Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6831-1:2001

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6831-1:2001 qui định ba phương pháp xác định sự ức chế phát quang của vi khuẩn biển Vibrio fischeri (NRRL B-11177). TCVN 6831-1:2001 (ISO 11348-1) qui định phương pháp sử dụng vi khuẩn tươi. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 6831-1 : 2001 ISO 11348-1 : 1998 CHẤT LƯỢNG NƯỚC - XÁC ĐỊNH ẢNH HƯỞNG ỨC CHẾ CỦA MẪU NƯỚC ĐẾN SỰ PHÁT QUANG CỦA VI KHUẨN VIBRIO FISCHERI (PHÉP THỬ VI KHUẨN PHÁT QUANG) - PHẦN : PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN TƯƠI Water quality - Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) - Part 1: Method using freshly prepared bacteria Lời nói đầu TCVN 6831 -1 : 2001 hồn tồn tương đương với ISO 11348 - : 1998; TCVN Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F13 6831 - : 2001 Các phương pháp phân tích lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học, Công nghệ Môi trường ban hành CHẤT LƯỢNG NƯỚC - XÁC ĐỊNH ẢNH HƯỞNG ỨC CHẾ CỦA MẪU NƯỚC ĐẾN SỰ PHÁT QUANG CỦA VI KHUẨN VIBRIO FISCHERI (PHÉP THỬ VI KHUẨN PHÁT QUANG ) - PHẦN : PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN TƯƠI Water quality - Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) - Part : Method using freshly prepared bacteria Phạm vi áp dụng TCVN 6831 : 2001 (ISO 11348) qui định ba phương pháp xác định ức chế phát quang vi khuẩn biển Vibrio fischeri (NRRL B-11177) TCVN 6831 - : 2001 (ISO 11348-1) qui định phương pháp sử dụng vi khuẩn tươi Tiêu chuẩn áp dụng cho : - nước thải; - dịch chiết dịch ngâm chiết nước; - nước (nước mặt nước ngầm) nước mặn nước lợ, đặc biệt dùng để kiểm soát thay đổi ức chế vi khuẩn; - nước giếng khoan Tiêu chuẩn trích dẫn ISO 5667-16 : 1998 Chất lượng nước - Hướng dẫn thử sinh học mẫu TCVN 6184 : 1996 (ISO 7027 : 1990) Chất lượng nước - Xác định độ đục Nguyên tắc Sự ức chế phát quang cấy vi khuẩn Vibrio fischeri xác định cách thử nghiệm theo mẻ Điều thực việc kết hợp thể tích qui định mẫu thử mẫu thử pha loãng với huyền phù chứa vi khuẩn phát quang đựng cuvet Chuẩn thử giảm độ phát quang đo sau mẫu vi khuẩn tiếp xúc 15 phút 30 phút phút, tuỳ chọn, có tính đến hệ số hiệu chỉnh (ƒ kt), phép đo thay đổi cường độ mẫu kiểm tra suốt thời gian tiếp xúc ảnh hưởng ức chế mẫu nước xác định LID (xem phụ lục B) giá trị EC20 / EC50 thơng qua dãy pha lỗng Xác định mức pha loãng gây ức chế phát quang < 20% Với mức gây ức chế cao hơn, ảnh hưởng nồng độ xác định biểu đồ phép phân tích thống kê Sự ức chế mẫu biểu thị theo độ pha loãng gây giảm phát quang 20% 50% so với giá trị mẫu thử trắng (EC20 EC50) Những giá trị nội suy dãy pha loãng Các chất gây nhiễu Các chất khơng tan, tan dễ bay chất có phản ứng với nước pha lỗng với huyền phù, làm thay đổi trạng thái chúng q trình thử, ảnh hưởng đến kết làm giảm độ tái lập kết thử Trong trường hợp nước đục đậm màu, xẩy dập tắt phát quang việc hấp thụ ánh sáng tán xạ ánh sáng gây Sự gây nhiễu đơi khắc phục được, thí dụ : cách sử dụng cuvet hiệu chỉnh hấp thụ hai ngăn (xem phụ lục A) Vì phát quang sinh học cần đến lượng oxy > 0,5 mg/l, nên mẫu có nhu cầu oxy cao (và / có hàm lượng oxy thấp) gây thiếu hụt oxy mẫu bị ức chế Mẫu bị nhiễm bẩn chất hữu chất giàu dinh dưỡng dễ phân huỷ vi sinh vật (thí dụ như: urê, pepton, cao men, thơng thường ≥100 mg/l), làm giảm tự ô nhiễm việc phát quang sinh học Hàm lượng muối mẫu ban đầu vượt 30 g/l NaCl, hàm lượng thành phần khác có độ thẩm thấu tương đương, với lượng muối cần phải thêm vào thử gây ảnh hưởng siêu thẩm thấu Nếu mẫu chứa tương đương từ 20 g/l đến 50 g/ l NaCI khơng phải cho thêm muối Hàm lượng muối cuối có mẫu thử không vượt độ thẩm thấu dung dịch NaCI 35 g/l Thuốc thử vật liệu Chỉ sử dụng hoá chất đạt chất lượng phân tích Dùng nước cất nước có độ tinh khiết tương đương 5.1 Vi khuẩn thử Loài vi khuẩn phát quang thuộc chủng Vibrio fischeri NRRL - 11177 Các huyền phù vi khuẩn dùng để xác định độc tính phải dung dịch chuẩn bị từ chất cấy 5.2 Dung dịch natri clorua, làm chất pha lỗng Hồ tan 20 g natri clorua (NaCI) nước thêm nước đến lít 5.3 Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = mol/l 5.4 Axit clohydric, c(HCI) = mol/l Chú ý - Để điều chỉnh pH sử dụng axit bazơ nồng độ thấp cao 5.5 Dung dịch dùng cho vi khuẩn tươi D(+)- Glucoza ngậm nước ( C6H12O6 H2O) 8,0 g Natri clorua (NaCI) 20,0 g Magie clorua ngậm nước (MgCl2.6H2O) 2,035 g Kali clorua (KCl) 0,30 g N- (2- Hydroxyetyl) piperazin-N- (2- axit ethanesunfonic) (HEPES) 11,9 g Hoà tan thành phần nước, khuấy 30 phút chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 dung dịch natri hydroxit (5.3) axit clohydric (5.4) Thêm nước đến lít Dung dịch chia thành phần nhỏ bảo quản nhiệt độ - 20 0C 5.6 Chất đối chứng - Kẽm sunfat ngậm nước (ZnSO4.7H2O) - 3,5-dichlorophenol (C6H4OCI2) - Kali dicromat (K2Cr2O7) 5.7 Môi trường nuôi cấy lỏng dùng để cấy sơ cấy - Natri clorua (NaCI) 30 g - Natri dihydrophosphat ngậm nước (NaH2PO4.H2O) 6,10 g - Kali hydrophosphat ngậm nước (K2HPO4.3H2O) 2,75 g - Magie sunfat ngậm nước (MgSO4.7H2O) 0,204 g - Hydrophosphat diammoni [(NH4)2.HPO4] 0,500 g - Glyxerol ml - Caso- pepton 5,00 g - Cao men 0,50 g Hoà tan thành phần nước chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 dung dịch natri hydroxit (5.3) axit clohydric (5.4) Thêm nước đến lít Chuyển lần 50 ml vào bình Erlenmeyer (dung tích bình khoảng 250 ml) khử trùng 20 phút nồi hấp áp lực nhiệt độ 121 0C Chú thích - Caso-pepton cao men nhiều hãng cung cấp nên cho chất lượng khơng ổn định Trong trường hợp có trở ngại (thí dụ : ức chế phát triển), cần mua sản phẩm hãng khác 5.8 Môi trường thạch để cấy vi khuẩn gốc Điều chỉnh môi trường nuôi cấy (5.7) đến pH 7,0 ± 0,2 Thêm 12 g thạch lít hồ tan cách làm ấm nhẹ; khử trùng chuyển sang đĩa Petri vô trùng 5.9 Môi trường bảo vệ - D(+)- Glucoza ngậm nước ( C6H12O6 H2O) 66 g - Natri clorua (NaCI) 4g - L-histidin 2g - Albumin huyết bò, BSA 0,5 g Hoà tan kỹ thành phần nước 37 0C, cần dùng natri hydroxit (5.3) axit clohydric (5.4) để chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 nhiệt độ phòng Thêm nước đến 100 ml Chú thích - Sử dụng môi trường bảo vệ để không gây hại đến tế bào vi khuẩn trình làm lạnh BSA nhiều hãng cung cấp có chất lượng khơng ổn định Trong trường hợp có trở ngại cần mua sản