Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm đánh giá đa hình hệ gen các quần đàn tôm sú thu từ các vùng biển Việt Nam; Sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNP) có tiềm năng liên kết với tính trạng tăng trưởng bằng cách áp dụng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (phương pháp GBS) trên hai nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm.
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MINH THANH (Cambria, 14, Bold, giữa, chữ In hoa) NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH HỆ GEN CÁC DỊNG TƠM SÚ (Penaeus monodon) VIỆT NAM NHẰM PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG TÔM (Verdana, 18, Bold, giữa, chữ In hoa, giãn dòng Multiple 1.3) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC (Cambria, 14, Bold, giữa, chữ In hoa) HÀ NỘI, 2019 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nguyễn Thị Minh Thanh (Times New Roman, 15, Bold, Viết chữ thường) NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH HỆ GEN CÁC DỊNG TƠM SÚ (Penaeus monodon) VIỆT NAM NHẰM PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG TÔM (Times N ew Roma, Bold, Viết chữ in) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Đinh Duy Kháng Viện Công nghệ sinh học PGS.TS Nguyễn Hữu Ninh Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản III Hà Nội, 2019 LỜI CẢM ƠN Với tất lòng, tơi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Đinh Duy Kháng - Phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Cơng nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam PGS.TS Nguyễn Hữu Ninh - Viện trưởng Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III người Thầy tận tình hướng dẫn, động viên hết lòng giúp đỡ tơi từ ngày đầu thực luận án lúc hoàn thành Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Đồng Văn Quyền - Phó Viện trưởng, Trưởng Phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ thực nghiên cứu Phòng vi sinh vật học phân tử Phòng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ gen Tơi xin chân thành cảm ơn Tập thể cán nghiên cứu Phòng Vi sinh vật học phân tử giúp học hỏi thêm kiến thức kỹ thuật sinh học phân tử tin sinh học q trình thực luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Văn Hảo tập thể nghiên cứu Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II giúp đỡ tơi nhóm thực đề tài việc thu mẫu thực phần nội dung nghiên cứu quan trọng luận án di truyền số lượng Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Đăng Tôn tập thể nghiên cứu Viện nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tơi q trình thực kỹ thuật GBS Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Viện suốt năm qua Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Bùi Thị Hải Hà giúp đỡ hoàn thành thủ tục cần thiết thời gian học tập bảo vệ luận án Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Biên tập Tạp chí Cơng nghệ sinh học hỗ trợ tơi nhóm nghiên cứu đăng tải công bố liên quan đến luận án i Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Công nghệ Đông Á nơi công tác tạo điều kiện thuận lợi thời gian tơi làm nghiên cứu sinh để tơi vừa cơng tác vừa học tập hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn mong muốn nhận ý kiến đóng góp quý báu đến từ chuyên gia, nhà nghiên cứu đồng nghiệp để giúp chỉnh sửa hồn thiện nội dung luận án Cuối cùng, tơi xin nói lời biết ơn sâu sắc đến người thân gia đình người bạn, đồng nghiệp thân thiết bên cạnh, giúp đỡ, động viên, hỗ trợ mặt khích lệ để tơi vượt qua khó khăn thời gian dài học tập nghiên cứu để hoàn thành luận án Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Minh Thanh ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu kết trình bày Luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chun ngành với đồng ý đồng tác giả, phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả Nguyễn Thị Minh Thanh iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .i LỜI CAM ĐOAN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG ix DANH MỤC CÁC HÌNH xi MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tôm sú Penaeus monodon 1.1.1 Đặc điểm sinh học, phân loại phân bố địa lý 1.1.2 Khái qt tình hình ni tơm sú giới Việt Nam 1.2 Các kỹ thuật phân tích thị phân tử thơng dụng 14 1.3 Ứng dụng kỹ thuật phân tích thị phân tử nghiên cứu đa hình hệ gen tơm sú 23 1.4 Phương pháp GBS ứng dụng chọn giống 30 1.5 Phương pháp PCR đặc hiệu alen cạnh tranh (KASP) ứng dụng 37 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 Vật liệu nghiên cứu 39 2.1.1 Mẫu tôm sú 39 2.1.2 Hóa chất 40 2.1.3 Thiết bị 43 2.2 Phương pháp nghiên cứu 44 2.2.1 Thu mẫu tôm sú tự nhiên phục vụ nghiên cứu đa hình hệ gen 44 2.2.2 Thu mẫu tôm sú tự nhiên làm tôm giống bố mẹ, sàng lọc mầm bệnh chăm sóc tơm bố mẹ 45 2.2.3 Thiết lập gia đình tơm sú tạo hệ Go G1 46 2.2.4 Tách chiết, tinh xác định nồng độ DNA tổng số từ mô tôm sú 48 iv 2.2.5 Điện di kiểm tra DNA gel agarose 49 2.2.6 Kỹ thuật AFLP đánh giá đa hình hệ gen 50 2.2.7 Phân tích kết AFLP máy xác định trình tự tự động sử dụng điện di mao quản phần mềm phân tích đoạn 54 2.2.8 Kỹ thuật GBS phân tích hệ gen tơm sú 55 2.2.9 Chú giải đoạn trình tự xác định gen liên quan 58 2.2.10 Xác định trình tự amino acid contig đánh giá mức độ tương đồng với gen mã hóa protein quan tâm 59 2.2.11 Phương pháp KASP 60 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 61 3.1 Đa hình AFLP quần đàn tơm sú Việt Nam 61 3.1.1 Kiểm tra hoạt tính cắt DNA cặp enzyme EcoRI MseI 61 3.1.2 Tách DNA tổng số từ tôm sú để thực kỹ thuật AFLP 62 3.1.3 Kết thực phản ứng tiền chọn lọc 62 3.1.4 Đa hình AFLP quần đàn quần đàn tôm sú 64 3.1.5 Cây phát sinh chủng loại quần đàn tôm sú Việt Nam 78 3.2 Sản xuất tôm sú hệ Go, G1 79 3.2.1 Sàng lọc nguồn tôm bố mẹ đầu vào 79 3.2.2 Thiết lập gia đình tơm sú hệ Go, G1 81 3.3 Sàng lọc đa hình nucleotide đơn (SNP) liên quan đến tính trạng tăng trưởng tôm sú 85 3.3.1 Giải trình tự, kết nối đoạn trình tự thiết lập hệ gen tham chiếu tạm thời 85 3.3.2 Sàng lọc SNP 88 3.3.3 Chú giải gen chức từ liệu giải trình tự tơm sú 88 3.3.4 Xác định thị SNP tương quan contig chứa SNP với gen MHC 91 3.3.5 Xác định vùng tương đồng contig chứa SNP so với gen mã hóa protein MHC, xác định codon chứa SNP vị trí tương ứng thị v SNP gen MHC 94 3.4 Sàng lọc thị SNP G>A tôm sú tăng trưởng nhanh phương