Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xác định mức độ kháng kháng sinh và phát hiện gen blaOXA_51, blaOXA_23 và blaOXA_58 ở một số chủng Acinetobacter baumannii phân lập tại 3 bệnh viện khu vực Thái Nguyên.
Tạp chí y - dợc học quân số 2-2017 ĐẶC ĐIỂM KHÁNG KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG ACINETOBACTER BAUMANNII PHÂN LẬP TẠI THÁI NGUYÊN TÓM TẮT Nguyễn Đắc Trung*; Nguyễn Thị Huyền** Mục tiêu: xác định mức độ kháng kháng sinh phát gen blaOXA_51, blaOXA_23 blaOXA_58 số chủng Acinetobacter baumannii phân lập bệnh viện khu vực Thái Nguyên Đối tượng phương pháp: 97 chủng A baumannii, phân lập từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng năm 2015 2016, xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh phương pháp khoanh giấy khuếch tán Kirby-Bauer phát gen blaOXA multiplex PCR Kết kết luận: chủng A baumannii phân lập chủ yếu từ bệnh phẩm hô hấp (đờm 60,31%; dịch rửa phế quản 10,73%) > 75% chủng A baumannii kháng với kháng sinh thơng thường dùng bệnh viện; kháng với nhóm carbapenem (imipenem meropenem) 78 chủng (80,41%); vi khuẩn (VK) nhạy cảm với colistin cefoperazole/sulbatam Gen blaOXA_51 phát 78 chủng A baumannii kháng nhóm carbepenem (ở dạng đơn phối hợp với gen blaOXA khác); 64,1% chủng VK mang gen blaOXA_51 blaOXA_23; gen blaOXA_51 blaOXA_58 tìm thấy 6,41% chủng A baumannii * Từ khóa: Acinetobacter baumannii; Kháng kháng sinh; Multiplex PCR; Gen BlaOXA_51; BlaOXA_23; BlaOXA_58 Characteristics of Antibiotic-Resistant Acinetobacter Baumannii Strains Isolated in Thainguyen Province Summary Objectives: To determine the level of antibiotic resistance and detect genes blaOXA_51, blaOXA_23 and blaOXA_58 in several strains of A baumannii isolated at hospitals in ThaiNguyen Subjects and methods: 97 strains of A baumannii isolated from clinical specimens in the period of 2015 and 2016 were identified the level of antibiotic sensitivity by disk diffusion method of Kirby-Bauer and were subjects to detect genes of blaOXA by multiplex PCR assays Results and conclusions: 71.04% of the A baumannii strains were isolated from the respiratory specimens Resistance to the common antibiotics in hospitals was observed in over 75% of the strains; resistance to carbapenems (imipenem and meropenem) was indicated with 78 strains (80.41%); most strains were susceptible to colistin and cefoperazole/sulbatam All of the strains resistant to carbapenems carried blaOXA-51 (in the single or double form); 64.1% of strains harbored simultaneously blaOXA_51 and blaOXA_23; both blaOXA_51 and blaOXA_58 were found with 6.41% of the strains * Key words: Acinetobacter baumannii; Antibiotic resistance; Multiplex PCR; BlaOXA_51; BlaOXA_23; BlaOXA_58 * Trường Đại học Y - Dược Thái Nguyên ** Bệnh viện TW Thái Nguyên Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Đắc Trung (dactrung69@gmail.com) Ngày nhận bài: 30/11/2016; Ngày phản biện đánh giá báo: 05/01/2017 Ngày báo đăng: 12/01/2017 40 Tạp chí y - dợc học quân số 2-2017 ĐẶT VẤN ĐỀ Acinetobacter baumannii cầu trực khuẩn Gram âm, có đặc tính sinh học đặc biệt, sống môi trường khô lẫn ẩm ướt, nhờ khả bám dính màng sinh học (biofilm) VK tạo ra, giúp VK