uống loại nước có số đếm theo hướng dẫn nhỏ 15 100 ml Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 5992 : 1995 (ISO 5667-2 : 19911)) Chất lượng nước - Lấy mẫu - Phần 2: Hướng dẫn kỹ thuật lấy mẫu; TCVN 6663-1 : 2002 (ISO 5667-1 : 19802)) Chất lượng nước - Lấy mẫu - Phần 1: Hướng dẫn lập chương trình lấy mẫu; TCVN 6450 : 2007 (ISO/IEC Guide : 2004) Tiêu chuẩn hóa hoạt động có liên quan Thuật ngữ chung định nghĩa; TCVN 6663-3 : 2008 (ISO 5667-3 : 2003) Chất lượng nước - Lấy mẫu - Phần 3: Hướng dẫn bảo quản xử lý mẫu; ISO 8199 : 19883) Water quality - General guide to the enumeration of microorganism by culture (Chất lượng nước - Hướng dẫn chung để đếm vi sinh vật nuôi cấy); ISO 3951 : 1989 Sampling procedures and charts for inspection by variables for percent nonconforming (Qui trình lấy mẫu biểu đồ để tra dùng biến thiên theo phần trăm không phù hợp) Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn này, áp dụng thuật ngữ định nghĩa TCVN 6450 (ISO/IEC Hướng dẫn 2) thuật ngữ sau: 3.1 Khuẩn đường ruột (Intestinal enterococci) Vi khuẩn có khả phát triển hiếu khí 44 oC thủy ngân 4-metylbeliferyl- -D-glucosi (MUD) có tali axetat, axit nalidic 2,3,5-triphenyltetrazolium clorua (TTC) môi trường lỏng xác định Nguyên tắc Mẫu pha lỗng ni cấy giếng cấy đĩa microtit có chứa mơi trường cấy loại nước Phiến giếng cấy kiểm tra tối có ánh sáng cực tím 366 nm sau ủ khoảng thời gian từ 36 h đến 72 h 44 oC ± 0,5 oC Sự có mặt khuẩn đường ruột thị huỳnh quang kết thủy phân MUD Kết đưa số có xác suất lớn 100 ml (MNP) Thiết bị, dụng cụ Ngoại trừ dụng cụ, thiết bị vô khuẩn cấp, tất dụng cụ thủy tinh phải khử khuẩn theo ISO 8199 Các thiết bị phòng thí nghiệm phân tích vi sinh thơng thường cụ thể: 5.1 Thiết bị để khử khuẩn sấy nhiệt (lò) (nồi hấp) 5.2 Tủ ủ có nhiệt độ ổn định, đặt nhiệt độ 44 oC ± 0,5 oC 5.3 Hầm sấy (lò sấy kiểu hầm) phòng sấy luồng khí (nên dùng loại II) 5.4 Buồng quan sát lắp đèn UV (Đèn Wood 366 nm) CẢNH BÁO - Ánh sáng UV gây kích ứng da mắt Sử dụng găng kính bảo vệ 5.5 Máy đo khúc xạ cầm tay (tùy chọn) 5.6 pH mét, với độ xác = 0,1 1) ISO 5667-2 : 1991 bị hủy thay ISO 5667-1 : 2006 ISO 5667-1 có phiên năm 2006 3) ISO 8199 có phiên năm 2005 2) 5.7 Ống nghiệm, 16 mm x 160 mm 20 mm x 200 mm, bình có dung tích tương tự 5.8 Pipet nhiều đầu điều chỉnh pipet có sẵn đầu điều chỉnh được, hệ thống phù hợp để đo phân chia 200 l giếng cấy 5.9 Ống chóp vơ khuẩn lắp vào đầu pipet dùng cho multipipet 5.10 Thiết bị lọc màng, phù hợp với ISO 8199, kể lọc màng có cỡ lỗ danh nghĩa 0,2 để khử khuẩn môi trường lỏng 5.11 Phiến giếng cấy vô khuẩn, 96 giếng cấy, 350 quang m, l, đáy phẳng, không cản ánh sáng huỳnh 5.12 Băng dính vơ khuẩn để bọc kín đĩa cấy microtit 5.13 Đĩa Petri vơ khuẩn, đường kính 90 mm Lấy mẫu Lấy mẫu đưa đến phòng thí nghiệm theo TCVN 6663-1 (ISO 5667-1), TCVN 5992 (ISO 56672) TCVN 6663-3 (ISO 5667-3) Môi trường ni cấy dung dịch pha lỗng 7.1 Hướng dẫn chung Để đảm bảo có kết