Nghiên cứu xây dựng mô hình bệnh nấm hệ thống do candida để đánh giá hiệu quả thuốc chống nấm in vivo

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá hiệu quả thuốc chống nấm là rất cấp thiết, cả in vitro và in vivo. Bài viết tiến hành nghiên cứu này nhằm xây dựng mô hình bệnh nấm hệ thống do Candida albicans để áp dụng trong thực tiễn.

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MƠ HÌNH BỆNH NẤM HỆ THỐNG DO CANDIDA ĐỂ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ THUỐC CHỐNG NẤM IN VIVO Lê Trần Anh*; Nguyễn Tuấn Quang* TÓM TẮT Mục tiêu: nhu cầu nghiên cứu đánh giá hiệu thuốc chống nấm cấp thiết, in vitro in vivo Chúng tiến hành nghiên cứu nhằm xây dựng mơ hình bệnh nấm hệ thống Candida albicans để áp dụng thực tiễn Phương pháp: gây nhiễm chuột nhắt trắng không suy giảm miễn dịch qua đường tĩnh mạch Kết quả: liều chết tối thiểu C albicans x 10 tế bào (TB)/chuột Liều LD10 x 10 ; liều LD90 7,5 x 10 TB/chuột Tại ngày thứ (D3) D8 sau gây nhiễm, mật độ nấm thận 4,52 4,06 log10 CFU (đơn vị hình thành khuẩn lạc)/gam, cao so với mật độ nấm gan (3,77 2,74 log10 CFU/gam) lách (2,93 2,58 log10 CFU/gam) Kết luận: áp dụng mơ hình đánh giá thấy amphotericin B có tác dụng kéo dài thời gian sống chuột nhiễm liều LD90 giảm mật độ nấm thận nhiễm liều LD10 * Từ khóa: Candida albicans; Chuột; Amphotericin B; In vivo Develop a Murine Model of Disseminated Candidiasis to Evaluate the Efficacy of Antifungals in Vivo Summary Objectives: To evaluate the efficacy of anti-fungal drugs are urgently needed, both in vitro and in vivo We conducted this study to develop a model of systemic mycosis caused by Candida albicans to apply in practice Methods: Immunocompetent mice were intravenously infected Results: The minimal lethal dose of C albicans was 10 cells/mouse LD10 dose was x 10 ; LD90 dose was 7.5 x 10 cells/mouse At day (D3) and D8 after infection, the fungal burden in kidney were 4.52 and 4.06 log10 CFU (colony forming units)/g respectively, higher than that in the liver (3.77 and 2.74 log10 CFU/g) and spleen (2.93 and 2.58 log10 CFU/g) Conclusion: Applying the model to evaluate the efficacy of amphotericin B showed that amphotericin B reduced mortality rate and the fungal burden in kidneys of mice receiving LD 90 and LD10, respectively * Key words: Candida albicans; Mouse; Amphotericin B; In vivo ĐẶT VẤN ĐỀ Các bệnh nấm có xu hướng ngày gia tăng, đòi hỏi phải có thuốc điều trị bệnh an tồn, hiệu Thuốc sản xuất trước đưa vào áp dụng điều trị cần đánh giá hiệu cách khách quan, khoa học Trong đánh giá hiệu thuốc có kỹ thuật đánh giá in vitro in vivo Đánh giá in vitro * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Lê Trần Anh (anh lt@vmmu.edu.vn) Ngày nhận bài: 27/08/2015; Ngày phản biện đánh giá báo: 25/11/2015 Ngày báo đăng: 30/11/2015 58 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 cung cấp thông tin ban đầu hiệu thuốc, nhiên thuốc có tác dụng tốt in vitro khơng đảm bảo có hiệu lực cao in vivo Nghiên cứu thực nghiệm động vật đặc biệt quan trọng giai đoạn tiền lâm sàng nghiên cứu hiệu phối hợp thuốc, thuốc mới, đánh giá hiệu in vivo độc tính cấp, mạn chúng [4, 6] Candida sp tác nhân gây bệnh nấm hệ thống hay gặp nhất, C albicans nguyên phổ biến, nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu Việt Nam nước có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, thuận lợi cho nấm bệnh nấm phát triển Hiện Việt Nam chưa có sở thực gây bệnh nấm hệ thống động vật thực nghiệm để đánh giá hiệu thuốc điều trị Chúng tiến hành đề tài với mục tiêu: Xây dựng quy