Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6831-3:2001 qui định ba phương pháp xác định sự ức chế phát quang của vi khuẩn biển Vibrio fischeri (NRRL B-11177). TCVN 6831-3 : 2001 (ISO 11348-3) này qui định phương pháp sử dụng vi khuẩn đông - khô. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.
TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 6831-3 : 2001 ISO 11348-3 : 1998 CHẤT LƯỢNG NƯỚC - XÁC ĐỊNH ẢNH HƯỞNG ỨC CHẾ CỦA MẪU NƯỚC ĐẾN SỰ PHÁT QUANG CỦA VI KHUẨN VIBRIO FISCHERI (PHÉP THỬ VI KHUẨN PHÁT QUANG) - PHẦN : PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN ĐÔNG-KHÔ Water quality - Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) - Part : Method using freeze-dried bacteria Lời nói đầu TCVN 6831 - : 2001 hồn toàn tương đương với ISO 11348 - : 1998; TCVN 6831 - : 2001 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F13 Các phương pháp phân tích lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học, Công nghệ Môi trường ban hành CHẤT LƯỢNG NƯỚC - XÁC ĐỊNH ẢNH HƯỞNG ỨC CHẾ CỦA MẪU NƯỚC ĐẾN SỰ PHÁT QUANG CỦA VI KHUẨN VIBRIO FISCHERI (PHÉP THỬ VI KHUẨN PHÁT QUANG ) - PHẦN : PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN ĐÔNG - KHÔ Water quality - Deterrmination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) - Part : Method using freeze-dried bacteria Phạm vi áp dụng TCVN 6831 : 2001 (ISO 11348) qui định ba phương pháp xác định ức chế phát quang vi khuẩn biển Vibrio fischeri (NRRL B-11177) TCVN 6831-3 : 2001 (ISO 11348-3) qui định phương pháp sử dụng vi khuẩn đông - khô Tiêu chuẩn áp dụng cho : - nước thải; - dịch chiết dịch ngâm chiết nước ; - nước (nước mặt nước ngầm) nước mặn nước lợ, đặc biệt dùng để kiểm soát thay đổi ức chế vi khuẩn; - nước giếng khoan Tiêu chuẩn trích dẫn ISO 5667-16 : 1998 Chất lượng nước - Hướng dẫn thử sinh học mẫu TCVN 6481 : 1996 (ISO 7027: 1990) Chất lượng nước - Xác định độ đục Nguyên tắc Sự ức chế phát quang cấy vi khuẩn Vibrio fischeri xác định cách thử nghiệm theo mẻ Điều thực việc kết hợp thể tích qui định mẫu thử mẫu thử pha loãng với huyền phù vi khuẩn phát quang đựng cuvet Chuẩn thử nghiệm giảm phát quang đo sau mẫu vi khuẩn tiếp xúc 15 phút 30 phút phút, tuỳ chọn, có tính đến hệ số hiệu chỉnh (ƒkt), phép đo thay đổi cường độ mẫu kiểm tra thời gian tiếp xúc ảnh hưởng ức chế mẫu nước xác định LID (xem phụ lục B) giá trị EC20 / EC50 thơng qua dãy pha lỗng Xác định mức pha loãng gây ức chế phát quang < 20% Với mức gây ức chế cao hơn, ảnh hưởng độ pha lỗng xác định biểu đồ phép phân tích thống kê Sự ức chế mẫu biểu thị theo độ pha loãng mức giảm