Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa hình hệ gen các dòng tôm sú (Penaeus monodon) Việt Nam nhằm phục vụ công tác chọn giống tôm

Mục đích nghiên cứu của đề tài là đánh giá đa hình hệ gen các quần đàn tôm sú thu từ các vùng biển Việt Nam; Sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNPs) có tiềm năng liên kết với tính trạng tăng trưởng bằng cách áp dụng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (phương pháp GBS) trên hai nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm.

Lu n án đ ậ ượ c b o v  t i H i đ ng đánh giá lu n án Phiên chính th c h p t i  ả ệ ạ ộ ồ ậ ứ ọ ạ

Vi n Công ngh   ệ ệ sinh h c, Vi n Hàn lâm Khoa h c và Công ngh  Vi t Nam,  ọ ệ ọ ệ ệ

18 Hoàng Qu c Vi t, C u Gi y, Hà N i ố ệ ầ ấ ộ

Vào h i  …gi  …, ngày  …   tháng   …  năm 2019 ồ ờ

Có th  tìm đ c Lu n án t i: ể ọ ậ ạ

­ Th  vi n Qu c Gia Vi t Nam ư ệ ố ệ

­ Trang web c a B  Giáo d c và đào t o (http:luanvan.moet.gov.vn) ủ ộ ụ ạ

­ Vi n Công ngh  sinh h c ệ ệ ọ

M  Đ U Ở Ầ

1. Tính c p thi t c a Đ  tàiấ ế ủ ề

Tôm sú Penaeus monodon Fabricius (1798) là loài th y s n nuôi kinh t  quan tr ng   nhi uủ ả ế ọ ở ề  

qu c gia trên th  gi i.ố ế ớ    Vi t Nam, tôm sú là m t trong Ở ệ ộ nh ngữ  đ i tố ượng nuôi ch  l c choủ ự  

xu t kh u th y s n. N n t ng cho chi n lấ ẩ ủ ả ề ả ế ược phát tri n b n v ng ngành công nghi p nuôiể ề ữ ệ  tôm sú là chú tr ng phát tri n ngu n tôm b n đ a v i các chọ ể ồ ả ị ớ ương trình nhân gi ng khoa h c đố ọ ể nâng cao t  l  s ng và s  tăng trỷ ệ ố ự ưởng. Đ  đ t để ạ ược m c tiêu này, nghiên c u c u trúc và ch cụ ứ ấ ứ  năng c a h  gen tôm sú là v n đ  khoa h c c  b n có đ nh hủ ệ ấ ề ọ ơ ả ị ướng  ng d ng h t s c quanứ ụ ế ứ  

tr ng.ọ

Hi n nay, cệ ác nghiên c uứ  v  di truy n phân tề ề ử trên đ i tố ượng tôm sú v n còn ít  i và ẫ ỏ ch aư  

tương x ng v i vai trò c a m t đ i tứ ớ ủ ộ ố ượng nuôi kinh t  quan tr ng.ế ọ  Thông tin v  các locus tínhề  

tr ng đ nh lạ ị ượng (QTLs) liên quan đ n tính tr ng tăng trế ạ ưởng h u nh  r t hi m. Vì v y, vi cầ ư ấ ế ậ ệ  nghiên c uứ  đa d ng di truy n vàạ ề  xác đ nh m i tị ố ương quan gi a các SNP (ữ đa hình nucleotide 

đ nơ ) ­ lo i bi n d  ph  bi n nh t trong h  gen ­ v i tính tr ng tăng trạ ế ị ổ ế ấ ệ ớ ạ ưởng   tôm sú đ  t o cở ể ạ ơ 

sở d  li uữ ệ  cho các nghiên c u v  ch n gi ng d a trên ứ ề ọ ố ự ch  th  phân t  (CTPT) ỉ ị ử là hướng nghiên 

c u quan tr ng đ i v i ngành công nghi p nuôi tôm sú.  ứ ọ ố ớ ệ

Trong khuôn kh  Đ  tài ổ ề “L p b n đ  b  gen tôm sú (Penaeus monodon)” ậ ả ồ ộ  thu c ộ Nhi m vệ ụ đánh giá di truy n ngu n gen c p Nhà nề ồ ấ ước, chúng tôi đã th c hi n đ  tài “ự ệ ề Nghiên c u đa ứ   hình h  gen các dòng tôm sú ( ệ Penaeus monodon) Vi t Nam nh m ph c v  công tác ch n ệ ằ ụ ụ ọ  

gi ng tôm” ố     

2. M c tiêu nghiên c u ụ ứ

Đánh giá đa hình h  gen các qu n đàn tôm súệ ầ  thu t  các vùng bi nừ ể  Vi t Namệ ; Sàng l c cácọ  

đa hình nucleotide đ n (SNPs) có ti m năng liên k t v i tính tr ng tăng trơ ề ế ớ ạ ưởng b ng cách ápằ  

d ng công ngh  gi i trình t  gen th  h  m i (phụ ệ ả ự ế ệ ớ ương pháp GBS) trên hai nhóm tôm sú tăng 

trưở  nhanh và tăng trng ưởng ch m.ậ

3. Đ i tố ượng nghiên c u ứ

(3) Áp d ng ụ k  thu tỹ ậ  xác đ nh ki uị ể  gen b ng phằ ương pháp gi i trình tả ự (GBS) đ  phân tíchể  

h  gen tôm sú thu c hai nhóm ệ ộ tăng trưở  nhanh và tăng trng ưở  ch mng ậ  th  h  Gế ệ o và G1 nh mằ  sàng l c các đa hình nucleotide đ n (SNP) liên quan đ n tính tr ng tăng trọ ơ ế ạ ưở ;       ng

(4) Sàng l c ch  th  SNP G>A   tôm sú tăng trọ ỉ ị ở ưởng nhanh b ng k  thu t PCR đ c hi u alenằ ỹ ậ ặ ệ  

c nh tranh (KASP) đ  ạ ể đánh giá ti m năng  ng d ng ề ứ ụ c a SNP này đ i v i vi c đánh giá nhanhủ ố ớ ệ  chóng và chính xác các cá th  tôm nh m h  tr  trong công tác ch n gi ng tôm súể ằ ỗ ợ ọ ố

5. Nh ng đóng góp m i c a Lu n án v  m t khoa h c và th c ti nữ ớ ủ ậ ề ặ ọ ự ễ

(1) Lu n án là nghiên c u đ u tiên đ a ra đánh giá v  đa d ng di truy n c a ba qu n đànậ ứ ầ ư ề ạ ề ủ ầ  tôm sú t  nhiênự  t  các vùng bi nừ ể  Vi t Nam b ng k  thu t AFLP.ệ ằ ỹ ậ

(2) Sàng l c đọ ược b  ch  th  SNP   nhóm tôm sú tăng trộ ỉ ị ở ưởng nhanh làm c  s  cho vi c tìmơ ở ệ  

ki m ch  th  SNP liên k t v i tính tr ng tăng trế ỉ ị ế ớ ạ ưởng nhanh   tôm sú.ở  Hai ch  th  SNP đỉ ị ược xác 

đ nh trong nghiên c u c a lu n án là ị ứ ủ ậ phát hi n đ u tiên v  ch  th  SNP n m trong exon c a genệ ầ ề ỉ ị ằ ủ  MHC   h  giáp xác. Nh ng k t qu  nàyở ọ ữ ế ả  cung c p d n li u khoa h cấ ẫ ệ ọ  h u íchữ  cho vi c  ngệ ứ  

d ng ch  th  phân t  trong ch n gi ng tôm sú.ụ ỉ ị ử ọ ố

Chương 1. T NG QUAN TÀI LI UỔ Ệ

1.1. Khái quát v  tôm sú ề Penaeus monodon và tình hình nuôi tôm sú trên th  gi i ế ớ

Tôm sú Penaeus monodon thu c h  ộ ọ Penaeidae, b  ộ Decapoda, l p ớ Malacostraca, ngành phụ Crustatacea, ngành Arthropoda. 