gắn chặt vào bề mặt dụng cụ, môi trường bảo vệ VK, tạo điều kiện cho VK dễ dàng tồn lâu dài Ngày nay, người ta phát chúng loại VK thường trú bệnh viện tác nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện Nhiễm khuẩn bệnh viện A baumannii khả kháng kháng sinh VK có xu hướng ngày tăng, vấn đề đáng lo ngại thực hành điều trị [3] VK ghi nhận có khả kháng với nhiều nhóm kháng sinh khác nhau, có kháng sinh nhóm carbapenem, nhóm kháng sinh điều trị đặc hiệu trường hợp nhiễm khuẩn A baumannii Cơ chế đề kháng phổ biến với carbpenem A baumannii nhờ hình thành carbapenemases blaOXA (oxacillinases thủy phân carbapenem thuộc β-lactamases lớp D), mã hóa gen nằm plasmid nhiễm sắc thể VK [5] Gen blaOXA_51 blaOXA_23 gen tìm thấy phổ biến chủng A baumannii gây bệnh châu Á, gen blaOXA_58 phát chủ yếu châu Âu số khu vực châu Á [2, 7, 9] Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài nhằm: Xác định mức độ kháng VK phát số gen blaOXA số chủng A baumannii phân lập từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng bệnh viện khu vực Thái Nguyên ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 97 chủng A baumannii phân lập từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên, Bệnh viện Trường Đại học Y khoa Thái Nguyên Bệnh viện A Thái Nguyên năm 2015 2016 Phương pháp nghiên cứu Các chủng VK phân lập định danh hệ thống máy tự động Vitek compact 60 Thực kháng sinh đồ phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán Kirby-Bauer; xác định độ nhạy cảm A baumannii (nhạy cảm, đề kháng) với kháng sinh theo hướng dẫn CLSI, Hòa Kỳ (2014) Phát gen blaOXA_23, blaOXA_51 blaOXA_58 multiplexPCR chủng A baumannii có biểu kháng nhóm carbapenem ADN khuôn cho phản ứng PCR tách chiết trực tiếp từ khuẩn lạc VK theo phương pháp Cebula CS [4] Cặp mồi sử dụng cho phản ứng multiplex PCR trình tự nucleotide, tham khảo từ nghiên cứu Woodford CS (2006) [8], gồm: blaOXA_58 (599 bp: 5’- AAG TAT TGG GGC TTG TGC TG-3’), blaOXA_51 (353 bp: 5’-TAA TGC TTT GAT CGG CCT TG-3’) blaOXA_23 (501 bp: 5’-GAT CGG ATT GGA GAA CCA GA-3’) Hỗn hợp mix (Hãng Thermo Scientific) cho phản ứng multiplex PCR gồm: 200 µM loại dNTP; 2,5 mM MgCI2; 0,2 pmol loại ADN mồi; U Taq ADN polymerase 41 T¹p chÝ y - dợc học quân số 2-2017 1x m PCR (20 mM Tris-HCI, pH 8,4, 50 mM KCI), bổ sung nước khử ion tới thể tích 25 µl Phản ứng multiplex PCR thực hệ thống luân nhiệt BioRad với chu trình nhiệt: phút biến tính 940C, 30 chu kỳ (940C/25 giây; 520C/40 giây; 720C/50 giây), chu kỳ tổng hợp cuối 720C/6 phút Kiểm tra hiệu q trình khuếch đại kích thước sản phẩm PCR gel agarose 1,5% dung dịch đệm TAE 1x, nhuộm gel ethidium bromide chụp ảnh gel hệ thống ghi phân tích gel BioDoc KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết phân lập A baumannii từ loại bệnh phẩm Tổng số có 97 chủng A baumannii phân lập từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng * Tỷ lệ A baumannii phân lập theo bệnh phẩm: Loại bệnh phẩm Số lượng Tỷ lệ % Đờm 59 60,31 Dịch rửa phế quản 10 10,73 Mủ 18 17,92 Máu 3,58 Nước tiểu 4,06 Bệnh phẩm khác 3,4 Tổng số 97 100 Kết tương đồng với nghiên cứu Dương Hoàng Lân CS Bệnh viện Chợ Rẫy (2010) [1] cho thấy A baumannii tác nhân quan trọng gây