phẩm hãng khác Chuẩn bị môi trường bảo vệ trước sử dụng Thiết bị, dụng cụ 6.1 Tủ lạnh, trì huyền phù gốc nhiệt độ 0C ± 0C 6.2 Hộp ổn nhiệt, để trì mẫu thử nhiệt độ 150C ± 10C Trong lần thử nghiệm nhiệt độ dao động tối đa ± 0,2 0C 6.3 Máy đo độ phát quang, tế bào đo trì nhiệt độ 15 0C ± 0C, có trang bị cuvet phù hợp 6.4 ống nghiệm (lọ), làm chất liệu trơ hố học, thích hợp để sử dụng với máy đo độ phát quang chọn có dung tích đủ lớn để đọc hết bề mặt lớn 6.5 pH mét 6.6 Đồng hồ bấm 6.7 Pipet pitông, dùng cho ống hút nhựa, dung tích danh định 10 μl , 500 μl 1000 μl 6.8 Pipet pitơng, có dung tích thay đổi, từ 10 ml đến 200 ml 200 μl đến 5000 μl 6.9 Máy li tâm lạnh 6.10 Máy khuấy từ que khuấy từ 6.11 Tủ ấm lắc rung, để ủ bình Erlenmeyer 6.12 Nồi hấp áp lực 6.13 Tủ ấm 6.14 Máy đo phổ máy đo quang kính lọc cuvet, có chiều dài cm 6.15 Vòng cấy ( kim cấy) 6.16 Máy đo độ dẫn Lấy mẫu xử lý mẫu sơ 7.1 Lấy mẫu Mẫu phải đựng bình sạch, trơ hố học phù hợp với ISO 5667-16 Cho mẫu vào đầy hộp chứa gắn kín Thử nghiệm mẫu sớm tốt sau lấy mẫu Nếu cần, bảo quản mẫu nhiệt độ từ 0C đến 0C bình thuỷ tinh, nơi tối khơng q 48 h Nếu phải bảo quản mẫu đến tuần để mẫu nhiệt độ - 20 0C Không sử dụng hoá chất để bảo quản mẫu Cần chỉnh pH thêm muối trước thử 7.2 Chuẩn bị mẫu Đo pH tất mẫu Nếu pH nằm khoảng - 8,5 khơng cần phải chỉnh Tuy nhiên, việc chỉnh pH làm biến đổi chất mẫu Mặt khác, pH mẫu pH mẻ thử khác khả đệm mơi trường thử Có thể cần phải thực thử nghiệm mẫu: mẫu chỉnh pH mẫu không chỉnh pH Nếu cần, chỉnh pH mẫu đến 7,0 ± 0,2 cách cho thêm axit clohydric (5.4) natri hydroxit (5.3); chọn nồng độ axit clohydric natri hydroxyt cho thể tích thêm vào khơng lớn % tổng thể tích Cho thêm 20 g natri clorua lít vào mẫu nước vào mẫu nước trung hoà Đối với nước lợ nước mặn, cần đo độ mặn tính lượng NaCl (nếu cần) để điều chỉnh độ thẩm thấu (xem điều 4) Các mẫu đục cần để lắng h cho ly tâm, thí dụ 10 phút 5000 g lọc Cấy vi khuẩn phát quang 8.1 Cấy vi khuẩn gốc Chuyển vi khuẩn phát quang loài Vibrio fischeri NRRL B -11177, điều kiện vô trùng, sang đĩa Petri chứa thạch dùng cho vi khuẩn gốc (5.8) ủ tủ ấm từ ngày đến ngày nhiệt độ 20 0C ± 0C Đánh dấu khuẩn lạc riêng lẻ phát quang, cách quan sát mắt bóng tối, sau bảo quản đĩa tủ lạnh Chuyển khuẩn lạc đánh dấu điều kiện vô trùng, sang đĩa sau thời gian bảo quản tối đa tuần Chú thích - Các lọ vi khuẩn bảo quản có bán sẵn khơng phân phối điều kiện vô trùng Để nuôi cấy vi khuẩn khiết nên dùng vài chủng khuẩn lạc đơn Để tránh biến đổi tính di truyền, nên mở lọ vi khuẩn bảo quản tháng lần Chú thích - Độ phát quang khuẩn lạc phát quang bị giảm trình bảo quản 8.2 Chuẩn bị chất cấy sơ Dưới điều kiện vô trùng, cho 50 ml môi trường ni cấy sơ (5.7) vào bình Erlenmeyer (dung tích khoảng 250 ml) có khuẩn lạc đơn lẻ phát quang chất cấy gốc ủ từ đến ngày Lắc 21 h ± h 20 0C ± 0C với 180 vòng /phút Đo độ đục dịch pha lỗng 1:10 dung dịch natri clorua (5.2), thí dụ, bước sóng 578 nm, tính đơn vị đo độ đục (FNU), theo TCVN 6184 : 1996 (ISO 7027) 8.3 Chuẩn bị chất cấy Bơm 50 ml mơi trường ni (5.7) vào bình Erlenmeyer 250 ml có sẵn thể tích chất cấy sơ cho có độ đục ước đốn ban đầu 10 