Mục đích cơ bản của luận án này là nghiên cứu đặc điểm hình thái, phân bố, hiện trạng, thành phần hoá học và phương pháp nhân giống và nuôi trồng của một số loài thuộc chi Kim tuyến làm cơ sở để đề xuất giải pháp bảo tồn, phát triển và sử dụng bền vững các loài thuộc chi Kim tuyến ở Việt Nam.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT PHAN XUÂN BÌNH MINH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CƠ SỞ KHOA HỌC NHẰM BẢO TỒN, PHÁT TRIỂN VÀ SỬ DỤNG BỀN VỮNG MỘT SỐ LOÀI TRONG CHI KIM TUYẾN (Anoectochilus Blume) Ở VIỆT NAM Chuyên ngành Mã số : Thực vật : 42 01 11 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2017 Cơng trình hoàn thành tại: Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Trần Minh Hợi Người hướng dẫn khoa học 2: TS Phạm Hương Sơn Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Viện, họp Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 201… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật - Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Phan Xuân Bình Minh, Phạm Hương Sơn, Trần Minh Hợi, Nguyễn Thị Vân (2015), Nghiên cứu nhân giống nhằm bảo tồn phát triển Lan sứa (Anoectochilus lylei), Báo cáo khoa học Sinh thái Tài nguyên sinh vật Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ VI, Nhà xuấn Khoa học Tự nhiên Công nghệ, trang 695 – 699 Pham Huong Sơn, Nguyen Thị Lai, Phan Xuan Binh Minh, (2015), Isolation and simultaneous quantification ofadenosine, narcissin and roseoside in Anoectochilus roxburghii (Wall.) Wall ex Lindl, Journal of Chemical, Biological and Physical Sciences (4): 4002 – 4007 Tran Minh Hoi, Tran Van Thai, Chu Thi Thu Ha, Ha Thi Van Anh, Phan Xuan Binh Minh, (2016), Flavonoids from Anoectochilus annamensis and their Anti-inflammatory Activity, Natural Product Communications 11(5): 613 - 614 Phan Xuan Binh Minh, Pham Huong Son, (2016), Distridution, Habitat of Five Species of the Genus Anoectochilus Blume in Vietnam, Proceedings The 12th Asia Pacific Orchid Conference: 110- 116 Phan Xuan Binh Minh, Pham Huong Son, Tran Minh Hoi, (2017), Hiệu môi trường lỏng vi nhân giống loài Kim tuyến trung (Anoectochilus annamensis Aver.), Báo cáo khoa học Sinh thái Tài nguyên sinh vật Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ VII, Nhà xuấn Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, trang 1756- 1762 Phan Xn Bình Minh, Bùi Thị Thanh Phương, Phạm Hương Sơn, Trần Minh Hợi, Nguyễn Thị Phương Lan,Vũ Thị Thảo (2018), Ảnh hưởng chế độ chiếu sáng đèn LED lên khả sinh trưởng phát triển chồi hai loài Kim tuyến (Anoectochilus annamensis Aver vàAnoectochilus roxburghii (Wall.) Wall ex Lindl) ni cấy in vitro, Tạp chí Sinh học 40(1): 32- 38 DOI: 10.15625/0866-7160/v40nl 10636 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài luận án Chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) thuộc họ Lan (Orchidaceae Juss.), giới có khoảng 50 lồi Ở Việt Nam, theo Nguyễn Tiến Bân cộng (2005) chi Kim tuyến có 12 lồi Trong năm lồi có tên Sách đỏ Việt Nam, là: Anoectochilus acalcaratus Aver., Anoectochilus calcareus Aver., A chapaensis Gagnep., A setaceus Blume, A tridentatus Seidenf ex Aver.) Theo Averyanov LV (2008), chi Anoectochilus Blume Việt Nam có tổng số 30 lồi khu vực châu Á nhiệt đới Chi nằm Danh mục Thực vật rừng nguy cấp, quý (nhóm IA) Nghị định số 32/2006/NĐ- CP ngày 30/3/2006 Chính phủ nghiêm cấm khai thác, sử dụng mục đích thương mại Cũng giống Việt Nam, loài thuộc chi Kim tuyến giới bị thu hái ngồi tự nhiên Nhiều lồi có ý nghĩa khoa học (đa dạng nguồn gen, tính đặc hữu) giá trị sử dụng cao (đặc biệt dùng làm thuốc) như: Anoectochilus koshunensis, Anoectochilus sandvicensis, Anoectochilus zhejiangensis…đang đứng trước nguy bị tuyệt chủng Vì cần thiết phải tìm giải pháp bảo tồn phát triển bền vững số lồi, đặc biệt lồi có giá trị Mục tiêu nghiên cứu đề tài luận án Nghiên cứu đặc điểm hình thái, phân bố, trạng, thành phần hố học phương pháp nhân giống ni trồng số loài thuộc chi Kim tuyến làm sở để đề xuất giải pháp bảo tồn, phát triển sử dụng bền vững loài thuộc chi Kim tuyến