Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8737:2011 giới thiệu về thuốc thú y - phương pháp định lượng số bào tử Lactobacillus. Mời các bạn cùng tham khảo để nắm bắt nội dung của tiêu chuẩn này.
TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8737:2011 Xuất lần THUỐC THÚ Y – PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG SỐ BÀO TỬ LACTOBACILLUS Veterinary drugs – Method for enumeration spores of Lactobacillus HÀ NỘI – 2011 TCVN 8737:2011 Lời nói ñầu TCVN 8737:2011 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm ñịnh, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN 8737:2011 TCVN 8737:2011 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8737:2011 Thuốc thú y – Phương pháp ñịnh lượng số bào tử Lactobacillus Veterinary drugs – Method for enumeration spores of Lactobacillus Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy ñịnh phương pháp ñếm tổng số vi khuẩn Lactobacillus gồm: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus lactic, Lactobacillus plantarum, loại chế phẩm sinh học dùng thú y Nguyên tắc Phương pháp dựa việc nuôi cấy lượng sản phẩm định mẫu pha lỗng môi trường thạch, nuôi dưỡng mẫu cấy ở 37 0C ± 0C ngày, đếm khuẩn lạc điển hình tính số lượng chúng g (cm3) môi trường thạch chọn lọc Trên mơi trường đặc, vi sinh vật bào tử ñứng riêng phát triển thành khuẩn lạc Đếm số khuẩn lạc tính số lượng vi sinh vật ñơn vị thể tích dịch nghiên cứu Ưu điểm phương pháp không phát nhầm vi sinh vật chết mảnh xác hữu Môi trường thuốc thử 3.1 Môi trường thạch MRS, pH 5,7 ± 0,2, có thành phần sau: Pepton 10,0 g Chất chiết thịt 10,0 g Chất chiết nấm men 4,0 g Glucose 20,0 g Dinatri hydro phosphat 2,0 g Tween 80 1,0 g TCVN 8737:2011 Diamoni hydro xitrat 2,0 g Natri axetat 5,0 g Magie sulfat 0,2 g Mangan sulfat 0,04 g Thạch 14 g Nước cất 1000 ml 3.2 Natri clorua 3.3 Kali dihydro phosphat 3.4 Dinatri hydro phosphat 3.5 Bromocresol tía 3.6 Thạch 3.7 Cồn 3.8 Bộ thuốc nhuộm Gram 3.9 Nước cất 3.10 Natri hydroxit (NaOH) 3.11 Axit clohydric (HCl) Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường cụ thể sau: 4.1 Tủ cấy vi sinh vật 4.2 Nồi hấp áp lực 4.3 Tủ ấm CO2, trì nhiệt ñộ 37 oC 4.4 Tủ lạnh 4.5 Máy lắc 4.6 Máy ñếm khuẩn lạc TCVN 8737:2011 4.7 Máy đo pH 4.8 Cân phân tích, có khả cân xác đến 0,1 mg 4.9 Kính hiển vi quang học 4.10 Lò vi sóng 4.11 Bể điều nhiệt, trì nhiệt độ 45 0C ± 0C 80 oC 4.12 Bình định mức, dung tích 1000 ml (loại A) 4.13 Bình nón 4.14 Ống nghiệm 4.15 Pipet, dung tích ml 10 ml 4.16 Ống đong, dung tích 100 ml 250 ml 4.17 Micropipet, dung tích 1000 µl 4.18 Bơng khơng thấm nước 4.19 Đĩa Petri Lấy mẫu bảo quản mẫu 5.1 Yêu cầu chung Lấy mẫu theo nguyên tắc ngẫu nhiên Lượng thuốc mẫu phân tích mẫu lưu phải đủ cho ba lần phân tích phải đủ để thực phép thử ñảm bảo thu ñược kết xác tin cậy Lượng thuốc tính tốn sở tiêu chuẩn phương pháp thử sản phẩm Thông thường lơ sản xuất lấy hai mẫu (một mẫu phân tích mẫu lưu) Trường hợp đặc biệt, số mẫu phân tích mẫu lưu nhiều hai ñể ñủ gửi kiểm nghiệm lưu nhiều nơi xét thấy cần thiết 5.2 Lấy mẫu thành phẩm Mẫu lấy vị trí khác lơ sản xuất, khơng phá lẻ ñơn vị ñóng gói sản phẩm ñể lấy mẫu Từ ñơn vị lấy