đơn vị FNU Lắc 20 h ± h 20 0C ± 0C với 180 vòng/phút Đo độ đục dịch pha loãng 1:10 dung dịch natri clorua (5.2) đo quang bước sóng 578 nm, tính FNU Chú thích - Khi tuân thủ điều kiện nêu trên, chất cấy khơng pha loãng thường cho độ đục từ 700 FNU đến 1800 FNU 8.4 Chuẩn bị huyền phù gốc Làm lạnh sơ dung dich natri clorua (5.2) môi trường bảo vệ (5.9) nước đá Ly tâm huyền phù vi khuẩn thu từ dịch cấy (8.3) nhiệt độ 0C ± 0C máy ly tâm làm lạnh trước, từ 15 phút đến 20 phút 6000 g ± 2000 g Gạn bỏ phần tái tạo phần bị vón cục lại thành huyền phù ml đến 10 ml dung dịch natri clorua lạnh (5.2) (cho 50 ml chất cấy chính) Ly tâm lại điều kiện tương tự Gạn bỏ phần tái tạo phần bị vón cục lại thành huyền phù ml đến 10 ml dung dịch natri clorua lạnh (5.2) (cho 50ml chất cấy chính) Chuyển huyền phù vi khuẩn vào cốc thí nghiệm (dung tích khoảng 100 ml) làm lạnh trước đặt cốc lên đá lạnh Thêm từ từ khoảng ml (cho 50 ml chất cấy chính) mơi trường bảo vệ (5.9) điều kiện làm lạnh liên tục nước đá khuấy Tiến hành xác định độ đục dịch pha loãng : 100 với dung dịch natri clorua (5.2) phương pháp đo quang Thêm thật nhanh môi trường bảo vệ làm lạnh trước (5.9) đạt độ đục ước tính 2500 FNU± 500 FNU (xem thích 8.1) Chú thích - Để chuẩn bị huyền phù gốc thích hợp, mililit huyền phù natri clorua nên cho thêm 10ml môi trường bảo vệ Khi cho thêm mơi trường bảo vệ độ phát quang sinh học bị giảm rõ rệt, xuất lại sau thêm dung dịch pha loãng Tiếp tục khuấy 15 phút để thu hỗn hợp đồng Cho hỗn hợp vào ống nghiệm thích hợp (6.4), ống 100 μl Nếu huyền phù cần sử dụng ngay, bảo quản tối đa h nhiệt độ 0C ± 0C trước cho thêm dung dịch (5.5) Bảo quản huyền phù gốc tủ đá - 20 0C; sử dụng vòng tháng Huyền phù gốc bảo quản lâu – 70 oC Các huyền phù gốc làm tan băng dùng cho thử nghiệm sơ Có thể sử dụng huyền phù gốc vào mục đích thử nghiệm thoả mãn chuẩn tính đắn (điều 12) Cách tiến hành Chuẩn bị mẫu theo 7.2 Chuẩn bị dãy pha loãng cần thiết (xem phụ lục B) Đối với mẫu kiểm tra, trì dung dịch NaCl (5.2) nhiệt độ 15 0C ± 0C Duy trì ống nghiệm đựng mẫu kiểm tra, mẫu pha loãng chất pha loãng (5.2) nhiệt độ 150C±10C Nếu huyền phù gốc (8.4) bảo quản tủ đá, làm tan băng nồi cách thuỷ nhiệt độ 200C ± 0C Thêm 0,5 ml dung dịch (5.5) (cho 100 μl huyền phù gốc), giữ nhiệt độ 15 0C ± 0C làm đồng cách lắc nhẹ lọ Chờ khoảng 15 phút Dùng pipet cho vào ống nghiệm 500 μl huyền phù cần thử, trì nhiệt độ 15 0C ± 10C tủ ấm, với khoảng thời gian (20 giây) phép đo cường độ sau Nếu có thể, thực phép đo kép mức pha loãng nhiệt độ thử 15 0C ± 0C Sau thời gian ổn định 15 phút, dùng máy đo độ phát quang xác định ghi cường độ phát quang l0 huyền phù thử Điều chỉnh dụng cụ đo huỳnh quang cho gần với mức cực đại Chú thích - Phải đo tất mẫu thử, độ phát quang khác huyền phù thử khơng đồng Vì thời gian tiếp xúc tất mẫu phải nhau, nên sử dụng đồng hồ bấm để cố định thời gian đo cường độ phát quang khoảng thời gian đo Khoảng thời gian đo thích hợp 20 giây Ngay sau đo độ phát quang huyền phù cần thử, cần cho thêm mẫu (7.2), mẫu pha loãng (phụ lục B), dung dịch natri clorua (5.2) để dung dịch có tổng thể tích ml Dùng tay trộn, bật đồng hồ bấm đặt cuvet