Bài viết nghiên cứu xác định các subtype HIV-1 bằng PCR đa mồi và giải trình tự của 720 mẫu trên các khu vực nghiên cứu, xác định được subtype của 679 mẫu, trong đó, chủ yếu là subtype CRF01-AE (98,53%), subtype B (1,33%), subtype CRF25_CPX (0,15%). Không xác định được subtype của 41 mẫu (5,69%). Sử dụng phương pháp PCR đa mồi đã tối ưu nhằm xác định các subtype HIV-1 tại Việt Nam có giá trị tương đương với phương pháp giải trình tự.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 ĐẶC ĐIỂM PHÂN BỐ CÁC SUBTÝP HIV-1 TẠI VIỆT NAM Phạm Đức Minh*; Đặng Xuân Kiên*; Trần Văn Tuấn* TrÇn ThÞ Oanh**; Lê Bách Quang* TĨM TẮT Nghiên cứu xác định subtýp HIV-1 PCR đa mồi giải trình tự 720 mẫu khu vực nghiên cứu, xác định đƣợc subtýp 679 mẫu, đó, chủ yếu subtýp CRF01-AE (98,53%), subtýp B (1,33%), subtýp CRF25_CPX (0,15%) Không xác định đƣợc subtýp 41 mẫu (5,69%) Sử dụng phƣơng pháp PCR đa mồi tối ƣu nhằm xác định subtýp HIV-1 Việt Nam có giá trị tƣơng đƣơng với phƣơng pháp giải trình tự * Từ khóa: HIV-1; Phƣơng pháp PCR đa mồi; Subtýp HIV; Ph©n bè CHARACTERISTICS OF DISTRIBUTION OF SUBTyPe HIV-1 IN VIETNAM Summary The study identified the HIV-1 subtypes by mPCR and sequencing of 720 samples in the study area, the results showed the subtype of the 679 samples, which mainly subtype CRF01-AE (98.53%), subtype B (1.33%), subtype CRF25_CPX (0.15%) The subtype of 41 samples (5.69%) can not be identified Optimal mPCR methods was used for identification of HIV-1 subtype in Vietnam which is equivalent to the sequencing method * Key words: HIV-1; mPCR; HIV subtype; Distribution ĐẶT VẤN ĐỀ HIV có týp HIV-1 HIV-2, hai týp lây truyền qua đƣờng tình dục, đƣờng máu từ mẹ sang Riêng HIV1 có tính đa dạng di truyền cao dễ dàng lây lan nhanh cộng đồng Các chủng HIV-1 đƣợc phân thành nhóm: M, N, O, P, đó, nhóm M chiếm đa số, đƣợc chia thành 10 phân týp, bao gồm: phân týp A, B, C, D, E, F, G, H, J K 49 dạng tái tổ hợp (CRFs) [7] phân týp Phân týp phân bố mang tính trội cho vùng địa lý khác nhau, phân týp lại có tính trội theo đƣờng lây truyền định Ví dụ, Thái Lan, phân týp B trội đối tƣợng tiêm chích ma túy, phân týp E trội trƣờng hợp lây nhiễm qua đƣờng tình dục [6, 7] Nghiên cứu phân bố phân týp dạng tái tổ hợp HIV-1 có giá trị giám sát dịch tễ học tầm quốc gia khu vực, góp phần xây dựng chiến lƣợc dự phòng, phát triển vắcxin thích hợp cho khu vực, đối tƣợng, chế tạo kit chẩn đoán lựa chọn liệu pháp kháng virut đặc hiệu hiệu thuốc kháng virut khác với phân týp [1, 3, 6] * Học viện Quân y ** Bộ Y tế Người phản hồi (Corresponding): Phạm Đức Minh dminhphamduc@gmail.com 33 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu - Đối tƣợng: 720 bệnh nhân (BN) từ Trung tâm Phòng chống HIV-AIDS tỉnh, trại cai nghiện, Trung tâm Giáo dục Lao động Xã hội (số 02, 05), bệnh viện tỉnh, thành