Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5150:1990 về Thịt và sản phẩm thịt - Phương pháp xác định dư lượng hoocmôn thyroxin quy định phương pháp xác định hoócmôn thyroxin tồn dư trong thịt và sản phẩm của thịt dùng làm thực phẩm cho người và thức ăn gia súc.
TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 5150:1990 THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT Phương pháp xác định dư lượng hoocmôn thyroxin Meat and meat products Determination of thyroxin residues Tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định hcmơn thyroxin tồn dư thịt sản phẩm thịt dùng làm thực phẩm cho người thức ăn gia súc ĐẶC TÍNH CHUNG Thyroxin tên hóa học 3,3,5,5-Tetra-Iodo-Tyroxin loại hcmơn Trong thực phẩm (chủ yếu thịt động vật) có chứa hàm lượng nhỏ chất (thường từ cỡ namơ-gam đến micrơgam) Để phân tích định lượng, trước hết phải chiết khỏi mẫu, sau xác định phương pháp phân tích có độ nhạy cao Ngày để xác định thyroxin, người ta thường dùng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) NGUYÊN TẮC Sau xử lý mẫu, thyroxin chiết vào dung dịch đệm phù hợp Thí dụ đệm xitrát - phốtphat Lấy phần dung dịch bơm vào hệ HPLC với chất nhồi (pha tĩnh) nhựa RP - 8, RP - 18 hay Hypersil CDS Khi đó, thyroxin bị hấp thụ chất nhồi cột sắc ký Để tách phân tích thyroxin, người ta rửa giải hỗn hợp dung mơi (pha động) gồm MeOH/H 2O với tỷ lệ 65/35 có thêm chất đệm chất phụ gia axit propylic Thyroxin khỏi cột sắc ký phát dêtếcto UV sóng 240 nm nồng độ xác định theo phương pháp đường chuẩn LẤY MẪU Theo TCVN 4833-89 (ST SEV 2433 - 80) DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 4.1 Dụng cụ, thiết bị: + Hệ máy HPLC với detector UV + Máy li tâm + Máy lắc + Phễu, chiết cỡ 250 ml + Bình định mức loại + Pipét loại + Cốc chịu nhiệt + Cột sắc ký loại 250 x 3,2 mm + Một vài dụng cụ khác 4.2 Hóa chất: dùng loại tinh khiết cho HPLC + Chất nhồi cột RP - hay RP - 18 cỡ Ø = - Mm + Đệm xitrát - phốt phát pH - 6,4 + Natrihydro cacbonat (NaHCO3), dung dịch 0,1 M + Thuốc thử Methanolic + Trifluoro axetic axit + Methanol (CH3OH) + Nước cất lần + Dung dịch gốc tiêu chuẩn thyroxin nồng độ mg/ml CHUẨN BỊ THỬ 5.1 Chuẩn bị mẫu phân tích: Mẫu thịt cần phân tích thái nhỏ, nghiền mịn, trộn cân lượng 10g cho vào bình nón Thêm 15 ml dung dịch đệm xitrát - phốtphat pH = Đậy nút lại lắc kỹ 30 phút Lọc hay li tâm lấy dung dịch Thêm ml natrihydrocácbonat 0,1M 2ml thuốc thử methanolic, lắc kỹ để chậu nước đá 30 phút Sau làm bay đến cạn 30 350C Thêm 0,5 ml trifluoro axetic axit, lắc nhẹ để nhiệt độ phòng 30 phút Sau trung hòa - ml natrihydrocácbonát, dung dịch 1M Ly tâm lấy kết tủa, hòa tan kết tủa hỗn hợp methanol/natrihydrocácbonát 0,1M với tỷ lệ 1/1 (về thể tích) định mức nước cất đến 10 ml sau ly tâm lấy dung dịch bơm vào cột sắc ký để phân tích thyroxin 5.2 Pha dãy dung dịch chuẩn: Dùng dung dịch gốc tiêu chuẩn thyroxin nồng độ mg/ml, tính lấy lượng phù hợp để pha định mức nước cất đến 25 ml cho nồng độ thyroxin bình định mức - - - - 10 - 12 Mg/ml 5.3 Mẫu trắng: Mẫu trắng phải chuẩn bị điều kiện mẫu phân tích khơng có mẫu phân tích, phải tiến hành làm đồng thời với mẫu phân tích 5.4 Các điều kiện thực nghiệm: + Hệ thống HPLC với đêtếcto UV sóng đo 240 nm + Cột tách HPLC: 250 x 3,2 mm nhồi nhựa RP - 18 có cỡ hạt - Mm Ø + Máy ghi píc sắc ký (recorder) ghi 10 - 20 mV tốc độ giấy - 10 mm/phút + Pha động: methanol/dung dịch đệm xitrát - phốtphát pH - tỷ lệ 60/40 (về thể tích) + Tốc độ pha động: ml/phút + Lượng mẫu bơm vào cột: 50 Ml/1 lần thí nghiệm + Nhiệt độ thí nghiệm 250C + Các điều kiện khác chọn phù hợp với hệ HPLC TIẾN HÀNH THỬ + Đặt thông số chọn mục 5.4 cho máy HPLC + Đặt máy chạy, bơm pha động để ổn định cột cách đường Khi đường thẳng + Bơm mẫu chuẩn, mẫu trắng đến mẫu phân tích (mỗi mẫu bơm lần lấy giá trị trung bình) vào cột tách ghi píc sắc ký tương ứng + Hiệu chỉnh giá trị mẫu trắng (nếu có) + Dựng đường chuẩn theo hệ tọa độ H - C Trong H chiều cao píc sắc ký tương ứng với nồng độ C mẫu chuẩn + Xác định nồng độ Cx mẫu phân tích theo đường chuẩn TÍNH KẾT QUẢ Hàm lượng thyroxin, tính dlg/g, mẫu phân tích tính theo cơng thức sau: Co = (Cx V) / a Trong đó: a lượng mẫu thịt để phân tích (10g) định mức thể tích V ml Theo mục 5.1 V = 10ml Cx nồng độ thyroxin dung dịch phân tích tìm qua đường chuẩn ...+ Nước cất lần + Dung dịch gốc tiêu chuẩn thyroxin nồng độ mg/ml CHUẨN BỊ THỬ 5.1 Chuẩn bị mẫu phân tích: Mẫu thịt cần phân tích thái nhỏ, nghiền mịn, trộn... tâm lấy dung dịch bơm vào cột sắc ký để phân tích thyroxin 5.2 Pha dãy dung dịch chuẩn: Dùng dung dịch gốc tiêu chuẩn thyroxin nồng độ mg/ml, tính lấy lượng phù hợp để pha định mức nước cất đến... thẳng + Bơm mẫu chuẩn, mẫu trắng đến mẫu phân tích (mỗi mẫu bơm lần lấy giá trị trung bình) vào cột tách ghi píc sắc ký tương ứng + Hiệu chỉnh giá trị mẫu trắng (nếu có) + Dựng đường chuẩn theo hệ