pháp KASP 97 Chương BÀN LUẬN KẾT QUẢ 99 4.1 Chọn địa điểm thu mẫu để nghiên cứu đa hình di truyền 99 4.2 Tách DNA tổng số từ tôm sú tạo vật liệu nghiên cứu 100 4.3 Kết phản ứng tiền chọn lọc AFLP 102 4.4 Đa hình AFLP quần đàn tơm sú 104 4.5 Lựa chọn kỹ thuật thị AFLP để đánh giá đa hình hệ gen tơm sú 107 4.6 Quan hệ phát sinh chủng loại quần đàn tôm sú 108 4.7 Tạo vật liệu tôm sú hệ Go, G1 110 4.8 Ứng dụng kỹ thuật GBS để sàng lọc đa hình nucleotide đơn (SNP) liên quan đến tính trạng tăng trưởng tơm sú 112 4.9 Sàng lọc thị SNP G>A tôm sú tăng trưởng nhanh phương pháp KASP tiềm ứng dụng chọn giống 121 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 125 CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 126 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 127 TÀI LIỆU THAM KHẢO 134 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt AFLP bp Tiếng Anh Amplified Fragment Length Đa hình độ dài đoạn Polymorphism khuếch đại Base pair Cặp base Chỉ thị phân tử CTPT DNA Deoxyribonucleic Acid EDTA Ethylene-Diamine-TetraAcetic Acid Đồng tác giả et al GBS Gb Tiếng Việt Genotyping By Sequencing Xác định kiểu gen phương pháp giải trình tự GigaByte Phản ứng chuỗi trùng hợp KASP Kompetitive Allele Specific PCR LMM Light meromyosin MAS Marker-assisted selection MHC Myosin Heavy Chain Myosin chuỗi nặng mtDNA Mitochondrial DNA DNA ty thể NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự hệ thứ PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp PCI Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol CI Chloroform : Isoamyl alcohol đặc hiệu alen cạnh tranh Meromyosin chuỗi nhẹ Chọn giống dựa thị phân tử QTL Quantitative Trait Loci Locus tính trạng định lượng QC Quality control Kiểm sốt chất lượng Restriction Fragment Length Đa hình độ dài đoạn cắt hạn Polymorphism chế RFLP RAPD Random Amplify Polymorphism DNA DNA đa hình nhân ngẫu nhiên vii RNase Ribonuclease SNP Single Nucleotide Polymorphism TE Tris-EDTA IHHNV Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus Đa hình nucleotide đơn Virus gây bệnh hoại tử quan tạo máu quan tạo biểu mô Virus gây Hội chứng LSNV Laem Singh Virus YHV Yellow Head Virus Virus gây bệnh đầu vàng White Spot Syndrome Virus Virus gây bệnh đốm trắng WSSV VIE Visible Implant Elastomer ĐBSCL chậm lớn Chất màu phát xạ huỳnh quang Đồng sông Cửu Long BTB Bắc Trung Bộ NTB Nam Trung Bộ Nam Bộ NB Ni trồng thủy sản NTTS Dòng tơm sú Ấn Độ Dương Dòng A Dòng tơm sú Dòng T Thái Bình Dương Dòng N Dòng tơm sú Nội địa Dòng G Dòng tơm sú Gia hóa Go Tơm sú hệ Go G1 Tôm sú hệ G1 F Fast Tôm sú lớn nhanh L Low Tôm sú lớn chậm NCBI National Center for Biotechnology Information Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (Hoa Kỳ) viii PHỤ LỤC Nguyên lý điện di mao quản Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis - CE) phương pháp phân tách chất dựa vào khác tốc độ chuyển động chúng tác dụng lực điện trường mao quản hẹp Kỹ thuật điện di mao quản dựa sở tính chất điện di phần tử chất phân tích mao quản (ɸ: 25-100m) dung dịch chất điện giải có chất đệm pH thích hợp, tác dụng từ trường điện E định cung cấp nguồn cao chiều (V: 10-30kV) đặt vào hai đầu