Đang tải... (xem toàn văn)
Mục đích nghiên cứu của đề tài là đánh giá đa hình hệ gen các quần đàn tôm sú thu từ các vùng biển Việt Nam; Sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNPs) có tiềm năng liên kết với tính trạng tăng trưởng bằng cách áp dụng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (phương pháp GBS) trên hai nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm.
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MINH THANH NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH HỆ GEN CÁC DỊNG TƠM SÚ (Penaeus monodon) VIỆT NAM NHẰM PHỤC VỤ CƠNG TÁC CHỌN GIỐNG TƠM Chun ngành: Di truyền học Mã số: 9 42 01 21 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC Hà Nội 2019 Luận án được hồn thành tại: Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. ĐINH DUY KHÁNG Viện Cơng nghệ sinh học 2. PGS.TS. NGUYỄN HỮU NINH Viện Nghiên cứu Ni trồng thủy sản III Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án Phiên chính thức họp tại Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam, 18 Hồng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi …giờ …, ngày … tháng … năm 2019 Có thể tìm đọc Luận án tại: Thư viện Quốc Gia Việt Nam Trang web của Bộ Giáo dục và đào tạo (http:luanvan.moet.gov.vn) Viện Cơng nghệ sinh học MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của Đề tài Tơm sú Penaeus monodon Fabricius (1798) là lồi thủy sản ni kinh tế quan trọng ở nhiều quốc gia trên thế giới. Ở Việt Nam, tơm sú là một trong những đối tượng ni chủ lực cho xuất khẩu thủy sản. Nền tảng cho chiến lược phát triển bền vững ngành cơng nghiệp ni tơm sú là chú trọng phát triển nguồn tơm bản địa với các chương trình nhân giống khoa học để nâng cao tỷ lệ sống và sự tăng trưởng. Để đạt được mục tiêu này, nghiên cứu cấu trúc và chức năng của hệ gen tơm sú là vấn đề khoa học cơ bản có định hướng ứng dụng hết sức quan trọng Hiện nay, các nghiên cứu về di truyền phân tử trên đối tượng tơm sú vẫn còn ít ỏi và chưa tương xứng với vai trò của một đối tượng ni kinh tế quan trọng. Thơng tin về các locus tính trạng định lượng (QTLs) liên quan đến tính trạng tăng trưởng hầu như rất hiếm. Vì vậy, việc nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định mối tương quan giữa các SNP (đa hình nucleotide đơn) loại biến dị phổ biến nhất trong hệ gen với tính trạng tăng trưởng ở tơm sú để tạo cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu về chọn giống dựa trên chỉ thị phân tử (CTPT) là hướng nghiên cứu quan trọng đối với ngành cơng nghiệp ni tơm sú. Trong khn khổ Đề tài “Lập bản đồ bộ gen tơm sú (Penaeus monodon)” thuộc Nhiệm vụ đánh giá di truyền nguồn gen cấp Nhà nước, chúng tơi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu đa hình hệ gen các dòng tơm sú (Penaeus monodon) Việt Nam nhằm phục vụ cơng tác chọn giống tơm”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá đa hình hệ gen các quần đàn tơm sú thu từ các vùng biển Việt Nam; Sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNPs) có tiềm năng liên kết với tính trạng tăng trưởng bằng cách áp dụng cơng nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (phương pháp GBS) trên hai nhóm tơm sú tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm 3. Đối tượng nghiên cứu Tơm sú Penaeus monodon Fabricius (1798) 4. Các nội dung nghiên cứu (1) Đánh giá đa hình hệ gen ba quần đàn tơm sú thu từ các vùng biển khác nhau của Việt Nam bằng kỹ thuật AFLP; (2) Lai hỗn hợp 4 dòng tơm sú bố mẹ khác nhau về nguồn gốc địa lý để tạo vật liệu nghiên cứu thế hệ Go và G1; (3) Áp dụng kỹ thuật xác định kiểu gen bằng phương pháp giải trình tự (GBS) để phân tích hệ gen tơm sú thuộc hai nhóm tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm thế hệ Go và G1 nhằm sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNP) liên quan đến tính trạng tăng trưởng; (4) Sàng lọc chỉ thị SNP G>A ở tơm sú tăng trưởng nhanh bằng kỹ thuật PCR đặc hiệu alen cạnh tranh (KASP) để đánh giá tiềm năng ứng dụng của SNP này đối với việc đánh giá nhanh chóng và chính xác các cá thể tơm nhằm hỗ trợ trong cơng tác chọn giống tơm sú 5. Những đóng góp mới của Luận án về mặt khoa học và thực tiễn (1) Luận án là nghiên cứu đầu tiên đưa ra đánh giá về đa dạng di truyền của ba quần đàn tơm sú tự nhiên từ các vùng biển Việt Nam bằng kỹ thuật AFLP (2) Sàng lọc được bộ chỉ thị SNP ở nhóm tơm sú tăng trưởng nhanh làm cơ sở cho việc tìm kiếm chỉ thị SNP liên kết với tính trạng tăng trưởng nhanh ở tơm sú. Hai chỉ thị SNP được xác định trong nghiên cứu của luận án là phát hiện đầu tiên về chỉ thị SNP nằm trong exon của gen MHC họ giáp xác. Những kết quả này cung cấp dẫn liệu khoa học hữu ích cho việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống tơm sú 6. Bố cục của Luận án Luận án gồm tổng cộng 194 trang cả bìa, trong đó: Mở đầu 4 trang; Chương 1 Tổng quan tài liệu 34 trang; Chương 2 Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu 22 trang; Chương 3 Kết nghiên cứu 38 trang; Chương 4 Bàn luận kết quả 25 trang; Kết luận và Kiến nghị 2 trang; Danh mục các cơng trình cơng bố 2 trang; Tóm tắt kết quả nghiên cứu bằng tiếng Anh 7 trang; Tài liệu tham khảo 28 trang; Phụ lục 17 trang; Trong Luận án có 24 bảng và 23 hình Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái qt về tơm sú Penaeus monodon và tình hình ni tơm sú trên thế giới Tơm sú Penaeus monodon thuộc họ Penaeidae, bộ Decapoda, lớp Malacostraca, ngành phụ Crustatacea, ngành Arthropoda. Với những tiến bộ về kỹ thuật ni và cơng nghệ chế biến thức ăn thủy sản thì ngành cơng nghiệp ni tơm sú đã nhanh chóng lan rộng khắp Châu Á, Châu Mỹ trong những thập niên cuối thế kỷ 20. Tuy nhiên trong những năm sau đó, dịch bệnh gia tăng trong các quần đàn tơm tự nhiên khiến chất lượng giống liên tục sụt giảm đã dẫn đến sự thay thế dần tơm sú bởi tơm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) sạch bệnh có nguồn gốc Nam Mỹ. Việc các nước Châu Á dần từ bỏ đối tượng bản địa quan trọng này chủ yếu là do chưa gia hố và kiểm sốt được dịch bệnh nên khơng đảm bảo chất lượng tốt của con giống. Việt Nam nằm trong nhóm gồm các quốc gia sản xuất tơm sú hàng hố lớn nhất thế giới Khác với các nước Châu Á láng giềng (chủ yếu ni tơm thẻ chân trắng), Việt Nam hiện là một trong số ít các nước vẫn đang sản xuất tơm sú cỡ to, chất lượng cao và chiếm phần lớn sản lượng tơm ni. Tuy nhiên nghề ni tơm sú ở Việt Nam hiện nay cơ bản vẫn dựa vào nguồn tơm giống đánh bắt từ tự nhiên và các thành tựu gia hóa dựa trên phương pháp chọn giống truyền thống. Do đó, nghề ni tơm sú vẫn đối mặt với khơng ít thách thức, trong đó có vấn đề về chủ động nguồn tơm giống đảm bảo chất lượng Nhìn chung, xu thế ở các quốc gia trên thế giới trong sản xuất tơm giống là từng bước gia hóa đàn tơm, tiến hành các giải pháp cơng nghệ để khép kín vòng đời, chọn giống tơm sạch bệnh, tạo ra các dòng mới chất lượng cao và tăng trưởng tốt. Những nỗ lực trong vấn đề gia hố (tạo tơm bố mẹ) và nâng cao chất lượng di truyền (nghiên cứu đa dạng di truyền, tìm kiếm các CTPT liên kết với các tính