mẫu ñược tập hợp lại thành mẫu chung mẫu cuối TCVN 8737:2011 Số lượng mẫu thành phẩm cần lấy theo quy ñịnh Bảng Bảng – Số lượng mẫu cần lấy theo quy cách đóng gói Quy cách đóng gói (g ml) Số lượng mẫu lấy (đơn vị bao gói) Đến 70 Từ ñến 30 Từ ñến 50 Từ 50 ñến 100 Từ 100 trở lên Trong trường hợp đặc biệt tùy theo quy cách đóng gói tính chất thuốc lấy mẫu đủ để phân tích lưu 5.3 Bảo quản mẫu Xem tiêu chuẩn cụ thể ñối với sản phẩm liên quan theo hướng dẫn nhà sản xuất Cách tiến hành 6.1 Chuẩn bị dung dịch pha loãng Cân 4,3 g natri clorua, 3,6 g kali dihydro phosphat, g dinatri hydro phosphat, g pepton hoà tan 1000 ml nước cất, chỉnh pH cho sau khử trùng 7,2 ± 0,2 dung dịch HCl 0,1 N dung dịch NaOH 0,1 N Dùng ống đong cho vào bình nón bình 90 ml dùng pipet chot vào ống nghiệm ống ml dung dịch Đậy nút bơng, có giấy bạc, hấp tiệt trùng nhiệt độ 121 0C 15 Bảo quản tủ lạnh nhiệt ñộ từ 0C ñến 0C sử dụng 15 ngày 6.2 Chuẩn bị môi trường Cân thành phần môi trường thạch MRS theo 4.1 dùng 68,2 g môi trường tổng hợp; 60 mg Bromocresol tía, cho vào 1000 ml nước cất, hòa tan chất cách ñun cách thuỷ sử dụng lò vi sóng (mơi trường trong), chỉnh cho sau khử trùng pH 5,7 ± 0,2 dung dịch HCl 0,1 N dung dịch NaOH 0,1 N Sau hòa tan thành phần, dùng ống đong rót vào bình nón 250 ml bình 100 ml Đậy nút bơng, có giấy bạc, hấp tiệt trùng nhiệt độ 118 0C 15 Nếu mơi trường sử dụng ngay, ñể nguội ñến 45 0C ± 0C bể ñiều nhiệt, chưa sử dụng cần bảo quản tủ lạnh nhiệt độ từ 0C đến 0C khơng q 30 ngày TCVN 8737:2011 6.3 Chuẩn bị mẫu thử Cân vô trùng 10 g (10 ml) mẫu, xác đến 0,1 mg, cho vào bình nón đựng 90 ml dung dịch pha lỗng tiệt trùng trên, thu độ pha lỗng 10-1 Cho lên máy lắc, đồng hố mẫu khoảng 30 6.4 Các bước tiến hành 6.4.1 Pha loãng mẫu Dùng micropipet lấy ml dịch pha loãng 10-1 từ bình nón mẫu đồng hóa cho vào ống nghiệm chứa ml dung dịch pha lỗng tiệt trùng độ pha lỗng 10-2 Tiếp tục pha lỗng tương tự đến độ pha lỗng cần thiết để ñếm ñược từ 25 khuẩn lạc ñến 250 khuẩn lạc ñĩa theo dự kiến 6.4.2 Đổ ñĩa Đối với mẫu kiểm nghiệm phải ni cấy ñậm ñộ pha loãng, ñậm ñộ dùng ñĩa petri vô trùng Lấy ml mẫu dung dịch pha lỗng đậm độ khác cho vào đĩa Petri Mơi trường MRS thạch tan chảy, để nguội đến 45 0C ± 0C Rót vào đĩa 12 ml đến 15 ml mơi trường thạch, đảo dung dịch mẫu với mơi trường cách lắc lần sang phải lần sang trái Để đĩa thạch đơng tự nhiên mặt phẳng mát, nằm ngang Thời gian bắt đầu pha lỗng đến rót mơi trường vào đĩa khơng q 30 6.5 Ủ ấm Khi thạch đơng, lật úp ñĩa cho vào tủ ấm % CO2, 37 0C thời gian từ 24 ñến 72 h Nếu khơng có tủ ấm CO2, tạo điều kiện yếm khí để ni cấy cách: sau đĩa thạch đơng, đổ thêm lớp thạch lên để tạo điều kiện yếm khí 6.6 Đọc kết Sau 48 h, ñọc kết sơ Sau 72 h, ñọc kết quả, ñếm tổng số khuẩn lạc mọc ñĩa Vi khuẩn Lactobacillus mơi trường thạch làm chuyển màu đĩa mơi trường từ đỏ tía sang màu vàng, khuẩn lạc có đường kính từ mm đến mm, màu vàng, hình thấu kính hình Để khẳng định Lactobacillus tiến hành kiểm tra khuẩn lạc điển hình theo cách sau: − Nhuộm Gram: Lactobacillus trực khuẩn Gram (+) tạo thành chuỗi − Thử phản ứng Catalase: Lactobacillus cho catalase (-) TCVN 8737:2011 − Thử phản ứng sinh