trở lại vào hộp ổn nhiệt 15 0C ± 0C Lặp lại với tất cuvet, ý để thời gian lần thử liên tiếp phải Đo ghi cường độ phát quang tất cuvet, kể mẫu kiểm tra, sau 15 phút sau 30 phút (l15 , l30) , đo sau phút ( l5 ), tuỳ chọn Ghi lại điều chỉnh dụng cụ 10 Đánh giá 10.1 ảnh hưởng ức chế lên vi khuẩn phát quang Sử dụng cơng thức (1) để tính hệ số hiệu chỉnh (giá trị fkt) từ cường độ phát quang đo Hệ số dùng để hiệu chỉnh giá trị ban đầu l0 tất mẫu thử trước chúng dùng làm giá trị đối chứng cho việc xác định độ giảm phát quang nước fkt = lkt/ l0 (t = phút, 15 phút, 30 phút) (1) fkt hệ số hiệu chỉnh thời gian tiếp xúc phút, 15 phút, 30 phút; lkt cường độ phát quang mẫu kiểm tra sau thời gian tiếp xúc 15 phút 30 phút, tính đơn vị phát quang tương ứng; l0 cường độ phát quang huyền phù thử kiểm tra trước cho thêm chất pha loãng (5.2), tính đơn vị phát quang tương ứng; Lấy giá trị fkt trung bình mẫu kiểm tra Dùng cơng thức (2) để tính lct: f kt giá trị trung bình fkt; l0 [xem công thức (1)]; lct vào giá trị hiệu chỉnh l0 cuvet đựng mẫu thử trước cho mẫu thử Dùng công thức (3) để tính ảnh hưởng ức chế mẫu thử: Hl ảnh hưởng ức chế mẫu thử sau thời gian tiếp xúc 15 phút 30 phút, tính phần trăm; lct [xem cơng thức (2)]; lTt cường độ phát quang mẫu thử sau thời gian tiếp xúc 15 phút 30 phút, tính đơn vị phát quang tương ứng; Tính giá trị trung bình ảnh hưởng ức chế Hl cho mức pha lỗng, tính phần trăm; Tính độ lệch phép xác định song song Hl từ giá trị trung bình tương ứng lần thử kép theo phần trăm giá trị trung bình mẫu kiểm tra Để đánh giá ảnh hưởng nồng độ, dùng công thức (4) để đánh giá giá trị gamma cho mức pha lỗng: Гt giá trị gamma mẫu thử sau thời gian tiếp xúc 15 phút 30 phút; Ht giá trị trung bình Ht [xem cơng thức (3)] Chú thích - Khi nồng độ thử định cho độ ức chế phát quang sinh học % 100 % , khơng thể tính giá trị gamma Do đó, có giá trị Ht nằm khoảng 10% 90% dùng để tính ảnh hưởng nồng độ 10.2 Xác định giá trị EC Tính ảnh hưởng nồng độ khoảng thời gian tiếp xúc, sử dụng phép hồi qui tuyến tính chuẩn ảnh hưởng nồng độ khoảng thời gian tiếp xúc cụ thể thường biểu thị cơng thức tuyến tính (5): lg ct = b lg Гt + lg a (5) ct phần mẫu nước có mẫu thử, tính phần trăm; Гt [xem công thức (4)]; b giá trị độ dốc đường vẽ ; lg a giá trị phần bị chắn đường vẽ Bằng phương pháp thống kê bình phương tối thiểu, tính giá trị EC20 EC50 với giới hạn tin cậy tương ứng, : ct = EC20,t Гt = 0,25; ct = E50,t Гt = 1,00 Nếu phạm vi cặp giá trị khơng thể khớp với đường cong, giá trị EC ước tính đồ thị, sử dụng hệ toạ độ logarit kép 11 Biểu thị kết Báo cáo kết theo mẫu bảng Nếu xác định được, báo cáo giá trị LID (xem phụ lục B) Nếu xác định được, báo cáo giá trị EC20 E50 Báo cáo cách chuẩn bị vi khuẩn sử dụng Bảng – Thí dụ đánh giá thử nghiệm - Mẫu : nước thải sau xử lý trạm xử lý nước thải Thí nghiệm kiểm tra Thử nghiệm Giá trị đo l0 lk30/l0 Lk30 2) fk 30 Thử nghiệm tính đắn Độ lệch so với giá trị trung bình tính % 80% 1) 50% 1) 297 242 0,8148 292 236 0,8082 295 253 0,8576 305 257 0,8426 0,8115 ± 0,4 0,8501 ± 0,9 3) fk 30 , Thí nghiệm thử Thử Mức pha loãng Giá trị đo D l0 lT30 lc30 H30 % H 30 Thử nghiệm