phố điều trị HIV-1 Khánh Hòa, Đ¾k Lắk, TP Hồ Chí Minh, Cần Thơ, Tây Ninh, Đà Nẵng, Hà Nội, Yên Bái, Sơn La, Lạng Sơn, Quảng Ninh Nghệ An - Bệnh phẩm: mẫu bệnh phẩm mẫu máu từ đối tƣợng nghiên cứu nhƣ Chia mẫu bệnh phẩm để bảo quản theo máu toàn phần buffy coat, bảo quản -800C Eppendorf 1,5 ml vô trùng - Mẫu chứng: ngƣời khơng có HIV-1 dƣơng tính: 50 BN bị nhiễm HBV nhƣng không nhiễm HIV-1 làm đối chứng (đƣợc xét nghiệm điều trị ngoại trú Bệnh viện 103, Học viện Quân y) Phƣơng pháp nghiên cứu ADN kít QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) Các ADN mồi cho phản ứng mPCR để xác định phân týp HIV (Fumihiro Y [3]), gồm: + BECO5 (7938-7960 bp): 5’ GGCATCAAACAGCTCCAGGCAAG 3’ + BECO3 (8766-8791 bp): 5’AGCAAAGCCCTTTCTAAGCCCTGTCT3’ + BE-ANCH (7963-7985 bp): 5’TCCTGGCTGTGGAAAGATACCTA3’ + B-SPEC (8384-8403 bp): 5’GTCCCCTCGGGGCTGGGAGG 3’ + E-SPEC (8585 bp) 5’ GTCTCAGTCCCTTGAGACTGCTG 3’ + C-SPEC (8615-8638 bp): 5’ AGACCCCAATACTGCACAAGACTT 3’ + F-SPEC (8720-8744 bp): 5’AACAGCTCTACCAGCTCTTTGCAAA 3’ + 5’A (8094-8112 bp):5’ GANAACATGACCTGGCTGC 3’ 3’A (8693-8716 bp): 5’TCTATAACCCTATCTGTCCAGCCA 3’ Cắt ngang phân tích labo để tìm hiểu phân týp HIV-1 + 5’E (8181-8207 bp): 5’CAGGAAAGGAATGAAAAGGATTTGTTA 3’ Xác định cỡ mẫu phƣơng pháp dịch tễ học nghiên cứu tỷ lệ quần thể 3’E (8693-8713 bp): 5’ATAACCCTATCTGTCCACCCC 3’ Mẫu máu đƣợc chống đông, ly tâm tách huyết tƣơng, bảo quản lạnh, vận chuyển Trung tâm Nghiên cứu Y - Dƣợc học Quân sự, Học viện Quân y Tách khối bạch cầu, tách tinh ADN kít QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Đức) + 5’G (8131-8757 bp): 5’ACAATTACACATACCACATATACAGCC 3’ Sử dụng kỹ thuật mPCR xác định phân týp HIV [1, 2, 3]; kiểm chứng phân týp kỹ thuật giải trình tự, đối chiếu với Genbank [7] Tiến hành kỹ thuật nghiên cứu Trung tâm Nghiên cứu Y - Dƣợc học Quân sự, Học viện Quân y Thu thập mẫu máu đối tƣợng HIV (+), sau tách khối bạch cầu, tách tinh 3’G (8694-8716 bp): 5’TCTATAACCCTATCTGTCCAGTT 3’ + 5’D (8037-8058 bp): 5’ACCACTAATGTGCCCTGGAACT 3’ 3’D (8356-8386 bp): 5’ AGGAGGGTCTGAAATGACAGA 3’ * Phƣơng pháp mPCR xác định phân týp HIV-1 với ADN mồi khuếch đại vùng gen env (gp120 gp41) tiến hành theo trình tự sau (cải tiến từ nghiên cứu Fumihiro [2, 3]): PCR1 với ADN mồi BECO3 BECO5 khuếch đại gp120 gp41 35 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 PCR2 xác định phân týp A, E, G với ADN mồi (5’A-3’A), (5’E-3’E), (5’G-3’G) PCR2.1 xác định phân týp A, E, G, B, D, C, F với ADN mồi BE-ANCH mồi xuôi, cặp primer B-SPEC, C-SPEC, E-SPEC F-SPEC mồi ngƣợc khuếch đại đoạn gen đặc hiệu cho HIV-1 phân týp A, B, C, D, E, F G PCR2.2 phân biệt phân týp B, D với ADN mồi 5’D -3’D - Hỗn hợp mix cho phản ứng PCR gồm: 200 µM loại dNTP; 2,5 mM MgCl2; 0,2 pmol loại ADN mồi; U Taq ADN polymerase (Invitrogen) x đệm PCR (20 mM Tris-HCl, pH 