Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 7906:2008 quy định phương pháp định lượng vi khuẩn axit lactic ưa nhiệt trung bình bằng cách đếm các khuẩn lạc phát triển trong môi trường đặc sau khi ủ 3 ngày ở 30oC. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 7906:2008 ISO 15214:1998 VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI – PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI KHUẨN AXIT LACTIC ƯA NHIỆT TRUNG BÌNH – KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Ở 30 oC Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the enumeration of mesophilic lactic acid bacteria – Colony-count technique at 30 oC Lời nói đầu TCVN 7906:2008 hoàn toàn tương đương với ISO 15214:1998; TCVN 7928:2008 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Cơng nghệ cơng bố Lời giới thiệu Do tính đa dạng thực phẩm thức ăn chăn nuôi nên phương pháp khơng thích hợp đến chi tiết cho sản phẩm cụ thể Trong trường hợp này, sử dụng phương pháp khác đặc trưng cho sản phẩm, hoàn toàn lý kỹ thuật Tuy nhiên, cần cố gắng áp dụng phương pháp Khi tiêu chuẩn sốt xét cần phải tính đến thông tin liên quan đến phạm vi mà phương pháp đếm đĩa phải tuân theo nguyên nhân gây sai lệch so với phương pháp trường hợp sản phẩm cụ thể Việc hài hòa phương pháp thử khơng thực vài nhóm sản phẩm cụ thể tồn tiêu chuẩn quốc tế và/hoặc tiêu chuẩn quốc gia mà không phù hợp với tiêu chuẩn Trong trường hợp có sẵn tiêu chuẩn quốc tế cho sản phẩm cần thử nghiệm phải tn theo tiêu chuẩn Thơng thường, tiêu chuẩn sốt xét, chúng phải sửa đổi để phù hợp với tiêu chuẩn này, cho cuối sai lệch với phương pháp đếm đĩa lý kỹ thuật thừa nhận VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI KHUẨN AXIT LACTIC ƯA NHIỆT TRUNG BÌNH – KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Ở 30 OC Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the enumeration of mesophilic lactic acid bacteria – Colony-count technique at 30 oC Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp định lượng vi khuẩn axit lactic ưa nhiệt trung bình cách đếm khuẩn lạc phát triển môi trường đặc sau ủ ngày 30 oC CHÚ THÍCH Đối với số loại thực phẩm, có số vi khuẩn axit lactic ưa nhiệt ưa lạnh nhiệt độ ni cấy phải khác với 30 oC Tuy nhiên, tất vi khuẩn axit lactic mọc thạch MRS pH 5,7 số mọc yếu Các hạn chế phương pháp nêu lời giới thiệu thích trên, tiêu chuẩn áp dụng cho sản phẩm thực phẩm thức ăn chăn nuôi Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Yêu cầu chung hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật TCVN 6507–1 (ISO 6887-1), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, dung dịch huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật – Phần 1: Các nguyên tắc chung để chuẩn bị huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau đây: 3.1 Vi khuẩn axit lactic ưa nhiệt trung bình (mesophilic lactic acid bacteria) Vi sinh vật tạo thành khuẩn lạc môi trường chọn lọc đặc 30 oC (MRS pH 5,7), điều kiện thử nghiệm quy định tiêu chuẩn Nguyên tắc 4.1 Chuẩn bị hai đĩa Petri chứa thạch MRS pH 5,7 Cấy lên bề mặt 2) đổ đĩa lượng xác định mẫu thử sản phẩm ban đầu dạng lỏng lượng xác định huyền phù ban đầu sản phẩm dạng khác 4.2 Cấy cặp đĩa khác, sử dụng dinh dịch pha loãng thập phân mẫu thử huyền phù ban đầu, điều kiện Ủ đĩa 30 oC 72 h 4.3 Tính số vi khuẩn axit lactic ưa nhiệt trung bình (3.1) gam mililit mẫu thử từ số khuẩn lạc thu 4.2 đĩa chọn khẳng định 3) Dịch pha loãng môi trường cấy 5.1 Yêu cầu chung Về thực hành phòng thử nghiệm, xem TCVN 6404 (ISO 7218) 5.2 Dịch pha lỗng Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) CHÚ THÍCH Khơng phải lúc nước đệm pepton cho phép phục hồi hết vi khuẩn axit lactic (xem Phu lục A, [1], [2], [3]) 5.3 Môi trường nuôi cấy: môi trường MRS (de Man, Rogosa Sharpe) pH 5,7 (xem [4]) CHÚ THÍCH Có thể sử dụng mơi trường có bán sẵn Tuy nhiên, ý dao động thành phần pH xuất sản phẩm nhà sản xuất khác nhau, cho kết khác với kết thu sử dụng môi trường quy định tiêu chuẩn 