V i nh ng ti n b  v  k  thu t nuôi và công ngh  ch  bi n th c ăn th y s n thìớ ữ ế ộ ề ỹ ậ ệ ế ế ứ ủ ả  ngành công nghi p nuôi tôm sú ệ đã nhanh chóng lan r ng kh p ộ ắ Châu Á, Châu M  trong nh ng th p niênỹ ữ ậ  

cu i th  k  20ố ế ỷ  Tuy nhiên trong nh ng năm sau đó, ữ d ch b nh gia tăng trong các qu n đàn tômị ệ ầ  

t  nhiên khi n ch t lự ế ấ ượng gi ng liên t c s t gi mố ụ ụ ả  đã d n đ n s  thay th  d n tôm sú b i ẫ ế ự ế ầ ở tôm 

th  chân tr ng (ẻ ắ Litopenaeus vannamei) s ch b nh có ngu n g c Nam Mạ ệ ồ ố ỹ. Vi c các nệ ướ Châu c 

Á d n t  b  đ i tầ ừ ỏ ố ượng b n đ a quan tr ng này ả ị ọ ch  y u ủ ế là do ch a gia hoá và ki m soát đư ể ượ  c

d ch b nh nên không đ m b o ch t lị ệ ả ả ấ ượng t t c a conố ủ  gi ngố  Vi t Nam nệ ằm trong nhóm g mồ  các qu c gia s n xu t tôm sú hàng hoá l n nh t th  giố ả ấ ớ ấ ế ới  Khác v i các nớ ước Châu Á láng 

gi ng (ch  y u nuôi tôm th  chân tr ng),ề ủ ế ẻ ắ  Vi t Nam hi n là m t trong s  ít các nệ ệ ộ ố ước v n đangẫ  

s n xu t tôm sú c  to, ch t lả ấ ỡ ấ ượng cao và chi m ph n l n s n lế ầ ớ ả ượng tôm nuôi. Tuy nhiên nghề nuôi tôm sú   Vi t Nam hi n nay c  b n v n d a vào ngu n tôm gi ng đánh b t t  t  nhiênở ệ ệ ơ ả ẫ ự ồ ố ắ ừ ự  

và các thành t u gia hóa d a trên phự ự ương pháp ch n gi ng truy n th ng. Do đó, ngh  nuôi tômọ ố ề ố ề  

sú v n đ i m t v i không ít thách th c, trong đó có v n đ  v  ch  đ ng ngu n tôm gi ngẫ ố ặ ớ ứ ấ ề ề ủ ộ ồ ố  

ki m các CTPT liên k t v i các tính tr ng tăng trế ế ớ ạ ưởng nhanh, ch ng ch u b nh t t, s c sinhố ị ệ ố ứ  

s n cao…)ả  được coi là nh ng v n đ  then ch tữ ấ ề ố  

1.2. K  thu t phân tích ch  th  DNA và  ng d ng trong nghiên c u đa hình h  gen vàỹ ậ ỉ ị ứ ụ ứ ệ  trong ch n gi ng tôm sú  ọ ố

Các CTPT đượ ử ục s  d ng r ng rãi nh  nh ng công c  ch n l cộ ư ữ ụ ọ ọ  đ c l cắ ự  đ i v i các tínhố ớ  

tr ng ạ quan tâm trong các chương trình ch n gi ng   nhi u loọ ố ở ề ài v t nuôi, cây tr ng và các loàiậ ồ  

th y s n. Vi c  ng d ng các CTPT giúp cho các nhà ch n gi ng nh n di n chính xác các genủ ả ệ ứ ụ ọ ố ậ ệ  quan tâm nh m rút ng n th i gian ch n gi ng. Hi u qu  c i ti n gi ng s  gia tăng g p nhi uằ ắ ờ ọ ố ệ ả ả ế ố ẽ ấ ề  

l n so v i các phầ ớ ương pháp ch n gi ng c  đi n nh  th c hi n vi c ch n l c không c n tr cọ ố ổ ể ờ ự ệ ệ ọ ọ ầ ự  

ti p trên tính tr ng mong mu n mà thông qua CTPT liên k t v i tính tr ng đó.ế ạ ố ế ớ ạ  Các CTPT là công c  h u hi u đ  đánh giá s  đa d ng di truy n, xây d ng b n đ  di truy n ụ ữ ệ ể ự ạ ề ự ả ồ ề và  ng d ngứ ụ  trong nghiên c u c i t o, ch n gi ng tôm ch t lứ ả ạ ọ ố ấ ượng t t, s ch b nh nh : RAPD (Garcia &ố ạ ệ ư  

Benzie, 1995), RFLP (Benzie et al., 1993, Klinbunga et al., 1999), xác đ nh các ch  th  RAPD ị ỉ ị ở 

qu n đàn tôm sú kháng b nh đ m tr ng (Dutta  ầ ệ ố ắ et al.,  2013), phát tri n ch  th  microsatelliteể ỉ ị  trong ch n tôm sú b  m  (Jerry  ọ ố ẹ et al., 2006),  k  thu t microsatellite nghiên c u đa hình diỹ ậ ứ  truy n trên đ i tề ố ượng tôm sú (Saeid et al., 2011, Nguy n Th  Th o ễ ị ả et al., 2004; Rumisha et al.,  2017; Staelens et al., 2018…), s  d ng k  thu t AFLP đ  l p b n đ  di truy n trên đ i tử ụ ỹ ậ ể ậ ả ồ ề ố ượ  ngtôm Trung Qu c (Zhaoxia ố et al., 2006, You et al., 2010), đa hình SNP t i th  th  vitellogeninạ ụ ể  (PmVtgr) g n li n v i các ki u hình liên quan đ n sinh s n (ch  s  gonadosomatic và tr ngắ ề ớ ể ế ả ỉ ố ọ  

lượng bu ng tr ng) c a tôm sú ồ ứ ủ P. monodon đã được phát hi n (Klinbunga ệ et al., 2015), bi uể  

hi n c a protein g n k t X­box 1 (PmXbp1) trong quá trình phát tri n bu ng tr ng   tôm sú bệ ủ ắ ế ể ồ ứ ở ố 

m  ẹ P. monodon hoang dã và s  liên k t gi a SNP v i các tham s  liên quan đ n tăng trự ế ữ ớ ố ế ưởng đã 