tính đắn % Г30 Độ lệch so với giá trị trung bình , tính % 4) 80% 1) 300 81 243,5 66,7 297 85 241,0 64,7 280 141 238,0 40,8 42,2 65,7 ± 1,0 1,919 ± 1,4 0,731 ± 0,65 0,298 ± 0,65 0,113 50% 1) 292 140 248,2 43,6 292 193 248,2 22,3 22,95 285 185 242,3 23,6 303 229 257,6 11,1 11,75 302 225 256,7 12,4 1) Thể tích huyền phù thử : tương ứng 0,2 ml 0,5 ml 2) Thể tích cuối cuvet: ml 3) Độ lệch giá trị fk30 , tính phần trăm lần xác định song song so với giá trị trung bình chúng số đo độ phân tán mẫu kiểm tra 4) Độ lệch giá trị H30 , tính phần trăm lần xác định song song so với giá trị trung bình chúng số đo độ phân tán mẫu thử Giá trị LID thí dụ = Giá trị EC20 thí dụ = 31,9 %, Giá trị EC 50 = 58,7 % 12 Chuẩn tính đắn Phép thử coi - giá trị fkt ủ 30 phút nằm phạm vi từ 0,6 đến 1,8; - kết xác định song song không chênh lệch 3% so với trung bình chúng Điều cho mẫu kiểm tra, mẫu thử xác định giá trị LID xác định riêng giá trị EC20/EC50; - ba chất đối chứng (5.6) gây ức chế từ 20% đến 80% sau thời gian tiếp xúc 30 phút nồng độ sau (các dung dịch khơng trung hồ, kiểm tra riêng rẽ): 3,5-diclorophenol 2+ mg/l Zn (là kẽm sunfat ngậm nước) 25 mg/l Cr6+ (là kali dicromat) mg/l 13 Độ xác Trong thử nghiệm liên phòng thí nghiệm quốc gia tiến hành suốt mùa hè năm 1991 22 phòng thí nghiệm tham gia xác định số liệu độ xác Các kết nêu phụ lục C 14 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải nêu trích dẫn tiêu chuẩn phần sử dụng [TCVN 6831-1 : 2001 (ISO 11348-1); TCVN 6831-2 : 2001 (ISO 11348-2) TCVN 6831-3 : 2001 (ISO 11348-3)] gồm thông tin sau: a) nhận biết mẫu nước, kể việc lấy mẫu, thời gian điều kiện bảo quản; b) pH mẫu nước gốc; c) ngày thử nghiệm; d) xử lý sơ mẫu, có; e) nguồn gốc vi khuẩn, số mẻ; f) ngày chuẩn bị vi khuẩn; g) nhiệt độ bảo quản vi khuẩn, bảo quản đông lạnh; h) biểu thị kết theo điều 11 bảng 1; i) sai lệch so với phương pháp thơng tin tình ảnh hưởng đến kết quả; j) kết thử với chất đối chứng Phụ lục A (tham khảo) PHƯƠNG PHÁP CHỈNH MÀU A.1 Phạm vi áp dụng Việc giảm độ phát quang hấp thụ ánh sáng xẩy mẫu dãy pha loãng quan sát thấy rõ màu, đặc biệt màu từ đỏ đến nâu Nếu quan sát thấy màu nồng độ EC20, nên thực qui trình sau để kiểm tra thấy cần thiết phải hiệu chỉnh màu Trong trường hợp, nồng độ mẫu thử gần với giá trị EC50 nên hiệu chỉnh màu A.2 Dụng cụ bổ sung A.2.1 Cuvet hiệu chỉnh màu: cuvet có hai lớp, lắp vừa với dụng cụ đo độ phát quang A.2.2 Pipet Pasteur A.3 Cách tiến hành Thực tồn qui trình hiệu chỉnh màu nhiệt độ 15 0C ± 0,5 0C tủ ấm kiểm soát nhiệt độ Chuẩn bị dung dịch pha lỗng mẫu thử có nồng độ gần giá trị EC 20,t (Ck) Khi giá trị EC20,t chênh lệch lớn Ck phải gần với giá trị EC20,t thấp Chú thích - Khơng cần phải chọn Ck khác cho khoảng thời gian tiếp xúc (5 phút, 15 phút, 30 phút) Cho 2,0 ml dung dịch natri clorua 2% vào khoang cuvet hiệu chỉnh màu Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn đặc biệt Chú thích - Đối với vi khuẩn Microtox, nên dùng 1,0 ml nước pha loãng với 50 μl huyền phù vi khuẩn gốc Đối với vi khuẩn Umistox, nên dùng 1,0 ml huyền phù vi khuẩn gốc Trộn kỹ huyền phù trước dùng pipet Paster để chuyển vào khoang cuvet hiệu chỉnh