trình gây bệnh nấm hệ thống Candida albicans động vật thực nghiệm áp dụng đánh giá hiệu điều trị bệnh nấm hệ thống in vivo amphotericin B để thử nghiệm mơ hình ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu - Động vật: chuột nhắt trắng, không phân biệt đực cái, trọng lượng 20 ± gam - Nấm: C albicans, chủng ATCC- 90028 Vật liệu nghiên cứu * Dụng cụ: - Dụng cụ nuôi chuột, giữ chuột để tiêm tĩnh mạch, bơm tiêm ml, kim 27G - Dụng cụ nuôi cấy, định lượng nấm: buồng cấy vô trùng, hộp lồng petri, ống nghiệm, que cấy nấm, đèn cồn, kính hiển vi, buồng đếm tế bào Neubauer, máy ly tâm - Dụng cụ xác định lượng nấm tạng: cân điện tử Mettler Toledo (Thụy Sĩ), chày, cối thủy tinh * Hóa chất: - Dung dịch NaCl 0,9%; glucose 5%; gentamicin, formol - Môi trường Sabouraud (Bio Rad, Pháp) - Thuốc amphotericin B (amphotret, Bharat Serums and Vaccines Ltd, Ấn Độ) Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu - Nấm C albicans nuôi cấy môi trường Sabouraud, nhiệt độ phòng theo kỹ thuật thường quy Vào ngày gây nhiễm, thu hồi nấm nước muối sinh lý, ly tâm hút bỏ dịch lần để rửa Đếm buồng đếm tế bào tính tốn mật độ nấm - Tiêm tĩnh mạch đuôi chuột: chuột giữ dụng cụ, bộc lộ đuôi chuột, lần tiêm 0,2 ml dung dịch nấm/thuốc vào tĩnh mạch đuôi chuột - Kỹ thuật xác định mật độ nấm tạng: lấy tạng phương pháp vô trùng, nghiền ml dung dịch NaCl 0,9% có kháng sinh (gentamycin 160 mg/l) chày/cối vơ trùng; hòa lỗng 1/10; 1/100 1/1.000 lần; cấy trải 0,2 ml hộp lồng petri có mơi trường Sabouraud, ni cấy nhiệt độ phòng, đếm khuẩn lạc sau 48 59 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 - Kỹ thuật làm tiêu mô bệnh học: lấy tạng cố định vào dung dịch formol, gửi Bộ môn Giải phẫu Bệnh, Học viện Quân y làm đọc tiêu Chỉ tiêu nghiên cứu cách theo dõi - Liều chết 10% (LD10), LD90 (tế bào/chuột): sau gây nhiễm chuột theo dõi sau 14 ngày để đánh giá, tính tốn liều dựa phần mềm - Mật độ nấm tạng: log10 CFU/ gam tạng - Hiệu điều trị: tỷ lệ sống chuột nhiễm liều LD90, mật độ nấm thận nhiễm liều LD10 Chuột gây nhiễm (ngày D0), tiêm tĩnh mạch amphotericin B liều mg/kg thể trọng từ D1 đến D7, theo dõi chuột đến D14 * Xử lý số liệu: số liệu xử lý phần mềm SPSS 16.0 * Thời gian, địa điểm nghiên cứu: - Thời gian nghiên cứu: 10 - 2014 đến - 2015 - Địa điểm nghiên cứu: Labo Nấm, Bộ môn Ký sinh trùng, Học viện Quân y KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Xây dựng quy trình bệnh nấm hệ thống C albicans Bảng 1: Xác định liều nấm C albicans thấp gây chết chuột 60 Chuột Liều (TB/chuột) Tình trạng sống/chết Ca1 10.000 Chết Ca2 10.000 Sống Ca3 100.000 Chết Ca4 100.000 Chết Ca5 500.000 Chết Ca6 500.000 Chết Ca7 1.000.0000 Chết Ca8 1.000.0000 Chết Ca9 1.500.0000 Chết Ca10 1.500.0000 Chết Liều tối thiểu gây chết chuột 104 TB C albicans/chuột Gây nhiễm bệnh nấm hệ thống động vật thực nghiệm có nhiều mục đích khác áp dụng mơ hình khác Chúng tơi lựa chọn mơ hình gây nhiễm C albicans qua đường tĩnh mạch để tạo bệnh nấm hệ thống chuột không suy giảm miễn dịch, C albicans nguyên nhân phổ biến bệnh nấm Candida hệ thống nghiên cứu nhiều động vật; chuột nhắt trắng có nhiều ưu điểm chi phí thấp, dễ ni, điều kiện kỹ thuật tương đối dễ dàng, dễ mua từ nhà cung cấp Kết tìm liều chết tối thiểu chủng C albicans 104 TB/chuột Bảng 2: Liều gây chết C albicans (TB/chuột) Liều LD10 LD50 LD90 40.000 225.000 750.000 Liều LD10 x 104; liều LD90 7,5 x 105 TB/chuột Sau lựa chọn điều kiện thí nghiệm, cần xác định liều gây nhiễm Kết tìm LD10 LD90 chúng tơi phù hợp với số tác giả khác C albicans ATCC 90028 có độc lực cao, gây TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 nhiễm liều - 6,8 x 105 cfu/chuột trung vị, thời gian sống chuột ngày [10] Graybill CS (1996) thấy liều LD10 2,7 x 104 CFU/chuột [5] Liều x 106 CFU/chuột liều chuẩn (LD90) nghiên cứu so sánh hiệu lực kéo dài thời gian sống [4, 10] cứu đánh giá hiệu thuốc điều trị đến mật độ nấm thận Bảng 3: Mật độ C albicans tạng sau gây nhiễm liều LD10 (mean ± SE, log10 CFU/g, n = 5) Thời gian Thận (1) Gan (2) Lách (3) p1-2;3 x 100 lần D3 4,52 ± 0,16 3,77 ± 0,10 2,93 ± 0,25 < 0,05 D8 4,06 ± 0,26 2,74 ± 0,19 2,58 ± 0,32 < 0,05 Tại thời điểm mật độ nấm thận cao gan, lách Kết nghiên cứu mật độ nấm số tạng chuột phù hợp với đa số tác giả: thận nơi có mật độ nấm cao Nghiên cứu Chin CS (2014) cho thấy mật độ nấm phổi, gan giảm nhanh (2 logs log sau 24 - 168 gây nhiễm), mật độ nấm thận tăng logs từ 24 - 72 giảm nhẹ sau 168 [3] Theo Leunk CS (1979), sau gây nhiễm nấm C albicans vào tĩnh mạch đuôi chuột, sau 30 phút thấy nấm tập trung chủ yếu phổi (23%), gan (7,5%), chuột chết, lượng nấm phân lập thận chiếm tới 98,2% [7] Nghiên cứu Odds CS (2000) thấy thận quan có mật độ nấm C albicans cao nhất, khoảng 105cfu/g ngày đầu, 106 - 107 (cfu/g) ngày 14 Tại phổi, gan, lách: 103 ± 105cfu/g ngày 1; giảm xuống < 100 cfu/g ngày thứ sau gây nhiễm; mật độ C albicans não chuột thấp [9] Chính lý mật độ nấm thận cao nên đa số nghiên x 400 lần Hình 1: Nấm C albicans thận (D5) (PAS) Hình 2: Nấm C albicans gan (D5) (PAS, x 630 lần) Các tế bào nấm men nảy chồi, màu tím đỏ 61 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 Làm tiêu mô bệnh học để đánh giá tổn thương tạng cho thấy thận, gan xuất ổ viêm với tế bào nấm men, chứng tỏ nấm lan tràn đến thận, gan Theo Ashman (1996), thận thấy viêm thận cấp (acute pyelonephritis), tế bào nấm men, sợi nhìn rõ thận chuột có biểu viêm nặng, chuột viêm nhẹ không thấy thâm nhiễm tế bào bạch cầu đa nhân [2] Đánh giá hiệu amphotericin B điều trị bệnh nấm hệ thống C albicans Bảng 4: Thời gian sống chuột gây nhiễm Candida albicans liều LD90 điều trị (ngày) Trung bình Trung vị Thuốc Ước đoán Ðộ sai chuẩn (SE) Ước đoán Ðộ sai chuẩn (SE) Amphotericin B 11,74 0,29 13,0 0,57 Chứng 10,31 0,29 11,0 0,45 (p < 0,001) Biểu đồ 1: Tỷ lệ sống theo thời gian chuột gây nhiễm C albicans liều LD90 điều trị Kết nghiên cứu cho thấy amphotericin B có hiệu điều trị, thể kéo dài thời gian sống chuột gây nhiễm C albicans liều LD90 (p < 0,001) Trong đánh giá hiệu thuốc, tiêu hay sử dụng tác dụng kéo dài thời gian sống động vật gây nhiễm liều LD90 giảm mật độ nấm tạng gây nhiễm liều LD10 [4, 6] Nghiên cứu tiến hành theo khuyến cáo 62 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 số nhà nghiên cứu để đánh giá thời gian sống chuột gây nhiễm liều LD90%, điều trị thuốc sau 24 kéo dài ngày, theo dõi chuột chết vòng tuần [6] Khi sử dụng đường cong Kaplan-Meier cho thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001) Bảng 5: Mật độ nấm thận sau gây nhiễm C albicans liều LD10 điều trị (log10 CFU/g, n = 5) Thời gian Thuốc Mean ± SE Trung bình Nhỏ Cao D3 Amphotericin B (1) 3,27 ± 0,21 3,30 2,70 3,85 Chứng (2) 4,52 ± 0,16 4,57 3,93 4,86 Amphotericin B (1) 1,57 ± 0,65 2,27 2,92 Chứng (2) 4,06 ± 0,26 4,28 3,08 4,49 p1-2 < 0,01 D8 < 0,01 (Non parametric test, Mann-Whitney U test) Mật độ nấm thận chuột sau gây nhiễm C albicans liều LD10 D3 D8 tiêm amphotericin B giảm rõ ràng so với nhóm chứng Trong nghiên cứu đánh giá mật độ nấm hai thời điểm đợt điều trị (D3) sau kết thúc điều trị 24 theo hướng dẫn Viện Nghiên cứu Bệnh Dị ứng Truyền nhiễm Quốc gia Mỹ (NIAID) [8] áp