được phát hi n (Prasertlux ệ et al., 2015)…

K  thu tỹ ậ  AFLP được s  d ng đ  phân tích đa hình DNA b ng cách nh n bi t đ ng th iử ụ ể ằ ậ ế ồ ờ  nhi uề  phân đo n DNA ạ sau khi c t b i enzyme vàắ ở  khu ch đ i ch n l c.ế ạ ọ ọ  Đây là công c  hi uụ ệ  

qu  đ  nh n bi t ả ể ậ ế các locus đa hình mà không c n bi t trầ ế ước thông tin v  trình t  DNA c aề ự ủ  

chúng (Richard et al., 1998). Phương pháp này có th  ể ướ ược l ng nhanh sự đa d ng di truy nạ ề  trong và gi a các qu n th  v i nhau (Watson và Barker, 2004). AFLP đữ ầ ể ớ ượ ử ục s  d ng cho nhi uề  

m c đích nh :ụ ư  nghiên c uứ  bi n d  di truy n (Mueller và Wolfenbarger, 1999)ế ị ề ; đánh giá đa d ngạ  

di truy n các qu n đàn   các đ i tề ầ ở ố ượng khác nhau nh  cá trê (Liu ư et al., 1998), cá th m (Seki ơ et  al., 1999), cá chép (Wang et al., 2000); l p b n đ  di truy n (Zhaoxia ậ ả ồ ề et al., 2006, You et al.,  2010; Staelens et al., 2018); xác đ nh quan h  gi a các gi ng (ị ệ ữ ố Jacobs et al., 2008); xây d ng cácự  nhóm liên k t chéoế ; các nghiên c u v  đa d ng di truy n và phát sinh loài phân t  (ứ ề ạ ề ử Wang et al., 

2004)… 

SNP là m t trong nh ng CTPT hi u qu  độ ữ ệ ả ượ ức  ng d ng trong ch n gi ng. Các v  trí SNPụ ọ ố ị  trong h  gen là n i mà   đó chu i DNA đệ ơ ở ỗ ược phân bi t b i m t base duy nh t khi hai ho cệ ở ộ ấ ặ  nhi u cá th  đề ể ược so sánh. S  khác nhau v  nucleotide này có th  d n đ n thay đ i tính tr ngự ề ể ẫ ế ổ ạ  

và đượ ử ục s  d ng đ  đánh giá đa d ng trong ti n hóa. SNP có s  lể ạ ế ố ượng l n,  n đ nhớ ổ ị , thích h pợ  cho vi c t  đ ng hóa trong phân tích và ch  ra đệ ự ộ ỉ ược các đa hình có th  không phát hi n để ệ ượ  c

b i các phở ương pháp khác (Vaseeharan et al., 2013; Liu and Cordes, 2004). SNP có th  xu tể ấ  

hi n   các vùng mã hóa và không mã hóa trong h  gen c a sinh v t, tác đ ng tr c ti p đ n tínhệ ở ệ ủ ậ ộ ự ế ế  

tr ng quan tâm, r t hi u qu  trong vi c xác đ nh tạ ấ ệ ả ệ ị ương quan gi a SNP và tính tr ng (Beuzen ữ ạ et al., 2000). SNP đã đượ ử ục s  d ng đ  sàng l c các gen ti m năng liên quan đ n tính tr ng tăngể ọ ề ế ạ  

trưởng c a m t s  đ i tủ ộ ố ố ượng thu  s n: cá h i ỷ ả ồ Salvelinus alpinus (Tao và Boulding, 2003), cá 

ch m (Xu ẽ et al., 2006), tôm th  chân tr ng ẻ ắ Litopenaeus vannamei và tôm sú P. monodon (Glenn 

et al., 2005)

1.3. K  thu t GBS và  ng d ng trong ch n gi ngỹ ậ ứ ụ ọ ố

GBS (Genotyping By Sequencing: K  thu tỹ ậ  xác đ nh ki uị ể  gen b ng pằ hương pháp gi i trìnhả  

t ) là m t  ng d ng m i c a k  thu t NGS ự ộ ứ ụ ớ ủ ỹ ậ (Next Generation Sequencing: công ngh  gi i trìnhệ ả  

t  th  h  m i) đ  phát hi n SNP. Nh ng c i ti n không ng ng c a các hóa ch t gi i trình tự ế ệ ớ ể ệ ữ ả ế ừ ủ ấ ả ự 

và các công c  ph n m m cho phép các k  thu t NGS cung c p nh ng thông lụ ầ ề ỹ ậ ấ ữ ượng l n v  dớ ề ữ 

li u gi i trình t  trong m i l n th c hi n, nh  đó gi m giá thành, khi n cho GBS tr  thànhệ ả ự ỗ ầ ự ệ ờ ả ế ở  

gi i pháp thay th  có tính c nh tranh so v i các phả ế ạ ớ ương pháp phân tích gen khác. NGS cho phép t o ra các b n đ  SNP m t đ  cao đạ ả ồ ậ ộ ược d  đoán s  là hự ẽ ướng  ng d ng r ng rãi trongứ ụ ộ  nhi u chề ương trình ch n gi ng. Các nhà ch n gi ng có th  gi i trình t  các b  gen l n và xâyọ ố ọ ố ể ả ự ộ ớ  

d ng các b n đ  liên k t m t đ  cao t  các qu n th  ch n gi ng. Các  ng d ng trong tự ả ồ ế ậ ộ ừ ầ ể ọ ố ứ ụ ươ  nglai c a GBS đ i v i vi c c i thi n gi ng cây tr ng, v t nuôi có th  cho phép các nhà ch nủ ố ớ ệ ả ệ ố ồ ậ ể ọ  

gi ng ki m soát đố ể ược các chương trình MAS (ch n gi ng d a trên CTPT) hay GS (ch n l cọ ố ự ọ ọ  

h  gen) trên phôi m m hay loài m i mà không c n phát tri n các công c  phân t  trệ ầ ớ ầ ể ụ ử ước đó. Khi vi c phân tích gen d a trên vi c gi i trình t  có th  th c hi n đệ ự ệ ả ự ể ự ệ ược đ i v i toàn b  cácố ớ ộ  lĩnh v c nghiên c u v  h  gen thì GBS s  tr  thành nhân t  chính trong di truy n và ch nự ứ ề ệ ẽ ở ố ề ọ  

gi ng (ố He et al., 2014).      

1.4. Phương pháp PCR đ c hi u alen c nh tranh (KASP)ặ ệ ạ

KASP là m t d ng bi n đ i c a k  thu t PCR đ  phân tích h  gen d a trênộ ạ ế ổ ủ ỹ ậ ể ệ ự   s  kéo dàiự  chu i oligo đ c hi u alen và s  chuy n năng lỗ ặ ệ ự ể ượng c ng hộ ưởng hu nh quang đ  t o ra tínỳ ể ạ  

hi u (Kumpatla ệ et al., 2012; He et al., 2014). Công ngh  này có nhi u  ng d ng trong phân tíchệ ề ứ ụ  

ki m soát ch t lể ấ ượng h  gen, l p b n đ  QTL, ch n gi ng d a trên CTPT (MAS)ệ ậ ả ồ ọ ố ự

Chương 2. V T LI U VÀ PHẬ Ệ ƯƠNG PHÁP NGHIÊN C UỨ

2.1. V t li uậ ệ

* Các m u tôm sú s  d ng cho nghiên c u đa hình AFLP do Vi n Nghiên c u NTTS Iẫ ử ụ ứ ệ ứ  cung 

c p. M uấ ẫ  được thu t  3 qu n đàn t  nhiên khác nhau: ừ ầ ự Qu n đàn B c Trung B  (kí hi u: BTB)ầ ắ ộ ệ  thu m u t i vùng bi n t nh Ngh  An, ẫ ạ ể ỉ ệ Qu n đàn Nam Trung B  (NTB) thu m u t i vùng bi nầ ộ ẫ ạ ể  

t nh Khánh Hòa và ỉ Qu n đàn Nam B  (NB) thu m u t i vùng bi n t nh B c Liêu. Mầ ộ ẫ ạ ể ỉ ạ ỗi qu nầ  đàn thu trên 50 m u.ẫ

