Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá sự biến đổi hình thái mô tinh hoàn sau trữ lạnh. Bước đầu so sánh hai chất trữ lạnh chậm mô tinh hoàn là glycerol và DMSO. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2012 NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM TRỮ LẠNH MƠ TINH HỒN VỚI HAI CHẤT BẢO QUẢN GLYCEROL VÀ DMSO Nguyễn Đình Tảo*; Lê Thị Thu Hiền* CS TÓM TẮT Tiến hành phân tích tinh trùng (TT) trªn 65 mẫu mơ tinh hồn 12 chuột nhắt trƣởng thành, 25 mẫu sử dụng glycerol, 30 mẫu sử dụng DMSO, mẫu mô tƣơi mẫu sau rã đông Kết quả: tỷ lệ ống sinh tinh (OST) có cấu trúc bình thƣờng, chất lƣợng TT đƣợc phân lập từ mơ tinh hồn sau trữ lạnh nhóm sử dụng glycerol so với nhóm DMSO Tuy cấu trúc OST chất lƣợng TT đƣợc phân lập từ mô tinh hồn sau trữ lạnh giảm, nhƣng có đủ số lƣợng dùng hỗ trợ sinh sản * Từ khóa: Mơ tinh hồn; Trữ lạnh; Chất bảo quản; Glycerol; DMSO EXPERIMENTAL STUDY ON TESTICULAR TISSUE CRYOPRESERVATION WITH GLYCEROL AND DMSO Summary A semen analysis was done on 65 testicular tissue samples from 12 mice, of which 25 samples were preserved by glycerol (group 1), 30 samples preserved by DMSO (group 2), fresh and postfreezed samples Result: Normal testicular tubuli and quality of sperm from group were worse than that of group Although the structure of testicular tubuli and quality of sperm from testicular reduced, it was adequate for ISCI * Key words: Testicular tissue; Cryopreservation; Glycerol; DMSO ĐẶT VẤN ĐỀ Đối với trƣờng hợp vô sinh khơng có TT tinh dịch, việc thu nhận TT từ mào tinh mơ tinh hồn cần thiết để thực hỗ trợ sinh sản thông qua thủ thuật nhƣ MESA, PESA, TESE, Tuy nhiên, thủ thuật gây tai biến nhƣ đau, chảy máu, nhiễm khuẩn… hay gây biến chứng tổn thƣơng mào tinh, mơ tinh hồn, ảnh hƣởng đến chức sinh sản tình dục từ nhẹ tới nặng, chí khơng hồi phục Thủ thuật nhiều lần gây áp lực tâm lý, tăng chi phí điều trị cho bệnh nhân Trữ lạnh mơ tinh hồn gióp bảo quản TT để làm ICSI thực chu kỳ hỗ trợ sinh sản Kỹ thuật góp phần giảm số lần ngƣời chồng phải đến bệnh viện để thực thủ thuật thu nhận TT, hạn chế tai biến, biến chứng thủ thuật, giảm chi phí thời gian điều trị cho ngƣời bệnh, giúp bác sỹ ngƣời bệnh chủ động trình điều trị Có nhiều phƣơng pháp trữ lạnh TT từ mào tinh mơ tinh hồn, phƣơng pháp có ƣu điểm hạn chế định * Học viện Quân y Phản biện khoa học: PGS TS Quản Hoàng Lâm GS TS Hồng Văn Lương 34 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2012 Hiện giới, nhiều trung tâm hỗ trợ sinh sản triển khai áp dụng lƣu trữ TT từ mào tinh OST sử dụng TT thu nhận từ OST trữ lạnh để làm ICSI Ở nƣớc ta, thu nhận TT từ mào tinh mơ tinh hồn kỹ thuật MESA, PESA, TESE… bƣớc đầu cho kết khả quan [9, 10] Tuy nhiên, việc trữ lạnh mô tinh hoàn để hỗ trợ sinh sản cần tiếp tục đƣợc nghiên cứu Trên sở khoa học nhu cầu thực tế, tiến hành nghiên cứu đề tài nhằm: - Đánh giá biến đổi hình thái mơ tinh hồn sau trữ lạnh - Bước đầu so sánh hai chất trữ lạnh chậm mơ tinh hồn glycerol DMSO ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu - DMSO (D2650, Sigma, Đức): ống ml - Ferticult aspiration 100 ml - Ferticul flushing (Fertipro, Bỉ) 20 ml Phƣơng pháp nghiên cứu * Phương pháp trữ lạnh mơ tinh hồn: Mẫu mơ tinh hồn sau lấy cho vào đĩa Petri có chứa dung dịch ferticult aspiration, sau đó, rửa hết máu bám chuyển sang đĩa khác có chứa mơi trƣờng ferticult flushing, rửa nhẹ nhàng, chuyển mẫu mô vào ống Nunc 1,8 ml đƣợc ghi mã số, nhỏ giọt chất bảo quản lạnh glycerol DMSO Bảo quản tất mẫu tháng, sau rã đông đánh giá Phƣơng pháp đánh giá * Với mẫu mơ tinh hồn: tiêu kính hiển vi quang học: đánh giá OST vật kính 40X theo phƣơng pháp bán định lƣợng Victoria Keros [6] - điểm: hủy hoại nghiêm trọng > 50% OST, có 2/3 yếu tố sau: 65 mẫu mơ tinh hồn 12 chuột nhắt trƣởng thành, chia ngẫu nhiên thành nhóm: + Phá vỡ kết nối tế bào OST; lớp tế bào tách khỏi màng đáy; nhân tinh nguyên bào bị thu nhỏ - 55 mẫu trữ lạnh - rã đông (25 mẫu sử dụng hóa chất bảo quản glycerol, 30 mẫu sử dụng DMSO) Đông lạnh tháng, sau rã đơng + Màng nhân tế bào leydig bị phá hủy, chất đệm bị tan rã; - Tiến hành phân lập TT 10 mẫu (5 mẫu mô tƣơi mẫu sau rã đông), đánh giá tỷ lệ vận động tỷ lệ sống chết - điểm: cấu trúc OST cã sù thay đổi nhỏ * Hóa chất thiết bị sử dụng nghiên cứu: Hóa chất: - Glycerol (Sperm Frezze - Fertipro, Bỉ): lọ 20 ml + Màng đáy bị bong khỏi lớp áo xơ OST - điểm: khơng có thay đổi Điểm 1,2: cấu trúc OST đƣợc coi bình thƣờng * Với mẫu TT thu sau phân lập từ mơ tinh hồn chuột trước sau rã đơng: - Đánh giá độ di động TT trƣớc sau rã đơng theo tiêu: 36 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2012 + TT di động tiến tới + TT vận động chỗ + TT di động: tổng TT di động tiến tới TT vận động chỗ - Tỷ lệ sống TT trƣớc sau rã đông: đánh giá qua tiêu nhuộm Eosin Nigrosin Những TT bắt màu hồng đỏ TT chết, TT không bắt màu TT sống KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Đánh giá cấu trúc mơ tinh hồn trƣớc sau rã đơng * Cấu trúc mơ tinh hồn trước đơng lạnh: Bảng 1: Đặc điểm mơ tinh hồn chuột trƣớc trữ lạnh ĐIỂM ĐIỂM ĐIỂM + ĐIỂM 77 82 159 41 38,5 ± 8,5 40,9 ± 10,4 79,4 ± 8,6 20,6 ± 8,5 Số lƣợng OST (200) Tỷ lệ (%) Cấu trúc OST bình thƣờng mơ tinh hồn chuột trƣớc trữ lạnh chiếm 79,4%; 20,6% OST bị thƣơng tổn, thƣờng gặp tế bào thành OST bị bong khỏi màng đáy, mô kẽ bị tan rã * Cấu trúc mơ tinh hồn chuột sau đơng lạnh: 25 mẫu mơ sử dụng chất bảo quản glycerol (nhóm I), 30 mẫu mơ sử dụng DMSO (nhóm II), mẫu sau rã đơng làm tiêu kính hiển vi quang học, tiêu đánh giá 10 OST Nhƣ vậy, nhóm I có 500 OST, nhóm II có 600 OST đƣợc đánh giá Bảng 2: So sánh kết trữ lạnh mơ tinh hồn sử dụng chất bảo quản glycerol DMSO ĐIỂM ĐIỂM ĐIỂM ĐIỂM + ĐIỂM OST (n = 500) 32 77 109 391 Tỷ lệ % 6,4 ± 5,1 15,4 ± 8,2 21,8 ± 10,8 78,2 ± 10,7 OST (n = 600) 185 253 438 162 Tỷ lệ % 30,8 ± 6,7 42,2 ± 8,1 73,0 ± 9,43 27,0 ± 9,48 PHƢƠNG PHÁP Nhóm I Nhóm II p < 0,01 Ở nhóm sử dụng glycerol làm chất bảo quản lạnh, sau rã đơng có 78,2% OST bị thƣơng tổn; 21,8% OST có cấu trúc bình thƣờng Ở nhóm mơ trữ lạnh sử dụng DMSO, tỷ lệ lần lƣợt 27,0% 73% Các tổn thƣơng thƣờng gặp