Việt Nam Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án 3.1 Ý nghĩa khoa học Cung cấp, bổ sung dẫn liệu khoa học chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) Việt Nam phân bố loài, thành phần hoạt chất loài 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Là sở khoa học cho việc phát triển bền vững số loài chi Kim tuyến ( Anoectochilus Blume) Việt Nam Những điểm luận án - Đây cơng trình khoa học nghiên cứu tương đối đầy đủ mang tính hệ thống (các đặc điểm sinh học, sinh thái, phân bố) loài Kim tuyến có giá trị Việt Nam (Anoectochilus annamensis, A calareus, A elwesii, A lylei A setaceus) - Nghiên cứu thành phần hóa học lồi (Kim tuyến tơ Kim tuyến trung bộ) xác định được: + hợp chất từ loài A setaceus, có hợp chất bổ sung adensine reoside + hợp chất từ loài A annamensis, có hợp chất 4’, 5dihydroxy-3,3’, 7- trimethoxyflavone 4’-O-α-L-rhamnopyranosyl- (1→6)β-D-glucopyranoside -Nghiên cứu xác định khoa học, để nhân giống thành công loài A annamensis, A lylei A setaceus băng phương pháp nuôi cấy in vitro từ hạt chồi - Đề xuất số giải pháp ban đầu, mang tính khả thi nhằm nhân giống, nuôi trồng để bảo tồn điều kiện chuyển chỗ (ex situ) kết hợp với bảo tồn chỗ (in situ) loài A annamensis, A lylei A setaceus - Điều tra, đánh giá, thu thập số thông tin trạng khai thác, bn bán, tiêu thụ số lồi Kim tuyến VQG, KBTTN vài khu vực có rừng số địa phương - Dựa kết nghiên cứu có tính hệ thống đề xuất giải pháp bảo tồn hiệu loài thuộc chi Kim tuyến Bố cục luận án Toàn luận án bao gồm 156 trang, 49 hình 20 bảng, gồm phần: 1.1 Mở đầu: trang Chương 1: Tổng quan vấn đề nghiên cứu: 30 trang Chương 2: Đối tượng, nội dung phương pháp nghiên cứu: trang Chương 3: Kết nghiên cứu thảo luận: 94 trang Kết luận kiến nghị: trang Tài liệu tham khảo: 17 trang Chƣơng TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU Khái quát chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) Chi Kim tuyến (Anoectochilus) thuộc họ Lan bao gồm khoảng 40 - 50 loài thảo mộc nhỏ mặt đất khác từ dãy Himalaya Ấn Độ đến dãy núi Đông Nam Á, miền Nam Trung Quốc, Nhật Bản, Indonesia, số quần đảo Thái Bình Dương Kim tuyến đa phần loài thân thảo nhỏ, mọc đất, số lồi có đường gân màu vàng hay hồng bật Hoa nhỏ mơi lại có kích thước lớn so với hoa chia hai thuỳ rõ ràng Kim tuyến biết đến loại dược liệu quý có tác dụng bồi bổ sức khoẻ, trị rắn cắn bệnh gan phổi Những người dân địa phương sử dụng Kim tuyến mọc rừng quà thiên nhiên ban tặng để tăng cường sức khoẻ 1.2.Tình hình nghiên cứu chi Kim tuyến giới - Những kết nghiên cứu chi Kim tuyến giới chủ yếu tập trung Trung Quốc Ngoài ra, có quốc gia Ấn Độ, Thái Lan nước Đông Nam Á khác Những nghiên cứu chi Kim tuyến theo ba hướng là: nghiên cứu thực vật (thành phần loài, vùng phân bố, thực trạng…); nghiên cứu công dụng chủ yếu giá trị dược liệu; nghiên cứu giải pháp nhân giống nuôi trồng - Các kết nghiên cứu cho thấy chi Kim tuyến (Anoectochilus) với khoảng 30- 50 loài giới phân bố khắp vùng lục địa Châu Á, Úc, Papua New Guinea số quần đảo thuộc Thái Bình Dương Trong Trung Quốc có khoảng 13 lồi, Ấn Độ có khoảng 16 lồi nước Đơng Nam Á có khoảng 20 lồi - Các kết nghiên cứu cơng dụng lồi Kim tuyến: Theo y học cổ truyền Kim tuyến liên vị thuốc quý giá tiệm thuốc bắc, thuốc mang tính mát có vị ngọt, nhiệt, huyết, bổ phổi, giải trừ u uất, thơng trung khí, bồi dưỡng sức khỏe, nóng gan, bệnh phổi, thổ huyết, ho hen, đau ngực, đau lách, đau cuống họng, cao huyết áp, trẻ chậm lớn, suy thận Giá trị dược liệu Theo y học đại có nhiều kết nghiên cứu lồi Kim tuyến có chứa hợp chất như: flavonoid, axit amin có khả kháng khuẩn, chống lão hoá, giảm huyết áp, tiểu đường làm tê liệt chế hoạt động tế bào lạ Hiện có sản phẩm hoạt chất số loài Kim tuyến A setaceus, A formossanus… thương mại - Các kết nghiên cứu nhân giống nuôi trồng: Những kết nghiên cứu năm 80, 90 Quốc Kết cho thấy giải pháp nhân giống dùng chủ yếu nhân giống in vitro từ hạt môi trường có bổ sung vi sinh vật hỗ trợ cho sinh trưởng phát triển Kim tuyến Ngoài ra, nghiên cứu gần có sử dụng hệ thống nuôi