quả, chuẩn bị mơi trường ni cấy dung dịch pha lỗng, sử dụng thành phần có chất lượng đồng hóa chất phân tích dung dịch pha lỗng loại nước mơi trường hồn chỉnh chuẩn bị theo hướng dẫn nhà sản xuất Chuẩn bị chất với nước cất nước loại khoáng, khơng chứa chất có khả gây ức chế thúc đẩy phát triển vi khuẩn điều kiện thử nghiệm Nếu chưa sử dụng môi trường ngay, lưu giữ mơi trường đến tháng tối (5 ± 3) oC điều kiện tránh thay đổi thành phần chúng CHÚ THÍCH Có thể sử dụng hóa chất có chất lượng khác hóa chất cho tính phép thử 7.2 Dung dịch pha loãng 7.2.1 Dung dịch pha loãng đặc biệt (SD) Muối biển tổng hợp4) 22,5 g Dung dịch bromophenol xanh (tùy chọn) 10 ml Nước loại khoáng nước cất (7.2.2) o 1000 ml o Tiệt trùng nồi hấp (5.1) 121 C ± C 15 đến 20 Dung dịch bromophenol xanh chuẩn bị cách thêm 0,04 g vào 100 ml etanol 50 % Dung dịch dùng để tạo màu xanh cho SD để tránh nhầm lẫn với nước loại khoáng nước cất 7.2.2 Nước loại khoáng nước cất Nước dùng để pha lỗng cần loại khống nước cất khơng chứa chất gây ức chế phát triển điều kiện thử nghiệm Tiệt trùng nồi hấp (5.1) trước dùng 121 oC ± oC 15 đến 20 7.3 Môi trường nuôi cấy: Mơi trường MUD/SF 7.3.1 Thành phần 4) Phân tích điển hình sản phẩm có sẵn thị trường muối biển tổng hợp phù hợp đưa Phụ lục C Dung dịch NaCl tinh khiết không phù hợp chúng có ảnh hưởng ức chế đáng kể 7.3.1.1 Dung dịch A Tryptoza 40 g KH2PO4 10 g D(+)-galactoza 2g 5) Polyoxyetylensorbitan moncoleat (Tween® 80 ) 1,5 ml Nước loại khoáng nước cất (7.2.2) 900 ml Cho tryptoza, KH2PO4, galactoza, Tween® 80 vào 900 ml nước, làm nóng nhẹ khuấy khuấy từ, sau đun sơi đến tan hồn tồn Để nguội 7.3.1.2 Dung dịch B NaHCO3 4g Axit nalidixic 250 mg Nước loại khoáng nước cất (7.2.2) 50 ml Cho hai hóa chất vào 50 ml nước đun nóng nhẹ khuấy khuấy từ Để nguội 7.3.1.3 Dung dịch C Thalium axetat 2g 2,3,5-triphenyltetrazolium clorua 0,1 g Nước loại khoáng nước cất (7.2.2) 50 ml Cho hai hóa chất vào 50 ml nước đun nóng nhẹ khuấy khuấy từ Để nguội 7.3.1.4 Dung dịch D MUD (4-metylbeliferyl- -D-glucosi) N,N-dimetylfomamid 150 mg ml CẢNH BÁO - Talium axetat N,N-dimetylfomamid chất độc Sử dụng hóa chất tủ hút 7.3.2 Chuẩn bị Trộn dung dịch A + B + C + D với Điều chỉnh pH đến 7,5 ± 0,2 Tiệt trùng cách lọc qua màng có cỡ lỗ trung bình 0,2 m (5.10) Phân bổ dung dịch vào đĩa microtit 96 giếng cấy (5.11) với thể tích 100 l mơi trường cho giếng cấy (dung tích giếng cấy tối thiểu 350 l) loại nước tủ sấy kiểu hầm hộp sấy dòng khí (5.3) Sản xuất mơi trường ni cấy cần đáp ứng tiêu chí chất lượng đưa Phụ lục Ε Cách tiến hành 8.1 Lựa chọn số lần pha lỗng 5) Tween® 80 ví dụ sản phẩm phù hợp có sẵn ngồi thị trường Thơng tin đưa tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn mà xác nhận ISO sản phẩm Số lần pha loãng để cấy thay đổi theo mức nhiễm bẩn dự kiến nước thử Bảng đưa số ví dụ Bảng Nguồn gốc mẫu Số lần pha loãng Số giếng cấy/lần pha loãng Giới hạn đo vi khuẩn/ 100 ml Nước bể bơi 64 giếng pha loãng