8.4, 50 mM KCl), bổ sung nƣớc tới thể tích 25 µl Phản ứng PCR thực hệ thống luân nhiệt, với chu trình nhiệt: phút biến tính 950C, 35 chu kỳ (95oC/45 giây - 64oC/phút 72oC/1,5 phút), cuối chu kỳ tổng hợp 10 phút 72oC Kiểm tra hiệu trình khuếch đại kích thƣớc sản phẩm PCR gel agarose 1% nhuộm ethidium * Phương pháp giải trình tự: lấy ngẫu nhiên 30% sản phẩm phản ứng PCR mẫu nghiên cứu để giải trình trừ xác định subtýp KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU So sánh kết hai phƣơng pháp mPCR giải trình tự Bảng 1: Kết xác định subtýp phƣơng pháp MẪU SỐ MẪU MPCR E B SEQUENCING Kh¸c CRF_AE B Cần Thơ 20 20 TP Hồ Chí Minh 48 47 Khánh Hòa 16 16 16 Tây Ninh 20 20 20 Đắk Lắk 20 19 19 Đà Nẵng 20 19 19 Hà Nội 40 39 38 Yên Bái 20 19 19 Sơn La 16 16 Lạng Sơn 20 19 19 Quảng Ninh 32 29 29 Nghệ An 16 16 TỔNG 288 279 CPX 20 47 1 16 16 278 Tiến hành giải trình tự đối chiếu với phƣơng pháp mPCR cho thấy kết phƣơng pháp tƣơng đƣơng Riêng địa bàn Hà Nội, xuất trƣờng hợp đƣợc xác định subtýp CPX sau giải trình tự, đó, mPCR xác định subtýp E Phân bố subtýp HIV-1 36 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 Bảng 2: Phân bố subtýp HIV-1 theo khu vực nghiên cứu MẪU ÂM TÍNH SUBTÝP DƢƠNG TÍNH E-A B CPX Cần Thơ 45 45 0 TP Hồ Chí Minh 115 114 Khánh Hòa 38 38 0 Tây Ninh 44 44 0 Đắk Lắk 47 46 Đà Nẵng 47 46 Hà Nội 95 93 1 Yên Bái 48 47 Sơn La 38 38 0 Lạng Sơn 48 47 Quảng Ninh 76 73 Nghệ An 38 38 0 TỔNG 41 679 669 100,00 98,53 1,33 0,15 94,31 92,92 1,25 0,14 % (n = 679) % (n = 720) 5,69 Trong số mẫu HIV dƣơng tính đƣợc xác định subtýp, tỷ lệ phổ biến subtýp CRF_01AE (98,53%), tỷ lệ subtýp B 1,13% 01 mẫu CRF25_CPX (0,15%) Sai khác tỷ lệ phân nhóm theo khu vực nghiên cứu khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Bảng 3: Phân bố subtýp HIV-1 theo độ tuổi TUỔI SUBTÝP 18 - 29 30 - 39 40 - 49 50 - 59 > 60 TỔNG n % n % n % n % n % AE 116 17.34 456 68.16 83 12.41 12 1.79 0.30 669 B - 77.78 22.22 - - CPX25 100.0 - - - - Tổng 125 18,41 492 72,46 88 12,96 13 1,91 0,29 679 p > 0,05 Subtýp AE B chủ yếu ngƣời độ tuổi lao động, độ tuổi nhiễm HIV nhiều Việt Nam (p > 0,05) Tuy nhiên, subtýp xuất chủ yếu nghiên cứu nên số liệu chƣa đạt tính đa dạng Mẫu HIV-1 mang subtýp CRF25_cpx 37 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 Hình 1: Chọn trình tự kiểu gen N77 phần mềm Bio edit Trên kết giải trình tự, chọn lọc phần rõ nét trình tự để blast với ngân hàng gen thu đƣợc kết nhƣ sau: Trình tự gen chọn lọc: ACTGGGACGGGATGTACAATGTCGCTCATGCATGCCACTGGATTAGCCAGTGGTATCA CTCATTGCTGCTAATGGCAGTCTCGCAAAAAGAATATAATCAATCTGAAACCTCACAGACAT GCCAAATCATAATATGCATCTTAATGAATCTGTAAATCATTGTACCAACCCTACACATAAACA AAATAACTACTATGACCACCACAAAAATCTATATACAAAAAAAGTAGGAGAAATATAAAAAAA CTTTTTGTGTTGATGTGCACCATGTGTGTGTTTTATAAAAGAGCTGTGGACTACAAGACACT TTTTAATATAGTATATCTTTTACCACCCTCTCAGGAGACTCAAATACACACTCATTTTATAGT