phát quang 20% 50% so với giá trị mẫu thử trắng (EC20 EC50) Những giá trị nội suy dãy pha loãng Các chất gây nhiễu Các chất khơng tan, tan dễ bay chất có phản ứng với nước pha lỗng với huyền phù thử nghiệm, làm thay đổi trạng thái chúng q trình thử, ảnh hưởng đến kết làm giảm độ tái lập kết thử Trong trường hợp nước đục đậm màu, xẩy dập tắt phát quang việc hấp thụ ánh sáng tán xạ ánh sáng gây Sự gây nhiễu khắc phục được, thí dụ : cách sử dụng cuvet hiệu chỉnh hấp thụ hai ngăn (xem phụ lục A) Vì phát quang sinh học cần đến lượng oxy > 0,5 mg/l, nên mẫu có nhu cầu oxy cao (và / có hàm lượng oxy thấp) bị thiếu hụt oxy phát quang bị ức chế Mẫu bị nhiễm bẩn chất hữu chất dinh dưỡng dễ phân huỷ sinh học (thí dụ như: urê, pepton, cao men, thơng thường ≥100 mg/l) làm giảm phát quang sinh học không lệ thuộc vào tác nhân ô nhiễm Hàm lượng muối mẫu ban đầu vượt 30 g/l NaCl, hàm lượng thành phần khác có độ thẩm thấu tương đương, với lượng muối cần phải thêm vào thử gây ảnh hưởng siêu thẩm thấu Nếu mẫu chứa tương đương từ 20 g/l đến 50 g/ l NaCI cho thêm muối Hàm lượng muối cuối có mẫu thử khơng vượt q độ thẩm thấu dung dịch NaCI 35 g/l Thuốc thử vật liệu Chỉ sử dụng hoá chất đạt chất lượng phân tích Dùng nước cất nước có độ tinh khiết tương đương 5.1 Vi khuẩn thử Loài vi khuẩn phát quang thuộc chủng Vibrio fischeri NRRL - 11177 Các huyền phù vi khuẩn dùng để xác định độc tính chuẩn bị từ thuốc thử đơng - khơ có bán sẵn bảo quản tủ đông lạnh nhiệt độ -18oC đến - 20oC.Vi khuẩn phát triển sau khôi phục dùng cho thử nghiệm 5.2 Dung dịch natri clorua, làm chất pha lỗng Hồ tan 20 g natri clorua (NaCI) nước thêm nước đến lít 5.3 Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = mol/l 5.4 Axit clohydric, c(HCI) = mol/l Chú thích - Để điều chỉnh pH cần sử dụng axit bazơ nồng độ thấp cao 5.5 Dung dịch dùng cho vi khuẩn đông - khô Natri clorua (NaCI) 20,0 g Magie clorua ngậm nước (MgCl2.6H2O) 2,035 g Kali clorua (KCl) 0,30 g Hoà tan thành phần nước thêm nước đến lít Dung dịch có bảo quản tủ đá - 20 0C 5.6 Chất đối chứng - Kẽm sunfat ngậm nước (ZnSO4.7H2O) - 3,5-dichlorophenol (C6H4OCI2) - Kali dicromat (K2Cr2O7) Thiết bị, dụng cụ 6.1 Tủ đá, để lưu giữ vi khuẩn cần bảo quản 6.2 Tủ lạnh, để trì huyền phù gốc nhiệt độ oC ± 3oC 6.3 Hộp ổn nhiệt, để trì mẫu thử nhiệt độ 150C ± 10C Trong lần thử nghiệm nhiệt độ dao động tối đa ± 0,2 0C 6.4 Máy đo độ phát quang, tế bào đo trì nhiệt độ 15 0C ± 0C, có trang bị cuvet thích hợp 6.5 ống nghiệm (lọ), làm chất liệu trơ hố học, thích hợp để sử dụng với máy đo độ phát quang chọn có dung tích đủ lớn để đọc hết bề mặt