dụng số nghiên cứu [4, 6] Kết nghiên cứu cho thấy hai thời điểm, amphotericin B làm giảm rõ rệt mật độ nấm thận, D8 số chuột không thấy nấm Nghiên cứu cho thấy mật độ nấm giảm rõ ràng, có chuột khơng thấy nấm mọc nữa, khơng phải tất chuột nấm Theo số tác giả, thuốc chống nấm có tác dụng nhanh in vitro không loại thuốc (kể polyene amphotericin B) làm nấm hồn tồn in vivo; mơi trường in vivo có tác dụng bảo vệ nấm khỏi thuốc hay thuốc khó tiếp cận nấm gây bệnh [1] KẾT LUẬN - Chúng tơi xây dựng mơ hình chuột thực nghiệm mắc bệnh hệ thống C albicans qua gây nhiễm tĩnh mạch đuôi chuột không suy giảm miễn dịch - Liều tối thiểu C albicans gây chết 10 TB/chuột Liều LD10 x 104; LD90 7,5 x 105 TB/chuột Tại ngày thứ (D3) D8 sau gây nhiễm, mật độ nấm thận 4,52 4,06 log10 CFU/gam, cao so với mật độ nấm gan (3,77 2,74 log10 CFU/gam) lách (2,93 2,58 log10 CFU/gam) - Áp dụng mơ hình đánh giá thấy amphotericin B có tác dụng kéo dài thời gian sống chuột nhiễm liều LD90 giảm mật độ nấm thận nhiễm liều LD10 63 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 TÀI LIỆU THAM KHẢO Agents and Chemotherapy 1996, 40 (3), pp.816-818 Anaissie EJ, McGinnis MR, Pfaller MA, Anstead GM, Arora A Clinical Mycology (second edi.) Elsevier Inc 2009 Kavanagh K Medical Mycology: Cellular and Molecular Techniques West Sussex, England: John Wiley & Sons 2007 Ashman RB, Fulurija A, Papadimitriou JM Strain-dependent differences in host response to Candida albicans infection in mice are related to organ susceptibility infectious load Infection and Immunity 1996, 64 (5), pp.1866-1869 Leunk RD, Moon RJ Physiological and metabolic alterations accompanying systemic candidiasis in mice Infect Immun 1979, 26 (3), pp.1035-1041 Chin VK, Foong KJ, Maha A, Rusliza B, Norhafizah M, Chong PP Multi-step pathogenesis and induction of local immune response by systemic Candida albicans infection in an intravenous challenge mouse model International Journal of Molecular Sciences 2014, 15 (8), pp.14848-14867 doi:10.3390/ijms150814848 Graybill J The role of murine models in the development of antifungal therapy for systemic mycoses Drug Resistance Updates 2000, 3, pp.364-383 doi:10.1054/drup.2000.0171 Graybill JR, Bocanegra R, Fothergill A, Rinaldi MG Bleomycin therapy of experimental disseminated candidiasis in mice Antimicrobial 64 NIH/NIAID (n.d.) Standard Operating Procedure (SOP) Candida albicans Murine Invasive Candidiasis Model NIH/NIAID Task Order A13 Odds FC, Nuffel L Van, Gow NA R Survival in experimental Candida albicans infections depends on inoculum growth conditions as well as animal host Microbiology 2000, 146 (8), pp.1881-1889 10 Wiederhold NP, Najvar LK, Bocanegra Ra, Kirkpatrick WR, Patterson TF Caspofungin dose escalation for invasive candidiasis due to resistant Candida albicans Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2011, 55 (7), pp.3254-3260 doi:10.1128/AAC.01750-10  ... gây bệnh nấm hệ thống Candida albicans động vật thực nghiệm áp dụng đánh giá hiệu điều trị bệnh nấm hệ thống in vivo amphotericin B để thử nghiệm mơ hình ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối... amphotericin B) làm nấm hồn tồn in vivo; mơi trường in vivo có tác dụng bảo vệ nấm khỏi thuốc hay thuốc khó tiếp cận nấm gây bệnh [1] KẾT LUẬN - Chúng xây dựng mô hình chuột thực nghiệm mắc bệnh hệ thống. .. 2015 - Địa điểm nghiên cứu: Labo Nấm, Bộ môn Ký sinh trùng, Học viện Quân y KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Xây dựng quy trình bệnh nấm hệ thống C albicans Bảng 1: Xác định liều nấm C albicans