5.3.1 Thành phần 2) Xem thích 9.2 3) Xem thích 9.3 Sản phẩm thủy phân casein enzyme 10,0 g Dịch chiết thịt 10,0 g Dịch chiết nấm men 4,0 g Triamoni xitrat [(NH4)3C6H5O7] 2,0 g Natri axetat (CH3COONa) 5,0 g Magie sulfat ngậm bảy phân tử nước (MgSO4.7H2O) 0,2 g Mangan sulfat ngậm bốn phân tử nước (MnSO4.4H2O) 0,05 g Dikali hydro phosphat (K2HPO4) 2,0 g Glucoza (C6H12O6) 20,0 g Polyoxyetylensorbitan monooleat (Tween 80) 1,08 g Thạch 12 g đến 18 g 1) Nước 000 ml 1) Tùy thuộc vào sức đông thạch 5.3.2 Chuẩn bị 5.3.2.1 Hòa tan thành phần mơi trường hồn chỉnh khơ nước cách đun sôi Sử dụng máy đo pH (6.7) để đo, chỉnh pH cho sau khử trùng, pH 5,7 ± 0,1 4) 25 oC Chuyển môi trường vào chai có dung tích thích hợp Khử trùng 15 nồi hấp áp lực (6.1) 121 oC Nếu mơi trường sử dụng làm nguội nồi thủy (6.5) đến nhiệt độ khoảng 47 oC kỹ thuật khác mà cho kết tương tự, xem TCVN 6404 (ISO 7218) Nếu khơng sử dụng ngay, để tránh chậm trễ rót mơi trường trước kiểm tra vi sinh, làm tan chảy hồn tồn mơi trường nồi cách thủy đun sôi (6.6), làm nguội nồi cách thủy (6.5) đến nhiệt độ khoảng 47 oC 5.3.2.2 Nếu có nguy nhiễm nấm men (ví dụ xúc xích khơ), bổ sung axit sorbic vào mơi trường thạch MRS sau: Hòa tan 1,4 g axit sorbic khoảng 10 ml dung dịch natri hydroxit mol/l Lọc để khử trùng Cho dung dịch vào 1000 ml thạch MRS khử trùng làm nguội đến 47 oC Độ pH cuối môi trường phải 5,7 ± 0,1 25 oC Thiết bị, dụng cụ thủy tinh Sử dụng thiết bị thơng thường phòng thử nghiệm vi sinh [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] cụ thể sau: 6.1 Thiết bị khử trùng khô (tủ sấy) thiết bị khử trùng ướt (nồi hấp áp lực) Xem TCVN 6404 (ISO 7218) 6.2 Tủ ấm, có khả trì nhiệt độ 60 oC ± oC 6.3 Đĩa Petri, chất dẻo thủy tinh, đường kính từ 90 mm đến 100 mm 6.4 Pipet chia độ xả hết, dung tích danh định 10 ml ml, chia vạch tương ứng 0,5 ml 0,1 ml 4) Để giá trị pH thấp 5,6 dung sai ± 0,1 thay ± 0,2 thơng thường 6.5 Nồi cách thủy, thiết bị tương tự, có khả trì nhiệt độ 47 oC ± oC 6.6 Nồi cách thủy đun sôi 6.7 Máy đo pH, đọc xác đến 0,01 đơn vị pH 25 oC, đo xác đến ± 0,1 đơn vị pH Lấy mẫu Việc lấy mẫu không quy định tiêu chuẩn Nên lấy mẫu theo thiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm Nếu khơng có tiêu chuẩn riêng lấy mẫu sản phẩm có liên quan bên tự thỏa thuận vấn đề Điều quan trọng mẫu gủi đến phòng thử nghiệm phải mẫu đại diện không bị hư hỏng bị biến đổi suốt trình vận chuyển bảo quản [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn cụ thể thích hợp với sản phẩm có liên quan Nếu khơng có tiêu chuẩn cụ thể bên có liên quan nên thỏa thuận với vấn đề Cách tiến hành 9.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng Chuẩn bị huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng, theo TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) 9.2 Cấy ủ CHÚ THÍCH Cấy lên bề mặt kết hợp với việc ủ điều kiện kỵ khí vi hiếu khí sử dụng thay cho quy trình đổ đĩa mơ tả Có thể sử dụng bình nến để có điều kiện thích hợp CHÚ THÍCH Cũng sử dụng mơi trường MRS hai lớp 9.2.1 Lấy hai đĩa Petri vô trùng (6.3) Dùng pipet vô trùng (6.4) chuyển sang đĩa ml mẫy thử sản phẩm dạng lỏng ml huyền phù ban đầu sản phẩm dạng khác Lấy tiếp hai đĩa Petri vô trùng khác Dung pipet vô trùng chuyển sang đĩa ml dung dich pha loãng thập phân thứ mẫu thử sản phẩm dạng lỏng ml dung dịch pha loãng thập phân thứ huyền phù ban đầu sản phẩm dạng khác Lặp lại quy trình với dung dịch pha lỗng tiếp theo, sử dụng pipet vơ trùng cho dung dịch pha lỗng thập phân CHÚ THÍCH Nếu dự đốn có số lượng vi khuẩn axit lactic cao cấy dung dịch pha lỗng cần thiết để định lượng theo trường hợp chung (xem 10.1) 9.2.2 Rót vào đĩa Petri khoảng 15 ml môi trường MRS (5.3) chuẩn bị làm nguội đến 47 oC nồi cách thủy (6.5) Trộn kỹ dịch cấy với môi trường để yên cho hỗn hợp đông đặc 9.2.3 Lật úp đĩa thạch chuẩn bị xong ủ tủ ấm (6.2) để 30 oC 72 h ± h Tránh làm khô thạch trình ủ cho mơi trường khơng trở nên q bị ức chế 9.3 Đếm khuẩn lạc Sau thời gian ủ quy định (xem 9.2.3), đếm