lớn 6.6 pH mét 6.7 Đồng hồ bấm 6.8 Pipet pitông với ống hút nhựa, dung tích danh định 10 μl, 500 μl 1000 μl 6.9 Pipet pitơng có dung tích thay đổi, từ 10 ml đến 200 ml 200 μl đến 5000 μl 6.10 Máy li tâm lạnh 6.11 Máy đo độ dẫn Lấy mẫu xử lý mẫu sơ 7.1 Lấy mẫu Mẫu phải đựng bình sạch, trơ hoá học phù hợp với ISO 5667-16 Cho mẫu vào đầy bình gắn kín Thử nghiệm mẫu sớm tốt sau lấy mẫu Nếu cần, bảo quản mẫu nhiệt độ từ 0C đến 0C bình thuỷ tinh, nơi tối khơng q 48 h Nếu phải bảo quản mẫu đến tuần để mẫu nhiệt độ - 20 0C Khơng sử dụng hoá chất để bảo quản mẫu Cần chỉnh pH thêm muối trước thử 7.2 Chuẩn bị mẫu Đo pH tất mẫu Nếu pH nằm khoảng - 8,5 khơng cần phải chỉnh Tuy nhiên, việc chỉnh pH làm biến đổi chất mẫu Mặt khác, pH mẫu pH mẻ thử khác khả đệm môi trường thử khác Có thể cần phải thực thử nghiệm mẫu: mẫu chỉnh pH mẫu không chỉnh pH Nếu cần, chỉnh pH mẫu đến 7,0 ± 0,2 cách cho thêm axit clohydric (5.4) natri hydroxit (5.3); chọn nồng độ axit clohydric natri hydroxyt cho thể tích thêm vào khơng lớn 5% tổng thể tích Cho thêm 20 g natri clorua lít vào mẫu nước vào mẫu nước trung hoà Đối với nước lợ nước mặn, cần đo độ mặn tính lượng NaCl (nếu có) cần thiết để điều chỉnh độ thẩm thấu (xem điều 4) Các mẫu đục cần để lắng h cho ly tâm, thí dụ 10 phút 5000 g phải lọc Cách tiến hành 8.1 Chuẩn bị huyền phù gốc 8.1.1 Các bước chuẩn bị ban đầu Chuẩn bị mẫu theo 7.2 Chuẩn bị dãy pha loãng cần thiết (xem phụ lục B) Đối với mẫu kiểm tra, trì dung dịch NaCl (5.2) nhiệt độ 15 0C ± 0C Duy trì ống nghiệm đựng mẫu kiểm tra, mẫu dãy pha loãng chất pha loãng (5.2) nhiệt độ 15 0C ± 0C Lấy lọ chất cấy đông - khô khỏi tủ đá - 20oC trước hoàn nguyên vào nước Để hoàn nguyên, làm mát ml nước cất ống nghiệm thuỷ tinh đến 0C ± 30C Rót hết lúc lượng nước làm mát vào lọ đựng vi khuẩn ưa dung mơi, cách giảm đến mức tối đa hư hỏng tế bào suốt trình loại nước Vì lý quan nước phải thêm nhanh khuẩn lạc tiếp xúc đột ngột với nước, nên không dùng pipet Lấy thể tích xác nước khơng khó Huyền phù vi khuẩn phát quang hồn nguyên dùng làm huyền phù gốc; bảo quản huyền phù gốc 30C ± 0C Sử dụng huyền phù gốc cho mục đích thử nghiệm chuẩn tính đắn điều 11 thoả mãn Có thể dùng vi khuẩn loại nước, tan băng phép thử sơ Chờ sau phút chuẩn bị huyền phù thử từ huyền phù gốc 8.1.2 Cách A Chuẩn bị huyền phù thử trực tiếp ống nghiệm Cho phần 10 μl huyền phù gốc vào 500 μl dung dịch (5.5), đựng cuvet trì 15 0C ± 0C, khoảng thời gian giống phép đo cường độ sau Lắc hỗn hợp tay 8.1.3 Cách B Chuẩn bị huyền phù thử bình nón (thí dụ : dung tích 250 ml) ngồi ống nghiệm Cho thể tích huyền phù gốc