cấy môi trường lỏng hệ thống chiếu sáng LED Biện pháp ni trồng có hai biện pháp là: Ni trồng nhà kính ni trồng tán rừng 1.3 Tình hình nghiên cứu chi Kim tuyến Việt Nam - Những kết nghiên điều tra, khảo sát, kiểm kê thành phần loài tác giả Phạm Hoàng Hộ, Nguyến Thiện Tịch, Nguyễn Tiến Bân Averyanov L thực từ năm 90 kỷ trước - Những kết nghiên cứu thành phần hoá học giá trị dược liệu chi Kim tuyến hạn chế Vũ Công Luận cộng (2005) công bố kết nghiên cứu nhân giống định lượng β- sitosterrol, hoạt chất dùng đề điều trị bệnh tim mạch ni cấy mơ Sau tác giả Đỗ Thị Gấm cộng (2017) chiết xuất định lượng Flavonoid tổng ba loài Kim tuyến (Kim tuyến tơ, Kim tuyến trung Kim tuyến lyle) - Những nghiên cứu nhân giống tập trung vào phương pháp nhân giống in vitro từ chồi hai lồi điển hình (A setaceus, A formossanus) CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu đề tài loài thuộc chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) có phân bố tự nhiên Việt Nam Khảo sát, thu thập mẫu vật, xác định vùng phân bố đánh giá trữ lượng khai thác loài thực dựa kết điều tra khảo sát thực đia, vấn người dân địa phương, cán quản lý VQG, KBTTN điểm có rừng khác 2.2 Địa điểm nghiên cứu 18 điểm khảo sát: VQG Ba Bể, VQG Xuân Sơn, VQG Tam Đảo, VQG Phong Nha -Kẻ Bảng, VQG Bạch Mã, VQG Chư Yang Sin, KBTTN Khau Ca, KBTTN Hoàng Liên - Văn bàn, KBTTN Thần Sa Phượng Hoàng, KBTTN Xn Liên, KBTTN Bắc Hướng Hóa, huyện Hồng Su Phì – Hà Giang, huyện Bắc Mê – Hà Giang, huyện Trà Lĩnh - Cao Bằng, huyện Sa Pa- Lao Cai, huyện Kỳ Sơn- Nghệ An, huyện Nam Trà Mi - Quảng Nam huyện Bảo Lộc - Lâm Đồng Những nghiên cứu tách chiết phân lâp hoạt chất tiến hành phòng Hoạt tính Sinh học -Viện Hóa sinh Biển, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Địa điểm nghiên cứu nhân giống ni trồng thực tại: Phòng thí nghiệm ni cấy mô vườn ươm Trung tâm Sinh học Thực nghiệm – Viện Ứng dụng Công nghệ Địa điểm phát triển vùng trồng thực tại: Công ty Biopharma, Hòa Bình 2.3 Nội dung nghiên cứu luận án Đặc điểm hình thái phân loại loài chi Kim tuyến Việt Nam Xác định thành phần hoạt chất hai loài Kim tuyến tơ Kim tuyến trung Nghiên cứu, điều tra trạng khai thác bn bán lồi thuộc chi Kim tuyến Từ đưa giải pháp quản lý, tuyên truyền để người dân địa phương hiểu giá trị loài Kim tuyến bảo vệ chúng Đề xuất giải pháp nhằm bảo tồn phát triển bền vững loài quý thuộc chi Kim tuyến + Giải pháp cho quản lý : Đưa loài Kim tuyến vào danh mục loài thuốc cần bảo vệ, đề xuất khu bảo tồn hợp lý tuyên truyền cộng đồng + Giải pháp kỹ thuật : Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống phương pháp nuôi cấy in vitro, ni trồng ba lồi Kim tuyến trung (A annamensis), Kim tuyến tơ (A setaceus) Lan sứa (A lylei) phục vụ có cơng tác bảo tồn phát triển bền vững 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp thu thập số liệu thực địa - Điều tra thực địa thu thập mẫu vật theo phương pháp nghiên cứu thực vật Nguyễn Nghia Thìn (2007) - Phương pháp vấn đánh giá nhanh nông thôn (RRA) 2.4.2 Phương pháp phân loại giám định tên loài - Sử dụng phương pháp chuyên gia tài liệu Phạm Hoàng Hộ (2000), Nguyễn Thiện Tịch (2001), Nguyễn Tiến Bân (2005) Averyanov LV (2008) để phân loại giám định tên loài 2.4.3 Phương pháp xác định thành phần hóa học - Phương pháp chiết tổng methanol, dịch chiết gom cô quay áp suất thấp - Phương pháp phân lập: Phân lập chất tinh khiết phương pháp sắc ký phổ biến sắc ký cột pha thường (silica gel thường), pha đảo (RP18, YMC ODS), dùng nhựa trao đổi ion (Dianion HP20) hấp phụ cỡ hạt (Sephadex LH20) - Xác định cấu trúc hóa học: Xác định cấu trúc chất phân lập phương pháp quang phổ đại bao gồm phổ hấp thụ hồng ngoại (IR), tử ngoại (UV), phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (1D 2D-NMR), phổ khối lượng thường (MS) phân giải cao (HR MS) 2.4.4 Phương pháp nhân giống nuôi cấy in vitro - Phương pháp nhân giống in vitro từ chồi: Nghiên cứu điều kiện mơi trường thích hợp sử dụng chồi ngủ làm nguyên liệu nuôi cấy tạo vật liệu khởi đầu - Phương pháp nhân giống in vitro từ hạt: Nghiên cứu điều kiện