mao quản Nói cách khác, CE kỹ thuật phân tách thực mao quản nhờ lực từ trường điện E điều khiển tách chất Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt tốn mẫu hố chất, số đĩa hiệu dụng Nef lớn tách chất xẩy nhanh với hiệu cao (http://www.impe-qn.org.vn/) Sơ đồ nguyên lý cấu tạo hệ điện di mao quản (Nguồn: http://www.impe-qn.org.vn/) PHỤ LỤC Minh họa kết phân tích liệu AFLP phần mềm GeneMapper® Software Version 4.1 PHỤ LỤC Cơ sở lý thuyết phương pháp xác định nồng độ độ DNA thông qua đo mật độ quang học (Optical Density - OD) (Nguồn: Desjardins and Conklin, 2010) Dựa vào tính chất hấp thụ ánh sáng tử ngoại bước sóng 260 nm base purine pyrimidine để định lượng DNA dung dịch Giá trị mật độ quang học bước sóng 260 nm (OD260) mẫu đo tỷ lệ thuận với hàm lượng DNA có dung dịch, từ cho phép xác định nồng độ DNA mẫu Để kiểm tra độ tinh DNA dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD 280 nm (OD 280) 280 nm bước sóng protein có mức hấp thụ cao nhất, số protein hấp thụ ánh sáng bước sóng 260 nm acid nucleic làm sai lệch giá trị nồng độ thật acid nucleic Nồng độ độ DNA dung dịch tách chiết tính theo cơng thức: Nồng độ DNA (ng/µL) = OD260 x 50 x hệ số pha loãng Độ DNA = OD260/OD280 Trong đó: OD260: giá trị đo bước sóng 260 nm OD280: giá trị đo bước sóng 280 nm Nếu độ DNA nằm khoảng 1,8 - 2,0 mẫu coi PHỤ LỤC Phương pháp sàng lọc bệnh tôm bố mẹ đầu vào Thu bảo quản mẫu Thực thu mẫu cá thể tôm để kiểm tra mầm bệnh Một phần chân bơi số cá thể tôm cắt vô trùng vfa cho vào Eppendorf mã hóa chứa cồn Mẫu chân bơi sau bảo quản lạnh phân tích Ly trích DNA/RNA virus từ tơm * Chuẩn bị mẫu: Mẫu chân bơi cắt thành mảnh nhỏ để dễ dàng ly trích DNA RNA Trọng lượng mẫu phân tích khơng q 500 µg * Ly trích tinh DNA tổng số: Ly trích DNA virus theo quy trình Gudkovs (2008) có điều chỉnh: sử dụng 200 - 500 µg mơ tơm nghiền 500 µL dịch đệm ly trích DNA, ủ bồn nước đá phút, sau đun 100oC 10 phút, lấy mẫu cho vào nước đá phút, ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút Hút dịch bên chứa DNA cho vào Eppendorf 1,5 mL mới, sau tủa dịch thể tích cồn tuyệt đối, ly tâm 13.000 vòng/phút phút thu tủa DNA Loại bỏ dịch nổi, tủa DNA làm khô 58oC 10 phút, hòa tan cặn tủa DNA 200 µL nước khử ion giữ -20oC * Ly trích tinh RNA tổng số: Ly trích RNA tổng số dung dịch Trizol (Invitrogen) Dùng panh kéo để lấy khoảng 100 mg mô tôm, loại bỏ cồn giấy thấm nghiền mL Trizol, sau ủ dịch nghiền nhiệt độ phòng phút; Thêm 200 µL Chloroform vào dịch nghiền; Vortex 20 giây, sau ủ nhiệt độ phòng phút Mẫu sau ủ ly tâm lạnh 12.000 vòng/phút 10 phút Hút 300 µL dịch có chứa RNA vào ống eppendorf 1,5 mL mới; Thêm vào 300µL Isopropanol lạnh đảo nhẹ 3-4 lần Mẫu sau tủa RNA ủ nhiệt độphòng (25oC - 28oC) 15 phút Sau ủ, tủa RNA ly tâm 12.000 vòng/phút 10 phút, loại bỏ dịch Cặn RNA rửa lại mL Ethanol 70%, sau ly tâm lạnh 7500 vòng/phút phút, loại bỏ dịch nổi, làm khô cặn RNA 55oC, hòa cặn RNA 100µL H2O-DEPC, sau bảo quản -20oC đến phân tích Phân tích diện virus Quy trình PCR RT-PCR để phát virus gây bệnh tôm (WSSV, IHHNV, YHV/GAV LSNV) dựa quy trình cơng bố Kiatpathomchai et al (2001), Cao Thành Trung et al (2013), OIE (2009) Sritunyalucksana et al (2006) Quy trình phát Semi-nest PCR WSSV Quy trình sử dụng mồi xi F1 1µL ba mồi ngược R1 0.2 µL, R2 0.3 µL, R3 0.5 µL; Thể tích phản ứng 50µL; Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm: Buffer Flexi 1X, MgCl2 3mM, dNTP 0.2 mM, Go Tag Flexi Polymerase 1.5U; Thực quy trình lần phản ứng: Quy trình với chu kỳ (gồm biến tính 93oC giây, bắt cặp mồi 70oC 20 giây kéo dài mạch 72oC 20 giây); Sau Quy trình thực 20 chu kỳ (gồm 93oC 20 giây, 55oC 20 giây 72oC 20 giây); Quy trình thực 25 chu kỳ (gồm 93oC 20 giây, 50oC 20 giấy 72oC 20 giấy) Sản phẩm sau khuếch đại bao gồm loại sản phẩm có kích thước 1100 bp, 526 bp 250 bp Quy trình Multiplex PCR phát IHHNV Hỗn hợp phản ứng PCR sau: Hút 0,5 µM mồi vnIHF vnIHR, 0,2 µM mồi 309F 309R; Thêm Colorless GoTag® Flexi Buffer 1X, mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 1,5U GoTag® Hot Start Polymerase (Promega) Quy trình thực 35 chu kỳ (biến tính nhiệt độ 95oC 45 giây, bắt cặp mồi 58oC 45 giây, kéo dài mạch 72oC 60 giây) Giai đoạn kết thúc phản ứng gồm chu kỳ 72oC phút, 4oC sử dụng Sản phẩm khuếch đại cho loại sản phẩm có kích thước 997 bp 309 bp Quy trình RT-nested PCR phát YHV/GAV Quy trình sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu nhận diện khuếch đại trình tự vật liệu di truyền YHV/GAV hai phản ứng bước bước hai Cặp mồi GY1, GY4 GY5 thiết kế cho phản ứng RT-PCR bước để khuếch đại đoạn gen chung vả virus GAV YHV Sản phẩm khuếch đại có kích thước 794 bp Phản ứng PCR bước hai thực với cặp mồi GY2, Y3 G6 đặc hiệu riêng biệt cho GAV YHV Sản phẩm khuếch đại virus GAV có kích thước 406 bp virus YHV 277 bp Thành phần hỗn hợp phản ứng gồm: 35 pmol mồi GY1, GY4 GY5, Colorless GoTag® Flexi Buffer 1X, 3mM mgCl2 (Promega), 0,2Mm dNTPs (Promega), 5U AMV reverse transcriptase (Promega) 1,25U GoTaq® Hot Start Polymerase Phản ứng thực gồm: tổng hợp cDNA chu kỳ 42oC 45 phút, sau phản ứng PCR gồm chu kỳ 95oC phút, 35 chu kỳ, giai đoạn biến tính nhiệt độ 95oC 45 giây, giai đoạn bắt cặp mồi58oC 60 giây, giai đoạn kéo dài mạch 72oC 45 giây; giai đoạn kết thúc phản ứng gồm chu kỳ 72oC phút Hút 2µL sản phẩm bước chuyển qua phản ứng bước gồm 35 pmol mồi GY2, Y3 G6, Colorless GoTag® Flexi Buffer 1X, 3mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs 1,25U GoTaq® Hot Start Polymerase (Promega) Phản ứng thực 20 chu kỳ gồm 95oC 45 giây, giai đoạn bắt cặp mồi 58oC 60 giây, giai đoạn kéo dài mạch 72oC 30 giây; giai đoạn kết thúc phản ứng gồm chu kỳ 72oC phút Sản phẩm bảo quản 4oC để phân tích Quy trình RT-PCR phát LSNV Thành phần hỗn hợp phản ứng bao gồm 0,7 µM mồi 20AF 20AR, Colorless GoTag® Flexi Buffer 1X, mM MgCl2 (Promega), 0,2 mM dNTPs (Promega), 5U AMV reverse transcriptase (Promega) 1,25U GoTaq® Hot Start Polymerase (Promega) Sản phẩm sau khuếch đại có kích thước 197 bp Phản ứng thực gồm: tổng hợp cDNA chu kỳ 42oC 30 phút, sau phản ứng PCR gồm chu kỳ 95oC phút, 35 chu kỳ, giai đoạn biến tính nhiệt độ 95oC 30 giây, giai đoạn bắt cặp mồi 55oC 30 giây, giai đoạn kéo dài mạch 72oC 30 giây; giai đoạn kết thúc phản ứng gồm chu kỳ 72oC phút PHỤ LỤC Nguyên tắc ghép phối tôm bố mẹ Go để tạo hệ G1 Các phép