vào thể tích dung dịch (5.5) lớn gấp 50 lần, trì 0C ± 0C trộn kỹ huyền phù thu Dùng pipet lấy 500 μl huyền phù thử cho vào ống nghiệm, trì hộp ổn nhiệt 15 0C ± C, khoảng thời gian giống phép đo cường độ sau 8.2 Cách tiến hành Nếu có thể, thực phép đo kép mức pha loãng nhiệt độ thử 15 0C ± 0C Chú thích - Phải đo tất mẫu thử, phát quang khác huyền phù thử khơng đồng Điều chỉnh dụng cụ máy đo huỳnh quang cho gần với mức cực đại Sau thời gian ổn định 15 phút, dùng máy đo độ phát quang xác định ghi cường độ quang l0 huyền phù thử khoảng thời gian 20 giây Vì thời gian tiếp xúc tất mẫu phải nhau, nên sử dụng đồng hồ bấm để cố định thời gian đo cường độ phát quang khoảng thời gian đo Khoảng thời gian đo thích hợp 20 giây Ngay sau đo độ phát quang huyền phù cần thử, cần cho thêm mẫu (7.2), mẫu pha loãng (phụ lục B), dung dịch natri clorua (5.2) để dung dịch có tổng thể tích ml Dùng tay trộn, khởi động đồng hồ bấm đặt cuvet lại vào hộp ổn nhiệt 15 0C ± 0C Lặp lại với tất cuvet, ý để thời gian lần thêm liên tiếp Đo ghi cường độ phát quang tất cuvet, kể mẫu kiểm tra, lặp lại sau 15 phút sau 30 phút (l15 , l30) , đo sau phút ( l5 ), tuỳ chọn, khoảng thời gian 20 giây Ghi lại điều chỉnh dụng cụ Đánh giá 9.1 ảnh hưởng ức chế lên vi khuẩn phát quang Sử dụng cơng thức (1) để tính hệ số hiệu chỉnh (giá trị f kt) từ cường độ phát quang đo Hệ số dùng để hiệu chỉnh giá trị ban đầu l0 tất mẫu thử trước chúng dùng làm giá trị đối chứng để xác định độ giảm phát quang nước fkt = lkt/ l0 (t = phút, 15 phút, 30 phút) (1) fkt hệ số hiệu chỉnh thời gian tiếp xúc phút, 15 phút, 30 phút; lkt cường độ phát quang mẫu kiểm tra sau thời gian tiếp xúc 15 phút 30 phút, tính đơn vị phát quang tương ứng; l0 cường độ phát quang huyền phù thử kiểm tra, trước cho thêm chất pha lỗng (5.2), tính đơn vị phát quang tương ứng; Lấy giá trị fkt trung bình mẫu kiểm tra Dùng công thức (2) để tính lct: Ict = Io f kt .(2) f kt giá trị trung bình fkt; l0 [xem công thức (1)]; lct thử giá trị hiệu chỉnh l0 cuvet đựng mẫu thử trước cho thêm mẫu Dùng công thức (3) để tính ảnh hưởng ức chế mẫu thử: Hl ảnh hưởng ức chế mẫu thử sau thời gian tiếp xúc 15 phút 30 phút, tính phần trăm; lct [xem cơng thức (2)]; lTt cường độ phát quang mẫu thử sau thời gian tiếp xúc 15 phút 30 phút, tính đơn vị phát quang tương ứng; Tính giá trị trung bình ảnh hưởng ức chế Hl cho mức pha lỗng, tính phần trăm; Tính độ lệch phép xác định song song Hl từ trung bình tương ứng lần thử kép phần trăm giá trị trung bình mẫu kiểm tra Để đánh giá ảnh hưởng nồng độ, dùng cơng thức (4) để ước tính giá trị gamma cho mức pha lỗng: Гt giá trị gamma mẫu thử sau thời gian tiếp xúc 15 phút 30 phút; Ht giá trị trung bình Ht [xem cơng thức (3)] Chú thích - Khi nồng độ thử định cho độ ức chế phát quang sinh học % 100 % , khơng thể tính giá trị gamma Do đó, có giá trị Ht nằm khoảng 10% 90% dùng để tính ảnh hưởng nồng độ 9.2 Xác định giá trị EC Tính ảnh hưởng nồng độ khoảng thời gian tiếp xúc, sử dụng phép phân tích hồi qui tuyến tính chuẩn ảnh hưởng nồng độ khoảng thời gian tiếp xúc cụ thể thường biểu thị cơng thức tuyến tính (5): lg ct = b lg Гt + lg a (5) ct phần mẫu nước có mẫu thử, tính phần trăm; Гt [xem cơng thức (4)]; b giá trị độ nghiêng đường vẽ ; lg a giá trị phần bị cắt đường vẽ Bằng phương pháp thống kê bình phương tối thiểu, tính giá trị EC 20 EC50 với giới hạn tin cậy tương ứng, : ct = EC20,t Гt = 0,25; ct = E50,t Гt = 1,00 Nếu phạm vi cặp giá trị khớp với đường cong, giá trị EC ước tính đồ thị, sử dụng hệ toạ độ logarit kép 10 Biểu thị kết Báo cáo kết theo mẫu bảng Nếu xác định được, báo cáo giá trị LID (xem phụ lục B) Nếu xác định được, báo cáo giá trị EC20 E50 Báo cáo cách chuẩn bị vi khuẩn sử dụng Bảng – Thí dụ đánh giá thử nghiệm – Mẫu : nước thải sau xử lý trạm xử lý nước thải Thử kiểm tra Thử nghiệm Giá trị đo lk30/l0 l0 Thử nghiệm tính đắn f k 30 lk30 ) Độ lệch so với giá trị trung bình f k 30 , tính % 3) 80% 1) 50% 1) 297 242 0,8148 292 236 0,8082 295 253 0,8576 305 257 0,8426 0,8115 ± 0,4 0,8501 ± 0,9 Thử nghiệm Thử Mức pha loãng D Giá trị đo lc30 l0 H30 % lT30 2) H 30 Thử nghiệm đắn Ã30 % Độ lệch so với giá trị trung bình, tính % 4) 65,7 ± 1,0 1,919 42,2 ± 1,4 0,731 22,95 ± 0,65 0,298 11,75 ± 0,65 0,133 80% 1) 300 81 243,5 66,7 297 85 241,0 64,7 280 141 238,0 40,8 50% 1) 292 140 248,2 43,6 292 193 248,2 22,3 285 185 242,3 23,6 303 229 257,6 11,1 302 225 256,7 12,4 1) Thể tích huyền phù thử : tương ứng 0,2 ml 0,5 ml 2) Thể tích cuối cuvet: ml 3) Độ lệch giá trị fk30 , tính phần trăm lần xác định song song so với giá trị trung bình chúng số đo phân tán mẫu kiểm tra 4) Độ lệch giá trị H30 , tính phần trăm lần xác định song song so với giá trị trung bình chúng số đo phân tán mẫu thử Giá trị LID thí dụ = Giá trị EC20 thí dụ = 31,9 %, Giá trị EC 50 = 58,7 % 11 Chuẩn tính đắn Phép thử coi - giá trị fkt ủ 30 phút nằm phạm vi từ 0,6 đến 1,8; - kết xác định song song không chênh lệch 3% so với trung bình chúng Điều cho mẫu kiểm tra, mẫu thử xác định giá trị LID xác định riêng giá trị EC 20 EC50; - Cả ba chất đối chứng (5.6) gây ức chế từ 20% đến 80% sau thời gian tiếp xúc 30 phút nồng độ sau (các dung dịch khơng trung hồ, kiểm tra riêng rẽ): 3,5-diclorophenol 