đến 1/2 32 giếng pha loãng đến 1/20 15 đến 3,5 x 104 Nước mặt khác 24 giếng pha loãng đến 1/2 24 giếng pha loãng đến 1/20 24 giếng pha loãng đến 1/200 24 giếng pha loãng đến 1/2 000 40 đến 3,2 x 106 Nước thải nước trạm xử lý nước thải 16 giếng pha loãng đến 1/2 Giếng thứ 17 trở lên pha loãng đến 1/200 000 60 đến 6,7 x 104 8.2 Chuẩn bị pha lỗng CHÚ THÍCH Qui trình phải thực tủ an toàn sinh học pha lỗng hút pipet, sợi khí tạo 8.2.1 Nước nước lợ (thải) [độ muối < 30 g/kg, đo máy đo khúc xạ (5.5) phương pháp tương đương] Chuẩn bị số lượng ống nghiệm vô khuẩn (5.7) tương ứng theo số lần pha loãng chọn, đặt giá, cho ml dung dịch pha loãng đặc biệt (7.2.1) vào ống Khấy nhẹ mẫu (xem điều 6) để thu phân bổ loài vi sinh vật đồng sử dụng pipet vô khuẩn, chuyển ml dung dịch mẫu đồng vào ống thứ có chứa ml dung dịch pha lỗng (7.2.1) (Pha loãng 1/2) Dùng pipet mới, chuyển ml dung dịch (đã đồng nhất) vào ống thứ hai (pha loãng 1/20) Từ ống thứ hai (đã đồng pha loãng 1/20) cần, pha loãng tiếp 1/10 để đạt độ pha loãng 1/200 Tiếp tục tới tất pha loãng chuẩn bị 8.2.2 Nước biển (độ muối 30 g/kg) Chuẩn bị số lượng ống nghiệm vô khuẩn (5.7) đặt lên giá, theo số lần pha loãng chọn, cho ml nước loại khoáng nước cất (7.2.2) vào ống ml dung dịch pha loãng đặc biệt (7.2.1) vào ống khác Khấy nhẹ mẫu (xem điều 6) để thu phân bổ loài vi sinh vật đồng sử dụng pipet vô trùng, chuyển ml dung dịch mẫu đồng vào ống thứ có chứa ml nước cất (7.2.2) (Pha loãng 1/2) Dùng pipet mới, chuyển ml dung dịch (đã đồng nhất) vào ống thứ hai (pha loãng 1/20) Từ ống thứ hai (đã đồng pha loãng 1/20) cần, pha loãng tiếp 1/10 để đạt độ pha loãng 1/200 Tiếp tục tới tất dung dịch pha loãng chuẩn bị 8.3 Nuôi cấy ủ phiến giếng cấy 8.3.1 Ni cấy Chuyển tồn thành phần ống thứ vào đĩa Petri khử khuẩn có đường kính tối thiểu 90 mm Dùng pipet nhiều đầu hút (5.8) với ống chóp khử khuẩn (5.9), phân phối 200 giếng phiến giếng cấy (5.11) tương ứng với pha loãng thứ l vào Các lần pha lỗng sau (1/20, 1/200, …) tiến hành thay đĩa petri đầu ống chóp pipet lần pha lỗng Cách khác, dùng hệ thống phù hợp khác để (5.8) để phân chia 200 pha loãng vào giếng cấy theo bảng l dung dịch CHÚ Ý - Cần ý nhiễm bẩn tràn từ giếng cấy sang giếng cấy khác 8.3.2 Ủ Mỗi lần đem phiến giếng cấy để ủ phải bọc lại băng dính vơ trùng dùng lần dùng cho mục đích ni cấy Ủ phiến giếng cấy (5.2) 44 oC ± 0,5 oC 36 h tối đa 72 h CHÚ THÍCH Phiến giếng cấy cần giữ cẩn thận để không bị nghiêng 8.4 Đọc kết Đặt phiến giếng cấy, kể băng dính, vào buồng quan sát có lắp đèn UV (5.4) Tất giếng quan sát thấy màu xanh huỳnh quang coi dương tính CHÚ THÍCH Việc đọc tiến hành lúc sau 36 h, ánh sáng huỳnh quang khơng làm biến đổi kết theo thời gian Thể kết 9.1 Xác định số lượng đặc tính Đối với lần pha loãng chọn, ghi lại số lượng giếng cấy dương tính (+) VÍ DỤ 1: Nước bể bơi 1/2 32 + 64 1/20 + 32 Ghi 32/5 số lượng đặc tính VÍ DỤ 2: Nước mặt khác 1/2 24 + 24 1/20 18 + 24 1/200 + 24 1/2 000 + 24 