nhóm I tế bào bong khỏi màng đáy, liên kết tế bào, màng đáy khơng ngun vẹn bị bong khỏi lớp áo xơ OST, mơ kẽ bị tổn thƣơng, có vị trí mơ kẽ tan rã hồn tồn, nhóm II gặp thƣơng tổn tƣơng tự nhƣng 37 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2012 Kết trữ lạnh TT đƣợc phân lập từ mô tinh hoàn chuột * Độ di động: Bảng 3: So sánh độ di động TT đƣợc phân lập từ mô tinh hoàn sau trữ lạnh sử dụng chất bảo quản glycerol DMSO SAU TRỮ LẠNH TRƢỚC TRỮ LẠNH Nhóm I Nhóm II TT tiến tới (%) 2,2 ± 1,7 0,00 1,3 ± 1,0 TT vận động chỗ (%) 25,7 ± 5,3 4,3 ± 1,2 16,4 ± 6,4 Tổng TT vận động (%) 27,9 ± 7,2 4,3 ± 1,4 17,8 ± 6,9 * Tỷ lệ sống - chết: Bảng 4: So sánh tỷ lệ sống - chết TT đƣợc phân lập từ mơ tinh hồn sau trữ lạnh sử dụng chất bảo quản glycerol DMSO TRƢỚC TRỮ LẠNH Tỷ lệ sống (%) 71,2 ± 6,1 SAU TRỮ LẠNH Nhóm I Nhóm II 17,4 ± 11,4 49,3 ± 9,8 Các loại chất bảo quản (CBQ) hay đƣợc sử dụng glycerol, DMSO (dimethylsulfoxide), PrOH (1,2-propanediol), EG (ethylene glycol hay 1,2 -ethanediol) Các chất thƣờng hoạt động pha trình khử nƣớc, tế bào tiếp xúc với dung dịch có chứa CBQ, diện chúng môi trƣờng ngoại bào khiến chênh lệch áp suất thẩm thấu, giúp rút nƣớc khỏi tế bào, đồng thời CBQ từ từ vào bên tế bào, thay phân tử nƣớc Tùy mục đích phƣơng thức trữ lạnh mà lựa chọn CBQ khác nhau, trữ lạnh TT, mơ tinh hồn, CBQ đƣợc lựa chọn glycerol DMSO Glycerol: hợp chất đƣờng rƣợu, có nhiều tế bào gan động vật sống điều kiện nhiệt độ thấp, giúp máu động vật không bị đơng, đó, tƣơng thích với vật chất sinh hóa tế bào sống Glycerol có ƣu điểm gây độc nên thƣờng đƣợc sử dụng nhiều việc bảo vệ tế bào, nhiên, nhƣợc điểm khả thấm qua màng tế bào chậm Theo Abrishami M (2009) 3, Hallak J (2000) 3, Bell M (1993) 4: pha thêm sodium citrate fructose sodium citrate vào mơi trƣờng có egg yolk, glycerol TEST, thấy khơng có khác so sánh loại môi trƣờng không tốt so với bảo quản glycerol đơn Ngày nay, nhiều nghiên cứu đề cập môi trƣờng phối hợp với glycerol nhƣ TESTCY, GEYC dung dịch bảo quản đƣợc pha sẵn nhƣ sperm frezze Trong nghiên cứu Nguyễn Thị Thu Lan CS (2000) 1 với sperm frezze, số CSF tăng cao có ý nghĩa thống kê so với nhóm glycerol có bổ sung egg-yolk DMSO (Me2SO): chất bảo vệ quan trọng, đƣợc phát sau glycerol DMSO đƣợc sản xuất lƣu hành từ năm 1953 với vai trò dung môi phổ biến Năm 1961, bác sỹ Jacob Đại học Oregon, phát DMSO có tác dụng chất bảo vệ tế bào, mô nhiệt độ lạnh sâu Ngày nay, DMSO chất bảo vệ quan trọng phổ biến để bảo quản tế bào đặc biệt mơ động vật có vú Nhƣợc điểm DMSO khả gây độc cho tế bào cao nhiệt độ cao thời gian tiếp xúc dài, vậy, sử dụng DMSO trữ lạnh, ngƣời ta thƣờng để tế bào tiếp xúc mơi trƣờng có chứa DMSO nhiệt độ thấp (0 - 4oC) TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2012 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu phƣơng pháp trữ lạnh 65 mẫu mơ tinh hồn chuột trƣởng thành, rút số nhận xét sau: Đánh giá biến đổi hình thái mơ tinh hoàn sau trữ lạnh Cấu trúc OST chất lƣợng TT đƣợc phân lập từ mơ tinh hồn trƣớc sau trữ lạnh thay đổi có ý nghĩa thống kê TT