2+ 3,4 mg/l Zn (theo kẽm sunfat ngậm nước) 2,2 mg/l Cr6+ (theo kali dicromat) 18,7 mg/l 12 Độ xác Trong thử nghiệm liên phòng thí nghiệm quốc gia tiến hành suốt mùa thu năm 1993 16 phòng thí nghiệm tham gia xác định số liệu độ xác Các kết nêu phụ lục C 13 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải nêu trích dẫn tiêu chuẩn phần sử dụng [TCVN 6831-1 : 2001 (ISO 11348-1); TCVN 6831-2 : 2001 (ISO 11348-2) hay TCVN 6831-3 : 2001 (ISO 11348-3)] gồm thông tin sau: a) nhận biết mẫu nước, kể việc lấy mẫu, thời gian điều kiện bảo quản; b) pH mẫu nước gốc; c) ngày thử nghiệm; d) xử lý sơ mẫu, có; e) nguồn gốc vi khuẩn, số mẻ; f) ngày chuẩn bị vi khuẩn; g) nhiệt độ bảo quản vi khuẩn, bảo quản đông lạnh; h) biểu thị kết theo điều 10 bảng 1; i) sai lệch so với phương pháp thông tin tình ảnh hưởng đến kết quả; j) kết thử với chất đối chứng Phụ lục A (tham khảo) PHƯƠNG PHÁP CHỈNH MÀU A.1 Phạm vi áp dụng Việc giảm độ phát quang hấp thụ ánh sáng xẩy mẫu dãy pha loãng quan sát thấy rõ màu, đặc biệt màu từ đỏ đến nâu Nếu quan sát thấy màu nồng độ EC 20, nên thực qui trình sau để kiểm tra cần phải hiệu chỉnh màu Trong trường hợp, nồng độ mẫu thử gần với giá trị EC50 nên hiệu chỉnh màu A.2 Dụng cụ bổ sung A.2.1 Cuvet hiệu chỉnh màu: cuvet có hai lớp, có gắn phận đo độ phát quang A.2.2 Pipet Pasteur A.3 Cách tiến hành Thực toàn qui trình hiệu chỉnh màu nhiệt độ 15 0C ± 0,5 0C tủ ấm kiểm soát ổn định nhiệt độ Pha lỗng dung dịch mẫu thử có nồng độ gần giá trị EC 20,t (Ck) Khi giá trị EC20,t chênh lệch lớn Ck phải gần với giá trị EC20,t thấp Chú thích - Khơng cần phải chọn Ck khác cho khoảng thời gian tiếp xúc (5 phút, 15 phút, 30 phút) Cho 2,0 ml dung dịch natri clorua 2% vào khoang cuvet hiệu chỉnh màu Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn đặc biệt Chú thích - Với vi khuẩn Microtox : 1,0 ml nước pha loãng với 50 μl huyền phù vi khuẩn gốc Với vi khuẩn Lumistox : 1,0ml huyền phù vi khuẩn gốc Trộn kỹ huyền phù trước dùng pipet Paster để chuyển vào khoang cuvet hiệu chỉnh màu Thêm huyền phù cho với mức dung dịch có khoang ngồi cuvet hiệu chỉnh màu Đo mức ánh sáng (B0) sau 15 phút, khởi động đồng hồ bấm Chú thích - Từ thời điểm trở đi, vị trí cuvet hiệu chỉnh màu khoang đo phải giữ nguyên cho tất số đọc Dùng pipet lấy hết dung dịch natri clorua từ khoang thay vào 2,0 ml mẫu thử pha loãng (phụ lục B) làm lạnh sơ đến 15 0C ± 0C Sau lần đo đầu phút, đo mức ánh sáng (l 5) Dùng pipet lấy hết mẫu thử pha lỗng từ khoang ngồi thay vào 2,0 ml dung dịch natri clorua Sau lần đo đầu 10 phút, đo mức ánh sáng (B10) Chú thích - Qui trình