trạng tăng trưởng nhanh, chống chịu bệnh tốt, sức sinh sản cao…) được coi là những vấn đề then chốt. 1.2. Kỹ thuật phân tích chỉ thị DNA và ứng dụng trong nghiên cứu đa hình hệ gen và trong chọn giống tơm sú Các CTPT được sử dụng rộng rãi như những cơng cụ chọn lọc đắc lực đối với các tính trạng quan tâm trong các chương trình chọn giống ở nhiều lồi vật ni, cây trồng và các lồi thủy sản. Việc ứng dụng các CTPT giúp cho các nhà chọn giống nhận diện chính xác các gen quan tâm nhằm rút ngắn thời gian chọn giống. Hiệu quả cải tiến giống sẽ gia tăng gấp nhiều lần so với các phương pháp chọn giống cổ điển nhờ thực hiện việc chọn lọc khơng cần trực tiếp trên tính trạng mong muốn mà thơng qua CTPT liên kết với tính trạng đó Các CTPT là cơng cụ hữu hiệu để đánh giá sự đa dạng di truyền, xây dựng bản đồ di truyền và ứng dụng trong nghiên cứu cải tạo, chọn giống tôm chất lượng tốt, sạch bệnh như: RAPD (Garcia & Benzie, 1995), RFLP (Benzie et al., 1993, Klinbunga et al., 1999), xác định các chỉ thị RAPD ở quần đàn tôm sú kháng bệnh đốm trắng (Dutta et al., 2013), phát triển chỉ thị microsatellite trong chọn tơm sú bố mẹ (Jerry et al., 2006), kỹ thuật microsatellite nghiên cứu đa hình di truyền trên đối tượng tơm sú (Saeid et al., 2011, Nguyễn Thị Thảo et al., 2004; Rumisha et al., 2017; Staelens et al., 2018…), sử dụng kỹ thuật AFLP để lập bản đồ di truyền trên đối tượng tơm Trung Quốc (Zhaoxia et al., 2006, You et al., 2010), đa hình SNP tại thụ thể vitellogenin (PmVtgr) gắn liền với các kiểu hình liên quan đến sinh sản (chỉ số gonadosomatic và trọng lượng buồng trứng) của tơm sú P. monodon đã được phát hiện (Klinbunga et al., 2015), biểu hiện của protein gắn kết Xbox 1 (PmXbp1) trong q trình phát triển buồng trứng ở tơm sú bố mẹ P. monodon hoang dã và sự liên kết giữa SNP với các tham số liên quan đến tăng trưởng đã được phát hiện (Prasertlux et al., 2015)… Kỹ thuật AFLP được sử dụng để phân tích đa hình DNA bằng cách nhận biết đồng thời nhiều phân đoạn DNA sau khi cắt bởi enzyme và khuếch đại chọn lọc. Đây là cơng cụ hiệu để nhận biết các locus đa hình mà khơng cần biết trước thơng tin về trình tự DNA của chúng (Richard et al., 1998). Phương pháp này có thể ước lượng nhanh sự đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể với nhau (Watson và Barker, 2004). AFLP được sử dụng cho nhiều mục đích như: nghiên cứu biến dị di truyền (Mueller và Wolfenbarger, 1999); đánh giá đa dạng di truyền các quần đàn ở các đối tượng khác nhau như cá trê (Liu et al., 1998), cá thơm (Seki et al., 1999), cá chép (Wang et al., 2000); lập bản đồ di truyền (Zhaoxia et al., 2006, You et al., 2010; Staelens et al., 2018); xác định quan hệ giữa các giống ( Jacobs et al., 2008); xây dựng các nhóm liên kết chéo; các nghiên cứu về đa dạng di truyền và phát sinh lồi phân tử ( Wang et al., 2004)… SNP là một trong những CTPT hiệu quả được ứng dụng trong chọn giống. Các vị trí SNP trong hệ gen là nơi mà đó chuỗi DNA được phân biệt bởi một base duy nhất khi hai hoặc nhiều cá thể được so sánh. Sự khác nhau về nucleotide này có thể dẫn đến thay đổi tính trạng và được sử dụng để đánh giá đa dạng trong tiến hóa. SNP có số lượng lớn, ổn định , thích hợp cho việc tự động hóa trong phân tích và chỉ ra được các đa hình có thể khơng phát hiện được bởi các phương pháp khác (Vaseeharan et al., 2013; Liu and Cordes, 2004). SNP có thể xuất hiện ở các vùng mã hóa và khơng mã hóa trong hệ gen của sinh vật, tác động trực tiếp đến tính trạng quan tâm, rất hiệu quả trong việc xác định tương quan giữa SNP và tính trạng (Beuzen et al., 2000). SNP đã được sử dụng để sàng lọc các gen tiềm năng liên quan đến tính trạng tăng trưởng của một số đối tượng thuỷ sản: cá hồi Salvelinus alpinus (Tao và Boulding, 2003), cá chẽm (Xu et al., 2006), tơm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei và tơm sú P. monodon (Glenn et al., 2005) 1.3. Kỹ thuật GBS và ứng dụng trong chọn giống GBS (Genotyping By Sequencing: Kỹ thuật xác định kiểu gen bằng phương pháp giải trình tự) là một ứng dụng mới của kỹ thuật NGS (Next Generation Sequencing: cơng nghệ giải trình tự thế hệ mới) để phát hiện SNP. Những cải tiến khơng ngừng của các hóa chất giải trình tự và các cơng cụ phần mềm cho phép các kỹ thuật NGS cung cấp những thơng lượng lớn về dữ liệu giải trình tự trong mỗi lần thực hiện, nhờ đó giảm giá thành, khiến cho GBS trở thành giải pháp thay thế có tính cạnh tranh so với các phương pháp phân tích gen khác. NGS cho phép tạo ra các bản đồ SNP mật độ cao được dự đốn sẽ là hướng ứng dụng rộng rãi trong nhiều chương trình chọn giống. Các nhà chọn giống có thể giải trình tự các bộ gen lớn và xây dựng các bản đồ liên kết mật độ cao từ các quần thể chọn giống. Các ứng dụng trong tương lai của GBS đối với việc cải thiện giống cây trồng, vật ni có thể cho phép các nhà chọn giống kiểm sốt được các chương trình MAS (chọn giống dựa trên CTPT) hay GS (chọn lọc hệ gen) trên phơi mầm hay lồi mới mà khơng cần phát triển các cơng cụ phân tử trước đó Khi việc phân tích gen dựa trên việc giải trình tự có thể thực hiện được đối với tồn bộ các lĩnh vực nghiên cứu về hệ gen thì GBS sẽ trở thành nhân tố chính trong di truyền và chọn giống (He et al., 2014). 1.4. Phương pháp PCR đặc hiệu alen cạnh tranh (KASP) KASP là một dạng biến đổi của kỹ thuật PCR để phân tích hệ gen dựa trên kéo dài chuỗi oligo đặc hiệu alen và sự chuyển năng lượng cộng hưởng huỳnh quang để tạo ra tín hiệu (Kumpatla et al., 2012; He et al., 2014). Cơng nghệ này có nhiều ứng dụng trong phân tích kiểm sốt chất lượng hệ gen, lập bản đồ QTL, chọn giống dựa trên CTPT (MAS) Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu * Các mẫu tơm sú sử dụng cho nghiên cứu đa hình AFLP do Viện Nghiên cứu NTTS I cung cấp. Mẫu được thu từ 3 quần đàn tự nhiên khác nhau: Quần đàn Bắc Trung Bộ (kí hiệu: BTB) thu mẫu tại vùng biển tỉnh Nghệ An, Quần đàn Nam Trung Bộ (NTB) thu mẫu tại vùng biển tỉnh Khánh Hòa và Quần đàn Nam Bộ (NB) thu mẫu tại vùng biển tỉnh Bạc Liêu. M ỗi quần đàn thu trên 50 mẫu * Các mẫu tơm sú sử dụng cho nghiên cứu sàng lọc SNP do Viện Nghiên cứu NTTS II cung cấp: Vật liệu gốc bao gồm 4 dòng tơm sú bố mẹ có nguồn gốc địa lý khác nhau, trong đó 3 dòng có nguồn gốc tự nhiên là tơm sú Ấn Độ Dương (kí hiệu: A) Nhập từ Thái Lan (vùng biển Amanda) và từ Myanmar, tơm sú Thái Bình Dương (T) Nhập từ Singapore, tơm tự nhiên của Việt Nam (thu thập từ Cà Mau, Đà Nẵng, Phú n) gọi chung là tơm nội địa (N) và dòng tơm Gia hóa (G) được cung cấp bởi Cơng ty Moana Ninh Thuận Đây là dòng tơm được thương mại hóa dùng làm tơm bố mẹ sản xuất tơm giống phục vụ cho ni thương phẩm Tơm sú thế hệ Go và G1 được tạo ra từ các đàn tơm bố mẹ này bằng cách lai hỗn hợp giữa bốn dòng tơm bố mẹ. Từ các cá thể trong đàn con của các gia đình tơm sú thế hệ G o và G1, chọn ra các cá thể (bao gồm cả tơm cái ♀ và tơm đực ♂) thuộc hai nhóm khác nhau theo tiêu chí mức độ tăng trưởng: tăng trưởng nhanh (F) và tăng trưởng chậm (S) để sử dụng cho nghiên cứu sàng lọc SNP. 40 mẫu tơm sú cái lớn nhanh thế