* Các m u tôm súẫ  s  d ng cho nghiên c u ử ụ ứ sàng l c SNP do Vi n Nghiên c u NTTS II cungọ ệ ứ  

c p: V t li u g c bao g m 4 dòng tôm sú b  m  có ngu n g c đ a lý khác nhau, trong đó 3ấ ậ ệ ố ồ ố ẹ ồ ố ị  dòng có ngu n g c t  nhiên là tôm sú  n Đ  Dồ ố ự Ấ ộ ương (kí hi u: A) ­ Nh p t  Thái Lan (vùngệ ậ ừ  

bi n Amanda) và t  Myanmar, tôm sú Thái Bình Dể ừ ương (T) ­ Nh p t  Singapore, tôm t  nhiênậ ừ ự  

c a Vi t Nam (thu th p t  Cà Mau, Đà N ng, Phú Yên) ­ g i chung là tôm n i đ a (N) và dòngủ ệ ậ ừ ẵ ọ ộ ị  tôm Gia hóa (G)  đượ cung c p b i Công ty Moana Ninh Thu n ­ Đây là  c   ấ ở ậ dòng tôm  đượ  c

thương m i hóa dùng làm tôm b  m  s n xu t tôm gi ng ph c v  cho nuôi thạ ố ẹ ả ấ ố ụ ụ ương ph m.ẩ  Tôm sú th  h  Gế ệ o và G1 đượ t oc ạ  ra t  các đàn tôm b  m  này b ng cách lai h n h p gi a b nừ ố ẹ ằ ỗ ợ ữ ố  dòng tôm b  m  ố ẹ

T  các cá th  trong đàn con c a các gia đình tôm sú th  h  Gừ ể ủ ế ệ o và G1, ch n ra các cá th  (baoọ ể  

g m c  tôm cái ­   và tôm đ c ­  ) thu c hai nhóm khác nhau theo tiêu chí m c đ  tăngồ ả ♀ ự ♂ ộ ứ ộ  

trưởng: tăng trưởng nhanh (F) và tăng trưởng ch m (S) đ  s  d ng cho nghiên c u sàng l cậ ể ử ụ ứ ọ  SNP. 40 m u tôm sú cái l n nhanh th  h  Gẫ ớ ế ệ 1 được ch n đ  th c hi n k  thu t KASP.ọ ể ự ệ ỹ ậ

*  Các  hóa  ch t  và  kit  tinh  s ch   đấ ạ ược  s   d ng  c a  các  hãng:  ử ụ ủ Sigma  Aldrich,  Qiagen, Invitrogen, Life Technologies, Fermentas, Promega; Các hóa ch t thông d ng khác trong phòngấ ụ  thí nghi m đ t đ  tinh khi t c n thi t cho các nghiên c u.ệ ạ ộ ế ầ ế ứ

* Các thi t b  s  d ng trong nghiên c u thu c Phòng Vi sinh v t h c phân t  và Phòng thíế ị ử ụ ứ ộ ậ ọ ử  nghi m tr ng đi m Công ngh  gen, Vi n Công ngh  sinh h c, Vi n hàn lệ ọ ể ệ ệ ệ ọ ệ âm Khoa h c vàọ  Công ngh  Vi t Nam.ệ ệ

2.2. Các phương pháp nghiên c u chính ứ

2.2.1. Thu m u tôm sú  ẫ

­  Thu m u tôm sú t  nhiên ph c v  nghiên c u đa hình h  gen: các m u tôm sú đ c thuẫ ự ụ ụ ứ ệ ẫ ượ  gom b ng cách đ t hàng cho ngằ ặ ười dân đánh b t b ng lắ ằ ướ ởi   ngoài bi n xa b  ể ờ

­ Thu m u tôm sú t  nhiên làm tôm gi ng b  m , sàng l c m m b nh và chăm sóc tôm bẫ ự ố ố ẹ ọ ầ ệ ố 

m : Các quy trình thu m u tôm sú b  m , sàng l c m m b nh và chăm sóc tômẹ ẫ ố ẹ ọ ầ ệ  b  m  đ cố ẹ ượ  

th c hi n t i Trung tâm Qu c gia Gi ng h i s n Nam B  ­ Vi n NCNTTS II. ự ệ ạ ố ố ả ả ộ ệ

2.2.2. Thi t l p các gia đình tôm sú t o th  h  G ế ậ ạ ế ệ o , G 1  

Các phương pháp: lai h n h p gi a các dòng tôm sú b  mỗ ợ ữ ố ẹ, ghép ph i, sinh s n nhân t o,ố ả ạ  

ng nuôi, đánh d u hu nh quang và truy xu t ngu n g c tôm sú… đ c th c hi n theo quy

trình s n xu t gi ng đã đả ấ ố ược nghiên c u và th c hi n thành công nhi u năm t i Trung tâmứ ự ệ ề ạ  

Qu c gia Gi ng h i s n Nam B , thu c Vi n Nghiên c u nuôi tr ng th y s n II. ố ố ả ả ộ ộ ệ ứ ồ ủ ả

2.2.3. Tách chi t, tinh s ch, xác đ nh n ng đ  và đ  tinh s ch c a DNA t ng s  t  mô c  tôm ế ạ ị ồ ộ ộ ạ ủ ổ ố ừ ơ   sú

­ DNA t ng s  t  mô c  tôm sú đổ ố ừ ơ ược tách chi t theo quy trình c a ế ủ Eurobiobank (2004)

­  DNA t ng sổ ố được tinh s chạ  b ng ằ Kit PureLinkTM Genomic DNA (Life Technologies)

­ N ng đ  và đ  tinh s ch c a DNồ ộ ộ ạ ủ A  được xác đ nh  ị b ngằ   máy quang ph  ổ NanoDrop®  Spectrophotometer    bở ước   sóng     =  260   nm   và     =   280   nm  λ λ (Thermo  Fisher  Scientific  ­ NanoDrop Products, www.nanodrop.com)

2.2.4. K  thu t AFLP đánh giá đa hình  ỹ ậ h  gen ệ

­ K  thu t AFLP ỹ ậ được th c hi n theo quy trình c a hãng Applied BioSystems.ự ệ ủ

­ Phân tích k t qu  AFLP trên máy xác đ nh trình t  t  đ ng ABI3100 (ế ả ị ự ự ộ Invitrogen) s  d ngử ụ  

đi n di mao qu n và ph n m m phân tích đo n GeneMapper® Software Version 4.ệ ả ầ ề ạ 1 AFLP® System Analysis (Invitrogen) đ  ể đánh giá tính đa hình di truy n h  gen tôm sú;ề ệ

­ Xây d ng cây phát sinh ch ng lo i ự ủ ạ gi a các qu n đàn tôm sú Vi t Nam b ng ph n m mữ ầ ệ ằ ầ ề  

MEGA (Kumar et al., 2001).  