CACAGGAGATTTCTCTATACACACACACTGTGATGTATAGTGACAATTACACGCGAGAGGG TATATACATACACTCCCCCGGATAAACACTATAACACTGCACAGAGACA Hình 2: Blast kiểu gen N77 ngân hàng gen NCBI Kết blast cho thấy: trình tự thu đƣợc thuộc HIV-1 với xác suất cao (E-value: 1e-34) 38 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 Hình 3: So trình tự kiểu gen N77 genotyping NCBI So sánh trình tự với genotyping ngân hàng gen NCBI thu đƣợc kết hình mẫu HIV-1 mang subtýp 25_CPX BÀN LUẬN Trong thời gian gần đây, số tác giả nghiên cứu phân bố subtýp HIV khu vực Đông Nam Á Sa Nguon Ta Van (2011) bƣớc đầu tiến hành nghiên cứu 280 BN có HIV (+), bao gåm 140 BN khu vực Hà Nội (KVHN) 140 BN khu vực Viêng Chăn (KVVC) Tác giả tập trung xác định so sánh phân týp HIV-1 đối tƣợng có xét nghiệm HIV dƣơng tính KVHN KVVC; tìm hiểu tƣơng đồng phân týp HIV, làm tiền đề cho nghiên cứu tiếp theo, góp phần thiết kế đồ dịch tế học phân týp HIV-1 Việt Nam, Lào khu vực, giúp nhà khoa học quan chuyên ngành hai nƣớc có thêm số liệu tham khảo nhằm kiểm sốt tình hình nhiễm HIV nƣớc khu vực Kết cho thấy: phân týp dạng tái tổ hợp CRF01-AE HIV-1 phân týp chủ yếu KVHN (98,57%) KVVC (84,30%) Viêng Chăn có tỷ lệ phân týp HIV phức tạp đa dạng Hà Nội Ngoài dạng CRF01AE, phát phân týp A, B, C với tỷ lệ thấp Trong nhóm đối tƣợng nghiên cứu, tiêm chích ma túy gái mại dâm có tỷ lệ phân týp phức tạp đối tƣợng khác [6] Những nghiên cứu ban đầu dịch tễ học phân tử HIV xác định đƣợc phân týp 39 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 lƣu hành Việt Nam Nghiên cứu Viện Công Nghệ Sinh học phát đƣợc phân týp phân týp CRF01_AE (96,7%) phân týp B (3,3%) (Bạch Thị Nhƣ Quỳnh, 2012) [1] Theo thống kê Cục Phòng, chống HIV/AIDS, tỷ lệ nhiễm HIV lây nhiễm qua đƣờng máu đƣờng tình dục cao, lây nhiễm qua đƣờng máu chiếm tỷ lệ cao nhất, tiếp đến lây nhiễm qua đƣờng tình dục thấp lây nhiễm qua đƣờng từ mẹ sang Tỷ lệ lây nhiễm qua đƣờng tình dục đƣợc phát riêng quý I năm 2011 43% Dƣờng nhƣ có chuyển đổi tỷ trọng đƣờng lây nhiễm HIV Toàn quốc phát ngƣời nhiễm HIV 75,2% xã/phƣờng, gần 97,9% quận/huyện 63/63 tỉnh/thành phố Trong tổng số ngƣời nhiễm HIV, nam chiếm 69%, nữ: 31% Tỷ lệ nam giới gấp 2,3 - 2,5 lần so với nữ Hình thái lây nhiễm HIV có khác biệt lớn khu vực nƣớc Khu vực miền Nam, tỷ lệ lây nhiễm HIV qua đƣờng tình dục cao: Thành phố Hồ Chí Minh, Kiên Giang, Đồng Tháp Ngƣợc lại, tỉnh miền Bắc, tỷ lệ ngƣời nhiễm HIV qua đƣờng máu lại cao: Hà Nội, Điện Biên, Nghệ An, Thái Nguyên [4] Trong nghiên cứu này, phƣơng pháp PCR đa mồi đƣợc so sánh với giải trình tự để xác định subtýp HIV 288 mẫu HIV-1 (+) cho kết tƣơng đƣơng Trong 720 mẫu HIV-1 (+), xác định đƣợc subtýp 679 mẫu, đó, subtýp AE B lần lƣợt 98,53% 1,33% Đặc biệt, số mẫu dƣơng tính đƣợc giải trình tự, xuất subtýp mẫu CRF_25cpx Đây mẫu virut mang đặc