lai thực theo sơ đồ lai thiết kế sẵn (sơ đồ lai lý thuyết) Nguyên tắc sơ đồ lai theo lý thuyết đảm bảo tránh cận huyết theo Index * Tránh cận huyết: Để tránh cận huyết, việc ghép tinh tôm bố mẹ Go tạo hệ G1 thực theo sơ đồ lai lý thuyết thiết kế sẵn phần mềm Excel Khi nhập thông tin tôm tôm đực vào, phần mềm thiết kế cho kết phả hệ (cụ thể hệ ơng bà) 0, 1, (Bảng PL7) Trường hợp kết có nghĩa phả hệ khơng trùng nhau, việc ghép tinh tơm đực tơm đảm bảo tránh cận huyết hoàn toàn Trường hợp kết có nghĩa dòng hệ ông bà (bà ngoại, ông ngoại, bà nội, ông nội) có trùng dòng (ví dụ tơm AN ghép với tôm đực AG) Trường hợp chấp nhận ghép Với kết tra cứu phả hệ 2, có nghĩa trùng dòng hệ ơng bà (Lai chéo trùng Nội dòng hay Lai chéo trùng Lai chéo) (ví dụ: AN ghép với đực AA; NN; AN; NA), trường hợp cần phải cẩn thận Tốt không nên ghép kết tra cứu phả hệ Tuy nhiên, trường hợp phát triển túi tinh buồng trứng không mong muốn chấp nhận kết với Lai chéo trùng Nội dòng (AN ghép với AA hay NN); với Lai chéo trùng Lai chéo tuyệt đối khơng thực Trường hợp cuối cùng, kết tra cứu phả hệ 4, Nội dòng trùng với Nội dòng (chỉ có khả xảy ra: AA x AA; GG x GG; NN x NN; TT x TT) tuyệt đối khơng thực ghép tinh tơm tơm đực Bảng PL7 Sơ đồ lai theo lý thuyết để kiểm tra phả hệ 16 tổ hợp Go tạo hệ G1 CON CÁI CON ĐỰC AA AG AN AT GA GG GN GT NA NG NN NT TA TG TN TT AA 2 2 0 0 0 AG AN AT GA GG GN GT NA NG NN NT TA TG TN TT 2 2 0 0 0 1 2 1 1 0 1 0 1 2 1 1 0 1 0 1 2 1 2 1 1 0 1 0 0 2 0 0 1 2 1 2 1 1 1 2 1 2 1 2 1 1 1 2 1 2 1 0 0 2 0 0 1 0 1 1 2 1 2 1 0 1 0 1 1 2 1 2 1 0 1 1 2 1 2 0 0 0 2 2 * Theo Index: Việc ghép tôm đực tôm Go với cần vào giá trị Index chúng Nhằm đảm bảo tính đa dạng di truyền, đồng thời tích lũy giá trị chọn lọc trước hết tất gia đình Go nên trì dòng máu hệ (G1), nhiên tỷ trọng góp “máu“ chúng có khác tùy thuộc vào giá trị Index chúng Index (I) gia đình i Ii = (xi x LSM khối lượng gia đình i) + (yi x tỷ lệ sống gia đình i); đó: xi hệ số cho tính trạng khối lượng, yi hệ số cho tính trạng tỷ lệ sống, LSM trung bình bình phương tối thiểu (Least Square Medium) Các gia đình xếp theo giá trị I, chia làm nhóm: Nhóm tơm có giá trị Index cao (Ii > 110), Nhóm tơm có giá trị Index trung bình (90≤ Ii ≥ 110) Nhóm tơm có giá trị Index thấp (Ii < 90) Nhằm đảm bảo ưu lai tính trạng tăng trưởng đồng thời đảm bảo độ đa dạng di truyền hệ Go, quần thể Go hình thành với việc chọn đại diện nhóm với tỷ lệ khác Cụ thể tỷ lệ nhóm tơm G o mong muốn giữ lại là: Nhóm cao 65-75%, Nhóm trung bình 20-30%, Nhóm thấp 5% 10 PHỤ LỤC Phương pháp đánh dấu huỳnh quang cá thể tơm sú Quy trình đánh dấu sử dụng phẩm màu huỳnh quang sau: - Chuẩn bị phẩm màu: Phẩm màu huỳnh quang (VIE) chuẩn bị theo hướng dẫn nhà sản xuất (Công ty Northwest Marine Technology) Pha dung dịch màu (VIE) với chất xúc tác theo tỷ lệ 10:1 trộn đều, liên tục vòng phút Dung dịch sau trộn chuyển vào xi-lanh 0,3 ml gắn với dụng cụ đánh dấu cầm tay Màu sau pha tốt bảo quản điều kiện lạnh ( ≈ 4oC) Phẩm màu bảo quản tốt sử dụng vòng 12 nữa, khơng nên sử dụng lại VIE bảo quản qua đêm - Thao tác đánh dấu: Phẩm màu tiêm vào lớp mặt bụng tôm giống, song song với lớp vỏ kitin Phẩm màu tiêm nhẹ nhàng tránh làm tổn thương lớp thịt tôm kết thúc trước kim tiêm rút khỏi thể tơm Trong q trình đánh dấu khơng cần phải gây mê tôm VIE Dấu VIE tôm sú (thu hoạch sau ba tháng ni) Các vị trí đánh dấu tơm sú (vị trí đánh dấu bên trái từ đến tương tự bên phải) 11 PHỤ LỤC Cơ chế hóa học phương pháp KASP (Nguồn: https://www.lgcgroup.com/kasp/?