hệ G1 được chọn để thực hiện kỹ thuật KASP * Các hóa chất kit tinh sử dụng hãng: Sigma Aldrich, Qiagen, Invitrogen, Life Technologies, Fermentas, Promega; Các hóa chất thơng dụng khác trong phòng thí nghiệm đạt độ tinh khiết cần thiết cho các nghiên cứu * Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu thuộc Phòng Vi sinh vật học phân tử và Phòng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ gen, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam 2.2. Các phương pháp nghiên cứu chính 2.2.1. Thu mẫu tơm sú Thu mẫu tơm sú tự nhiên phục vụ nghiên cứu đa hình hệ gen: các mẫu tơm sú được thu gom bằng cách đặt hàng cho người dân đánh bắt bằng lưới ở ngồi biển xa bờ. Thu mẫu tơm sú tự nhiên làm tơm giống bố mẹ, sàng lọc mầm bệnh và chăm sóc tơm bố mẹ: Các quy trình thu mẫu tơm sú bố mẹ, sàng lọc mầm bệnh và chăm sóc tơm bố mẹ được thực hiện tại Trung tâm Quốc gia Giống hải sản Nam Bộ Viện NCNTTS II. 2.2.2. Thiết lập các gia đình tơm sú tạo thế hệ Go, G1 Các phương pháp: lai hỗn hợp giữa các dòng tơm sú bố mẹ, ghép phối, sinh sản nhân tạo, ương ni, đánh dấu huỳnh quang và truy xuất nguồn gốc tơm sú… được thực hiện theo quy trình sản xuất giống đã được nghiên cứu và thực hiện thành cơng nhiều năm tại Trung tâm Quốc gia Giống hải sản Nam Bộ, thuộc Viện Nghiên cứu ni trồng thủy sản II. 2.2.3. Tách chiết, tinh sạch, xác định nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số từ mơ cơ tơm sú DNA tổng số từ mơ cơ tơm sú được tách chiết theo quy trình của Eurobiobank (2004) DNA tổng số được tinh sạch bằng Kit PureLinkTM Genomic DNA (Life Technologies) Nồng độ và độ tinh sạch của DN A được xác định bằng máy quang phổ NanoDrop® Spectrophotometer bước sóng λ = 260 nm λ = 280 nm (Thermo Fisher Scientific NanoDrop Products, www.nanodrop.com) 2.2.4. Kỹ thuật AFLP đánh giá đa hình hệ gen Kỹ thuật AFLP được thực hiện theo quy trình của hãng Applied BioSystems Phân tích kết quả AFLP trên máy xác định trình tự tự động ABI3100 ( Invitrogen) sử dụng điện di mao quản và phần mềm phân tích đoạn GeneMapper® Software Version 4.1 AFLP® System Analysis (Invitrogen) để đánh giá tính đa hình di truyền hệ gen tơm sú; Xây dựng cây phát sinh chủng loại giữa các quần đàn tơm sú Việt Nam bằng phần mềm MEGA (Kumar et al., 2001). 2.2.5. Kỹ thuật GBS phân tích hệ gen tơm sú, sàng lọc SNP liên kết với tính trạng tăng trưởng Xây dựng thư viện GBS và giải trình tự DNA: Kỹ thuật GBS được thực hiện theo các bước như mơ tả trong cơng bố của Elshire et al. (2011). Enzyme cắt hạn chế được sử dụng là ApeKI (New England Biolabs). DNA tổng số sau khi được cắt và gắn với adaptor được tinh sạch bằng QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). Các đoạn DNA tinh sạch từ các mẫu được trộn lại với nhau với tỷ lệ tương đương. Khoảng 100 ng sản phẩm DNA trộn từ các mẫu được sử dụng làm khuôn để tạo thư viện cho NGS với cặp mồi primer1 và primer2 bắt cặp bổ sung với barcode adaptor và common adaptor: Primer1:(5’3’)AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT Primer2:(5’3’) CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT Sản phẩm PCR có kích thước 300500 bp được thu nhận bằng phương pháp cắt gel và tinh sạch bằng QIAquick PCR Purification Kit. Kích thước và độ sạch của thư viện DNA sau đó được đánh giá trên Bioanalyzer 2100 (Agilent Technology). Thư viện DNA được làm giàu và xác định trình tự hai chiều (pairend) hệ thống Illumina NextSeq®500, sử dụng NextSeq 500/550 High Output v2 kit (300 cycles) Xử lý dữ liệu GBS, lắp ráp hệ gen tham chiếu tạm thời và xác định SNP: Dữ liệu GBS được xử lý và phân tích để phát hiện SNP dựa theo phương pháp GBSSNP CROP (GBS SNPCalling Reference Optional Pipeline) được mơ tả bởi Melo et al. (2016). Dữ liệu thơ được chuyển thành định dạng fastq bằng cơng cụ BCL2FASTQ 2.1. Chất lượng trình tự được đánh giá bằng FastQC. Trình tự adaptor được loại bỏ bằng phần mềm Trimmomatic software v.0.3.6 (Bolger et al., 2014). Trình tự của từng mẫu được tách ra trên cơ sở nhận biết trình tự barcode sử dụng cơng cụ Inhouse script do nhóm nghiên cứu tự phát triển. Do hệ gen tơm sú chưa được cơng bố trình tự tham chiếu nên chúng tơi đã sử dụng các mẫu lắp ráp de novo để tạo trình tự tham chiếu tạm thời theo phương pháp được mơ tả bởi Melo et al. (2016), sử dụng các cơng cụ PEAR v.0.96 và USEARCH v.8.0.162 (Zhang et al., 2014; Edgar, 2010). Trình tự của các mẫu tơm sú được so sánh với trình tự tham chiếu bằng BWAMEM v.0.7 (Li et al., 2009a). Dữ liệu SNP được truy xuất bằng cơng cụ SAMtools v.1.2 (Li et al., 2009b). SNP được xác định khi gióng hàng các contig và sự sai khác nucleotide được phát hiện trên ít nhất bốn trình tự. Chỉ các SNP hai allen đáp ứng mức độ l ặp lại như trên mới được xác định là SNP (Melo et al., 2016; Nguyễn Minh Thành et al., 2015; Kumar, 2014). Chú giải các đoạn trình tự và xác định gen liên quan: Cơng cụ BlastX (EvalueC], tức là SNP A G trên mạch gốc contig83953 được xác định là vị trí SNP A4486G trên gen MHCa (Hình 3.5). SNP này là nucleotide thứ 3 trong bộ ba Contig 83953 (codon) mã hóa amino acid, làm bi ến đổi codon AAA thành AAG. Cả hai codon này đều mã hóa amino acid Lysine (K) với vị trí amino acid tương ứng trên protein MHCa là K1456K (Hình 3.6). Nói cách khác, SNP này khơng làm thay đổi amino acid tương ứng. SNP G A tại vị trí nucleotide thứ 19 trên contig260347 [Contig260347:g.19G>A] Contig 83953 được xác định là vị trí SNP G4320A trên gen MHC1 (Hình 3.7). SNP này là nucleotide thứ 2 trong bộ ba mã hóa amino acid, làm biến đổi codon GGA (mã hóa amino acid Glycine G) thành GAA (mã hóa amino acid Glutamic E). Vị trí amino acid tương ứng Contig 83953 trên protein MHC 1 là G1401E (Hình 3.8). Như vHình 3.5. Vùng t ậy, với việc sươ ử d ụng hệ gen tham chiếu tạm thời của tôm sú P. monodon được thiết ng đồng nucleotide giữa mạch bổ sung của contig83953 của tôm sú P. lập de novo đ ể sàng l ọc SNP, nghiên c ứu của chúng tôi đã xác đ ịnh đ ược hai SNP ở nhóm tơm monodon so v ới trình t ự gen MHCa ở tơm he Nh ật Bản P. japonicus (v ị trí nucleotide 4408 4505) sú tăng trưởng nhanh. Hai SNP này nằm trong phân vùng chức năng LMM của gen MHC liên quan đến tính trạng tăng trưởng S2 LMM Contig 83953 Contig 83953 Contig 83953 Hình 3.6. Ánh xạ trình tự amin oacid thể hiện vùng tương đồng giữa contig83953 của tơm sú P. monodon với protein MHCa ở tơm he Nhật Bản P. japonicus (vị trí amino acid 1431 1462) 16 Contig260347 Contig260347 Hình 3.7. Vùng tương đồng nucleotide giữa contig260347 so với trình tự gen MHC1 ở tơm sú P. monodon (vị trí nucleotide 4302 4379) S2 LMM Contig260347 Contig260347 Hình 3.8. Ánh xạ trình tự acid amin thể hiện vùng tương đồng giữa contig260347 với MHC1 ở tơm sú P. monodon (vị trí acid amin 1396 1422) 3.4. Sàng lọc chỉ thị SNP G>A ở tơm sú tăng trưởng nhanh bằng phương pháp KASP Kết quả kiểm tra trên 40 mẫu tơm sú cái tăng trưởng nhanh thế hệ G 1 (Hình 3.9) cho thấy: hầu hết mẫu tơm sú tăng trưởng nhanh (28/40 mẫu) chứa SNP dạng đồng hợp tử A:A (màu xanh dương); có 2/40 mẫu chứa SNP dạng đồng hợp tử