mơi trường thích hợp sử dụng chồi ngủ làm nguyên liệu nuôi cấy tạo vật liệu khởi đầu - Phương pháp lựa chọn điều kiện ni cấy thích hợp: Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy in vitro đại như: Nuôi cấy môi trường lỏng, sử dụng hệ thống chiếu sáng đèn LED 2.4.5.Phương pháp nuôi trồng ex vitro - Phương pháp nuôi trồng nhà lưới: Nghiên cứu điều kiện thích hợp ni trồng in vitro nhà lưới - Phương pháp nuôi trồng tán rừng: Nghiên cứu thời vụ, sâu bệnh cách phòng trừ trồng tán rừng 2.4.6 Phương pháp xử lý thống kê số liệu Phương pháp xử lý phân tích số liệu phần mềm Iristat 5.0 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm hình thái, phân bố chi Kim tuyến Việt Nam 3.1.1 Đặc điểm hình thái Các loài thuộc chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume.) thân thảo, có kích thước nhỏ, mọng nước, mọc sát mặt đất số lồi Kim tuyến gọi với tên Lan đất Rễ Kim tuyến có hệ rễ rễ đơn mọc từ đốt thân rễ, đơi từ đốt thân khí sinh, rễ ống, kích thước nhỏ Thân: thân thảo, mọng nước, có kích thước nhỏ (trung bình 825cm) thân chia hai phần thân rễ thân khí sinh Lá Kim tuyến đơn, mọc cách xoắn quanh thân, xoè mặt đất, với màu xanh đến xanh đen mang màu sắc khác (tùy theo loài) Lá hình trứng hình thoi, mép nhẵn gợn cưa Bề mặt mịn nhung mang mạng lưới gân phức tạp, tên "Kim tuyến" hay "Kim hoàn” bắt nguồn từ đường gân đẹp phiến loài lan này, cá biệt có lồi khơng có đương gân bật, dễ nhận biết Hoa Kim tuyến dạng cụm thân, mang hoa, hoa mọc thưa, hoa có cánh mơi to rõ ràng có cuống ngắn chia hai thuỳ rõ ràng Quả bao bọc mảnh vỏ mỏng xếp lại với liên kết hai đầu trụ, bên có trụ nằm có chứa nhiều hạt nhỏ bám quanh trụ Sau chín, vỏ khơ tách ra, hạt nhỏ bay Cây tái sinh tự nhiên từ chồi hạt Trong thời gian thực nghiên cứu khảo sát từ năm 2012-2017 VQG, KBTTN điểm có rừng nhiều tỉnh thành khác nhau, thu thập xác định loài thuộc chi Kim tuyến bao gồm: Kim tuyến trung (A annamensis Aver.), Kim tuyến đá vôi (A calcareus Aver.); Giải thuỷ tím (A elwesii C.B Clarke ex Hook.); Kim tuyến lyle (A lylei Rolfe ex Downie); Kim tuyến tơ (A setaceus Wall ex Lindl.) 3.1.2 Vùng phân bố loài thuộc chi Kim tuyến Khảo sát VQG, 5KBTTN khu vực có rừng vùng có vị trị địa lý hệ sinh thái đặc trưng trải dài từ Bắc vào Nam cho thấy, hầu hết loài thuộc chi Anoectochilus Việt Nam phân bố khu rừng rậm rộng thường xanh nhiệt đới, khu rừng tre nứa hỗn giao Chúng thường tập trung phân bố vùng trung tâm rừng, nơi có độ che phủ rừng từ 10 ARW11.4 Adenosine-5' methyl sunpua ARW12.2 (6S,9S)Roseoside ARW18.7 Stigmasterol ARW13.7 Hỗn hợp Benzylβ-Dglucopyranoside methylarbutin 3.2.2 Phân lập xác định cấu trúc hoá học chất Kim tuyến trung ( A annamensis) Từ dịch chiết MeOH Kim tuyến trung phân lập hợp chất thể bảng 3.3 Bảng 3.3: Danh sách chất phân lập từ Kim tuyến trung STT Ký hiệu mẫu Cấu trúc 14 CTPT, KLPT Ghi C18H16O7 M = 344 AAH9.10 - 5,4'-dihydroxy-3,7,3'trimethoxyflavonone AAE14.1 (trùng với ARW3.5) C28H32O1 - M = 624 Isorhamnetin 3-O-rutinoside C30H36O1 AAE14.1 M = 652 5-Hydroxy-3,7,3'trimethoxyflavone 4'-O-α-Lrhamnopyranosyl-(1→6)-βD-glucopyranoside 15 Chất AAH8.2 C28H40O M = 392 - C39H68O5 M = 616 - C24H38O4 M = 390 - Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen3-one (Ergone) AAH10.9 (2S)-2,3-O-dioctadeca 9Z,12Z-dienoyl-glycerol AAH8.15 Di-(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) 3.3 Hiện trạng khai thác, sử dụng bn bán lồi thuộc chi Kim tuyến 3.3.1 Hiện trạng khai thác Trong 10 năm gần nhu cầu thu mua tài nguyên dược liệu nói chung lồi thuộc chi Kim tuyến gia tăng nhanh chóng Tại 11 khu vực khảo sát có ơng chủ thu mua lâm sản ngồi gỗ (LSNG) 100% số họ có thu mua Kim tuyến Theo người dân địa phương 11 khu vực việc khai thác Kim tuyến cuối năm 90, phát triển rầm rộ vào đầu năm 2000 ông chủ người Trung Quốc đặt hàng thu mua Đến việc khai thác thu mua tiếp tục diễn số lượng quy mô nhỏ nguồn khai thác tự nhiên ngày cạn kiệt 3.3.2 Hiện trạng sử dụng bn bán quản lý lồi Kim tuyến địa phương 16 Tại 18 điểm khảo sát thu mẫu thấy người dân thu hái mua bán loài thuộc chi