acid lactic: Lactobacillus cho phản ứng (+) − Thử phản ứng thủy phân CaCO3: Lactobacillus cho phản ứng (+) − Nếu 80 % trường hợp, tức khơng khuẩn lạc khuẩn lạc khẳng định thuộc chủng Lactobacillus tất khuẩn lạc ñặc trưng phát triển ñĩa ñược coi thuộc nhóm − Trong trường hợp lại số vi khuẩn chủng Lactobacillus xác ñịnh từ tỉ lệ phần trăm khuẩn lạc ñã ñược khẳng ñịnh tổng số khuẩn lạc ñặc trưng ñược lấy ñể kiểm tra Tính biểu thị kết 7.1 Tính kết Chọn đĩa có từ 25 khuẩn lạc ñến 250 khuẩn lạc đậm độ pha lỗng liên tiếp để tính kết Nếu chênh lệch giá trị ñậm ñộ nhỏ lần, tính số N vi khuẩn cho g ml sản phẩm cách tính trung bình cộng tống số khuẩn lạc đếm đĩa theo cơng thức sau: N= ∑C V (n1 + 0,1× n ) × d Trong đó: ΣC tổng khuẩn lạc đếm ñược tất ñĩa ñược giữ lại từ đậm độ pha lỗng tiếp theo; V thể tích mẫu cấy đĩa, tính mililit (ml); n1 số đĩa có đậm độ pha lỗng thứ giữ lại; n2 số đĩa có đậm ñộ pha loãng thứ hai ñược giữ lại; d hệ số pha lỗng tương ứng với độ pha lỗng thứ Làm tròn số kết có được, giữ lại số có nghĩa 7.2 Biểu thị kết Biểu thị kết dạng thập phân số 1,0 9,9 nhân với 10n (n số mũ thích hợp 10) Nếu chênh lệch giá trị ñậm ñộ lớn lần, lấy giá trị đậm độ pha lỗng thấp để tính kết 10 TCVN 8737:2011 Nếu đĩa sản phẩm lỏng ngun chất đậm độ pha lỗng ban đầu có 25 khuẩn lạc tính kết theo trung bình cộng khuẩn lạc ñếm ñược ñĩa tính cho g ml sản phẩm Nếu tất đĩa khơng có khuẩn lạc mọc, đánh giá kết sau: − Ít khuẩn lạc Lactobacillus ml sản phẩm; − Ít 1/d khuẩn lạc Lactobacillus g sản phẩm d hệ số pha lỗng đậm độ pha lỗng ban ñầu (10-1) Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải rõ: a) thông tin cần thiết ñể nhận biết ñầy ñủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu ñã sử dụng, biết; c) phương pháp thử nghiệm ñã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) nhiệt ñộ ủ; e) chi tiết thao tác khơng quy định tiêu chuẩn ñiều ñược coi tuỳ ý cố mà ảnh hưởng đến kết thử; f) kết thử nghiệm thu ñược 11 TCVN 8737:2011 Thư mục tài liệu kham khảo [1] QCVN 01-03:2009/BNNPTNT, Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia lấy mẫu thuốc thú y ñể kiểm tra chất lượng [2] TCVN 6507-1:2005 (ISO 6887-1:1999), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha lỗng thập phân ñể kiểm tra vi sinh vật – Phần 1: Các nguyên tắc chung ñể chuẩn bị huyền phù ban đầu dung dịch pha lỗng thập phân [3] TCVN 4884:2005, (ISO 4833:2003), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn ni – Phương pháp định lượng vi sinh vật ñĩa thạch – Kỹ thuật ñếm khuẩn lạc 300C _ 12 ... chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Cơng nghệ cơng bố TCVN 8737:2011 TCVN 8737:2011 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8737:2011 Thuốc thú y – Phương pháp ñịnh lượng số bào tử Lactobacillus.. .TCVN 8737:2011 Lời nói đầu TCVN 8737:2011 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thơn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Cơng nghệ cơng bố TCVN. .. dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) nhiệt ñộ ủ; e) chi tiết thao tác khơng quy định tiêu chuẩn ñiều ñược coi tuỳ ý cố mà ảnh hưởng ñến kết thử; f) kết thử nghiệm thu ñược 11 TCVN 8737:2011 Thư mục