G:G (màu đỏ); còn lại là 10/40 mẫu chứa SNP dạng dị hợp tử G:A (màu xanh lá cây). Kết quả này cho thấy: việc sử dụng các mồi xi và mồi ngược được thiết kế đặc hiệu với trình tự DNA chứa SNP G>A, trong đó trình tự mồi xi đặc hiệu với alen kiểu dại được gắn HEXtail (màu đỏ) và trình tự mồi xi đặc hiệu với alen đột biến được gắn FAMtail (màu xanh dương) đã phát hiện thấy đột biến G4320A thuộc gen MHC1 có mặt ở 38 trong số 40 mẫu tơm sú được kiểm tra (chiếm 95%). Trong số 38 cá thể tơm sú mang đột biến G4320A, có 28 cá thể mang kiểu gen đồng hợp tử (tương ứng với 28 tín hiệu huỳnh quang màu xanh dương) và có 10 cá thể mang kiểu gen dị hợp tử (tương ứng với 10 tín hiệu huỳnh quang màu xanh lá cây) 17 Hình 3.9. Kết quả phân tích tín hiệu huỳnh quang trong kỹ thuật KASP sàng lọc chỉ thị SNP G>A thuộc gen MHC1 ở tơm sú tăng trưởng nhanh Các chấm màu xanh dương thể hiện các mẫu tơm sú tăng trưởng nhanh có đồng hợp tử A:A (28/40 mẫu); Các chấm màu đỏ thể hiện các mẫu tơm tăng trưởng nhanh có đồng hợp tử G:G 2/40 mẫu; Các chấm màu xanh lá cây thể hiện các mẫu tơm tăng trưởng nhanh có dị hợp tử G:A 10/40 mẫu Các chấm màu đen là tín hiệu huỳnh quang bị nhiễu; Các mẫu đối chứng khơng có tín hiệu huỳnh quang (khơng xuất hiện trên hình) Chương 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ 4.1. Đa hình AFLP ở các quần đàn tơm sú Kết quả phân tích đa hình AFLP sử dụng cặp mồi chọn lọc MseICTT/EcoRIACC JOE đối với các mẫu tơm sú thuộc ba quần đàn BTB, NTB và NB với số lượng alen ở các quần đàn là khác nhau, khơng có sự trùng nhau hồn tồn về vị trí xuất hiện của các alen đã cho thấy genome của các mẫu tơm sú có cấu trúc khác nhau, tức là có sự đa hình về mặt di truyền giữa các cá thể. Khi so sánh chi tiết vị trí các alen của các mẫu tơm sú giữa các quần đàn với nhau cho thấy: khơng những các alen các mẫu là khơng trùng nhau hồn tồn khi so sánh hai mẫu bất kỳ thuộc cùng một quần đàn hay thuộc hai quần đàn khác nhau, mà ở mỗi quần đàn đều có những alen đặc trưng cho quần đàn đó, tức là chỉ xuất hiện ở một hoặc một vài cá thể của một quần đàn mà khơng thấy có các quần đàn khác. Trong đó: Quần đàn BTB có số lượng alen đặc trưng quần đàn nhiều hơn hẳn so với quần đàn NTB và NB Trong phạm vi từng quần đàn, khi so sánh sự đa hình AFLP giữa các cá thể thuộc cùng một quần đàn cho thấy: trong khi ở qn đan NTB co 4 alen trung nhau, ̀ ̀ ́ ̀ ở qn đan NB có 8 alen ̀ ̀ trùng nhau thì điểm đặc biệt của quần đàn Bắc Trung Bộ là khơng có bất kì alen nào trùng nhau. Điều này cho thấy tính đa dạng di truyền rất cao của các cá thể trong quần đàn này Phân tich sâu h ́ ơn chung tôi nh ́ ận thây, gi ́ ữa 3 qn đan nay khơng co alen nao trùng nhau ̀ ̀ ̀ ́ ̀ Từ những nhận định trên đây có thể kết luận: các mẫu tơm sú nghiên cứu thuộc 3 quần đàn khác nhau thể hiện tính đa hình di truyền rõ rệt. Mỗi cá thể đều là khác biệt hay nói cách khác chúng có kiểu gene khác nhau. Sự đa hình này khơng chỉ thể hiện giữa các cá thể bên trong mỗi quần đàn mà còn là sự đa hình giữa các quần đàn tơm sú thuộc các khu vực phân bố khác nhau về mặt địa lý. Trong số 3 quần đàn tơm sú nghiên cứu, quần đàn BTB thể hiện tính đa hình di truyền (đa hình AFLP) cao nhất và thấp nhất là quần đàn NB. 18 Các nhận định này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thảo et al. (2004) khi nghiên cứu tính đa hình của ba quần đàn tơm sú (gồm 2 quần đàn tơm sú Việt Nam và 1 quần đàn tơm sú nhập ngoại từ Singapore) bằng phương pháp phân tích microsatellite. Kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả này cho thấy: ngay trong nội bộ một quần đàn và giữa các quần đàn tơm cũng thể hiện tính đa hình di truyền cao ; Ba quần đàn với tổng số 83 cá thể là 83 sự khác biệt với 83 kiểu gene khác nhau, có rất ít hoặc khơng có alen trùng nhau ; Khi phân tích cây phát sinh chủng loại thì 2 quần đàn tơm Việt Nam thuộc cùng một nhánh tách biệt hồn tồn với nhánh tơm nhập từ Singapore còn lại; Quần đàn tơm sú ở vùng Phú n (thuộc vùng Trung Bộ) thể hiện tính đa hình cao hơn so với quần đàn vùng Rạch Gốc (Nam Bộ). Trong nghiên cứu của chúng tơi, dòng tơm Nội địa là tơm tự nhiên của Việt Nam được thu từ các vùng biển Đà Nẵng, Phú n… (vùng biển Nam Trung Bộ). Kết quả đánh giá đa hình di truyền AFLP trong nghiên cứu này đã cho thấy quần đàn vùng này có sự đa hình di truyền khá rõ nét. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thảo et al., (2004) với chỉ thị microsatellite cũng khẳng định điều này. Đây là những dẫn liệu quan trọng bước đầu định hướng cho việc lựa chọn dòng tơm bố mẹ từ các quần đàn bản địa có tính đa hình di truyền để tạo ưu thế lai trong cơng tác chọn giống tơm sú. Tuy nhiên đây mới chỉ là nhận định bước đầu trong phạm vi kết quả nghiên cứu của đề tài này. Để có thể khẳng định được mức độ đa hình di truyền của các quần đàn tơm sú tự nhiên Việt Nam thì cần phải tiến hành thêm nhiều nghiên cứu trên nhiều quần đàn với số lượng mẫu lớn hơn, đặc biệt cần có các số liệu nghiên cứu về các chỉ số đa dạng di truyền của các quần đàn đó Một số kết quả nghiên cứu của các nhóm tác giả khác trên các đối tượ ng tơm sú thuộc các quần đàn địa lý khác nhau trong khu v ực Đơng Nam Á cũng cho thấy những nhận định tươ ng tự về tính đa dạng di truyền của các quần đàn tơm. Khamnamtong et al. (2009) đã nghiên cứu sự đa hình di truyền và sự khác biệt về địa lý trên đối tượng tơm sú thu ở 3 vùng địa lý khác nhau ở Thái Lan. Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự đa hình di truyền cao trên các đối tượng tơm khảo sát, khơng có sự tương đồng di truyền mà có khác biệt rất lớn trong thơng tin di truyền của các cá thể. Sự đa dạng di truyền trên tơm cũng được thể hiện trong các nghiên cứu sử dụng kỹ thuật microsatellite (Supungul et al., 2000) Klinbunga et al. (2001) nghiên cứu tính dị hợp về thơng tin di truyền trên tơm sú Thái Lan bằng kỹ thuật RAPD và phân tích DNA ty thể bằng kỹ thuật RFLP. Kết quả nghiên cứu của nhóm này cho thấy sự khác biệt về vật chất di truyền giữa các cá thể thu ở 5 vùng địa lý khác nhau. Các cá thể thuộc cùng một khu vực địa lý cũng ít cho thấy sự tương đồng, mỗi cá thể mang một kiểu gene riêng 4.2. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa các quần đàn tơm sú Việt Nam Cây phát sinh chủng loại của các mẫu tơm sú nghiên cứu thuộc 3 quần đàn tự nhiên vùng biển BTB, NTB và NB của Việt Nam phản ánh rõ mối tương quan về mặt di truyền giữa chúng. Nhìn chung, các cá thể thuộc cùng một quần đàn có mức độ tương đồng về mặt di truyền (thể hiện ở các nhánh gần nhau trên cây phân loại) cao hơn so với các cá thể thuộc các quần đàn khác nhau Hiện tượng một số cá thể thuộc quần đàn này lại xuất hiện trên nhánh phân loại của quần đàn khác có thể được giải thích bởi các ngun nhân sau: (1) Do sự di cư của các đàn tơm sú 19 trong tự nhiên từ vùng biển này đến vùng biển khác theo các dòng hải lưu để tìm kiếm nguồn thức ăn và mơi trường mới thích hợp với giai đoạn sinh trưởng của chúng; (2) Do người ni tơm đánh bắt tơm sú bố mẹ từ tự nhiên đem về để sản xuất tơm giống, bán cho người ni ở các khu vực khác (Bắc, Trung, Nam), khi ni có thể tơm thốt ra ngồi tự nhiên nên có sự pha tạp. Các kết quả này phù hợp với đặc điểm ni trồng thủy sản ở Việt Nam cũng như ở các khu vực khác trên thế giới. Tính chất đa hình về mặt di truyền giữa các cá thể trong cùng một quần đàn và giữa các quần đàn, cũng như sự pha tạp cá thể giữa các quần đàn tiếp giáp cũng phù hợp với nhận định của các tác giả khác khi nghiên cứu về đa hình di truyền các quần thể tơm tự nhiên. Mặc dù vị trí địa lý của các quần đàn thu mẫu là khác nhau giữa các nghiên cứu nhưng về cơ bản đều cho thấy các quần thể tơm sú ở các vùng phân bố khác nhau có sự khác biệt rõ rệt về mặt di truyền giữa các quần thể địa lý (Pan et al., 2004). Theo đó, tơm giống tự nhiên ở những vùng khác nhau cũng sẽ khác nhau về sức sinh sản, tỷ lệ sinh trưởng, khả năng chống chịu bệnh và nhiều đặc tính khác (Kim Thị Phương Oanh et al., 2010). Mặt khác, tùy thuộc vào phương pháp đánh giá đa hình được sử dụng mà kết quả phân tích và mơ hình cây phát sinh chủng loại được thể hiện giữa các nghiên cứu cũng khác nhau, thậm chí trên cùng một đối tượng nghiên cứu hoặc trên các mẫu nghiên cứu được thu thập từ các quần thể khá tương đồng về mặt địa lý. Trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Thảo et al. (2004), phương pháp phân tích microsatellite được sử dụng để đánh giá đa hình ở ba quần đàn tơm sú tự nhiên cũng đã cho thấy có rất ít hoặc khơng có alen trùng nhau. Tuy nhiên mơ hình cây phát sinh chủng loại biểu thị 2 quần đàn tơm sú Việt Nam (thu thập tại các vùng biển Phú n (thuộc vùng Trung Bộ) và vùng Rạch Gốc (Nam Bộ) thuộc cùng một nhánh tách biệt hồn tồn với nhánh tơm nhập từ Singapore còn lại. Trong nghiên cứu này, cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng các cơng cụ phần mềm tương thích với dữ liệu đầu vào về phân tích AFLP. Về cơ bản, cây phát sinh chủng loại ở Hình 3.3 thể hiện được nội dung kết quả nghiên cứu, phản ánh mức độ gần gũi về mặt di truyền giữa các mẫu tơm sú được thu từ cùng một quần đàn cũng như sự pha tạp giữa các quần đàn 4.3. Tạo vật liệu tơm sú thế hệ G0, G1 Kết quả sàng lọc nguồn tơm bố mẹ đầu vào đối với 4 dòng tơm sú Ấn Độ Dương (A), Thái Bình Dương (T), Nội địa (N) và Gia hóa (G) theo tiêu chí sạch bệnh cho thấy: tỷ lệ sạch bệnh cao nhất là tơm G (100%). Kết quả này là phù hợp vì thực tế dòng tơm G là tơm chọn giống được thương mại hóa dùng làm tơm bố mẹ sản xuất tơm giống phục vụ cho ni thương phẩm. Dòng tơm này được ni trong điều kiện đảm bảo an tồn sinh học một cách nghiêm ngặt. Các dòng tơm tự nhiên nhập ngoại (A, T) cũng có tỷ lệ sạch bệnh khá cao. Riêng dòng tơm tự nhiên trong nước (N) có tỷ lệ giữ lại sau sàng lọc bệnh thấp nhất. Sau khi hồn thiện việc ghép cặp cho lai hỗn hợp bốn dòng tơm sú có nguồn gốc địa lý khác nhau đã tạo ra được các gia đình, bước đầu tạo được nguồn vật liệu đa dạng về mặt di truyền cho các nghiên cứu tiếp theo về sàng lọc chỉ thị phân tử SNP. Kết quả ghép phối hỗn hợp 4 dòng tơm sú có nguồn gốc địa lý khác nhau với 16 phép lai để tạo ra các gia đình cho thấy: tơm mẹ thuộc các dòng khác nhau sau khi được cấy tinh và thả ni để chuẩn bị cho sinh sản tạo thế hệ Go đã có sự khác nhau rõ rệt về khả năng sống. Nói cách khác, các phép lai có sự khác 20 nhau về nguồn gốc tơm mẹ và tơm bố sẽ dẫn đến sự khác nhau về số lượng gia đình được thả ni thành cơng. Điều này có thể được lý giải do sự khác nhau về sức sống của tơm mẹ thuộc các dòng khác nhau. Chẳng hạn: tơm mẹ N là dòng tơm sú có nguồn gốc bản địa trong nước nên có thể chúng thích nghi tốt hơn với điều kiện mơi trường, điều kiện dinh dưỡng, chăm sóc quản lý trong thời gian lưu giữ ni vỗ kéo dài để ghép cặp cho sinh sản nhân tạo. Do đó, các phép lai giữa tơm mẹ N với 4 dòng tơm bố khác nhau đều cho tỷ lệ thả ni thành cơng của các gia đình ở mức cao (tổng cộng là 21 gia đình). Trong khi đó, các phép lai có tơm mẹ nguồn gốc G cho tỷ lệ các gia đình thả ni thành cơng thấp nhất (9 gia đình). Điều này có thể giải thích là do tơm gia hóa các cơ sở sản xuất khác nhau được ni trong điều kiện nhân tạo với các chỉ tiêu nghiêm ngặt về điều kiện sống tại cơ sở sản xuất đó. Do đó dòng tơm này có tính thích nghi hẹp. Khi được ni trong điều kiện mơi trường nhân tạo tại địa điểm khác thì khả năng thích nghi và do đó sức sống của dòng tơm này giảm hẳn, tơm cái gia hóa thành thục sinh dục khơng tốt nên kết quả tất yếu là tỷ lệ thả ni thành cơng của các gia đình có tơm mẹ nguồn gốc gia hóa đạt thấp. Tơm mẹ thuộc hai dòng tơm tự nhiên nhập ngoại T và A cho tỷ lệ gia đình ni thả thành cơng khá cao. Những nhận định này rất có ý nghĩa về mặt thực tiễn chọn giống trong việc lựa chọn các dòng tơm phục vụ cho mục đích ghép phối để sản xuất thành cơng các thế hệ tơm lai. Một kết quả khác bổ trợ cho việc đánh giá các dòng tơm bố mẹ có nguồn gốc khác nhau dùng làm vật liệu ban đầu đó là đánh giá tỷ lệ góp vật liệu di truyền theo dòng ở thế hệ Go. Kết quả khi so sánh chung giữa các dòng tơm về tỷ lệ tơm bố mẹ tham gia tạo vật liệu cho hệ Go cho thấy có sự cân bằng tương đối, nhưng trong đó tỷ lệ đóng góp vật liệu di truyền của nhóm tơm Nội địa vẫn cao nhất và thấp nhất là nhóm Gia hóa. Khi so sánh giữa tơm đực và tơm cái trong cùng một dòng hoặc so sánh cùng một giới tính giữa các dòng khác nhau về tỷ lệ góp vật liệu di truyền tạo thế hệ Go thì có sự chênh lệch, trong đó tơm cái G vẫn chiếm tỷ lệ thấp nhất. Điều này góp phần minh chứng thêm vai trò của yếu tố khả năng thích nghi trong thực tiễn chọn giống. Những nhận định trên đây có ý nghĩa khoa học và thực tiễn vì tơm sú N là tơm tự nhiên của Việt Nam được thu từ các vùng biển Đà Nẵng, Phú n… (vùng biển Nam Trung Bộ). Đây là nguồn tơm có thể cung cấp chủ động trong nước. Kết quả đánh giá đa hình di truyền AFLP đã cho thấy quần đàn tơm sú ở vùng này có sự đa hình di truyền rõ nét. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thảo et al. (2004) với chỉ thị microsatellite cũng khẳng định điều này. Kết quả nghiên cứu này là dẫn liệu quan trọng bước đầu định hướng cho việc lựa chọn dòng tơm bố mẹ từ các quần đàn bản địa có tính đa hình di truyền cao. Đây sẽ là nguồn vật liệu đáng quan tâm trong các chương trình chọn giống tơm sú vì có tiềm năng hội tụ được cả ưu điểm về khả năng thích nghi tốt với điều kiện sống bản địa và tính đa dạng di truyền, cho phép khai thác hiệu quả ưu thế lai. 4.4. Ứng dụng kỹ thuật GBS để sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNP) liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tơm sú 4.4.1. Đánh giá thư viện, giải trình tự, kết nối các đoạn trình tự và thiết lập hệ gen tham chiếu tạm thời Cơng nghệ giải trình tự gen thế hệ mới có thể phân tích được hàng triệu đoạn trình tự (read) với giá thành thấp nhưng hạn chế đi kèm là kích thước các đoạn trình tự thường rất 21 ngắn (DW & Mockler, 2012). Vì vậy, các thuật tốn lắp ráp đối với các lồi khơng có hệ gen tham chiếu đã được phát triển để lắp ráp và phân tích cơ sở dữ liệu được tạo ra từ các thiết bị giải trình tự gen thế hệ mới. Hiện nay chưa có phương