Kim tuyến Trong nghiên cứu khảo sát hiểu biết giá trị sử dụng loài thuộc chi Kim tuyến, chọn VQG; KBT; điểm có rừng khác biết gần toàn Kim tuyên khai thác để bán tỉ lệ để sử dụng 10% Nguyên nhân đa phần người dân cán quản lý biết hạn chế giá trị nguồn gen giá trị sử dụng cùa loài kim tuyến Theo số liệu điều tra khảo sát 165 người dân địa phương tham gia khai thác 16 chủ buôn bán LSNG 11 điểm khảo sát Kết cho thấy việc khai thác thu mua loài Kim tuyến diễn hàng ngày nhiều điểm khác toàn quốc, số ngày khai thác năm phụ thuộc vào thời tiết, phong tục tập quán đặc điểm sinh thái loài Người dân địa phương rừng nhiều nên hiểu rõ quy luật để khai thác Qua tìm hiểu biết bị khai thác tận diệt nhiều năm liên tục dẫn đến nguồn Kim tuyến tự nhiên bị cạn kiệt dần, sản lượng khai thác 1/2 1/3 so với 10 năm trước Hiện tại, Kim tuyến sâu rừng địa hình hiểm trở Vì vậy, đối tượng tham gia khai thác bị thu hẹp lại khơng tham gia đơng đảo trẻ em phụ nữ trước nữa, địa bàn khai thác lại mở rộng Tại số điểm VQG Tam Đảo, VQG Phong Nha Kẻ Bàng, KBTTN Hoàng Liên-Văn Bàn hay Nam Trà My – Quảng Nam người dân không khai thác cánh rừng gần nhà Họ thành lập nhóm rừng 23 người đàn ơng rừng, 3-5 ngày trở về, đối tượng tập trung khai thác họ loài cảnh, song, mây lồi dược liệu rừng sâu có Kim tuyến 3.4 Giải pháp bảo tồn phát triển loài Kim tuyến 3.4.1 Giải pháp nhân giống ni trồng ba lồi Kim tuyến (Kim tuyến trung bộ, Kim tuyến lyle Kim tuyến tơ) Trước thực trạng lồi Kim tuyến có nguy tuyệt chủng nhiều nguyên nhân khác nguyên nhân khai thác tận diệt bn bán thiếu kiểm sốt Nhân giống ni trồng giải pháp bảo tồn phát triển hữu hiệu 3.4.1.1 Giải pháp nhân giống ba loài Kim tuyến phương pháp nuôi cấy in vitro 17 Đối với họ Lan nói chung chi Kim tuyến nói riêng nhân giống phương pháp nuôi cấy in vitro, đặc biệt nuôi cấy in vitro từ hạt giải pháp hiệu nhiều nước giới như: Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan…sử dụng Trong nhân giống in vitro có ba giai đoạn chính: Tạo vật liệu khởi đầu, nhân nhanh tạo hoàn chỉnh a Tạo vật liệu khởi đầu Trong nghiêu cứu có hai nội dung nhằm tìm cơng thức mơi trường khống, chất điều hồ sinh trưởng nồng độ thích hợp với đối tượng nghiên cứu -Ảnh hưởng mơi trường khống chất điều hồ sinh trưởng đến khả sinh chồi Kim tuyến trung Kim tuyến lyle Kết nghiên cứu cho thấy mơi trường thích hợp cho tái sinh chồi Kim tuyến trung mơi trường MS có bổ sung 1,0mg/l TDZ Mơi trường thích hợp cho Kim tuyến lyle mơi trường MS có bổ sung 1,5mg/l BAP - Ảnh hưởng mơi trường khống chất điều hoà sinh trưởng đến khả nảy mầm Kim tuyến trung bộ, Kim tuyến lyle Kim tuyến tơ Kết nghiên cứu ảnh hưởng môi trường khống chất điều hồ sinh trưởng đến khả nảy mầm ba loài Kim tuyến (Kim tuyến trung bộ, Kim tuyến lyle Kim tuyến tơ ) thể bảng 3.8 Bảng 3.8: Ảnh hƣởng mơi trƣờng khống chất kích thích đến khả nảy mầm hạt Kim tuyến trung nuôi cấy in vitro Mơi trường khống MS Nồng độ TDZ (mg/l) Tỉ lệ mầm xanh (%) Khối lượng trung bình mầm (mg/mầm) 17,1f 0,42d 0,1 21,5e 0,67c 0,5 36,4d 0,75c 18 73,2a 1,42b 1,5 65,6b 1,86a 2,0 58,7c 1,93a 3,1 0,1 15,8f 0,46e 0,1 22,2e 0,64d 0,5 31,7d 0,83c 62,7a 1,29b 1,5 59,7b 1,56a 2,0 56,3c 1,62a 2,7 0,08 16,4f 0,47f 0,1 20,5e 0,72e 0,5 29,7d 0,89d 66,2a 1,35c 1,5 61,7b 1,74b 2,0 52,8c 1,87a 3,4 0,12 15,8f 0,42f 0,1 19,7e 0,59e LSD0,05 Knud LSD0,05 HY LSD0,05 19 VW 0,5 29,2d 0,72d 57,4a 1,07c 1,5 51,8b 1,52b 2,0 48,4c 1,64a 2,4 0,06 LSD0,05 Chú thích: LSD0.05 sai số nhỏ có ý nghĩa mức cho phép 5%0; Những chữ khác (a, b, c…) nêu cột biểu diễn khác có ý nghĩa mức LSD Kết thí nghiệm cho thấy cơng thức mơi trường MS có bổ sung nồng độ 1,0 mg/l TDZ thích hợp cho hạt Kim tuyến trung nảy mầm(tỉ lệ nảy mầm 73,2%; trọng lượng trung bình mầm 1,42mmg/mầm sau 16 tuần ni cấy) Đây kết tốt so với kết YihJuh Shiau cộng năm 2002 ni cấy hạt A formosanus mơi trường MS có bổ sung 2mg BAP cho kết sau tháng ni cấy có tỉ lệ nảy mầm 81,4% trọng lượng trung bình mầm 1,84mg Tương tự hạt Kim tuyến lyle Kim tuyến tơ thích hợp gieo mơi trường MS có bổ sung 1,5 mg/l BAP A lylei sau 16 tuần