2.2.5. K  thu t GBS phân tích h  gen tôm sú ỹ ậ ệ , sàng l c  ọ SNP liên k t v i tính tr ng tăng ế ớ ạ  

tr ưở ng

Xây d ng th  vi n GBS ự ư ệ  và gi i trình t  DNA: ả ự  K  thu t ỹ ậ GBS được th c hi n theo cácự ệ  

bước nh  mô t  trong công b  c a ư ả ố ủ Elshire et al. (2011). Enzyme c t h n ch  đắ ạ ế ượ ử ục s  d ng là 

ApeKI (New England Biolabs). DNA t ng s  sau khi đổ ố ược c t và g n v i adaptắ ắ ớ or được tinh 

s ch b ng QIAquick PCR Purification Kitạ ằ  (Qiagen). Các đo n DNA tinh s ch t  các m u đạ ạ ừ ẫ ượ  c

tr n l i v i nhau v i t  l  tộ ạ ớ ớ ỷ ệ ương đương. Kho ng 100 ng s n ph m DNA tr n t  các m uả ả ẩ ộ ừ ẫ  

đượ ử ục s  d ng làm khuôn đ  t o th  vi n cho NGS v i c p m i primer1 và primer2 b t c pể ạ ư ệ ớ ặ ồ ắ ặ  

b  sung v i barcode adaptổ ớ or và common adaptor: 

Primer1:(5’­3’)AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT Primer2:(5’­3’) 

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT

S n ph mả ẩ  PCR có kích thước 300­500 bp được thu nh n b ng phậ ằ ương pháp c t gel và tinhắ  

s ch b ng ạ ằ QIAquick PCR Purification Kit. Kích thước và đ  s ch c a th  vi n DNA sau đóộ ạ ủ ư ệ  

được đánh giá trên Bioanalyzer 2100 (Agilent Technology). Th  vi n DNA đư ệ ược làm giàu và xác   đ nh   trình   t   c   hai   chi u   (pairị ự ả ề ­end)   trên   h   th ng   Illumina  ệ ố NextSeq®500,   s   d ngử ụ  NextSeq 500/550 High Output v2 kit (300 cycles)

X  lý d  li u GBS, l p ráp h  gen tham chi u t m th i và  ử ữ ệ ắ ệ ế ạ ờ xác đ nh ị  SNP:

D  li u GBS đữ ệ ược x  lý và phân tích đ  phát hi n SNP d a theo phử ể ệ ự ương pháp GBS­SNP­CROP (GBS SNP­Calling Reference Optional Pipeline) được mô t  b i Melo ả ở et al. (2016). Dữ 

li u thô đệ ược chuy n thành đ nh d ng fastq b ngể ị ạ ằ  công cụ BCL2FASTQ 2.1. Ch t lấ ượng trình 

t  đự ược đánh giá b ng FastQC. ằ Trình t  adaptự or được lo i b  b ng ph n m m Trimmomaticạ ỏ ằ ầ ề  

software v.0.3.6 (Bolger et al., 2014). Trình t  c a t ng m u đự ủ ừ ẫ ược tách ra trên c  s  nh n bi tơ ở ậ ế  trình t  barcode s  d ng công c  In­house script do nhóm nghiên c u t  phát tri n. Doự ử ụ ụ ứ ự ể  h  genệ  tôm sú ch a đư ược công bố trình t  tham chi u nên chúng tôi đã s  d ng các m u l p ráp ự ế ử ụ ẫ ắ de  novo đ  t o trình t  tham chi u t m th i theo phể ạ ự ế ạ ờ ương pháp được mô t  b i Melo ả ở et al. (2016), 

s  d ng các công c  PEAR v.0.96 và USEARCH v.8.0.162 (Zhang ử ụ ụ et al., 2014; Edgar, 2010). 

Trình t  c a các m u tôm sú đự ủ ẫ ược so sánh v i trình t  tham chi u b ng BWA­MEM v.0.7 (Liớ ự ế ằ  

et al., 2009a). D  li u SNP đữ ệ ược truy xu t b ng công c  SAMtools v.1.2 (Li ấ ằ ụ et al., 2009b). 

SNP được xác đ nh khi gióng hàng các contig và s  sai khác nucleotide đị ự ược phát hi n trên ítệ  

nh t b n trình t  Ch  các SNP hai allen đáp  ng m c đ  lấ ố ự ỉ ứ ứ ộ ặp l i nh  trên m i đạ ư ớ ược xác đ nh làị  

SNP (Melo et al., 2016; Nguy n Minh Thành ễ et al., 2015; Kumar, 2014). 

Chú gi i các đo n trình t  và xác đ nh gen liên quan ả ạ ự ị :

Công c  Bụ lastX (E­value< 1e­6) đượ ử ục s  d ng đ  so sánh s  tể ự ương đ ng gi a các contig v iồ ữ ớ  

c  s  d  li u NCBI non­redundant (Nr­NCBI) (ơ ở ữ ệ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). K t qu  tìmế ả  

ki m đế ược truy xu t dấ ướ ại d ng danh sách các gen ch c năng v i các thông tin v  geneIDứ ớ ề , protein được mã hóa và tên loài tương  ng.ứ  Danh sách này đượ ử ục s  d ng đ  ể xác đ nhị  gen mã hóa protein liên quan đ n tăng trế ưởng   tôm sú b ng cách đ i chi u v i 22 lo i protein đã bi tở ằ ố ế ớ ạ ế  liên quan đ n tăng trế ưởng trong h  giáp xác trong công b  c a Jung ọ ố ủ et al. (2013). 

Xác đ nh trình t  amino acid  ị ự c a contig ủ  và đánh giá m c đ  t ứ ộ ươ ng đ ng v i gen  ồ ớ mã hóa  protein quan tâm:

Công c  Expasy (ụ http://web.expasy.org) đượ ử ục s  d ng đ  xác đ nh trình t  ể ị ự amino acid tươ  ng

ng v i trình t  nucleotide c a contig quan tâm b ng cách ki m tra toàn b  6 khung đ c m

5’3’Frame 1 (+1), 5’3’ Frame 2 (+2), 5’3’ Frame 3 (+3), 3’5’ Frame 1 (­1) , 3’5’ Frame 2 (­2), 3’5’ Frame 3 (­3). Sáu khung đ c mọ ở này t o ra ạ 6 ki u trình t  ể ự amino acid khác nhau đ i v iố ớ  

m i ỗ contig, ti p t c s  d ng công c  ế ụ ử ụ ụ Uniprot (http://www.uniprot.org) để ch n ra ki u trình tọ ể ự amino acid có t  l  tỷ ệ ương đ ng cao nh t so v i trình t  ồ ấ ớ ự amino acid c a protein ủ quan tâm. 

2.2.6. Ph ươ ng pháp PCR đ c hi u alen c nh tranh (KASP) ặ ệ ạ

Phương pháp KASP s  d ng b  kit c a Hãng LGC Genomics. Các bử ụ ộ ủ ước ti n hành theo quyế  trình c a Hãngủ   (https://www.lgcgroup.com/kasp)  SNP liên quan  đ nế   tính tr ng tăng trạ ưở  ngnhanh   tôm sú thu c gen mã hóa ở ộ Myosin heavy chain type 1 đượ ử ục s  d ng đ  ki m tra trên 40ể ể  

cá th  tôm sú tăng trể ưởng nhanh thu c th  h  Gộ ế ệ 1 b ng k  thu t ằ ỹ ậ KASP. Các m i xuôi và m iồ ồ  

ngược được thi t k  đ c hi u v i trình t  DNA ch a SNP này. N ng đ  DNA m i m u sế ế ặ ệ ớ ự ứ ồ ộ ỗ ẫ ử 

d ng là 50ng. Thí nghi m b  trí 2  ng đ i ch ng âm đ  so sánh ụ ệ ố ố ố ứ ể (   ng đ i ch ng âm, DNAở ố ố ứ  template được thay th  b ng nế ằ ước)

Trình t  m i xuôi allele ki u d iự ồ ể ạ  (g m HEX­tail)ắ : 

5’­GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGCAGAGCTCCTTCGGCC­3’

Trình t  m i xuôi allele ki u đ t bi nự ồ ể ộ ế  (g n FAM­tail)ắ : 

5 ­GAAGGTGACCAAGTTCATGCT′ CGCACGCATCTTGGTCTTCTCC­3’

Trình t  m i ngự ồ ược: 5’­CGCACGCATCTTGGTCTTCTCC­3’

Chương 3. K T QU  NGHIÊN C UẾ Ả Ứ

3.1. Đa hình AFLP   các qu n đàn tôm sú Vi t Nam ở ầ ệ

K t quế ả phân tích AFLP s  d ng c p m i ch n l c ử ụ ặ ồ ọ ọ MseI­CTT/EcoRI­ACC JOE cho th yấ  

v i các m u tôm sú thu th p t  3 qu n đàn t  nhiên c a Vi t Nam, có 309 alen đớ ẫ ậ ừ ầ ự ủ ệ ược phát 

hi n. ệ

S  lố ượng alen   các qu n đàn là khác nhau và không có s  trùng nhau v  v  trí xu t hi nở ầ ự ề ị ấ ệ  

c a các alen: Qu n đàn BTB có s  lủ ầ ố ượng alen dao đ ng t  32 đ n 76, Qu n đàn NTB là 29ộ ừ ế ầ  

đ n 64 và Qu n đàn NB là 38 đ n 77. ế ầ ế

Trong ph m vi m i qu n đàn, quân đan NTB co 4 alen trung nhau gi a cac ca thê cung quânạ ỗ ầ ̀ ̀ ́ ̀ ữ ́ ́ ̉ ̀ ̀  đan,   quân đan NB có 8 alen trùng nhau, đ c bi t không phat hiên th y b t k  alen trùng nhaù ở ̀ ̀ ặ ệ ́ ̣ ấ ấ ỳ  nào gi a cac ca thê trong quân đan BTB ­ cho th y tính đa d ng di truy n r t cao gi a các cáữ ́ ́ ̉ ̀ ̀ ấ ạ ề ấ ữ  

th  ngay trong qu n đàn này. Không phát hi n th y alen nào chung cho c  3 quân đan. ể ầ ệ ấ ả ̀ ̀

Quan h  phát sinh ch ng lo i gi a các qu n đàn tôm sú Vi t Nam:  ệ ủ ạ ữ ầ ệ Cây phát sinh ch ng lo iủ ạ  

gi a các cá th  thu c ba qu n đàn tôm sú ữ ể ộ ầ BTB, NTB và NB cho th y m i liên h  h  hàng gi aấ ố ệ ọ ữ  các cá th  V  c  b n cây để ề ơ ả ược chia làm 3 nhánh, m i nhánh tỗ ương  ng v i các cá th  thu cứ ớ ể ộ  cùng m t vùng (m t qu n đàn) độ ộ ầ ược x p vào cùng m t nhánh. Tuy nhiên, có m t vài cá thế ộ ộ ể 

c a m t trong 3 qu n đàn này đủ ộ ầ ược x p v  nhánh c a qu n đàn khác (BTB7 và BTB16 thu cế ề ủ ầ ộ  cùng nhánh c a qu n đàn Nam Trung B , NTB2 và NTB3 thu c cùng nhánh c a qu n đàn B củ ầ ộ ộ ủ ầ ắ  Trung B  K t qu  này có th  độ ế ả ể ược lý gi i do quá trình di c  c a tôm sú đ n vùng bi n khácả ư ủ ế ể  theo các dòng h i l u đ  tìm ki m ngu n th c ăn và môi trả ư ể ế ồ ứ ường m i thích h p v i giai đo nớ ợ ớ ạ  sinh trưởng c a chúng. ủ

C

Hình  3.1.  Cây  phát  sinh 

ch ng lo i các qu n đàn tôm ủ ạ ầ

sú  thu  t  ba  vùng  bi n Vi t ừ ể ệ

Nam:  A­  Nhánh  B c  Trung ắ

B   (BTB),  B­  Nhánh  Nam ộ

Trung  B   (NTB),  C­  Nhánh ộ

Nam B  (NB) ộ (Vòng tròn màu 

đ   bi u  th   các  cá  th   tôm  sú ỏ ể ị ể

c a m t trong ba qu n đàn này ủ ộ ầ

xu t hi n trên nhánh c a qu n ấ ệ ủ ầđàn khác) 

3.2. S n xu t tôm sú th  h  Gả ấ ế ệ o, G1 

3.2.1. Sàng l c ngu n tôm b  m  đ u vào ọ ồ ố ẹ ầ

T  các cá th  tôm b  m  thu c 4 dòng tôm sú có ngu n g c đ a lý khác nhau (v t li u g c),ừ ể ố ẹ ộ ồ ố ị ậ ệ ố  

t ng c ng có 460 tôm cái và 376 tôm đ c đổ ộ ự ược s  d ng làm v t li u đ u vào đ  ti n hànhử ụ ậ ệ ầ ể ế  sàng l c. K t qu  (B ng 3.1) cho th y s  tôm đọ ế ả ả ấ ố ược gi  l i sau sàng l c b nh nghiêm ng tữ ạ ọ ệ ặ  

tương đ i th p: ch  có 48,0% tôm cái và 54,5% tôm đ c đố ấ ỉ ự ược gi  l i. Trong đó, t  l  gi  l iữ ạ ỷ ệ ữ ạ  

th p nh t là tôm dòng N i đ a, ch  đ t 21,6% đ i v i tôm cái và 39,8% đ i v i tôm đ c. Cácấ ấ ộ ị ỉ ạ ố ớ ố ớ ự  dòng tôm t  nhiên nh p ngo i có t  l  s ch b nh và đự ậ ạ ỷ ệ ạ ệ ược gi  l i sau sàng l c khá h n nh  ữ ạ ọ ơ ư ở tôm cái dòng  n Đ  DẤ ộ ương là 51,3% và   tôm cái dòng Thái Bình Dở ương là 80,2%. T  l  tômỷ ệ  

đ u vào s ch b nh và đầ ạ ệ ược gi  l i cao nh t là tôm Gia hóa: 100% đ i v i c  tôm đ c và tômữ ạ ấ ố ớ ả ự  cái.    

V  kh i lề ố ượng thân trung bình, nhìn chung các dòng tôm có ngu n g c nh p ngo i có kh iồ ố ậ ạ ố  

lượng l n h n so v i tôm Vi t Nam: ớ ơ ớ ệ nhóm tôm N i đ a và nhóm tôm Gia hóa có kh i lộ ị ố ượ  ngtrung bình l n lầ ượt là 165,7g và 160,8g, th p h n so v i nhóm tôm  n Đ  Dấ ơ ớ Ấ ộ ương (222,2g) và nhóm tôm Thái Bình Dương (220,0g)

B ng 3.1. K t qu  sàng l c tôm sú b  m  đ u vàoả ế ả ọ ố ẹ ầ

n Đ  D ng (A)

Ấ ộ ươ 76 71 39 34 51,3 47,9 222,2 ± 25,4 Thái Bình Dương (T) 86 58 69 36 80,2 62,1 220,0 ± 23,1 

N i đ a (N)ộ ị 236 186 51 74 21,6 39,8 165,7 ± 19Gia hóa (G) 62 61 62 61 100 100 160,8 ± 10,4