pháp chuẩn và phổ biến để đánh giá chất lượng các phần mềm lắp ráp (Nguyễn Giang Thu et al., 2015; Narzisi & Mishra, 2011). Lựa chọn phần mềm kết nối phù hợp cho kết quả kết nối tin cậy là điểm then chốt trong phân tích hệ gen của các lồi chưa có hệ gen tham chiếu. Phần mềm kết nối tối ưu là phần mềm sử dụng gần như hồn tồn các đoạn trình tự để kết nối thành các contig (Zhou et al., 2012; Nguyễn Minh Thành et al., 2015). Trong khi một số phần mềm như CLC Genomic Workbench v.6.0.4 (Nguyễn Minh Thành et al., 2015), Velvet/Oases (Robertson et al., 2010) hay Trinity (Grabherr et al., 2011) phù hợp cho kết nối các đoạn trình tự được giải mã từ thiết bị Ion Torrent thì phần mềm PEAR được sử dụng trong nghiên cứu này đã được đánh giá là cơng cụ mới có khả năng kết nối với độ chính xác cao các dữ liệu được giải trình tự từ thiết bị Illumina (Zhang et al., 2014). Đối với cơng nghệ giải trình tự của Illumina, kích thước các đoạn đọc trình tự phù hợp thường có độ dài 450. Kết quả này được lý giải là do chất lượng giải trình tự của thiết bị Illumina NextSeq500 tạo ra các đoạn đọc (reads) kích thước ngắn (tương ứng với các phân đoạn DNA được cắt ngẫu nhiên thành rất nhiều đoạn nhỏ); chất lượng đọc khơng đồng đều ở tất cả các vị trí gắn DNA trên giếng gắn mẫu (Flow cell). Do đó khi kết nối để tạo contig với độ sâu bao phủ đáp ứng cho kết nối chính xác nhằm hạn chế sai số do lỗi kết nối thì số lượng các contig thu được có kích thước ngắn chiếm tỷ lệ lớn Trong nghiên cứu của Baranski et al. (2014) cũng cho thấy kích thước trung bình của các read trước khi xử lý là 73 bp, sau khi xử lý còn lại 67 b Theo nhận định của Nguyễn Minh Thành et al. (2015), tiêu chí số lượng lớn contig khơng phải là tiêu chí tối ưu để lựa chọn phần mềm kết nối phù hợp. Trong khi đó, tiêu chí chiều dài trung bình của các contig là một trong những tiêu chí chuẩn cho việc đánh giá và lựa chọn phần mềm kết nối (Liu et al., 2013; Nguyễn Minh Thành et al., 2015). Cho đến nay, các nghiên cứu về tơm sú nói chung và genome tơm sú nói riêng trên thế giới phần lớn tập trung vào các lĩnh vực nghiên cứu đa hình di truyền, xây dựng các nhóm gen liên kết, chọn giống, bệnh học tơm, nghiên cứu hệ gen phiên mã ; rất ít các cơng bố về genome và thiết lập hệ gen tôm sú giả định. Một số công bố về gen chủ yếu là nghiên cứu gen chức năng ở tôm sú và các đối tượng tôm khác như: gen CHH ở tôm tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii (Nguyễn Minh Thành et al., 2011), gen kinase 1 Penaeus monodon (Qiu et al., 2018), các gen liên quan đến bệnh tơm Do đó, việc giải trình tự được một phần genome tơm sú và thiết lập được trình tự genome tơm sú giả định trong nghiên cứu này sẽ là cơ sở khoa học hữu ích cho các nghiên cứu tiếp theo. 4.4.2. Sàng lọc SNP và chú giải gen chức năng Tổng số SNP xác định được trong nghiên cứu này nhiều hơn so với một số nghiên cứu của các tác giả khác trên các đối tượng tơm như nghiên cứu của Kumar (2014) trên tơm sú P monodon (422 SNP), nghiên cứu của Du et al. (2010) trên tơm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei (1344 SNP); tuy nhiên ít hơn so với nghiên cứu của Nguyễn Minh Thành et al. (2015) trên đối tượng cá tra (21.302 SNP). Trong nghiên cứu của Baranski et al. (2014) trên tơm sú P. monodon Ấn Độ sử dụng cơng nghệ giải trình tự Illumina RNAseq: 473.620 SNP giả định đã được xác định. Sự khác nhau đáng kể về số lượng SNP sàng lọc được ở các nghiên cứu khác nhau trên các đối tượng tơm khác nhau do nhiều ngun nhân gây nên. Tuy nhiên nếu loại trừ 23 sai số về mặt kỹ thuật thì ngun nhân cơ bản lý giải cho hiện tượng này là do các nghiên cứu khác nhau tiến hành giải trình tự trên những phần khác nhau của hệ gen và thường chỉ bao phủ một tỷ lệ rất nhỏ so với hệ gen hồn chỉnh. Trong nghiên cứu này, vì hệ gen tham chiếu giả định được thiết lập de novo bao phủ khoảng 3,5% hệ gen hồn chỉnh của tơm sú (kích thước khoảng 2.17×109 bp theo You et al., 2010), do đó số lượng SNP sàng lọc được có sự sai khác lớn so với nghiên cứu của các tác giả khác, thậm chí trên cùng đối tượng là tơm sú P. monodon. Kết quả sàng lọc SNP trên genome của cả hai nhóm tơm sú tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm cho thấy số lượng SNP chỉ xuất hiện ở nhóm tơm tăng trưởng nhanh (mà khơng xuất hiện ở nhóm tơm tăng trưởng chậm) là tương đối nhiều (1799 SNP). Điều này mở ra một hướng phân tích và khai thác dữ liệu rất có ý nghĩa thực tiễn, đó là tìm kiếm các chỉ thị SNP có khả năng liên kết với tính trạng tăng trưởng ở tơm sú. Vì hệ gen của đa số lồi thủy sản nói chung và tơm sú nói riêng hiện nay chưa được giải mã hồn tồn nên việc xác định được các SNP liên kết với các gen chức năng sẽ mở ra nhiều tiềm năng ứng dụng đối với ngành ni trồng thủy sản. Theo Salem et al. (2012), SNP giải thích 90% sự khác biệt di truyền giữa các cá thể và q trình trao đổi chéo trong phân bào giảm nhiễm rất hiếm khi tách rời chỉ thị SNP khỏi gen chức năng khi SNP được xác định nằm trên hoặc gần gen chức năng (Nguyễn Minh Thành et al., 2015). Với mục tiêu tìm kiếm chỉ thị SNP liên kết với tính trạng tăng trưởng nên chỉ những đoạn trình tự (contig) chứa SNP được sử dụng làm dữ liệu đầu vào để chú giải gen chức năng. Kết thu được cho thấy chỉ có khoảng 17,67% (tương ứng với số lượng 510) contig cho kết chú giải tương ứng, phần lớn contig (chiếm tỷ lệ 82,33%) khơng cho kết quả chú giải gen chức năng. Ngun nhân có thể do đây là những đoạn trình tự mới so với dữ liệu của nr NCBI và đặc hiệu đối với lồi P. monodon. Ngồi ra còn có thể do một số ngun nhân khác. Kết quả này cũng phù hợp với nhiều nghiên cứu về chú giải gen chức năng sử dụng cơng cụ BlastX trên nrNCBI (Nguyễn Hải Bằng et al., 2017; Nguyễn Minh Thành et al., 2015; Jung et al., 2011). Trong nghiên cứu của Baranski et al. (2014) trên tơm sú P. monodon Ấn Độ, tỷ lệ contig được chú giải thành cơng bằng cơng cụ Blast chỉ chiếm khoảng 16%, tương ứng với số contig được chú giải thành cơng chưa đến 500 contig. Kết quả này phù hợp về tỷ lệ so với kết nghiên cứu của luận án. Kết quả này cũng cho thấy số lượng các chuỗi trình tự của các lồi giáp xác được cơng bố trên Ngân hàng gen là khơng nhiều. Theo số liệu thống kê ngày 01/10/2013, trên GenBank có 39.908 trình tự biểu hiện (EST) có tiềm năng được sử dụng để phát hiện các locus đa hình (chẳng hạn như các SNP đa hình) và có khoảng 600 trình tự microsatellite (Baranski et al., 2014). Theo kết quả chú giải, gen mã hóa protein Myosin Heavy Chain Type a, kí hiệu là MHCa (với geneID là gi|343183153|dbj|BAK61429.1|) xuất hiện lồi tơm Marsupenaeus japonicus gen mã hóa protein Myosin Heavy Chain Type 1, kí hiệu MHC1 (với geneID là gi| 410509306|dbj|BAM65719.1|) xuất hiện ở tơm sú P. monodon. Hai gen này thuộc nhóm gen mã hóa chuỗi nặng của phân tử protein myosin. Myosin là thành phần quan trọng của phức hệ co cơ, nó bao gồm hai chuỗi nặng và bốn chuỗi nhẹ, thuộc về một siêu họ protein lớn. Các protein myosin đều có vùng chức năng chung liên kết với actin tạo tơ cơ dày, thủy phân ATP và tạo lực co cơ. Các