khuẩn lạc đĩa (xem thích thích 2) Giữ lại đĩa 300 khuẩn lạc đĩa chứa nhiều 15 khuẩn lạc hai độ pha lỗng liên tiếp CHÚ THÍCH Một số Leuconostoc spp sinh lượng lớn khuẩn lạc lớn mà cản trở việc phát triển khuẩn lạc khác làm cho định lượng khơng xác số lượng vi khuẩn axit lactic CHÚ THÍCH Do khả phát triển vi sinh vật khác khác với vi khuẩn axit lactic môi trường MRS mô tả 9.2, mà số trường hợp cần phải khẳng định khuẩn lạc thu đucợ 9.2 kỹ thuật đơn giản (như nhuộm Gram phép thử catalaza) Nếu sử dụng quy trình cần phải nêu báo cáo thử nghiệm 10 Tính tốn biểu thị kết 10.1 Trường hợp chung Tính số lượng vi khuẩn axit lactic chịu nhiệt trung bình, N, có mẫu thử trung bình hai độ pha lỗng liên tiếp, theo cơng thức sau đây: N= tổng số khuẩn lạc đếm tất đĩa hai độ pha lỗng liên tiếp, đĩa chứa 15 khuẩn lạc; V thể tích dịch cấy đĩa, tính mililit; n1 số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ nhất; n2 số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ hai; d hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ giữ lại Làm tròn kết đến hai chữ số có nghĩa [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] Lấy kết số lượng vi khuẩn axit lactic ưa nhiệt trung bình mililit (đối với sản phẩm dạng lỏng) gam (sản phẩm dạng khác), biểu thị theo số từ 1,0 đến 9,9 nhân với lũy thừa 10 VÍ DỤ N= = = = 19182 Làm tròn kết đến hai chữ số có nghĩa ta có 19000 1,9 × 10 vi khuẩn axit lactic ưa nhiệt trung bình gam sản phẩm 10.2 Ước tính số lượng thấp 10.2.1 Nếu có hai đĩa mẫu thử (sản phẩm dạng lỏng) mức pha loãng huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) chứa 15 khuẩn lạc, tính giá trị trung bình, y, khuẩn lạc đếm hai đĩa Biểu thị kết sau: - sản phẩm dạng lỏng: số ước tính vi khuẩn axit lactic ưa nhiệt trung bình mililit NE = y; - sản phẩm dạng khác: số ước tính vi khuẩn axit lactic ửa nhiệt trung bình gam NE = y/d d hệ số pha loãng huyền phù ban đầu 10.2.2 Nếu có hai đĩa mẫu thử (sản phẩm dạng lỏng) mức pha loãng huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) không chứa khuẩn lạc biểu thị kết sau: - vi khuẩn axit lactic ưa nhiệt trung bình mililit (sản phẩm dạng lỏng); - 1/d vi khuẩn axit lactic ưa nhiệt trung bình gam (sản phẩm dạng khác) d hệ số pha lỗng huyền phù ban đầu 11 Giới hạn tin cậy Để tính khoảng tin cậy, xem TCVN 6404 (ISO 7218) 12 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: - thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; - phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; - phương pháp thử sử dụng viện dẫn tiêu chuẩn này; - tất chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn này, với chi tiết bất thường khác ảnh hưởng tới kết quả; - kết thử nghiệm thu được; - độ lặp lại kiểm tra nêu kết cuối thu THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] HARTMAN, P.A and HUNTSBERGER, D.V Influence of subtle differences in planting procedure on bacterial counts of prepared frozen foods J [2] YAY-WILLIAMS, D.J Report of discussion on the effect of the diluent on the recovery of bacteria J Appl Bacterol., 26, 1963, p 398 [3] KING, W.L., and HURT, A.A note on the survival of some bacteria in the different diluents J.Appl Bacterol., 26, 1963, p 504 [4] Pharmacopoeia of Culture media of Foof Microbiology: de De Man, Rogosa and Sharpe agar with sorbic acid (MRS-S agar) Int.J.Food Microbiol., 5, 1987, pp 230-232 ... trình vận chuyển bảo quản [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn cụ thể thích hợp với sản phẩm có liên quan Nếu khơng có tiêu chuẩn cụ thể bên có liên quan... ± 0,1 đơn vị pH Lấy mẫu Việc lấy mẫu không quy định tiêu chuẩn Nên lấy mẫu theo thiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm Nếu khơng có tiêu chuẩn riêng lấy mẫu sản phẩm có liên quan bên tự thỏa... phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; - phương pháp thử sử dụng viện dẫn tiêu chuẩn này; - tất chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn này, với chi tiết bất thường khác ảnh hưởng tới kết quả; - kết