T ngổ 460 376 221 205 48,0 54,5

3.2.2. Thi t l p các gia đình tôm sú th  h  G ế ậ ế ệ o,  G 1  

T  16 phép lai t  h p toàn ph n 4 dòng tôm sú khác nhau đã t o ra đừ ổ ợ ầ ạ ược các gia đình thế 

h  Gệ o. K t qu  có 69 gia đình Gế ả o được th  nuôi thành công. S  lả ố ượng gia đình Go đượ ươ  c  ngnuôi thành công đ n kích c  đánh d u, th  nuôi chung c a t ng phép lai đế ỡ ấ ả ủ ừ ượ   trình bày  ở c

B ng 3.2.  ả

B ng 3.2. S  lả ố ượng gia đình tôm sú th  h  Gế ệ o th  nuôi thành công t  16 phép lai ả ừ

Tômcái

Dòng tôm A G N T T ng c ngổ ộ

T 4 4 4 6 18

T ng c ngổ ộ 16 17 17 19 69

K t qu    B ng 3.ế ả ở ả 2 cho th y: có s  khác nhau khá rõ v  t  l  th  nuôi thành công gi a cácấ ự ề ỷ ệ ả ữ  gia đình Go khác nhau v  ngu n g c tôm b  và tôm m , đ c bi t là khác nhau v  ngu n g cề ồ ố ố ẹ ặ ệ ề ồ ố  tôm mẹ, c  th : ụ ể Các phép lai gi a tôm m  ngu n g c N i đ a v i 4 dòng tôm b  khác nhauữ ẹ ồ ố ộ ị ớ ố  

đ u cho t  lề ỷ ệ thả nuôi thành công c a các gia đình   m c cao (t ng c ng là 21 gia đình)ủ ở ứ ổ ộ ; Tôm 

m  ngu n g c A cũng cho t  l  các gia đình th  nuôi thành công khá cao (21 gia đình);ẹ ồ ố ỷ ệ ả  Tôm 

m  ngu n g c T cho t  l  các gia đình th  nuôi thành công th p h n (18 gia đình);ẹ ồ ố ỷ ệ ả ấ ơ  Trong khi 

đó, các phép lai có tôm m  ngu n g c G cho t  l  các gia đình th  nuôi thành công th p nh tẹ ồ ố ỷ ệ ả ấ ấ  (ch  có 9 gia đình).ỉ

K t qu  trên đây cho th y: ế ả ấ tôm m  thu c các dòng khác nhau sau khi đẹ ộ ược c y tinh nhânấ  

t o và th  nuôi đ  chu n b  cho sinh s n t o th  h  Gạ ả ể ẩ ị ả ạ ế ệ o đã có s  khác nhau rõ r t v  kh  năngự ệ ề ả  

s ng.ố  

Xét v   nh hề ả ưởng c a ngu n g c tôm b  đ i v i t  l  th  nuôi thành công c a các gia đìnhủ ồ ố ố ố ớ ỷ ệ ả ủ  

th  h  Gế ệ o thì không th y s  khác bi t l n: S  lấ ự ệ ớ ố ượng các gia đình khác nhau v  ngu n g c tômề ồ ố  

b  (A, G, N, T) l n lố ầ ượt là 16, 17, 17 và 19 gia đình

T  l  góp ỷ ệ v t li u di truy nậ ệ ề  theo dòng c a 4 dòng tôm sú   th  h  Gủ ở ế ệ o và s  lố ượng cá thể tôm đ c và tôm cái (tôm b  m ) c a t ng dòng tham gia sinh s n đ  t o th  h  Gự ố ẹ ủ ừ ả ể ạ ế ệ o được trình bày   B ng 3.3. T ng s  có 108 cá th  tôm b  m  (bao g m 55 tôm cái và 53 tôm đ c) đở ả ổ ố ể ố ẹ ồ ự ượ  c

ch n t  4 dòng tôm (v t li u ban đ u) đ  t o th  h  Gọ ừ ậ ệ ầ ể ạ ế ệ o. 

B ng 3.3. T  l  góp ả ỷ ệ v t li u di truy nậ ệ ề  theo dòng   th  h  Gở ế ệ o

(Ghi chú * : Các con s  t  l  % trong ngo c đ ố ỷ ệ ặ ượ c tính theo tôm cái riêng và tôm đ c riêng, t ng là 100% ự ổ  

đ i v i m i nhóm tôm đ c ­ cái) ố ớ ỗ ự

K t qu    B ng 3.3 cho th y: ế ả ở ả ấ

+ Trong 69 gia đình được nuôi thành công, có s  cân b ng tự ằ ương đ i v  t  l  tôm b  mố ề ỷ ệ ố ẹ tham gia t o v t li u cho th  h  Gạ ậ ệ ế ệ o, c  th : Dòng tôm sú A chi m t  l  26,9% v i t ng sụ ể ế ỷ ệ ớ ổ ố 29/108 cá th , trong đó có 19 cá th  tôm đ c và 10 cá th  tôm cái;ể ể ự ể  Dòng tôm sú G chi m t  lế ỷ ệ 20,4% v i t ng s  22/108 cá th , trong đó có 6 cá th  tôm đ c và 16 cá th  tôm cái; Dòng tômớ ổ ố ể ể ự ể  

sú N chi m t  l  28,7% v i t ng s  31/108 cá th , trong đó có 17 cá th  tôm đ c và 14 cá thế ỷ ệ ớ ổ ố ể ể ự ể tôm cái; Dòng tôm sú T chi m t  l  24,1% v i t ng s  26/108 cá th , trong đó có 13 cá th  tômế ỷ ệ ớ ổ ố ể ể  

đ c và 13 cá th  tôm cáiự ể  Nh  v y, tư ậ ỷ ệ l  góp v t li u di truy nậ ệ ề  c a ủ dòng tôm N i đ a (N) làộ ị  cao nh t (28,7%) và th p nh t là nhóm tôm ấ ấ ấ Gia hóa (20,4%)

+ Xét trong cùng m t dòng: có s  chênh l ch l n v  t  l  góp ộ ự ệ ớ ề ỷ ệ v t li u di truy nậ ệ ề  gi a tômữ  cái (tôm m ) và tôm đ c (tôm b ) trong cùng m t dòng tôm   nhóm tôm  n Đ  Dẹ ự ố ộ ở Ấ ộ ương (19 tôm cái, 10 tôm đ c) và nhóm tôm Gia hóa (6 tôm cái, 16 tôm đ c);   hai nhóm còn l i là N iự ự Ở ạ ộ  

đ a và Thái Bình Dị ương, t  l  tôm đ c và tôm cái tham gia sinh s n t o th  h  Gỷ ệ ự ả ạ ế ệ o là tươ  ng

đương nhau (l n lầ ượt là 17 tôm cái và 14 tôm đ c   dòng N; 13 tôm cái và 13 tôm đ c   dòngự ở ự ở  T). S  chênh l ch cũng th  hi n rõ   t  l  đóng góp tôm m  (nhóm  n Đ  Dự ệ ể ệ ở ỷ ệ ẹ Ấ ộ ương là 34,5% so 

v i nhóm Gia hóa là 10,9%) và tôm b  (nhóm  n Đ  Dớ ố Ấ ộ ương là 18,9% so v i nhóm Gia hóa làớ  30,2%) gi a b n nhóm v t li u ban đ u.       ữ ố ậ ệ ầ

Tôm b  m  Gố ẹ o được ghép c p đ  s n xu t các gia đình Gặ ể ả ấ 1 cùng cha m  (full­sibs family)ẹ  

và các c p gia đình cùng cha khác m  (half­sibs group). T ng c ng có 246 cá th  tôm th  h  Gặ ẹ ổ ộ ể ế ệ o 

