Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm chế tạo que thử nhanh phát hiện độc tố SEB của vi khuẩn tụ cầu. Đối tượng và phương pháp: nghiên cứu sử dụng các kháng thể đơn dòng kháng độc tố SEB của vi khuẩn Staphylococcus aureus.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 ĐỘC TỐ SEB (Staphylococcal enterotoxin B) CỦA VI KHUẨN TỤ CẦU VÀNG Hoàng Cao Sạ*; Hoàng Đặng An Sinh**; Phạm Đức Minh*** TÓM TẮT Mục tiêu: chế tạo que thử nhanh phát độc tố SEB vi khuẩn tụ cầu Đối tượng phương pháp: nghiên cứu sử dụng kháng thể đơn dòng kháng độc tố SEB vi khuẩn Staphylococcus aureus Que thử hoạt động dựa nguyên lý phản ứng mi n dịch kháng nguyên-kháng thể xảy màng mỏng So sánh khả phát que thử với kỹ thuật ELISA mẫu nhi m SEB Kết quả: que thử có khả phát độc tố SEB nồng độ 50 ng/ml, có độ đặc hiệu 100% Ở nồng độ 50 ng/ml 25 ng/ml độc tố SEB mẫu thử, que thử có độ nhạy 95% 57% so với kỹ thuật ELISA Kết luận: Học viện Quân y bước đầu chế tạo thành công que thử nhanh phát độc tố SEB vi khuẩn tụ cầu với quy mơ phòng thí nghiệm Que thử nhanh có giá thành thấp, d sử dụng, khả áp dụng cao thực ti n y học cộng đồng * Từ khóa: Vi khuẩn tụ cầu; Độc tố vi khuẩn tụ cầu; Que thử nhanh Development of a Rapid Test to Detect SEB (Staphylococcal enterotoxin B) Summary Objectives: To produce lateral flow test for rapid detection of SEB (Staphylococcal enterotoxin B) Subjects and methods: This study uses monoclonal antibody against SEB The lateral test operate based on antigen-antibody immune response on a thin membrane The detection ability of the test strip was compared with ELISA on SEB-contaminated samples Results: The lateral flow tests have the ability to detect SEB at concentrations of 50 ng/ml and a specificity of 100% At the concentration of 50 ng/ml and 25 ng/ml of SEB toxin in the samples, the test strip has a respective sensitivity of 95% and 57%; compared to ELISA Conclusion: Military Medical University has initial successfully made the lateral flow test to detect SEB toxin of Staphylococcus aureus The strips are low-cost, easy to use and have high applicability in practice and community medicine * Key words: Staphylococcus aureus; SEB; Lateral flow test * Bệnh viện Đa khoa TP Nam Định ** Học viện Quân y *** Bệnh viện Quân y 103 Người phản hồi (Corresponding): Phạm Đức Minh (drminh103@yahoo.com) Ngày nhận bài: 24/01/2016; Ngày phản biện đánh giá báo: 02/03/2016 Ngày báo đăng: 08/03/2016 44 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong tác nhân gây ngộ độc thực phẩm độc tố vi sinh vật, độc tố SEB (Staphylococcal enterotoxin B) vi khuẩn tụ cầu vàng nguyên nhân hay gặp, gây sốc độc tố dẫn đến tử vong [1, 7] Ngoài nguy gây ngộ độc thực phẩm, vi khuẩn tụ cầu vàng gây nhi m khuẩn huyết chủng đa kháng thuốc nguy hiểm, tỷ lệ tử vong cao [8] Trong hoạt động quân sự, độc tố vi khuẩn tụ cầu có nguy sử dụng trực tiếp vũ khí sinh học nguy hiểm Tại Hoa Kỳ, S aureus tác nhân gây bệnh hàng đầu liên quan đến bệnh truyền qua thực phẩm Trung tâm Kiểm soát Ngăn ngừa Bệnh (CDC) ước tính hàng năm có khoảng 240.000 bệnh nhân với 1.000 ca nhập viện trường hợp tử vong liên quan đến ngộ độc thức ăn tụ cầu vàng [7] Tại Việt Nam, tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm mức báo động, ngộ độc thực phẩm cộng đồng độc tố tụ cầu vàng thường xuyên xảy [1] Chính vậy, phát độc tố vi khuẩn tụ cầu vàng thực phẩm số bệnh phẩm khác giúp cho q trình chẩn đốn, điều trị dự phòng đạt kết cao [1, 4] Hiện nay, que thử nhanh chiếm ưu ứng dụng y học lĩnh vực liên quan Nguyên lý que thử nhanh Singer Plotz (1956) [6] khởi đầu nghiên cứu phát triển, nghiên cứu có nhiều cải tiến Đối tượng phát nguyên liệu chế tạo que thử nhanh không dừng lại kháng nguyên, kháng thể mà sợi Oligos [5] Với ưu điểm giá thành thấp, d áp dụng, độ xác cao, que thử nhanh mục tiêu nhiều phòng thí nghiệm cơng ty sản xuất sản phẩm liên quan đến sinh học phân tử Học viện Quân y quản lý khai thác hệ thống dây chuyền sản xuất que thử nhanh, bước đầu chế tạo thành công số loại que thử ứng dụng chẩn đoán [2, 4, 5] Hệ thống phun que thử (Arista, Hoa Kỳ), có khả hoạt động bán tự động tự động hoàn toàn với công suất từ 1.000 10.000 que thử/24 Hiện có số phương pháp thường dùng để phát vi khuẩn tụ cầu vàng độc tố SEB thực phẩm bao gồm: nuôi cấy; phương pháp ELISA; phương pháp khuếch đại gen (PCR), que thử nhanh [8] Trong que thử nhanh có ưu sàng lọc ưu tiên sử dụng Xuất phát từ u cầu đó, đề tài nhằm: Chế tạo thành cơng que thử nhanh phát độc tố SEB vi khuẩn tụ cầu với quy mơ phòng thí nghiệm ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu - Độc tố chuẩn: độc tố SEB (Staphylococcal enterotoxin B) vi khuẩn tụ cầu, code S4881 (Sigma) - Độc tố đối chứng: (1) độc tố SEA (Staphylococcal enterotoxin A) vi khuẩn tụ cầu, code S9399 (Sigma); (2) độc tố không chịu nhiệt LT (heat labile toxin) vi khuẩn E coli, code E8656 (Sigma); (3) độc tố CTX (Cholerae toxin) vi khuẩn tả, code G-117 (Enza Life Sciences) 45 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 Vật liệu nghiên cứu * Dụng cụ, thiết bị: dụng cụ thiết bị chuyên dụng Phòng Vi sinh vật Mầm bệnh sinh học, hệ thống sản xuất que thử nhanh (Hãng Arista, Hoa Kỳ) Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y * Kháng thể: Có kháng thể gắn lên màng: kháng thể phát (KT1), kháng thể bắt giữ (KT2) kháng thể kiểm tra (KT3) Kháng thể phát (Detection Antibody) C86400M gắn với hạt vàng, sau gắn lên màng chứa cộng hợp (Conjugate pad) Kháng thể bắt giữ (Capture antibody) C86220M, gắn lên màng NC vị trí test line Kháng thể kiểm tra ABCAM-0500, gắn lên màng NC vị trí vạch đối chứng (control line) Phƣơ g pháp ghi cứu * Phương pháp chế tạo que thử nhanh: - Thiết kế: Thiết kế chế tạo que thử nhanh dựa theo quy trình Cơng ty Arista (Hoa Kỳ) Đầu tiên loại màng xử lý dung môi thích hợp, để khơ, phun lên màng kháng thể, cuối lắp ghép phận giữ chặt đế nhựa Quá trình tiến hành điều kiện nhiệt độ khoảng 25oC, độ ẩm tương đối 40% Sau hoàn thành, cất giữ sản phẩm gói hàn nhiệt kín, có vật liệu chống ẩm bảo quản * Màng gắn que thử: Mỗi test cấu tạo phận sau: màng hút mẫu (Sample pad); màng chứa chất cộng hợp màu (Conjugate pad); màng NC (Nitrocellulose membrance); màng hút (Absorbent pad) đế nhựa giữ (Plastic adhesive backing card) que thử Được đặt mua Công ty Ahlstrom, P.O Box 329, Salmisaarenaukio 