đơn giản hoá cách dùng hai cuvet hiệu chỉnh màu giống hệt Khoang cuvet thứ chứa đầy nước, khoang cuvet thứ hai chứa đầy mẫu pha lỗng Sau 15 phút, đo mức ánh sáng B0 l0 Những giá trị thay cho giá trị B5 l5 để tính tốn sau A.4 Tính tốn kết Việc tính thừa nhận mẫu màu phù hợp với định luật Lambert - Beer, trường hợp thơng thường Tính B5 theo cơng thức: Tính độ hấp thụ (At) nồng độ EC20,t chưa hiệu chỉnh với thời gian tiếp xúc (t) theo công thức: Ck nồng độ mẫu hố chất có nồng độ thử (màu); k số thực nghiệm; In B5 I độ hấp thụ dung dịch thử pha loãng cuvet hiệu chỉnh màu Tính độ truyền qua tương ứng (Tt) theo cơng thức: Tính giá trị gamma hiệu chỉnh (Ãc) theo công thức: cГt = (5T1) - Гc = cГt Г0 cГt hệ số hiệu chỉnh cho giá trị gamma thời gian tiếp xúc định (t); Г0 giá trị gamma gốc Tiến hành tính lại kết thử với giá trị gamma hiệu chỉnh Chú thích - thời gian tiếp xúc định, độ hấp thụ (A t) độ truyền qua (Tt) nồng độ thử tính được, từ tính giá trị gamma chưa hiệu chỉnh theo công thức: Гc = T1(1+Г0) - Hệ số hiệu chỉnh giống giá trị gamma, thừa nhận độ dốc đồ thị gốc Do đó, điều đủ để tính hệ số hiệu chỉnh giá trị gamma Trong phép tính này, áp dụng giá trị gamma tương ứng với nồng độ EC 20,t chưa hiệu chỉnh (Г = 0,25) Cơng thức tính hệ số hiệu chỉnh rút gọn sau: Ãc C nồng độ mẫu; lt giá trị phát quang sinh học đo thời gian tiếp xúc định (t); cГt hệ số hiệu chỉnh cho giá trị gamma thời gian tiếp xúc định (t); Г0 giá trị gamma gốc; Гc giá trị gamma hiệu chỉnh A.5 Thí dụ Số liệu hiệu chỉnh màu Ck = 10,0% phần thể tích B5 = 81 l5 = 78 k = 3,1 Tính tốn hiệu chỉnh màu Ck = % phần thể tích phút 15 phút cГ5 = 0,708 l0 l5 mẫu trắng 100 90 5,625 98 82 Г0 30 phút cГ15 = 0,670 Гc l15 Г0 cГ30 = 0,657 Гc 80 0,076 0,054 74 l30 Г0 Гc 0,055 0,036 70 0,059 0,040 65 11,250 94 63 0,343 0,243 60 0,253 0,170 53 0,242 0,159 22,500 96 45 0,920 0,651 42 0,829 0,556 38 0,768 0,505 45,000 97 15 4,820 3,412 17 3,565 2,389 17 2,994 1,967 Công thức gốc lnГ= 1,96 x ln C - 5,96 lnГ= 1,95 x ln C - 6,16 nГ= 1,90 x ln C - 6,12 Công thức hiệu chỉnh lnГ= 1,96 x ln C - 6,30 lnГ= 1,95 x ln C - 6,56 nГ= 1,90 x ln C - 6,53 EC30,t gốc 10,3 11,6 12,1 EC30,t hiệu chỉnh 12,3 14,3 15,1 Phụ lục B (tham khảo) MỨC PHA LOÃNG D - CHUẨN BỊ CÁC DÃY PHA LỖNG Khi thử nước thải cách pha lỗng dần (D) mẻ thử có nồng độ đậm đặc mà nồng độ không gây ức chế, có ảnh hưởng nhỏ ức chế mà khơng vượt q độ biến đổi đặc trưng thử nghiệm, gọi “Độ pha lỗng thấp khơng ảnh hưởng” (LID) Độ pha loãng biểu thị giá trị nghịch đảo phần thể tích nước thải mẻ thử [ thí dụ, hàm lượng nước thải (25% phần thể tích) mức pha