điểm subtýp A, U, G Theo ghi nhận Ngân hàng Gen HIV Hoa Kỳ, kiểu gen CRF_25cpx thƣờng xuất châu Phi [7] Nhƣ vậy, BN bị nhiễm từ ngƣời châu Phi Tuy nhiên, chƣa xác định đƣợc subtýp 5,69% số mẫu, hạn chế cặp mồi dùng nghiên cứu So với nghiên cứu trƣớc đây, phân bố subtýp Việt Nam chƣa có thay đổi rõ rệt, nhiên, số subtýp xuất KẾT LUẬN Đã xác định subtýp HIV-1 mPCR giải trình tự 720 mẫu khu vực nghiên cứu, xác định đƣợc subtýp 679 mẫu, đó, chủ yếu subtýp CRF01-AE (98,53%), subtýp B (1,33%), subtýp CRF25_CPX (0,15%) Không xác định đƣợc subtýp 41 mẫu (5,69%) Sự khác biệt tỷ lệ phân nhóm theo khu vực nghiên cứu khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Phƣơng pháp mPCR tối ƣu sử dụng nghiên cứu nhằm xác định subtýp HIV-1 Việt Nam có giá trị tƣơng đƣơng với phƣơng pháp giải trình tự TÀI LIỆU THAM KHẢO Bạch Thị Như Quỳnh Nghiên cứu tạo protein tái tổ hợp HIV-1 ứng dụng để phát triển kit chẩn đoán HIV/AIDS Luận án Tiến sỹ Sinh học Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam 2012 Đặng Thị Hồng Thắng, Vũ Thị Kim Liên, Nguyễn Thái Sơn Nghiên cứu ứng dụng multiplex PCR xác định phân týp HIV-1 đối tƣợng nghiện chất ma túy gái mại dâm khu vực Hà Nội Tạp chí Y học Dự phòng 2009, tập XIX, số (112), tr.112-117 40 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 Cục Phòng chống HIV/AIDS Báo cáo tiến độ phòng, chống AIDS Việt Nam năm 2012 Bộ Y tế, 2012 Sa Ngouane TaVanh CS Xác định phân týp HIV-1 đối tƣợng nghiện chích ma túy mại dâm khu vực Hà Nội (Việt Nam) Viêng Chăn (Lào) Tạp chí Y - Dƣợc học quân 2012, số 01, tr.132-138 Shalom Spira, Mark A Wainberg, Hugues Loemba et al Impact of clade diversity on HIV-1 virulence, antiretroviral drug sensitivity and drug resistance Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2003, 51, pp.229-240 http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/ HIV/CRFs/CRFs.html Fumihiro Yagyu A, Shoko Okitsu et al Determination of HIV-1 subtype by PCR in the transmembrane region with novel primers Journal of Medical Virology 2005, 76, pp.16-23 Ngày nhận bài: 16/3/2013 Ngày phản biện đánh giá báo: 8/5/2013 Ngày báo đăng: 23/5/2013 41 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 42 ... phân týp HIV-1 đối tƣợng có xét nghiệm HIV dƣơng tính KVHN KVVC; tìm hiểu tƣơng đồng phân týp HIV, làm tiền đề cho nghiên cứu tiếp theo, góp phần thiết kế đồ dịch tế học phân týp HIV-1 Việt Nam, ... subtýp CPX sau giải trình tự, đó, mPCR xác định subtýp E Phân bố subtýp HIV-1 36 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2013 Bảng 2: Phân bố subtýp HIV-1 theo khu vực nghiên cứu MẪU ÂM TÍNH SUBTÝP DƢƠNG... cáo tiến độ phòng, chống AIDS Việt Nam năm 2012 Bộ Y tế, 2012 Sa Ngouane TaVanh CS Xác định phân týp HIV-1 đối tƣợng nghiện chích ma túy mại dâm khu vực Hà Nội (Việt Nam) Viêng Chăn (Lào) Tạp chí