1, FI-00180 Helsinki, Phần Lan Công ty Advanced Microdevices (mdi), 20-21 Industrial Area, Ambala Cantt 133 006, Ấn Độ * Dung môi xử lý màng: Các màng có chức riêng biệt tối ưu hóa hoạt động que thử, phải xử lý trước gắn lên test Mỗi dung môi đặc hiệu cho loại màng định làm tăng hoạt tính màng sau xử lý 46 Màng hút mẫu Màng chứa chất cộng hợp màu (chứa KT1) Màng phát Màng nitrocellulose (a) Vạch phát mẫu (chứa KT2) (b) Vạch đối chứng (chứa KT3) Màng hút Đế nhựa giữ Hình 1: Sơ đồ cấu tạo test phát nhanh - Nguyên lý hoạt động que thử: Kháng thể phát (KT1) gắn với kháng nguyên đặc hiệu gặp kháng thể bắt giữ (KT2) Nếu phản ứng mi n dịch đặc hiệu xảy cho kết vạch dương tính Tất phức hợp tiếp gặp kháng thể kiểm tra (KT3) làm xuất màu vạch đối chứng TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 - Tối ưu hóa: Cơng đoạn tối ưu hóa cho công thức phối hợp tối ưu nồng độ kháng thể hóa chất khác que nhúng cho đảm bảo nguyên tắc “sử dụng hàm lượng tối thiểu chất để tạo thiết bị có tính tối ưu” * Phương pháp thử nghiệm que nhúng với mẫu thử: Đối chiếu que nhúng với kỹ thuật ELISA thử nghiệm với mẫu độc tố để xác định độ nhạy độ đặc hiệu Đánh giá độ nhạy que thử qua khả phát mẫu SEB nồng độ pha loãng khác (5 - 200 ng/ml) Kiểm chứng độ đặc hiệu với độc tố SEA vi khuẩn tụ cầu, độc tố không chịu nhiệt LT vi khuẩn E coli độc tố CTX vi khuẩn tả Địa điểm thời gian nghiên cứu * Địa điểm nghiên cứu: Labo Vi sinh mầm bệnh sinh học, Trung tâm nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y Khoa Vi sinh vật, Bệnh viện Quân y 103 * Thời gian nghiên cứu: từ 10 - 2014 đến 10 - 2015 Xử lý số liệu Quản lý phân tích số liệu phần mềm Epi.info KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Chế tạo tối ƣu hóa que hú g * Nồng độ kháng thể màng que thử: Hình 1: Que thử có hàm lượng KT1: 0,25 µg/card; KT2: 0,5 µg/card; KT3: 0,25 µg/card Hình 2: Que thử có hàm lượng KT1: 0,5 µg/card; KT2: 0,5 µg/card; KT3: 0,25 µg/card 47 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 Hình 3: Que thử có hàm lượng KT1: 0,5 µg/card; KT2: µg/card; KT3: 0,25 µg/card Vị trí KT3: vạch chứng; vị trí KT2: vạch test Que thử có hàm lượng KT1: 0,5 µg/card; KT2: 0,5 µg/card; KT3: 0,25 µg/card cho tín hiệu nhận biết * Khả phát que thử mẫu độc tố chuẩn: Hình 4: Thử que nhúng với độc tố SEB nồng độ 25 ng/ml Hình 5: Thử que nhúng với độc tố SEB nồng độ 50 ng/ml Vị trí KT3: vạch chứng; vị trí KT2: vạch test Que thử cho kết dương tính (2 vạch) rõ nét mẫu SEB nồng độ 50 ng/ml sau thời gian 15 phút Tí h đặc hiệu que thử 48 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 Hình 6: Thử que nhúng với độc tố SEA, CTX, LT nồng độ 100 ng/ml Vị trí KT3: vạch chứng; vị trí KT2: vạch test Que thử cho kết âm tính (tín hiệu vạch chứng KT3) với độc tố SEA vi khuẩn Staphylococcus aureus, độc tố CTX vi khuẩn tả độc tố LT vi khuẩn Escherichia coli cho kết âm tính So sánh que thử với kỹ thuật ELISA phát hiệ độc tố SEB Bảng 1: Kết thử nghiệm que thử nhanh ELISA mẫu thực phẩm nhi m SEB nồng độ 50 ng/ml ELISA Kết Tổng (+) (-) (+) 114 114 (-) 6 120 120 Que thử nhanh Tổng Se [95%CI] = 0,95 [0,89 - 0,98] Bảng 2: Kết thử nghiệm que thử nhanh