nuôi cấy môi trường MS+ 1,5mg/l BAP cho kết tốt hai tiêu: tỉ lệ nảy mầm 64,7%; trọng lượng trung bình mầm 1,82mg Kim tuyến tơ sau 16 tuần nuôi cấy môi trường MS+ 1,5mg/BAP kết thu tỉ lệ nảy mầm 75,2%; trọng lượng trung bình mầm 1,62mg b Giai đoạn nhân nhanh Nhân nhanh giai đoạn gia tăng hệ số nhân chồi, giai đoạn cần phải đạt yêu cầu: Tạo hệ số nhân giống cao (thời gian nuôi cấy ngắn, đạt số lượng nhiều); chồi tạo đồng có sức sinh trưởng tốt, để tạo thành hoàn chỉnh phát triển khoẻ mạnh, sinh rễ khả dị dạng thấp Ỏ giai đoạn có hai nội dung nghiên cứu là: 20 -Ảnh hưởng điều kiện môi trường Kết cho thấy Kim tuyến trung thích hợp với môi trường MS + 0,5mg/l TDZ sau tuần nuôi cấy cho hệ số nhân chồi 9,23, chồi lại phát triển tốt Còn A lylei là: MS+ 1mg/l BAP sau tuần nuôi cấy cho hệ số nhân chồi 9,12 Sử dụng môi trường lỏng giai đoạn nhân nhanh không gia tăng sinh khối, tiết kiệm chi phí mà tiền đề cho quy trình sản xuất giống quy mơ lớn nghiên cứu tạo hạt giống nhân tạo Phương pháp áp dụng nhiều đối tượng trồng Kết nghiên cứu ba điều kiện môi trường khác nhau: Môi trường rắn; lỏng lắc (80 vòng/phút) lỏng có bổ sung bơng gòn để ni cấy loài Kim tuyến trung bộ, Kim tuyến lyle Kim tuyến tơ cho thấy công thức mơi trường lỏng lắc có hệ số nhân chồi cao so với môi trường rắn môi trường gòn ba lồi Kim tuyến Mơi trường lỏng lắc khích thích q trình phát sinh chồi rễ mạnh mẽ quan trọng hình thái khơng bị thay đổi Bên cạnh để thích nghi với điều kiện mơi trường lỏng lắc, hệ rễ phát triển giúp cho đứng thẳng, đường kính thân to thân cứng Đây tiêu quan trọng giống in vitro Sử dụng môi trường lỏng nhân giống in vitro nói chung dược liệu nói riêng nhằm gia tăng sinh khối hạ giá thành sản phẩm triển khai số quốc gia Nhật Bản, Ân Độ… -Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng Ở giai đoạn nhân nhanh việc xác định môi trường nuôi cấy điều kiện ngoại cảnh thích hợp có ý nghĩa định đến hiệu trình nhân nhanh Trong tự nhiên chi Kim tuyến đa phần phân bố tán rừng rậm thường xanh có độ tàn che 70-80% lồi thích hợp với cường độ chiếu sáng thấp Theo nghiên cứu Ma ZQ cộng (2010) cho thấy A formosanaus phù hợp với cường độ sáng từ 30- µmol/m2/s Trong nghiên cứu ảnh hưởng chế độ chiếu sáng, cơng thức thí nghiệm thực dải bước sóng (λ= 430-470 nm; λ= 470-510 nm; λ= 510-560 nm; λ= 560- 600 nm) với cường độ chiếu sáng 40µmol/m2/s, thời gian chiếu sáng 12h/ngày, công thức đối chứng đèn huỳnh quang ba đối tượng Kim tuyến trung bộ, Kim tuyến lyle Kim tuyến tơ, kết thu sau tuần nuôi cấy: Kim tuyến trung 21 không chịu ảnh hưởng thành phần môi trường, chất điều hồ sinh trưởng mà chúng chịu ảnh hưởng nhiều từ điều kiện chiếu sáng Ánh sáng đèn LED có bước sóng λ= 430-470 nm có khả kích thích sinh chồi cao (12,73 chồi/mẫu) cao 1,4 lần đối chứng, bước sóng λ= 470- 510 nm lại thích hợp cho phát triển chồi Kim tuyến trung dải bước sóng phát triển tốt so với dải bước sóng λ= 430- 470 nm chế độ chiếu sáng khác Đối với Kim tuyến lylei ánh sáng đèn LED có bước sóng λ= 470-510 nm chế độ chiếu sáng ba tiêu hệ số sinh chồi, chiều cao khối lượng trung bình chồi cao so với đối chứng với công thức khác Tương tự Kim tuyến lylei, Kim tuyến tơ hích hợp với chế độ chiếu sáng đèn LED dải bước sóng λ= 470- 510 nm Ở chế độ chiếu sáng ba số chồi trung bình /mẫu; chiều cao trung bình chồi trọng lượng trung bình chồi cao so với chế độ chiếu sáng khác, đặc biệt cao nhiêu so với công thức đối chứng đèn huỳnh quang (chỉ số chồi trung bình/ mẫu 12,67 cao 1,43 lần so với đối chứng 8,87) Các số khác chiều cao hay trọng lượng trung bình cao cơng thức đối chứng cơng thức thí nghiệm khác Kết cho thấy hệ thống chiếu sáng đèn LED có ảnh hưởng tích cực đến khả sinh trưởng phát triển chồi nuôi cấy in vitro hai loài Kim tuyến Cả hai loài phát triển tốt sử dụng hệ thống chiếu sáng đèn LED có dải bước sóng λ= 470- 510 nm Tuy nhiên Kim tuyến trung dải bước sóng λ= 430- 470nm lại giúp kích thích sinh chồi nhiều c Giai đoạn tạo hoàn chỉnh - Ảnh hưởng nồng độ chất điều hòa sinh trưởng Nghiên cứu ảnh hưởng NAA IBA nồng độ 0,1; 0,5; 