(bao g m 112 tôm cái và 134 tôm đ c) thu c 69 gia đình Gồ ự ộ o đượ ử ục s  d ng làm tôm b  m  đố ẹ ể 

s n xu t th  h  Gả ấ ế ệ 1. K t qu  đã t o đế ả ạ ược 76 gia đình th  h  Gế ệ 1. S  lố ượng các nhóm gia đình 

và s  lố ượng cá th  tể ương  ng đứ ược trình bày   B ng 3.4. ở ả

Tôm bố 

x tôm 

mẹ

S  lố ượng nhóm gia đình cùng cha khác 

mẹ

Số 

lượng gia đình cùng 

h  Gệ 1 thu được là 7.412, trong đó có 5.155 cá th  (chi m t  l  69,5%) thu c nhóm gia đìnhể ế ỷ ệ ộ  cùng cha khác m  và 2.257 cá th  (chi m t  l  30,5%) thu c nhóm gia đình cùng cha m  ẹ ể ế ỷ ệ ộ ẹTôm sú th  h  Gế ệ o, G1  ở các giai đo n khác nhau (t   u trùng đ n giai đo n thành th c)ạ ừ ấ ế ạ ụ  

đượ ươc  ng nuôi trong đi u ki n ki m soát nghiêm ng t v  các thông s  môi trề ệ ể ặ ề ố ường s ng. T tố ấ  

c  m u c a các gia đình lai đ u đả ẫ ủ ề ược sàng l c m m b nh và đ u cho k t qu  âm tính v iọ ầ ệ ề ế ả ớ  

m m b nh virus. Các qầ ệ u n đàn tôm lai th  h  Gầ ế ệ o và th  hế ệ G1 s  là ngu n v t li u ẽ ồ ậ ệ đượ ử c s

d ng choụ  các nghiên c u ti p theo ứ ế nh m sàng l c cácằ ọ  ch  th  phân tỉ ị ử (SNP) liên k t v i tínhế ớ  

tr ng tăng trạ ưởng. 

3.3. Sàng l cọ  đa hình nucleotide đ n (SNP) liên quan đ n tính tr ng tăng trơ ế ạ ưởng   tôm súở  

3.3.1. Gi i trình t , k t n i các đo n ả ự ế ố ạ  

trình   t   và   thi t   l p   h   gen ự ế ậ ệ   tham 

chi u t m th i ế ạ ờ   

Gi i trình tả ự  h  gen tôm sú thu cệ ộ  

hai   nhóm   tôm   tăng   trưởng   nhanh   và 

tôm tăng trưởng ch m trên h  th ngậ ệ ố  

Illumina  NextSeq®500  thu   đượ  c

145.836.644   đo n   trình   t  ạ ự thô  (raw 

read);   trong   s   đó   có   120.438.739ố  

(83%) đo n trình t  mang barcode vàạ ự  

đi m c tể ắ  c a ủ ApeKI. Sau khi tinh s chạ  

thu   được   102.505.713   (70,2%)   đo nạ  

n i   thu   đố ược   510.076   contig   v i   sớ ự 

phân b  kích thố ước các contig được th  hi nể ệ    ở Hình 3.2. Các contig có chi u dài 70­150bpề  chi m s  lế ố ượng l n nh t ớ ấ (211.389), ti p đ n là các contig có chi u dài 150 ­ 300 bp và ít nh tế ế ề ấ  

là các contig có chi u dài 450 ­ 547 bpề  Các contig kích thước ng n dắ ưới 70 bp b  lo i b ị ạ ỏ

H  gen tham chi u t m th iệ ế ạ ờ  c a tôm sú có kích thủ ước 76.299.742 bp (được thi t l p ế ậ t  dừ ữ 

li u gi i trình t  các đo n DNAệ ả ự ạ  có ch t lấ ượng t t nh t),ố ấ  đượ ử ục s  d ng đ  sàng l c SNPể ọ  

B ng 3.ả 5. Tóm t t k t qu  x  lý d  li u ắ ế ả ử ữ ệ gi i trình t  GBSả ự

Ch  s  phân tíchỉ ố Giá trị

Đ  sâu gi i trình tộ ả ự 50x

Dung lượng d  li u (GB)ữ ệ 100

S  lố ượng đo n trình t  thô (raw reads)ạ ự 145.836.644

S  lố ượng đo n trình t  (read)ạ ự   s  d ng k t n iử ụ ế ố  

trong đó có 1799 SNP ch  xu t hi n   nhóm tômỉ ấ ệ ở  

l nớ  nhanh, 587 SNP ch  xu t hi n   nhóm tôm ỉ ấ ệ ở l nớ  

ch m và 501 SNP xu t hi n   c  hai nhóm (Hìnhậ ấ ệ ở ả  

năng đượ ưc l u tr    GenBank (NCBI). Toànữ ở  

b  2887 đo n trình t  ch a SNP   c  haiộ ạ ự ứ ở ả  

nhóm tôm sú L n nhanh và L n ch m đớ ớ ậ ượ  c

chú gi i.ả  K t qu  có 510 (17,67%) contigế ả  

ch a SNP có trình t  nucleotide tứ ự ương đ ngồ  

v i các trình t  trên c  s  d  li u nr­NCBIớ ự ơ ở ữ ệ  

(v i tham s  E­value < 1eớ ố ­6); trong đó có 287 

Protein 

tương ng

ứ

Loài 

tương ng

Marsupen aeus  japonicus

CAAGGTCGTCGATCTTCAGCTTCCATTCAGAGATGATCTTATCGAAGTTCTTCTGTTTCTTCTCAGCGGAGTTGGCCAGAGTCTGTGCACGTTCAGCA

Myosin heavy chain type 1

Penaeus  monodon

CTCGTCTCGAGGAAGCCGAAATGCAGATTGAGTCTCTCAATGTTAAGAACTTGCATTTGGAGAAGACCAAGATGCGTGCG

T  k t qu  BlastX, chúng tôi thu đừ ế ả ược danh sách chú gi i g m các protein đã bi t ch cả ồ ế ứ  năng ho c các protein d  đoán cùng v i tên loài tặ ự ớ ương  ng. V i m c tiêu nghiên c u là tìmứ ớ ụ ứ  

ki m và xác đ nh s  liên quan gi a các gen mã hóa các protein có liên quan đ n tăng trế ị ự ữ ế ưởng ở tôm sú v i các SNP đã sàng l c đớ ọ ược, chúng tôi đã đ i chi u l n lố ế ầ ượt 22 protein liên quan đ nế  

Hình 3.4. K t quế ả chú gi iả gen ch c năngứ

Có  2377  contig  ch a  SNP  không  cho  k t  qu   chú  ứ ế ả

gi i, ả

510 contig ch a SNP cho k t qu  chú gi i, trong đó:  ứ ế ả ả

287 contig ch a SNP   nhóm tôm sú  ứ ở l n nhanh, 126  ớ contig  ch a  SNP    nhóm  tôm  sú  ứ ở l n  ch m  và  97  ớ ậ contig ch a SNP   c  hai nhóm ứ ở ả

ch mậ

A­  S   l ố ượ ng  SNP    nhóm  tôm  sú  ở l n ớ  nhanh  (1799),  B­  S   l ố ượ ng  SNP    nhóm  tôm  sú  ở l n ớ  

ch m (587) ậ ,  C­ S  l ố ượ ng SNP   c  hai nhóm (501) ở ả