ELISA mẫu thực phẩm nhi m SEB nồng độ 25 ng/ml ELISA Kết Tổng (+) (-) (+) 68 68 (-) 51 52 119 40 Que thử nhanh Tổng Se [95%CI] = 0,57 [0,48 - 0,66] Ở nồng độ 50 ng/ml 25 ng/ml độc tố SEB mẫu thử, que thử có độ nhạy 95% 57% so với kỹ thuật ELISA khả phát độc tố SEB 49 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 BÀN LUẬN Quy trình chế tạo que thử nhanh Nghiên cứu sử dụng kết từ khảo sát trước tác giả 04 kháng thể đơn dòng phát độc tố SEB cho thấy kháng thể có khả phát kháng nguyên khác nhau, xếp theo thứ tự tăng dần độ nhạy là: C01544M, C01543M, C86220M, C86400M Dựa kết đó, q trình sàng lọc lựa chọn cho cặp kháng thể tối ưu để sử dụng que thử Kết khảo nghiệm cho thấy nồng độ kháng thể 0,5 µg/card màng cộng hợp màng NC cặp kháng thể C86220M, C86400M cho tín hiệu rõ Kết cho thấy tín hiệu que thử phát mắt thường nồng độ độc tố mẫu thử 50 ng/ml - 10 phút Do thời gian phát nhanh, nên thực tế que thử nhanh giúp ích sàng lọc nhanh mẫu thực phẩm nhi m độc tố trước tiến hành xét nghiệm sâu hơn, điều làm giảm chi phí xét nghiệm chẩn đốn Khi áp dụng phương pháp với phương pháp khác, đặc biệt phương pháp khuếch đại gen định lượng mi n dịch định lượng, nhà khoa học trả lời nhanh xác chủng loại vi khuẩn, số lượng Sản xuất que thử cần quan tâm đến giá thành sản phẩm, cần sử dụng lượng nguyên liệu tối thiểu để có sản phẩm đạt u cầu Chính lý nên công thức phối hợp tối ưu hàm lượng kháng thể màng cộng hợp (KT1-kháng thể phát hiện), vạch kiểm tra (KT2-kháng thể bắt giữ), vạch đối chứng (KT3) lần lượt: 0,5; 0,5; 0,25 µg/card Với nguyên liệu hóa chất phục vụ chế tạo que thử tại, giá thành 01 que thử khoảng 10.000 VND Trong tương lai, nghiên cứu dùng kháng thể polyclonal thay cho monoclonal nhằm tăng ngưỡng phát giảm chi phí tạo kít mầm bệnh bị nhi m thực phẩm Khả ă g phát que thử nhanh với độc tố SEB vi khuẩn tụ cầu vàng kỹ thuật ELISA để so sánh khả phát Que thử nhanh sau tối ưu thử với độc tố SEB nồng độ khác thấy que thử có độ tương đồng cao 50 nồng độ độc tố có mẫu [4] Để đánh giá tính đặc hiệu que thử, số đối tượng chọn độc tố SEA vi khuẩn tụ cầu vàng độc tố hai vi khuẩn đường ruột phổ biến có tính độc cao, độc tố khơng chịu nhiệt LT (heat labile toxin) vi khuẩn E coli độc tố CTX (Cholerae toxin) vi khuẩn tả Kết cho thấy que thử khơng có phản ứng chéo với loại độc tố SEA, LT CTX Dựa tương đồng nguyên lý mi n dịch [3, 6], nghiên cứu lựa chọn độc tố SEB mẫu nghiên cứu nồng độ khác Kết cho (95%) với ELISA nồng độ 50 ng/ml TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 thấp (57%) nồng độ 25 ng/ml Điều tồn đáp ứng u cầu thực ngưỡng phát tế điều tra vụ dịch ELISA (10 ng/ml) thấp nhiều so với Nhờ đặc tính này, que thử tạo phát nhanh xác độc tố SEB nên khẳng định nguyên nhân gây ngộ độc trực tiếp Chứng tỏ que thử có ý nghĩa thực ti n cao so với kỹ thuật phát vi khuẩn S aureus đơn que thử nhanh (50 ng/ml) [3] nên khả phát ELISA nhạy so với que thử nhanh, đặc biệt mẫu có nồng độ thấp Trên thực tế, để chẩn đốn xác, cần phối hợp số kỹ thuật, que thử nhanh nghiệm pháp sàng lọc [4, 5] Giá trị ứng dụng thực tiễn que thử nhanh phát hiệ độc tố SEB vi khuẩn tụ cầu Tại Việt Nam, tình hay gặp ngộ độc thực