Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 5162:2008 qui định phương pháp xác định vitamin B1 trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Hàm lượng vitamin B1 là khối lượng thiamin tổng số bao gồm các dẫn xuất đã tách phospho.
TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 5162 : 2008 THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH VITAMIN B1 BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Foodstuffs – Determination fo vitamin B1 by high performance liquid chromatography (HPLC) CẢNH BÁO – Khi áp dụng tiêu chuẩn cần phải sử dụng vật liệu, thiết bị thao tác nguy hiểm Tiêu chuẩn không đề cập đến vấn đề an toàn sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập thao tác an tồn thích hợp xác định khả áp dụng giới hạn qui định trước sử dụng tiêu chuẩn Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp xác định vitamin B thực phẩm sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Hàm lượng vitamin B1 khối lượng thiamin tổng số bao gồm dẫn xuất tách phospho Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích phòng thí nghiệm u cầu kỹ thuật phương pháp thử Nguyên tắc Thiamin chiết khỏi thực phẩm sau thủy phân axit tách phospho sử dụng cách xử lý enzym định lượng HPLC có dẫn xuất sau cột trước cột với thiocrom [1] đến [6] Thuốc thử 4.1 Yêu cầu chung Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích sử dụng nước cất nước loại TCVN 4851 : 1989 (ISO 3696:1987) nước cất hai lần, trừ có qui định khác 4.2 Hóa chất dung dịch 4.2.1 Metanol, loại dùng cho HPLC, w(CH3OH) ≥ 99,8 % (khối lượng) 4.2.2 Dung dịch axit acetic, c(CH3COOH) = 0,02 mol/l 4.2.3 Isobutanol, w(C4H10O) ≥ 98 % 4.2.4 Natri dihydro phosphat, w(NaH2PO4) ≥ 99,8 % 4.2.5 Axit clohydric, w(HCl) = 36 % 4.2.6 Axit clohydric, c(HCl) = 0,1 mol/l 4.2.7 Axit sulfuric, c(H2SO4) = 0,05 mol/l 4.2.8 Natri hydroxit, w(NaOH) ≥ 99 % 4.2.9 Dung dịch natri hydroxit, nồng độ khối lượng p(NaOH) = 150 g/l 4.2.10 Dung dịch natri hydroxit, p(NaOH) = 200 g/l 4.2.11 Kali hexaxyanoferat III, w{K3[Fe(CN)6]} ≥ 99 % 4.2.12 Dung dịch kali hexaxyanoferat III, p{K3[Fe(CN)6]} = 10 g/l 4.2.13 Dung dịch kali hexaxyanoferat III kiềm (dẫn xuất trước cột), p{K3[Fe(CN)6]} = 0,4 g/l Pha loãng 2,0 ml dung dịch hexaxyanoferat (4.2.12) dung dịch natri hydroxit (4.2.9) đến 50 ml Chuẩn bị dung dịch ngày phân tích 4.2.14 Dung dịch kali hexaxyanoferat III kiềm (dẫn xuất sau cột), p{K3[Fe(CN)6]} = 0,5 g/l Pha loãng 2,5 ml dung dịch hexaxyanoferat (4.2.12) dung dịch natri hydroxit (4.2.10) đến 50 ml 4.2.15 Enzym tách phospho, có khả thủy phân thiamin liên kết từ thực phẩm CHÚ THÍCH: Taka-Diataza1) sử dụng để xác định liệu độ chụm 4.2.16 Dung dịch natri axetat, c(CH3COONa.3H2O) = 2,5 mol/l 4.2.17 Dung dịch natri axetat, c(CH3COONa.3H2O) = 0,5 mol/l 4.2.18 Pha động HPLC Các ví dụ hỗn hợp thích hợp với phần thể tích ví dụ từ 10 % đến 50 % metanol (4.2.1) nước sử dụng phosphat dung dịch đệm axetat nêu Phụ lục C Khả sử dụng tác nhân kết cặp ion nêu Phụ lục C 4.2.19 Dung dịch đệm phosphat (pH = 3,5), c(KH2PO4) = 9,0 mmol/l 4.2.20 Tetraetylamoniclorua, w(C8H20NCl) ≥ 98% 4.2.21 Natri heptansulfonat, w(C7H15NaO3S) ≥ 98% 4.2.22 Dung dịch đệm axatat (pH = 4,0), c(CH3COOH) = 50 mmol/l 4.3 Chất chuẩn 4.3.1 Yêu cầu chung Thiamin clorua hydroclorua lấy từ nhiều nhà cung cấp Độ tinh khiết chất chuẩn thiamin khác nhau, cần phải xác định nồng độ dung dịch hiệu chuẩn đo phổ UV (xem 4.4.4) 4.3.2 Thiamin clorua hydroclorua, w(C12H17CIN4OS.HCl) ≥ 99% 4.3.3 Thiamin monophosphat clorua, w(C12H17CIN4O4PS) ≥ 98% 4.3.4 Thiamin pyrophosphat clorua (cocarboxylaza), w(C12H19CIN4O7P2S) ≥ 98% 4.4 Dung dịch gốc 4.4.1 Thiamin clorua hydroclorua, p(C12H17CIN4OS.HCl) ≈ 0,1 mg/ml Hòa tan lượng xác chất chuẩn thiamin clorua hydroclorua (4.3.2) thể tích xác định dung mơi thích hợp, ví dụ 10 mg chất chuẩn vitamin B 100 ml axit clohydric (4.2.6) Dung dịch ổn định bốn tuần nhiệt độ +4 oC 4.4.2 Thiamin monophosphat, p(C12H17CIN4O4PS) ≈ 0,1 mg/ml Hòa tan lượng xác chất chuẩn monophosphat (4.3.3) thể tích xác định dung mơi thích hợp, ví dụ 10 mg chất chuẩn monophosphat 100 ml axit clohydric (4.2.6) Dung dịch ổn định bốn tuần nhiệt độ - 20 oC 4.4.3 Thiamin pyrophosphat p(C12H19CIN4O7P2S) ≈ 0,1 mg/ml Hòa tan lượng xác chất chuẩn pyrophosphat (4.3.4) thể tích xác định dung mơi thích hợp, ví dụ 10 mg chất chuẩn pyrophosphat 100 ml axit clohydric (4.2.6) 1) Taka-Diastase Nr T00040 tên thương mại sản phẩm cung cấp Pfaltz & Bauer, Waterbury, CT 06708, Mỹ Thông tin đưa tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn CEN không ấn định phải sử dụng chúng Có thể sử dụng sản phẩm tương tự cho kết tương đương 4.4.4 Kiểm tra nồng độ Pha loãng 10 ml dung dịch gốc thiamin clorua hydroclorua (4.4.1) dung dịch axit clohydric (4.2.6) bình định mức 100 ml đến vạch Đo độ hấp thụ dung dịch bước sóng 247 nm cuvet cm dựa vào dung dịch axit clohydric (4.2.6) cuvet đối chứng sử dụng máy đo phổ UV (5.2) Tính nồng độ khối lượng, p, microgram mililit dung dịch gốc, sử dụng công thức (1): ε 10 10 P = 247 (1) 421 ε 247 giá trị hấp thụ dung dịch bước sóng cực đại khoảng 247 nm; 1% 421 hệ số hấp thụ A1cm thiamin clorua hydroclorua axit clohydric 0,1 mol/l (xem [7]); 10 hệ số pha loãng 4.5 Dung dịch chuẩn 4.5.1 Thiamin clorua hydroclorua, p(C12H17CIN4OS.HCl) ≈ 0,1 μg/ml đến 10 μg/ml Dùng pipet lấy từ ml đến 10 ml dung dịch gốc thiamin clorua hydroclorua (4.4.1) cho vào bình định mức 100 ml pha lỗng đến vạch dung mơi thích hợp, ví dụ axit clohydric (4.2.6) Dung dịch ổn định tháng nhiệt độ oC, nơi tối 4.5.2 Thiamin monophosphat, p(C12H17CIN4O4PS) ≈ 0,1 μg/ml đến 10 μg/ml Dùng pipet lấy từ ml đến 10 ml dung dịch gốc monophosphat (4.4.2) cho vào bình định mức 100 ml pha lỗng đến vạch dung mơi thích hợp, ví dụ axit clohydric (4.2.6) Dung dịch ổn định tháng nhiệt độ oC nơi tối 4.5.3 Thiamin pyrophosphat p(C12H19CIN4O7P2S) ≈ 0,1 μg/ml đến 10 μg/ml Dùng pipet lấy từ ml đến 10 ml dung dịch gốc pyrophosphat (4.4.2) cho vào bình định mức 100 ml pha lỗng đến vạch dung mơi thích hợp, ví dụ axit clohydric (4.2.6) Dung dịch ổn định tháng nhiệt độ oC nơi tối Thiết bị, dụng cụ 5.1 Yêu cầu chung Sử dụng thiết bị phòng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau: 5.2 Máy đo phổ UV Có thể đo độ hấp thụ bước sóng xác định 5.3 Thiết bị hấp áp lực làm nóng Dùng thiết bị áp lực cho mục đích tách chiết, ví dụ kiểu nồi hấp áp lực, có phận ghi nhiệt độ áp suất, phận đốt nóng điện nồi cách thủy 5.4 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Gồm có bơm, phận bơm mẫu, detector huỳnh quang có bước sóng phát xạ kích thích cài đặt, ví dụ 420 nm 366 nm, tương ứng (xem Phụ lục C) hệ thống đánh tích phân 5.5 Cột HPLC 5.5.1 Yêu cầu chung Có thể sử dụng cột cỡ hạt có kích cỡ khác với quy định tiêu chuẩn Các thông số riêng cần phù hợp với vật liệu sử dụng để đảm bảo kết tương đương Chuẩn mực thực cột phân tích thích hợp độ phân giải đường chất phân tích có liên quan2) 5.5.2 Ơxy hóa trước cột Cột phân tích, ví dụ Lichropher® 60 RP Select B 2), cỡ hạt μm , đường kính từ 4,0 mm đến 4,6 mm, dài từ 100 mm đến 250 mm 2) Cột sillica bao gói vật liệu thích hợp có bán sẵn Lichrosorb ® Si 60, Spherisorb® Si, Hypersil® Si Lichrospher® 100 DIOL Các cột RP bao gói vật liệu thích hợp Spherisorb ® ODS, μ Bondapak® radial C18, Supelco® LC-18-DB Hypersil® ODS Thơng tin đưa tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn CEN không ấn định phải sử dụng chúng ... mmol/l 4.3 Chất chuẩn 4.3.1 Yêu cầu chung Thiamin clorua hydroclorua lấy từ nhiều nhà cung cấp Độ tinh khiết chất chuẩn thiamin khác nhau, cần phải xác định nồng độ dung dịch hiệu chuẩn đo phổ UV... thể sử dụng cột cỡ hạt có kích cỡ khác với quy định tiêu chuẩn Các thông số riêng cần phù hợp với vật liệu sử dụng để đảm bảo kết tương đương Chuẩn mực thực cột phân tích thích hợp độ phân giải... monophosphat, p(C12H17CIN4O4PS) ≈ 0,1 mg/ml Hòa tan lượng xác chất chuẩn monophosphat (4.3.3) thể tích xác định dung mơi thích hợp, ví dụ 10 mg chất chuẩn monophosphat 100 ml axit clohydric (4.2.6) Dung dịch