lỗng D = 4] Trong phép thử vi khuẩn phát quang, thường trộn thể tích huyền phù thử với thể tích mẫu nước thể tích mẫu pha lỗng Do đó, mức pha lỗng loạt pha lỗng theo thơng lệ D ≥ Nếu cần thử mẫu nước gần khơng pha lỗng, thêm 800 μl mẫu nước vào 200 μl huyền phù thử Độ pha loãng 1:1,25 Giá trị D tương ứng coi D =1 Đối với giá trị D này, cần đến mẻ kiểm tra đặc biệt mà tiến hành cách thêm 800 μl dung dịch natri clorua vào 200 μl huyền phù thử Để chuẩn bị dãy pha loãng nên tiến hành theo bảng B.1 Bảng B.1 - Chuẩn bị dãy pha loãng - Thành phần mẻ thử mẻ kiểm tra Pha loãng Mức pha loãng D Mẫu nước Nước pha loãng Huyền phù gốc μl μl μl (5.2) (8.4) 1,25 800 - 200 2 500 - 500 3 333,3 166,7 500 4 250 250 500 6 166,7 333,3 500 8 125 375 500 12 12 83,3 416,7 500 16 16 62,5 437,5 500 24 24 41,7 458,3 500 32 32 31,3 468,7 500 D=1 - 800 200 với D ≥ - 500 500 Mẻ kiểm tra với Giá trị D thấp mà ảnh hưởng ức chế H1 < 20% gọi LID Phụ lục C (tham khảo) SỐ LIỆU VỀ ĐỘ CHÍNH XÁC Các dung dịch 3,5-diclorophenol, kẽm sunfat ngậm nước, kali dicromat chưa trung hồ, chuẩn bị nước cất nước có độ tinh khiết tương đương dùng cho thử nghiệm liên phòng thí nghiệm Những giá trị EC xác định theo mô tả 9.2, kết đưa bảng C.1 Các chữ viết tắt bảng C.1 biểu thị: L: Số lượng phòng thí nghiệm tham gia N: Số lượng liệu NAP: Số lượng ngoại lệ, tính phần trăm sR: Độ lệch chuẩn độ tái lập x: Giá trị trung bình CVR: Hệ số biến thiên độ tái lập, tính phần trăm EC20, EC50: Nồng độ hữu ích gây ức chế phát quang 20% 50 % tương ứng Chú thích - Do số phòng thí nghiệm cho kết ức chế lớn 20% nồng độ thử thấp kết ức chế nhỏ 50 % nồng độ thử cao nên giá trị L đơi có khác EC20 EC50 Bảng C.1 - Số liệu độ xác vi khuẩn đông – khô L =N NAP % x mg/l sR CVR mg/l % 3,5-diclorophenol EC20 14 2,32 0,43 18,6 EC50 13 7,14 3,36 0,32 9,6 Kẽm sunfat ngậm nước 15 1,08 0,47 43,6 EC20 14 2,17 0,73 33,6 EC20 15 3,60 1,89 52,4 EC50 14 6,67 18,71 6,17 32,9 EC50 Kali dicromat 1) 1) Nồng độ Zn2+ Cr6+ tương ứng ... thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải nêu trích dẫn tiêu chuẩn phần sử dụng [TCVN 6831-1 : 2001 (ISO 11348-1); TCVN 6831-2 : 2001 (ISO 11348-2) hay TCVN 6831-3 : 2001 (ISO 11348-3)] gồm thông tin... ly tâm, thí dụ 10 phút 5000 g phải lọc Cách tiến hành 8.1 Chuẩn bị huyền phù gốc 8.1.1 Các bước chuẩn bị ban đầu Chuẩn bị mẫu theo 7.2 Chuẩn bị dãy pha loãng cần thiết (xem phụ lục B) Đối với... mục đích thử nghiệm chuẩn tính đắn điều 11 thoả mãn Có thể dùng vi khuẩn loại nước, tan băng phép thử sơ Chờ sau phút chuẩn bị huyền phù thử từ huyền phù gốc 8.1.2 Cách A Chuẩn bị huyền phù thử