phẩm tụ cầu khuẩn vàng (Staphylococcus aureus) tiệc cưới, liên hoan Do phải chuẩn bị cho nhiều suất ăn nên thức ăn cần nấu trước để qua đêm (> giờ) Tụ cầu khuẩn nhi m từ môi trường từ người chế biến phát triển nhanh thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng thích hợp (trứng, thịt, hải sản) sinh độc tố đường ruột Độc tố bền với nhiệt, trước ăn, có đun lại không huỷ độc tố Khi ăn phải thức ăn có nhi m độc tố SEB, sau 30 phút đến xuất triệu chứng nôn mửa, tiêu chảy [1] Do ngưỡng gây bệnh độc tố SEB thấp, cần 100 ng độc tố gây triệu chứng ngộ độc nên kỹ thuật phát cần có độ nhạy cao [8] Que KẾT LUẬN Đã chế tạo que thử nhanh phát độc tố vi khuẩn tụ cầu vàng quy mơ phòng thí nghiệm Que thử sử dụng kháng thể phát (Detection Antibody) C86400M với khối lượng 0,5 µg/card, kháng thể bắt giữ (Capture antibody) C86220M với khối lượng 0,5 µg/card kháng thể kiểm tra (Control antibody) ABCAM-0500 với khối lượng 0,25 µg/card Que thử có khả phát độc tố SEB nồng độ 50 ng/ml, có độ đặc hiệu tuyệt đối độ nhạy 95% so với kỹ thuật ELISA nồng độ TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Hùng Long, Phạm Đức Minh Thực trạng ngộ độc thực phẩm giai đoạn 2006 - 2010 Tạp chí Y - Dược học Quân 2015, Vol 40, No 2, tr.02-09 Phạm Đức Minh, Lê Quốc Tuấn, Nguyễn Hùng Long, Hoàng Văn Lương Nghiên cứu chế tạo test thử nhanh phát trực khuẩn Listeria monocytogenes Tạp chí thử nhanh nghiên cứu có Y - Dược học Quân 2012, Vol 37, No 2, ngưỡng phát 50 ng/ml nên hồn tr.72-77 51 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 Phạm Đức Minh, Nguyễn Hùng Long, Singer JM and Plotz CM The latex Hoàng Văn Lương Nghiên cứu ứng dụng fixation test Application to the serologic kỹ thuật ELISA phát độc tố vi khuẩn tả diagnosis of rheumatoid arthritis American Journal of Medicine 1956, 21, pp.888-892 Tạp chí Y học Việt Nam 2014, tập 419, (1), tr.46-49 Phạm Đức Minh, Hoàng Văn Lương Nghiên cứu chế tạo test thử nhanh phát độc tố vi khuẩn tả Tạp chí Y - Dược học Quân 2015, Vol 40, No 2, tr.18-24 Scallan E, Hoekstra RM, Angulo FJ, Tauxe RV, Widdowson MA, Roy SL, Jones JL, Griffin PM Foodborne illness acquired in the United States-major pathogens Emerg Infect Dis 2011, 17 (1), pp.7-15 Hong Nhung Tran et al Optical nanoparticles: Tallent SM, Degrasse JA, Wang N, Mattis DM, Kranz DM Novel platform for the synthesis and biomedical application Adv detection of Staphylococcus aureus enterotoxin Nat Sci.: Nanosci Nanotechnol (2015) 023002 B in foods Appl Environ Microbiol 2013, 79 (5), (14pp) doi:10.1088/2043-6262/6/2/023002 pp.1422-1427 52 ... độc tố SEB (Staphylococcal enterotoxin B) vi khuẩn tụ cầu, code S4881 (Sigma) - Độc tố đối chứng: (1) độc tố SEA (Staphylococcal enterotoxin A) vi khuẩn tụ cầu, code S9399 (Sigma); (2) độc tố. .. chọn độc tố SEA vi khuẩn tụ cầu vàng độc tố hai vi khuẩn đường ruột phổ biến có tính độc cao, độc tố không chịu nhiệt LT (heat labile toxin) vi khuẩn E coli độc tố CTX (Cholerae toxin) vi khuẩn. .. độc thực phẩm độc tố vi sinh vật, độc tố SEB (Staphylococcal enterotoxin B) vi khuẩn tụ cầu vàng nguyên nhân hay gặp, gây sốc độc tố dẫn đến tử vong [1, 7] Ngoài nguy gây ngộ độc thực phẩm, vi