nhiễm khuẩn hô hấp 42 Mức độ kháng kháng sinh A baumannii Bảng 1: Tỷ lệ đề kháng với kháng sinh 97 chủng A Baumannii Kháng sinh Đề kháng Số lượng Tỷ lệ % Ceftazidin 82 84,54 Cefotaxim 85 87,54 Ceftriaxone 88 90,61 Cefepim 86 88,16 Imipenem 78 80,41 Meropenem 78 80,41 Ticarcillin 73 75,64 Gentamycin 83 85,09 Amikacin 85 87,12 Ciprofloxacine 73 75,33 Levofloxacine 59 60,43 Cotrimoxazole 84 86,82 Doxycycline 29 30,21 Colistin 6,17 Cefoperazole/sulbatam 5,06 Dưới áp lực chọn lọc kháng sinh sử dụng thực hành điều trị, VK gây bệnh có xu hướng gia tăng mức độ đề kháng với nhóm kháng sinh Trong nghiên cứu này, chủng A baumannii có tỷ lệ đề kháng cao với hầu hết kháng sinh thông thường dùng bệnh viện (kháng > 75% với 11/15 loại kháng sinh thử nghiệm) Trong đó, tỷ lệ kháng nhóm carbapenem với đại diện imipenem meropenem 80,41% VK nhạy cảm với colistin (93,83%) cefoperazole/ sulbatam (94,94%) Kết khảo sát tương tự với nghiên cứu Dương Hoàng Lâm [1] Nguyn Thanh H [2] Tạp chí y - dợc học qu©n sù sè 2-2017 Kết phát gen blaOXA chủng A baumannii Trong số 97 chủng A baumannii phân lập được, 78 chủng có biểu kháng kháng sinh nhóm carbapenem chọn để phát gen blaOXA phản ứng multiplex PCR Hình 1: Kết phát gen blaOXA multiplex PCR (M: Marker GeneRulerTM 1kb; 1: blaOXA_51; 2: blaOXA_51 blaOXA_23; 3: blaOXA_51 blaOXA_58; 4: chứng âm) Kết điện di hình cho thấy phân đoạn ADN khuếch đại với cặp mồi gen blaOXA_51 có kích thước khoảng 353 bp; gen blaOXA_51 tìm thấy dạng gen đường chạy dạng phối hợp với gen blaOXA khác đường chạy Phân đoạn ADN có kích thước khoảng 501 kb, tương ứng với gen blaOXA_23, gen tìm thấy dạng phối hợp với gen blaOXA_51 Phân đoạn ADN với kích thước khoảng 599 bp sản phẩm khuếch đại từ cặp mồi gen blaOXA_58, gen xuất gen blaOXA_51 chủng A baumannii Bảng 2: Tỷ lệ gen blaOXA phát A baumannii Gen blaOXA Số lượng Tỷ lệ % blaOXA_51 23 29,49 blaOXA_51 + blaOXA_23 50 64,1 blaOXA_51 + blaOXA_58 6,41 Tổng số 78 100 Cả ba gen blaOXA_51, blaOXA_23 blaOXA_58 tìm thấy chủng A baumannii có biểu kháng nhóm carbapenem phân bố gen khác Chỉ có gen blaOXA_51 xuất đơn 23 chủng VK (29,49%); 50 chủng (64,1%) VK mang đồng thời gen blaOXA_51 blaOXA_23 chủng (6,41%) vừa mang gen blaOXA_51 vừa mang gen blaOXA_58 BlaOXA_51 gen nội giúp VK kháng tự nhiên với kháng sinh nhóm carbapenem có A Baumannii Do vậy, sử dụng phương pháp để xác định loài VK [5, 6] Kết phát gen blaOXA_51 có giá trị khẳng định thêm chủng VK mang gen A baumannii Sự xuất kiểu cách phân bố gen blaOXA chủng A baumannii tìm thấy chủng A baumannii nghiên cứu Nguyễn Thị Thanh Hà [6] Gen blaOXA_58, gen kháng thuốc nằm plasmid có khả lan truyền chủng VK chúng tiếp xúc với nhau, tìm thấy chủ yếu chủng A baumannii châu Âu, có báo cáo ghi nhận lưu hành gen khu vực châu Á [2, 7, 9] Tuy nhiên, gen blaOXA_58 tìm thấy số chủng A baumannii nghiên cứu (6,41%) Nguyn Th Thanh H 43 Tạp chí y - dợc häc qu©n sù sè 2-2017 (11,3%) Mặc dù gen tìm thấy với tỷ lệ thấp, cho thấy phần khả tiến hóa đặc tính kháng thuốc A baumannii Việt Nam Thực tế cho thấy ý nghĩa tầm quan trọng việc sử dụng kháng sinh an toàn, hợp lý thực hành điều trị công tác kiểm soát nhiễm khuẩn sở y tế KẾT LUẬN - Tổng số 97 chủng A baumannii