dạng đồng phân của myosin biểu hiện ở hầu hết các tế bào nhân thực và 24 được biểu hiện mạnh trong tế bào cơ (Jung et al., 2013). Ở tơm Farfantepenaeus paulensis, sự biểu hiện mạnh hơn của gen mã hóa chuỗi nặng của myosin được quan sát thấy ở nhóm tơm có khối lượng cơ thể lớn hơn. Điều này cho thấy gen MHC là ứng viên quan trọng cho các nghiên cứu về tính trạng tăng trưởng. Ngồi ra đối với sự tích lũy các khối cơ ở giáp xác, mức độ biểu hiện của các gen myosin có thể coi như chỉ thị phân tử cho tiềm năng tăng trưởng của cá thể (Jung et al., 2011; Jung et al., 2013) 4.4.3. Xác định chỉ thị SNP và tương quan về vị trí của chỉ thị SNP so với gen MHC Theo Liu (2007), SNP thường xuất hiện ở đoạn gen khơng mã hóa và chọn lọc tự nhiên nói chung bảo tồn đoạn gen mã hóa vì tính chất quan trọng của gen mã hóa. Tác giả DeSantis & Jerry (2007) cũng cơng bố các marker đa hình xuất hiện ở đoạn gen mã hóa của hormon tăng trưởng ở cá thường rất hiếm so với mức độ phổ biến của marker xuất hiện ở đoạn gen khơng mã hóa (Nguyễn Minh Thành et al., 2011). Nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Minh Thành et al. (2011) về xác định mối tương quan giữa SNP của gen CHH (crustacean hyperglycemic hormone) với tính trạng tăng trưởng tơm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) cũng cho thấy tất cả các SNP sàng lọc được đều xuất hiện ở đoạn gen khơng mã hóa (intron). Như vậy, hai SNP được phát hiện trong nghiên cứu của chúng tơi (thuộc vùng mã hóa exon của gen MHC) có sự khác biệt rõ nét so với nhận định của nhiều tác giả về sự xuất hiện của chỉ thị SNP. Chỉ thị SNP đã được khẳng định là có thể xuất hiện vùng gen mã hố, tác động trực tiếp đến tính trạng quan tâm và rất hiệu quả trong việc xác định mối tương quan giữa SNP với tính trạng (Beuzen et al., 2000, Nguyễn Minh Thành et al., 2011). Hiện nay chỉ có vài cơng bố về mối tương quan có ý nghĩa giữa SNP với các tính trạng có giá trị kinh tế ở đối tượng thủy sản. Đó là SNP xuất hiện ở gen amylase có liên quan đến tốc độ tăng trưởng hàu Crassostrea gigas (Prudence et al., 2006), SNP xuất gen parvalbumin ảnh hưởng đến tăng trưởng của cá chẽm Lates calcarifer (Xu et al., 2006). Nhóm nghiên cứu Zeng et al. (2008) đã cơng bố SNP ở gen Hsp70 có liên quan đến khả năng kháng bệnh của tơm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei. Nghiên cứu của Nguyễn Minh Thành et al. (2011) đã sàng lọc được SNP xuất hiện ở các đoạn khơng mã hóa của gen CHH. Việc ứng dụng SNP trong các chương trình chọn giống còn khá mới mẻ. Đa số các nghiên cứu sàng lọc thị SNP được thực hiện đối với hệ phiên mã (transcriptome) (Nguyễn Minh Thành et al., 2015; Nguyễn Giang Thu et al., 2015; Gao et al., 2012; Jung et al., 2011)… Một số nghiên cứu sử dụng SNP để sàng lọc các gen tiềm năng liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở một số đối tượng thuỷ sản như ở cá hồi Salvelinus alpinus (Tao and Boulding, 2003), tơm thẻ chân trắng Penaeus (Litopenaeus) vannamesi và tơm sú P. monodon (Glenn et al., 2005) 4.4.4. Vùng tương đồng giữa contig chứa SNP so với gen mã hóa protein MHC Kết quả so sánh các chuỗi trình tự tương ứng (nucleotide, amino acid) giữa contig83953 và contig260347 với trình tự của gen MHCa và MHC1 đã cho thấy vị trí của vùng tương đồng nằm phân vùng chức năng LMM trên phân tử protein myosin Kết quả này trùng khớp giữa cặp Contig83953 MHCa và cặp Contig260347 MHC1 cho thấy sự tin cậy của dữ liệu phân tích. Myosin là một hexamer bao gồm các tiểu đơn vị (các chuỗi nặng myosin heavy chain MHC và các chuỗi nhẹ myosin light chain MLC). Các phân vùng chức năng trên phân tử myosin đã được xác định (Koyama et al., 2012), bao gồm: (1) Vùng S1 (subfragment1): có 25 chức năng liên kết ATP và actin. (2) Vùng S2 (subfragment2): hoạt hóa chức năng trượt và điều hòa cơ vân; (3) Vùng LMM: gồm các tiểu đơn vị protein liên kết actin, được hình thành bởi q trình thủy phân trypsin, sau thủy phân hình thành hai loại meromyosin: HMM (heavy meromyosin) và LMM (light meromyosin) Kết quả nghiên cứu của luận án là phát hiện đầu tiên về chỉ thị SNP nằm trong exon của gen MHC ở họ giáp xác. Việc phát hiện được SNP liên kết với gen liên quan đến tính trạng tăng trưởng có ý nghĩa quan trọng và thiết thực đối với nghiên cứu và thực tiễn chọn giống dựa trên chỉ thị phân tử (MAS) nhằm làm tăng hiệu quả chọn giống. 4.5. Sàng lọc chỉ thị SNP G>A ở tơm sú tăng trưởng nhanh bằng phương pháp KASP và tiềm năng ứng dụng trong chọn giống Chỉ thị SNP G>A thuộc gen mã hóa protein MHC1 được sử dụng để kiểm tra trên 40 cá thể tơm sú cái tăng trưởng nhanh thuộc thế hệ G 1 bằng kỹ thuật PCR đặc hiệu allen cạnh tranh (KASP) đã cho thấy một phương pháp rất nhanh chóng và hiệu quả để đánh giá đặc điểm di truyền của giống. Cùng với kết quả phát hiện chỉ thị SNP G 4320A nằm trong vùng exon của gen mã hóa protein MHC1 một loại protein đã được nhiều nghiên cứu chứng minh là có liên quan đến sự tăng trưởng ở cơ thể giáp xác (Kamimura et al., 2008; Jung et al., 2013), kết quả sàng lọc SNP này trên các cá thể tơm sú tăng trưởng nhanh với các mồi đặc hiệu đã bổ sung cho nhau. Đây là cơ sở quan trọng để tiến tới xác định mối tương quan giữa SNP G 4320A với tính trạng tăng trưởng nhanh ở tơm sú trong các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả đánh giá trên 40 mẫu tơm sú bằng phương pháp KASP dựa trên trình tự DNA chứa SNP G4320A với tỷ lệ 95% cá thể tơm sú cái thuộc nhóm tơm tăng trưởng nhanh mang đột biến này, đã cho thấy có sự tương quan về mặt số lượng. Tỷ lệ cá thể tơm sú thuộc nhóm tơm tăng trưởng nhanh khơng mang đột biến G 4320A chiếm 2 trong số 40 cá thể. Nói cách khác, phần lớn cá thể tơm sú tăng trưởng nhanh trong nghiên cứu này có mang đột biến G4320A Như vậy, kết quả nghiên cứu ứng dụng bước đầu đối với SNP G>A thuộc vùng exon của gen mã hóa protein MHC1 bằng phương pháp KASP đã cho thấy tiềm năng ứng dụng của SNP này đối với việc đánh giá nhanh chóng và chính xác các cá thể tơm nhằm hỗ trợ trong cơng tác chọn giống tơm sú, đặc biệt là việc sàng lọc và tiến hành các đánh giá di truyền trên quy mơ lớn. Mơ hình nghiên cứu và ứng dụng này tuy còn mới mẻ ở Việt Nam nhưng đã được các nhà nghiên cứu trên thế giới sử dụng rất hiệu quả. Phương pháp này đã được ứng dụng trong việc khảo sát sự đa hình SNP của các vùng exon 2 6 thuộc gen mã hóa protein vỏ trứng ovocalyxin32 (OCX32) ở gà, liên quan đến đặc tính độ cứng và độ dày của vỏ trứng ( Majeed et al., 2019). Nghiên cứu của Ryu et al. (2018) trên cây mâm xơi (Rubus) với 25 SNP được sử dụng cho kỹ thuật KASP cũng đã kết luận việc phát triển các chỉ thị SNP đặc hiệu cho ứng dụng KASP có thể phát hiện được các kiểu gen ưu tú từ các dòng mang đột biến. Các ứng dụng tương tự cũng đã được tiến hành đối với các loại cây trồng như lúa ( Steele et al., 2018), cà chua (Devran et al., 2016), đậu (Zhao et al., 2017), bơng (Islam et al., 2015) v.v… Kết quả nghiên cứu của luận án cũng mở ra một định hướng ứng dụng hiệu quả và dễ dàng thực hiện, đó là sử dụng phương pháp KASP dựa trên chỉ thị SNP đã