Ghi 18/5/1 số lượng đặc tính VÍ DỤ 3: Nước thải 1/2 16 + 16 1/20 16 + 16 1/200 12 + 16 1/2 000 + 16 1/20 000 + 16 1/200 000 + 16 Ghi 12/5/0 số lượng đặc tính Khi ba nhiều dung dịch pha loãng cấy, cần phải ghi lại số lượng đặc tính ba chữ số, kết thúc theo ISO 8199 9.2 Tính tốn MPN khoảng tin cậy chúng MPN ước lượng thống kê mật độ vi sinh vật, coi tương ứng với phân bố Poisson thể tích cấy Khoảng tin cậy kèm với MPN Phần mềm đưa Phụ lục A B tính tốn MPN khuẩn đường ruột mililit nước cấu hình ni cấy khoảng tin cậy 95 % VÍ DỤ 1: Cho CN số đặc tính, LO giới hạn UP giới hạn trên: Nếu CN = 32/5, phần mềm Phụ lục A cho 7,56 khuẩn đường ruột mililit [LO = 5,42 - UP = 10,54], nghĩa 756/100 ml (542 đến 1054) VÍ DỤ 2: Nếu CN = 18/5/1, phần mềm Phụ lục A cho 159,08/ml [LO = 101,99 - UP = 248,11] VÍ DỤ 3: Nếu CN = 12/5/0, phần mềm Phụ lục A cho 724,61/ml [LO = 003,98 - UP = 2962,50] Nếu khơng có giếng cấy cho kết dương tính, thể kết sau: < n/100 ml Trong n MPN giếng cấy dương tính điều kiện pha lỗng dùng 10 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm cần bao gồm tất chi tiết cần thiết để nhận dạng đầy đủ mẫu, viện dẫn đến phương pháp dùng kết Báo cáo thử nghiệm cần đề cập đến tượng đặc biệt quan sát thử nghiệm thao tác không qui định tùy chọn phương pháp mà ảnh hưởng đến kết thử nghiệm 11 Dữ liệu đặc tính phương pháp Thông tin liên quan đến độ lặp lại độ tái lập qui trình, thu từ phép thử liên phòng thí nghiệm đưa Phụ lục D Phụ lục A (tham khảo) Ví dụ phần mềm phân tích thống kê MPN 10 REM************************************************************************** 20 REM GENERAL PURPOSE PROGRAM FOR MPN, ITS S.E., C.I 30 REM AND HOMOGENEITY TEST STATISTICS 40 REM************************************************************************** 50 REM 60 DIM A(10,6),X2(3,9) 70 REM SET PROGRAM LIMITS 80 D9=10 90 U9=50 100 L9=0 110 A1=.0005 120 E1=85 130 REM SET CHI-SQUARED SIGNIFICANCE LEVELS 140 GOSUB 1000 150 REM READ IN RESULTS OF A DILUTION SERIES 160 GOSUB 2000 170 REM CALC AND PRINT THE MPN 180 GOSUB 3000 190 REM CALC AND PRINT S.E OF LOG10(MPN) 200 GOSUB 4000 210 REM CALC AND PRINT 95 PERCENT C.I FOR MPN 220 GOSUB 5000 230 REM CALC AND PRINT DEVIANCE 240 GOSUB 6000 250 STOP 1000 REM SET CHI-SQUARE SIGNIFICANCE LEVELS 1010 FOR I=1 TO 1020 FOR J=1 TO 1030 READ X2(I.J) 1040 NEXT J 1050 NEXT I 1060 REM PERCENT LEVELS DF=1…9 1070 DATA 3.84, 5.99, 7.81, 9.49, 11.07 1080 DATA 12.59, 14.07, 15.51, 16.92 1090 REM PERCENT LEVELS 1100 DATA 6.63, 9.21, 11.34, 13.28, 15.09 1110 DATA 16.81, 18.48, 20.09, 21.67 1120 REM PERCENT LEVELS 1130 DATA 10.83, 13.81, 16.27, 18.47, 20.52 1140 DATA 22.46, 24.32, 26.12, 27.88 1150 RETURN 2000 REM READ IN RESULTS OF A DILUTION SERIES 2010 PRINT "MPN GENERAL PURPOSE PROGRAM" 2020 PRINT "*******************************************" 2030 PRINT " " 2040 PRINT "M.A HURLEY AND M.E ROSCOE" 2050 PRINT " " 2060 PRINT "NUMBER OF DILUTION LEVELS……K=": 2070 INPUT N 2080 IF N