thu đƣợc phân lập từ mô tinh hồn sau trữ lạnh đủ số lƣợng dùng hỗ trợ sinh sản Các thƣơng tổn thƣờng gặp tế bào bong khỏi màng đáy, liên kết tế bào, màng đáy khơng ngun vẹn bị bong khỏi lớp áo xơ OST, mơ kẽ bị tổn thƣơng, có vị trí mơ kẽ tan rã hoàn toàn So sánh hai chất trữ lạnh chậm mơ tinh hồn Tỷ lệ OST có cấu trúc bình thƣờng, chất lƣợng TT đƣợc phân lập từ mơ tinh hồn sau trữ lạnh nhóm sử dụng glycerol nhóm DMSO có ý nghĩa thống kê + Tỷ lệ OST có cấu trúc bình thƣờng nhóm I: 21,8%; nhóm II: 73% + Phân lập TT từ mơ tinh hồn sau rã đơng: nhóm I: 4,3% di động; 17,4% TT sống; nhóm II: tỷ lệ di động: 17,8%; tỷ lệ sống 49,3% TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Thị Thu Lan, Đặng Quang Vinh Kỹ thuật trữ lạnh hỗ trợ sinh sản Thụ tinh ống nghiệm 2010, 19, tr.387-408 Hồ Mạnh Tường Trữ lạnh TT ngƣời thụ tinh nhân tạo Thời Y dƣợc học 2000, 5, tr.8-13 3 Abrishami M, Anzar M, Yang Y, Honaramooz A Cryopreservation of immature porcin testis tissue to maintain its developmental potential after xenograffting into recipient mice Theriogenology 2009, 73, pp.86-96 Bell M, Wang R, Hellstrom MJ, Sikka S.C Effect of cryoprotective additives and cryopreservation protocol on sperm membrane lipid perixodation and recovery of motile human sperm J Androl, 1993, 14 (6), pp.472-478 Craft I, Tsirigotis M Simplified recovery, preparation and cryopreservation of testicular spermatozoa Hum Reprod 1995 Keros V Cryopreservation of human fetus testicular tissue and low temperature bank creation for further application in clinical transplantology Prob Cryobiol3, 1999, pp.54-58 Oates R.D, Mulhall J, Burgess C, Cunningham D, Carson R Fertilization and pregnancy using intentionally cryopreserved testiscular tissue as the sperm source for intracytopplasmic sperm injection in 10 men with non-obstructive azoospermia Human Reproduction 1997, Vol 12, No pp.734-739 Palermo G, Joris H, Devroey P, Van Steirteghem A.C Pregnancies after intracytoplasmic sperm injection of single spermatozoon in to an oocyte Lancet 1992, 340, pp.17-18 Saritha K.R, Bongso A Comparative evaluation of fresh and washed human sperm cryopreserved in vapor and liquid phases of liquid nitrogen J Androl 2001, 22 (5), pp.857-862 10 Schoroeder-P I, Zumbe J, Bispink L et al Microsurgical epididymal sperm aspiration: asprirate analysis and straws available after cryopreservation in patient with non-obstructive azoospermia Hum Reprod 2000, 15, pp.2531-2535 ... phân lập từ mô tinh hoàn sau trữ lạnh sử dụng chất bảo quản glycerol DMSO TRƢỚC TRỮ LẠNH Tỷ lệ sống (%) 71,2 ± 6,1 SAU TRỮ LẠNH Nhóm I Nhóm II 17,4 ± 11,4 49,3 ± 9,8 Các loại chất bảo quản (CBQ)... nhàng, chuyển mẫu mô vào ống Nunc 1,8 ml đƣợc ghi mã số, nhỏ giọt chất bảo quản lạnh glycerol DMSO Bảo quản tất mẫu tháng, sau rã đơng đánh giá Phƣơng pháp đánh giá * Với mẫu mô tinh hồn: tiêu kính... tinh hồn sau trữ lạnh - Bước đầu so sánh hai chất trữ lạnh chậm mơ tinh hồn glycerol DMSO ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu - DMSO (D2650, Sigma, Đức): ống ml - Ferticult