1; 1,5; mg/l Kết nghiên cứu cho thấy A annamensis nồng độ 0.5 mg/ l hai loại auxin cho kết tỉ lệ rễ số rễ trung bình chiều dài rễ tốt so với nồng độ khác Nhưng cho kết tốt công thức 0.5mg/l IBA với số: tỉ lệ rễ 93,33%; số rễ trung bình 2,64; dài rễ trung bình 11,60mm) Vậy nồng độ thích hợp cho A lylei NAA nồng độ 0,5mg/l với tỉ lệ rễ 89,72%, số rễ trung bình mẫu 2,78, chiều dài trung bình rễ 10.76mm -Ảnh hưởng điều kiện môi trường 22 Từ kết khả quan sử dụng môi trường lỏng giai đoạn nhân nhanh ba loài Kim tuyến Nghiên cứu tiếp tục thực giai đoạn tạo hoàn chỉnh công thức môi trường MS+ 0,5 mg/l IBA MS + 0,5 mg/l NAA thể môi trường khác nhau: môi trường rắn (bổ sung 8g agar/l); mơi trường với giá thể bơng gòn mơi trường lỏng lắc 60 vòng/phút cho ba lồi Kim tuyến trung bộ, Kim tuyến lyle Kim tuyến tơ sau tuần nuôi cấy Kết cho thấy, ba loài Kim tuyến: Kim tuyến trung bộ, Kim tuyến lyle Kim tuyến tơ môi trường lỏng lắc cho kết tốt Môi trường lỏng lắc kích thích q trình hình thành phát triển rễ tốt so với môi trường lỏng tĩnh môi trường rắn Hơn nữa, môi trường lỏng lắc giúp hệ rễ phát triển hơn, lơng hút rễ nhiều giúp đứng vững 3.4 1.2 Giải pháp nuôi trồng Kim tuyến a Nuôi trồng điều kiện nhà lưới Giai đoạn đưa in vitro vườn ươm giai đoạn có ý nghĩa vô quan trọng, định khả ứng dụng tồn q trình ni cấy in vitro vào thực tiễn sản xuất Đây giai đoạn gặp phải nhiều khó khăn cho việc chuyển từ ống nghiệm vườn ươm kéo theo thay đổi đột ngột điều kiện sống từ môi trường nhân tạo sang điều kiện tự nhiên có nhiều yếu tố tự nhiên khó điều khiển như: ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm … trồng thử nghiệm giá thể mùn hữu mùn dừa Tri Bat có bổ sung phân giun quế 25% 50% sau tháng ni trồng điều kiện nhà lưới có nhiệt độ trung bình từ 20-300C, cường độ chiếu sáng trung bình 40- 50µmol/m2/s sau 16 tuần ni cấy thu kết ba loài Kim tuyến trung bộ, Kim tuyến lyle Kim tuyến tơ sinh trưởng phát triển tốt trồng giá thể mùn hữu mùn dừa có bổ sung 25% phân giun quế Tiếp tục nuôi cấy điều kiện sau 10 -12 tháng cho thu hoạch b Nuôi trồng tự nhiên - Ảnh hưởng thời vụ trồng Ngồi ni trồng nhà kính ni trồng tán rừng giải pháp phát triển vùng trồng Kim tuyến áp dụng Đối với giải pháp nuôi trồng việc lựa chọn vùng trồng đáp ứng yêu cầu điều 23 kiện tự nhiên, khí hậu, thổ nhưỡng, kinh tế xã hội đóng vai trò quan trọng Điều kiện nuôi trồng phải tương tự điều kiên tự nhiên vùng phân bố Thêm vào thời vụ ni trồng, cần tránh thời điểm có khí hậu thời tiết cực đoan như: mưa lũ, nóng lạnh để tránh rủi ro.Vì với điều kiện khí hậu Hồ Bình, lựa chọn thời điểm ni trồng tháng 3; tháng 6; tháng tháng 12) Kết cho thấy thời điểm trồng tốt tháng tháng Hồ Bình có nhiệt độ trung bình 14-200C có mưa xn, độ ẩm khơng khí cao thích hợp cho sinh trưởng phát triển Kim tuyến tơ, sau 4-6 tuần ổn định đến mùa hè thời điểm phát triển sinh khối mạnh mà phát triển tốt cho thu hoạch vào tháng 12, thời điểm Kim tuyến tơ hoa thời điểm thu hoạch dược liệu tốt Đối với trồng vào tháng đến tháng bắt đầu phát triển lại gặp mưa sâu bệnh gây tổn hại nhiều dẫn đến tỉ lệ sống thấp Cây trồng thời điểm tháng có tỉ lệ sống cao sinh khối lại phát triển chậm điều kiện thời tiết sau mùa khơ lạnh Còn thời điểm tháng 12 có tỉ lệ sống thấp phát triển chậm điều kiện thời tiết Vậy thời điểm thích hợp đề trồng Kim tuyến tơ miền Bắc tháng -Các lồi sâu bệnh gây hại cách phòng trừ Như biết loài thuộc chi Kim tuyến nhạy cảm với điều kiên mơi trường sinh thái, chúng thích hợp sống điệu kiện ưa ẩm không ưa sáng, điều kiện thích hợp sinh sơi nẩy nở lồi sinh vật xâm hại Khi sống điều kiên tự nhiên chúng bảo vệ mối quan hệ cộng sinh tương hỗ lẫn Vì ni trồng Kim tuyến khó tránh khỏi tác hại sinh vật gây hại Những nghiên cứu Hồ Bình từ tháng năm 2014 đến tháng năm 2015 loài Kim tuyến tơ cho thấy có lồi sâu bệnh hại chủ yếu là: Nhện đỏ son, ốc sên, sên trần, thối mềm Kết điều tra mức độ gây hại thể thể bảng 3.20 Bảng 3.20: Mức độ gây hại loại sâu bệnh hại Kim tuyến (03/2014- 2/2015) 24 Mức độ phổ biến Kỳ điều tra Nhện đỏ son Ốc sên nhỏ Sên trần