#.WxjWlUiFPIU) 1) Các thành phần phản ứng: - Mẫu DNA chứa SNP quan tâm (DNA template); - KASP Assay mix chứa hai mồi xuôi đặc hiệu alen cạnh tranh khác với trình tự đặc trưng mồi ngược; - KASP Master mix chứa băng FRET, Taq polymerase dung dịch đệm tối ưu 2) PCR vòng 1: Chú giải Trình tự oligo gắn FAM đuôi Alen-1 (Alen-2 primer không kéo dài) (Alen-1 primer gắn vào kéo dài) H F Trình tự oligo gắn HEX đuôi Alen-2 (Mồi ngược kéo dài chiều 5’-3’) Mồi ngược F Trong chu kỳ PCR đầu tiên, mồi đặc hiệu alen bắt cặp với trình tự đích chứa SNP với mồi ngược khuếch đại vùng đích H 3) Tổng hợp đoạn bổ sung với trình tự đặc hiệu alen – PCR vòng 2: Mồi ngược gắn vào, kéo dài tổng hợp sợi bổ sung 4) Phát tín hiệu huỳnh quang – PCR vòng 3: H F Oligo gắn FAM bắt cặp với trình tự bổ sung tổng hợp tín hiệu huỳnh quang không bị dập tắt Trong chu kỳ PCR tiếp theo, mức độ đuôi đặc hiệu alen tăng lên Phần gắn huỳnh quang băng FRET (FRET cassette) bắt cặp bổ sung gắn vào trình tự tổng hợp, giải phóng chất huỳnh quang từ quencher để tạo tín hiệu huỳnh quang Chất huỳnh quang kết hợp với alen G không bị dập tắt Chất huỳnh quang không kết hợp với alen T lại bị dập tắt 12 PHỤ LỤC 10 Minh họa kết điện di gel agarose mẫu DNA tách chiết từ tôm sú 10 11 12 13 14 15 16 17 A 10 11 12 13 14 B C A- Các mẫu BTB; B- Các mẫu NTB; C- Các mẫu NB 13 PHỤ LỤC 11 Các mẫu tôm sú hệ Go sử dụng cho nghiên cứu sàng lọc SNPs Nhóm Tơm sú Lớn nhanh (F) ♀ STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Nhóm Tơm sú Lớn chậm (S) ♂ ♀ ♂ Dấu VIE Gia đình Dấu VIE Gia đình Dấu VIE Gia đình Dấu VIE Gia đình TDOO TDOO TOTO TOTO OOTT OTHO THOO THOO OXOH TOOT OTDO TOOH TOOH TDOO TOOH TOOH TOOH OTOX OTOD OOTC OTOD TOOX OTOX OTOD TOOX OTOX OTXO OTOT OTOX OTOX AA08 AA08 AG06 AG06 AG07 AG08 GG06 GG06 NT07 TA02 TA03 TG03 TG03 AA08 TG03 TG03 TG03 TG04 NT08 AN05 NT08 TA04 TG04 NT08 TA04 TG04 GA07 AA07 TG04 TG04 TOTO TOTO OOTT THOO THOO THOO OTDO TOOH TOOH TDOO TOTO THOO OXOH OOTC OOTC TCOO OTOD TTOO OXOH THOO TOTO OXOH OTXO OXHO OTOD TCOO OTOD OTOD OOTT TOOX AG06 AG06 AG07 GG06 GG06 GG06 TA03 TG03 TG03 AA08 AG06 GG06 NT07 AN05 AN05 AT04 NT08 AA06 NT07 GG06 AG06 NT07 GA07 AT02 NT08 AT04 NT08 NT08 AG07 TA04 HXOO HOXO HOOX HOOX ODOH CHOO OHXO DHOO DHOO OOHX HDOO DOOH DOOH DOOH HOOX CHOO OHXO OOHX ODOH HDOO HOHO OHOX HHOO OHCO HODO HCOO OHOX OHOX OOCH OHOH AA04 NA07 NG11 NG11 NG13 NG14 NN08 NN09 NN09 NT06 TN01 TT06 TT06 TT06 NG11 NG14 NN08 NT06 NG13 TN01 TT01 NT05 TT03 NT04 TT05 TN02 NT05 NT05 TA01 TT05 HXOO HOXO HOOX HOOX ODOH CHOO OHXO DHOO DHOO OOHX HDOO DOOH DOOH DOOH HXOO HXOO HDOO DOOH HXOO OOHX HDOO HCOO OHOX HCOO HODO HOHO OHOX OHOX HOOX OHCO AA04 NA07 NG11 NG11 NG13 NG14 NN08 NN09 NN09 NT06 TN01 TT06 TT06 TT06 AA04 AA04 TN01 TT06 AA04 NT06 TN01 TN02 NT05 TN02 TT05 TT01 NT05 NT05 NG11 NT04 14 