phân lập từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng, chủ yếu từ bệnh phẩm hơ hấp (đờm 60,31%; dịch rửa phế quản 10,73%) - > 75% chủng A baumannii kháng với kháng sinh thông thường dùng bệnh viện; kháng với nhóm carbapenem (imipenem meropenem) xuất 78 chủng VK (80,41%); VK nhạy cảm với colistin cefoperazole/sulbatam - Gen blaOXA_51 tìm thấy tất chủng A baumannii có biểu kháng nhóm carbapenem (gen tồn dạng đơn dạng phối hợp với gen blaOXA khác) - Gen blaOXA_51 tìm thấy với gen blaOXA_23 64,1% chủng A baumannii - Gen blaOXA_51 tìm thấy với gen blaOXA_58 6,41% chủng A baumannii TÀI LIỆU THAM KHẢO Dương Hoàng Lân, Trần Thị Thanh Nga, Mai Nguyệt Thu Hồng, Lục Thị Vân Bích Tình hình nhiễm Acinetobacter spp nhập viện Bệnh viện Chợ Rẫy từ 01 - - 2010 đến 44 31 - 12 - 2010 Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh 2012,16 (1), tr.104-109 Nguyễn Thị Thanh Hà Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng vi sinh bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết A baumannii (2011 - 2012) Luận án Tiến sỹ Y học Viện Nghiên cứu Khoa học Y Dược Lâm sàng 108 Hà Nội 2015 Anna M.G.V, Veronica V.G Antibioticresistant A baumannii increasing success remains a challenge as a nosocomial pathogen Review article Journal of Pathogens 2016 Cebula T.A, Payne W.L, Fegn P Simulataneous identification of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and their Shiga-like toxin type by mismatch amplification mutation assay multiplex PCR J Clin Microbiol 1995, 33(1), pp.248-250 Cicek A.C, Saral A, Iraz M et al OXA and GES-type beta-lactamases predominate in extensively drug-resistant A baumannii isolates from a Turkish University Hospital Clin Microbiol Infect 2014, 20(5), pp.410-415 Lee Y.T, Kuo S.C, Chiang M.C et al Emergence of carbapenem-resistant nonbaumannii species of Acinetobacter harboring a blaOXA-51-like gene that is intrinsic to A baumannii Antimicrob Agents Chemother 2012, 56(2), pp.1124-1127 Perez F, Hujer A.M, Hujer K.M et al Global challenge of multidrug-resistant A baumannii Antimicrob Agents Chemother 2007, 51, pp.3471-3484 Woodford N, Ellington M.J, Coelho M.J et al Multiplex PCR for genes encoding prevalent OXA carbapenemases in Acinetobacter spp Int J Antimicrob Agents 2006 27(4), pp.351-353 Zhao S, Jiang D, Xu P et al An investigation of drug-resistant A baumannii infections in a comprehensive hospital of East China Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials 2015, 14:7, doi:10.1186/s12941-015-0066-4 ... [1] cho thấy A baumannii tác nhân quan trọng gây nhiễm khuẩn hô hấp 42 Mức độ kháng kháng sinh A baumannii Bảng 1: Tỷ lệ đề kháng với kháng sinh 97 chủng A Baumannii Kháng sinh Đề kháng Số lượng... ghi phân tích gel BioDoc KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết phân lập A baumannii từ loại bệnh phẩm Tổng số có 97 chủng A baumannii phân lập từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng * Tỷ lệ A baumannii phân lập. .. gen blaOXA số chủng A baumannii phân lập từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng bệnh viện khu vực Thái Nguyên ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 97 chủng A baumannii phân lập từ mẫu bệnh