màu Thêm huyền phù cho với mức dung dịch có khoang ngồi cuvet hiệu chỉnh màu Đo mức ánh sáng (B0) sau 15 phút, bật đồng hồ bấm Từ thời điểm trở đi, vị trí cuvet hiệu chỉnh màu khoang đo phải giữ nguyên cho tất số đọc Dùng pipet lấy hết dung dịch natri clorua từ khoang thay vào 2,0 ml mẫu thử pha lỗng (phụ lục B) làm lạnh trước đến 15 0C ± 0,5 0C Đo mức ánh sáng (l5) phút sau lần đo đầu Dùng pipet lấy hết mẫu thử pha lỗng từ khoang ngồi thay vào 2,0 ml dung dịch natri clorua Đo mức ánh sáng (B10) 10 phút sau lần đo đầu Chú thích - Qui trình đơn giản hố cách dùng cuvet hiệu chỉnh màu giống hệt Khoang cuvet thứ chứa đầy nước, khoang cuvet thứ hai chứa đầy mẫu pha loãng Sau 15 phút, đo mức ánh sáng B0 l0 Những giá trị thay cho giá trị B5 l5 tính tốn A.4 A.4 Tính tốn kết Thừa nhận cường độ màu mẫu phù hợp với định luật Beer-Lambert, trường hợp thơng thường Tính B5 theo cơng thức: Tính độ hấp thụ (At) nồng độ EC20,t chưa hiệu chỉnh với thời gian tiếp xúc (t) theo cơng thức: Ck nồng độ mẫu hoá chất nồng độ thử (màu); k số hệ thống thu theo thực nghiệm; In B5 I5 độ hấp thụ dịch pha loãng cần thử cuvet hiệu chỉnh màu Tính độ truyền qua tương ứng (Tt) theo cơng thức: Tính giá trị gamma hiệu chỉnh (Ãc) theo cơng thức: cГt hệ số hiệu chỉnh cho giá trị gamma thời gian tiếp xúc định (t); Г0 giá trị gamma gốc Tiến hành tính lại kết thử với giá trị gamma hiệu chỉnh Chú thích - Với thời gian tiếp xúc định, tính độ hấp thụ (At) độ truyền qua (Tt) nồng độ thử, từ tính tính giá trị gamma chưa hiệu chỉnh theo công thức: Гc = T1(1+Г0) - Hệ số hiệu chỉnh giống giá trị gamma, thừa nhận độ dốc đồ thị gốc Do đó, điều đủ để tính hệ số hiệu chỉnh giá trị gamma Trong phép xác định này, áp dụng giá trị gamma tương ứng với nồng độ EC 20,t chưa hiệu chỉnh (Г = 0,25) Cơng thức tính hệ số hiệu chỉnh rút gọn sau: C nồng độ mẫu; lt giá trị phát quang sinh học đo thời gian tiếp xúc định (t); cГt hệ số hiệu chỉnh cho giá trị gamma thời gian tiếp xúc định (t); Г0 giá trị gamma gốc; Гc giá trị gamma hiệu chỉnh A.5 Thí dụ Số liệu chỉnh màu Ck = 10,0% phần thể tích B5 = 81 l5 = 78 k = 3,1 Tính tốn hiệu chỉnh màu Ck = % phần thể tích phút cГ5 = 0,708 mẫu trắng l0 l5 100 90 15 phút cГ15 = 0,670 Г0 Гc l15 80 30 phút cГ30 = 0,657 Г0 Гc l30 70 Г0 Гc 5,625 98 82 0,076 0,054 74 0,059 0,040 65 0,055 0,036 11,250 94 63 0,343 0,243 60 0,253 0,170 53 0,242 0,159 22,500 96 45 0,920 0,651 42 0,829 0,556 38 0,768 0,505 45,000 97 15 4,820 3,412 17 3,565 2,389 17 2,994 1,967 Công thức gốc lnГ= 1,96 x ln C - 5,96 lnГ= 1,95 x ln C - 6,16 nГ= 1,90 x ln C - 6,12 Công thức hiệu chỉnh lnГ= 1,96 x ln C - 6,30 lnГ= 1,95 x ln C - 6,56 nГ= 1,90 x ln C - 6,53 EC30,t gốc 10,3 11,6 12,1 EC30,t hiệu chỉnh 12,3 14,3 15,1 Phụ lục B (tham khảo) MỨC PHA LOÃNG D - CHUẨN BỊ CÁC DÃY PHA LOÃNG Khi thử nước thải cách pha loãng dần (D), dãy thử có nồng độ đậm đặc mà nồng độ khơng có ức chế, có ảnh hưởng ức chế mà không vượt độ biến đổi đặc trưng thử nghiệm, gọi “Độ pha lỗng khơng ảnh hưởng thấp nhất” (LID) Độ pha lỗng biểu thị giá trị nghịch đảo phần thể tích nước thải dãy thử [ thí dụ, lượng nước thải / (25% phần thể tích) mức pha lỗng D = 4] Trong phép