PHỤ LỤC 12 Các mẫu tôm sú hệ G1 sử dụng cho nghiên cứu sàng lọc SNPs Nhóm Tơm sú Lớn nhanh (F) STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Nhóm Tơm sú Lớn chậm (S) ♀ ♂ ♀ ♂ Dấu VIE Dấu VIE Dấu VIE Dấu VIE CODO CODO COOC COOC COXO COXO COXO CXOO CXOO DODO DODO DOXO DOXO ODCO ODDO ODDO OOCC OOCC OODD OODD OOVD OOVD OOVV OOVV OOXD OOXD OXHO OXHO OXOC OXOC CODO CODO COOC COOC COXO CXOO CXOO DODO DODO DOXO DOXO ODCO ODCO ODCO ODDO ODDO OOCC OOCC OODD OODD OOVD OOVD OOVV OOVV OOXD OOXD OXHO OXHO OXOC OXOC CCOO CCOO DOHO DOHO DOOH DOOH OCOC OCOC OCOD OCOD ODOC ODOC OOXX OOXX OXOD OXOD XODO XODO XOOH XOOH XXOO XXOO DCOO DCOO DDOO DDOO DHOO DHOO ODOX ODOX CCOO CCOO COCO COCO DOHO DOHO DOOH DOOH OCOC OCOC OCOD OCOD ODOC ODOC OOXX OOXX OXOD OXOD XODO XODO XOOH XOOH XXOO XXOO DCOO DCOO DDOO DDOO DHOO DHOO 15 PHỤ LỤC 13 Các mẫu tôm sú Lớn nhanh hệ G1 sử dụng cho phương pháp KASP STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Dấu VIE Trọng lượng (g) CODO CODO COOC COOC COXO COXO COXO CXOO CXOO DODO DODO DOXO DOXO ODCO ODDO ODDO OOCC OOCC OODD OODD OOVD OOVD OOVV OOVV OOXD OOXD OXHO OXHO OXOC OXOC VDOO VDOO VODO VODO VVOO VVOO XHOO XHOO XOOC XOOC 22,1 22,1 24,0 24,0 26,6 26,6 26,6 16,6 16,6 20,4 20,4 19,4 19,4 26,9 25,1 25,1 24,8 24,8 22,0 22,0 21,9 21,9 22,8 22,8 32,1 32,1 21,8 21,8 20,3 20,3 15,7 15,7 24,2 24,2 25,2 25,2 22,7 22,7 29,6 29,6 16 PHỤ LỤC 14 Giải thích thuật ngữ (Nguồn: http://bioinformatics.vn) Thuật ngữ Giải thích Adaptor/ adapter Đoạn trình tự oligonucleotide ngắn, tổng hợp hóa học, có dạng sợi đơn sợi đơi, sử dụng kỹ thuật di truyền để gắn vào đầu phân tử DNA RNA Read DNA sau nhân nhiều lần cắt ngẫu nhiên thành mẩu đủ nhỏ để giải trình tự Các đoạn nhỏ giải trình tự gọi read Contig Một contig đoạn trình tự liên tục có từ việc lắp ráp đoạn read có vùng trùng lặp với Lắp ráp contig Trình tự đoạn read tạo sử dụng phương pháp giải trình tự từ lên (bottom-up) Với phương pháp giài trình tự từ lên, phân tử DNA chia cắt thành mẩu nhỏ (bottom), đọc trình tự đoạn nhỏ này, lắp ráp chúng lại thành contig cuối hệ gen (up) Khả để lắp ráp thành công đoạn read thành contig phụ thuộc vào mức độ trùng lặp read, việc chia cắt phân tử DNA thành mẩu nhỏ ngẫu nhiên thực hàng loạt phân tử DNA Sau giải trình tự, đoạn read có trùng lặp lắp ráp thành contig chương trình máy tính Độ sâu kỹ thuật giải trình tự DNA mức độ trùng lặp đoạn trình tự vị trí nucleotide định kết nối Depth (or read depth) 17 ... dòng tôm sú (Penaeus monodon) Việt Nam nhằm phục vụ công tác chọn giống tôm 3 Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá đa hình hệ gen quần đàn tơm sú thu từ vùng biển Việt Nam; Sàng lọc đa hình nucleotide... VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nguyễn Thị Minh Thanh (Times New Roman, 15, Bold, Viết chữ thường) NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH HỆ GEN CÁC DỊNG TƠM SÚ (Penaeus monodon) VIỆT NAM NHẰM PHỤC VỤ... NGHIÊN CỨU BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM Đánh giá đa hình hệ gen quần đàn tôm sú kỹ thuật AFLP Thu mẫu tôm sú từ quần đàn BTB, NTB, NB DNA tổng số từ mẫu tôm sú Kỹ thuật AFLP đánh giá đa hình hệ gen Đa hình