biết có liên quan tới gen MHC1 để đánh giá nhanh chóng và chính xác các cá thể tơm sú mang đột biến. Phương pháp này có thể thay thế cho các phương pháp truyền thống phải sử dụng các thiết bị giải 26 trình tự, PCR và điện di trên gel đối với từng mẫu để xác định đột biến, từ đó giúp cho q trình chọn lọc trở nên nhanh chóng và hiệu quả KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận (1) Kỹ thuật AFLP sử dụng cặp enzyme EcoRI MseI cặp mồi chọn lọc MseI CTT/EcoRIACC JOE đã phát hiện được 309 alen từ 60 mẫu tôm sú thuộc 3 quần đàn vùng biển Bắc Trung Bộ, Nam Trung Bộ và Nam Bộ của Việt Nam; số alen trùng nhau giữa các mẫu trong mỗi quần đàn lần lượt là 0, 4, 8 cho thấy đa hình di truyền thể hiện rõ nhất ở quần đàn Bắc Trung Bộ. (2) Kỹ thuật GBS sử dụng thiết bị Illumina NextSeq500 và enzyme ApeKI đã sàng lọc được 1799 SNP xuất tôm sú lớn nhanh Hai SNP nằm vùng exon (vùng light meromyosin) của gen MHC ở họ giáp xác lần đầu tiên được xác định: SNP A4486G trên MHCa làm biến đổi codon AAA thành AAG nhưng không làm thay đổi acid amin Lysine; SNP G4320A trên MHC1 làm biến đổi codon GGA (mã hóa acid amin Glycine) thành GAA (mã hóa acid amin Glutamic). (3) SNP G4320A trên gen MHC1 được sử dụng để thiết kế mồi đặc hiệu trong kỹ thuật KASP ứng dụng trong việc sàng lọc chỉ thị SNP có tiềm năng liên kết với tính trạng tăng trưởng nhanh nhằm hỗ trợ trong cơng tác chọn giống tơm sú Kiến nghị (1) Từ những đánh giá bước đầu về đa dạng di truyền các quần đàn tơm sú tự nhiên bằng kỹ thuật AFLP, các nghiên cứu tiếp theo cần thực hiện trên các quần đàn với cỡ mẫu lớn hơn, đặc biệt cần có các số liệu nghiên cứu về các chỉ số đa dạng di truyền của các quần đàn đó (2) Hai chỉ thị SNP nằm trong vùng exon của gen MHC cần được nghiên cứu thêm về di truyền quần thể để kiểm tra sự di truyền của các SNP này, đặc biệt là việc khẳng định sự chính xác của các SNP này khi có hệ gen tham chiếu đã được giải mã của tơm sú P. monodon trên GenBank thay cho hệ gen tham chiếu giả định. (3) Theo hướng ứng dụng các kết quả nghiên cứu của luận án: (1) Có thể khai thác nguồn tơm bố mẹ từ các quần đàn có tính đa hình di truyền cao để ghép cặp trong lai tạo nhằm tạo vật liệu phong phú cho chọn lọc, từ đó khai thác ưu thế lai, đặc biệt là xu hướng kết hợp tơm bản địa với tơm chọn giống nhập ngoại để kết hợp các đặc tính tăng trưởng nhanh với khả năng thích nghi tốt điều kiện ni trong nước; (2) Chỉ thị SNP G4320A liên quan tới gen MHC có thể được ứng dụng trong kỹ thuật KASP để sàng lọc nhanh chóng tơm sú mang đột biến nhằm hỗ trợ cơng tác chọn giống tơm. TĨM TẮT SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Đánh giá đa hình hệ gen quần đàn tôm sú kỹ thuật AFLP Tạo vật liệu nghiên cứu: tôm sú hệ Go G1 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM Thu mẫu tơm sú từ quần đàn BTB, NTB, NB DNA tổng số từ mẫu tôm sú Kỹ thuật AFLP đánh giá đa hình hệ gen Đa hình AFLP quần đàn quần đàn tôm sú Thu mẫu dòng tơm sú: A, T, G, N Thiết lập gia đình tạo hệ Go, G1 Tách chiết DNA tôm sú Go, G1 Giải trình tự GBS Sàng lọc SNPs Sàng lọc SNPs liên quan đến tính trạng tăng trưởng tôm sú kỹ thuật GBS Kỹ thuật dựa SNP kiểm G1 tăng nhanh KASP thị tra tôm trưởng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Chú giải gen chức Xác định tương quan contig chứa SNP so với gen MHC Xác định: vùng tương đồng contig chứa SNP so với gen mã hóa protein MHC, codon chứa SNP, vị trí tương ứng thị SNP gen MHC Thiết kế mồi đặc hiệu dựa trình tự chứa SNP gen MHC Kiểm tra 40 cá thể tôm sú tăng trưởng nhanh thuộc hệ G1 Cây phát sinh chủng loại Tôm sú bố mẹ bệnh Tôm sú hệ Go, G1 Bộ liệu SNP nhóm tơm sú tăng trưởng nhanh tăng trưởng chậm Hai thị SNP nằm vùng exon gen MHC: SNP Contig83953:g.20T>C gen MHCa biến đổi codon AAAAAG, không làm thay đổi acid amin Lysine; SNP Contig260347:g.19G>A gen MHC1 biến đổi codon GGA (mã hóa acid amin Glycine) GAA (mã hóa acid amin Glutamic) 28 mẫu đồng hợp tử A:A; mẫu đồng hợp tử G:G; 10 mẫu dị hợp tử G:A CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN Nguyễn Thị Minh Thanh, Nguyễn Quyết Tâm, Nguyễn Văn Hảo, Nguyễn Văn Sáng, Nguyễn Đăng Tôn, Ma Thị Huyền Thương, Kim Thị Phương Oanh, Nơng Văn Hải, Nguyễn Thị Hoa, Hà Thị Thu, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Đình Duy, Trần Xn Thạch, Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Hữu Ninh, Đồng Văn Quyền, Đinh Duy Kháng (2018) Ứng dụng kỹ thuật xác định kiểu gen giải trình tự (GBS) để sàng lọc đa hình nucleotide đơn (SNPs) liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tơm sú (Penaeus monodon). Tạp chí Cơng nghệ sinh học 16(1): 7585. Nguyễn Hải Bằng, Phạm Quang Huy, Trần Xn Thạch, Nguyễn Giang Thu, Nguyễn Thị Minh Thanh, Nguyễn Thị Hoa, Hà Thị Thu, Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Cường, Nguyễn Hữu Ninh, Đồng Văn Quyền, Chu Hồng Hà, Đinh Duy Kháng (2017) Phân tích hệ phiên mã và sàng lọc một số gen giả định liên quan tới tính trạng tăng trưởng ở tơm sú (penaeus monodon). Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 15(2):110 Nguyễn Thị Minh Thanh, Nguyễn Hải Triều, Phạm Thị Hoa, Nguyễn Thị Hoa, Hà Thị Thu, Đậu Huy Tùng, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Hữu Ninh, Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Đồng Văn Quyền, Đinh Duy Kháng (2015) Đánh giá tính đa hình AFLP của các quần đàn tơm sú (Penaeus monodon) thu nhận từ các vùng biển của Việt Nam. Tạp chí Cơng nghệ sinh học 13(1): 3138. Đinh Duy Kháng, Chu Hoàng Hà, Đồng Văn Quyền, Nguyễn Thị Hoa, Hà Thị Thu, Nguyễn Đình Duy, Nguyễn Cường, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Thị Minh Thanh, Trần Xn Thạch, Nguyễn Đăng Tơn (2018) Chỉ thị phân tử SNPs liên quan tới tính trạng tăng trưởng nhanh tơm sú (Penaeus monodon) ni Việt Nam. Giải pháp hữu ích số đơn 22017 00330. QĐ của Cục Sở hữu trí tuệ số 4346QĐSHTT, ngày 13 tháng 01 năm 2018. ABSTRACT THAM DỰ HỘI NGHỊ QUỐC TẾ: Nguyen Thi Minh Thanh, Dong Van Quyen, Nguyen Hai Trieu, Pham Thi Hoa, Nguyen Thị Hoa, Ha Thi Thu, Dau Huy Tung, Vu Thi Hien, Nguyen Huu Ninh, Nguyen Thi Tuyet Nhung, Dinh Duy Khang (2016) AFLP analysis of genetic diversity among populations of black tiger shrimp (Penaeus monodon) collected from coastal regions of Viet Nam Abstract for The 7th AFOB Regional Symposium Asian Biotechnology: Research and Application (ARS 2016), January 2830, 2016, Hue, Vietnam. ... thuộc Nhiệm vụ đánh giá di truyền nguồn gen cấp Nhà nước, chúng tơi đã thực hiện đề tài Nghiên cứu đa hình hệ gen các dòng tơm sú (Penaeus monodon) Việt Nam nhằm phục vụ cơng tác chọn giống tơm”. ... ; rất ít các cơng bố về genome và thiết lập hệ gen tôm sú giả định. Một số công bố về gen chủ yếu là nghiên cứu gen chức năng ở tôm sú và các đối tượng tôm khác như: gen CHH ở tôm tôm càng xanh Macrobrachium ... 2. Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá đa hình hệ gen các quần đàn tơm sú thu từ các vùng biển Việt Nam; Sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNPs) có tiềm năng liên kết với tính trạng tăng trưởng bằng cách áp