thử vi khuẩn phát quang, thường trộn thể tích huyền phù thử với thể tích mẫu nước thể tích mẫu pha lỗng Do đó, mức pha lỗng dãy pha lỗng theo thơng lệ D ≥ Nếu cần thử mẫu nước gần khơng pha lỗng, thêm 800 μl mẫu nước vào 200 μl huyền phù thử Độ pha lỗng 1:1,25 Giá trị D tương ứng coi D =1 Đối với giá trị D này, cần đến mẻ kiểm tra ngoại tiến hành cách trộn 800 μl dung dịch natri clorua với 200 μl huyền phù thử Để chuẩn bị dãy pha loãng nên tiến hành theo bảng B.1 Bảng B.1 - Chuẩn bị dãy pha loãng - Thành phần mẻ thử mẻ kiểm tra Pha loãng Mức pha loãng D Mẫu nước μl Nước pha loãng μl Huyền phù gốc μl (5.2) (8.4) 1,25 800 - 200 2 500 - 500 3 333,3 166,7 500 4 250 250 500 6 166,7 333,3 500 8 125 375 500 12 12 83,3 416,7 500 16 16 62,5 437,5 500 24 24 41,7 458,3 500 32 32 31,3 468,7 500 với D = - 800 200 với D ≥ - 500 500 Mẻ kiểm tra Giá trị D thấp mà ảnh hưởng ức chế H1 < 20% gọi LID Phụ lục C (tham khảo) SỐ LIỆU VỀ ĐỘ CHÍNH XÁC Các dung dịch 3,5-diclorophenol, kẽm sunfat ngậm nước, kali dicromat xetyl-trimethylammonium bromua chưa trung hoà, chuẩn bị nước cất nước có độ tinh khiết tương đương dùng cho thử nghiệm liên phòng thí nghiệm Những giá trị EC xác định mô tả 10.2 , kết đưa bảng C.1 C.2 Các chữ viết tắt bảng C.1 C.2 biểu thị: L : Số lượng phòng thí nghiệm tham gia N : Số lượng liệu NAP : Số lượng ngoại lệ, tính phần trăm sR : Độ lệch chuẩn độ tái lập x : Giá trị trung bình CVR : Hệ số biến thiên độ tái lập, tính phần trăm EC20, EC50 : Nồng độ hữu ích gây ức chế phát quang 20% 50 % tương ứng Chú thích - Do số phòng thí nghiệm cho kết ức chế lớn 20% nồng độ thử thấp kết ức chế nhỏ 50 % nồng độ thử cao nên giá trị L đơi có khác EC20 EC50 Bảng C.1 - Số liệu độ xác vi khuẩn tươi L =N NAP x sR CVR % mg/l mg/l % 3,5-diclorophenol 15 0,0 3,78 1,65 43,5 EC20 14 6,7 6,06 1,69 27,9 Kẽm sulfat heptahydrat 13 0,0 20,4 7,9 38,9 EC20 13 0,0 32,4 10,4 32,3 Kali dicromat 1) 11,1 1,25 1,04 83,1 EC20 0,0 4,15 3,14 75,5 10 9,1 0,171 0,086 50,5 11 8,3 0,393 0,202 51,6 EC50 EC50 EC50 4.Cetyl-trimethyl-ammonium bromua EC20 EC50 1) Nồng độ Zn2+ Cr6+ tương ứng Bảng C.2 - Số liệu độ xác vi khuẩn tươi bảo quản tủ lạnh L =N NAP % x mg/l sR CVR mg/l % 3,5-diclorophenol EC20 15 0,0 3,31 0,75 22,6 EC50 15 0,0 5,80 1,28 22,1 EC20 13 13,3 14,6 2,4 16,6 EC50 13 13,3 26,0 3,3 12,8 EC20 11 15,3 0,717 0,283 39,5 EC50 10 28,6 2,726 0,947 34,8 11 8,3 0,229 0,105 45,6 13 7,1 0,476 0,152 31,8 Kẽm sulfat heptahydrat Kali dicromat 1) 4.Cetyl-trimethyl-ammonium bromua EC20 EC50 1) Nồng độ Zn2+ Cr6+ tương ứng  ... thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải nêu trích dẫn tiêu chuẩn phần sử dụng [TCVN 6831-1 : 2001 (ISO 11348-1); TCVN 6831-2 : 2001 (ISO 11348-2) TCVN 6831-3 : 2001 (ISO 11348-3)] gồm thông tin sau:... sơ Có thể sử dụng huyền phù gốc vào mục đích thử nghiệm thoả mãn chuẩn tính đắn (điều 12) Cách tiến hành Chuẩn bị mẫu theo 7.2 Chuẩn bị dãy pha loãng cần thiết (xem phụ lục B) Đối với mẫu kiểm... natri clorua (5.2), thí dụ, bước sóng 578 nm, tính đơn vị đo độ đục (FNU), theo TCVN 6184 : 1996 (ISO 7027) 8.3 Chuẩn bị chất cấy Bơm 50 ml mơi trường ni (5.7) vào bình Erlenmeyer 250 ml có sẵn