nhỏ Bệnh thối mềm vi khuẩn 3/2013 - + + - 4/2013 + +++ +++ + 5/2013 ++ +++ + ++ 6/2013 +++ + - ++ 7/2013 +++ + - + 8/2013 +++ + + + 9/2013 ++ +++ +++ + 10/2013 ++ +++ +++ + 11/2013 ++ +++ ++ + 12/2013 + ++ + - 1/2015 - ++ + - 2/2015 - + ++ + Ghi chú: - Không nhiễm bệnh; + tỉ lệ nhiễm bệnh ≤ 25%; ++ 25%> tỉ lệ nhiễm bệnh ≥ 50%; +++ 50% ≤ tỉ lệ nhiễm bệnh ≤ 70%;++++ 70%≤ tỉ lệ nhiễm bệnh ≤ 100% Kết cho thấy Kim tuyến dễ bị sâu bệnh cơng Mỗi loại sâu bệnh lại thích nghi với khoảng thời gian định năm Vì để tránh tổn thất sâu bệnh cần xử lí đất trồng thật kỹ có biện pháp thích hợp cho loại sâu bệnh Những kết nghiên cứu cho thấy giải pháp nhân giống nuôi 25 trồng giải pháp hữu hiệu giúp bảo tồn lưu giữ nguồn tài nguyên Kim tuyến Việt Nam 3.4.2 Giải pháp quản lý tuyên truyền 3.4.2.1 Giải pháp quản lý a Đưa lồi Kim tuyến có giá trị dược liệu như: Kiim tuyến trung (A annamensis); Kim tuyến tơ (A setaceus); Kim tuyến elwes (A elwesii) vào danh mục loài thuốc cần bảo vệ Việt Nam b Đề xuất điểm có sở vật chất điều kiện tự nhiên phù hợp để bảo tồn loài Kim tuyến bảng 3.21 Bảng 3.21: Đề xuất địa điểm bảo tồn loài thuộc chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) Địa điểm Sơ lượng lồi Tên Lồi Trạm dược liệu Sa Pa (Viện Dược Liệu- Bộ Y tế) A setaceus Blume A calcareus Aver Trạm dược liệu Tam Đảo (Viện Dược Liệu- Bộ Y tế) A setaceus Blume; KBTTN Xuân Liên A annamensis Aver A elwesii A setaceus Blume A annamensis Aver VQG Phong Nha Kẻ Bàng A setaceus Blume A annamensis Aver A calcareus Aver Trung tâm giống Ghi A setaceus Blume 26 Lưu giữ khu vực vườn Lan Lưu giữ khu vực vườn Lan thuốc Đà Lạt A lylei Rolfe ex Downie c Xây dựng kế hoạch phát triển vùng trồng 3.4.2.2 Giải pháp tuyên truyền a Tuyên truyền cho nhà quản lý nhà đầu tư thấy vai trò giá trị loài Kim tuyến b Tuyên truyền cho cộng đồng cán quản lý VQG, KBTTN địa phương giúp họ hiểu giá trị nguồn gen giá trị dược liệu lồi Kim tuyến đề từ họ có ý thức bảo vệ phát triển chúng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Thu thập giám định tên lồi xác định điểm phân bố ghi nhận 12 điểm phân bố năm loài Anoectochilus annamensis; A calcareus; A elwesii; A lylei A setaceus thuộc họ Lan (Orchidaceac) - Đã tách chiết phân lập hợp chất loài Kim tuyến tơ (A setaceus), có hai hợp chất phát lần đầu A setaceus adensine roeoside, hợp chất flavonoid lồi thuộc chi Kim tuyến hợp chất từ Kim tuyến trung (A annamensis), có hợp chất lần phân lập từ tự nhiên annamflavone chất có hoạt tính kháng khuẩn mạnh - Đã đánh giá trạng khai thác, bn bán lồi Kim tuyến 3VQG, KBTTN điểm có rừng khác cho thấy, hộ dân điểm khảo sát khai thác tận diệt tham gia bn bán lồi Kim tuyến - Đề xuất giải pháp quản lý tuyên truyền giải pháp kỹ thuật nhân giống ni trồng ba lồi Kim tuyến (Kim tuyến trung (A annamensis), Kim tuyến lyle (A lylei) Kim tuyến tơ (A setaceus)) - Đã thực nhân giống thành công kỹ thuật nhân giống in vitro từ hạt từ chồi ba loài Kim tuyến trung bộ, Kim tuyến lyle Kim 27 tuyến tơ Trong trình nhân giống in vitro sử dụng môi trường lỏng sử dụng hệ thống chiếu sáng đèn LED công nghệ tăng hiệu nhân giống Kết ứng dụng cho phát triển vùng trồng Kim tuyến phục vụ mục đích thương mại - Ni trồng thực phương pháp nuôi nhà lưới sau 16 tuần ni cấy sinh trưởng phát triển tốt (tỉ lệ sống 80%; sinh khối tăng gần gấp 3) nuôi trồng tán rừng Hồ Bình Đã xác định thời điểm trồng thích hợp tháng 3, sinh trưởng phát triển sau 16 tuần nuôi trồng, tỉ lệ sống 70%; sinh khối tăng gần gấp 2) Kiến nghị - Cần sớm bổ sung loài Kim tuyến vào danh mục lồi dược liệu có giá trị cần bảo tồn phát triển - Tiếp tục tiến hành đề tài nghiên cứu điều tra khảo sát nhằm kiểm kê, bổ sung số lượng, trữ lượng loài, đề tài nghiên cứu thành phần hoá học, giá trị dược liệu loài thuộc chi Kim tuyến Việt Nam - Nghiên cứu thử nghiệm để nhân rộng mơ hình ni trồng Kim tuyến nhà lưới tán rừng phục vụ cho thị 28 ... phát triển sử dụng bền vững loài thuộc chi Kim tuyến Việt Nam Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án 3.1 Ý nghĩa khoa học Cung cấp, bổ sung dẫn liệu khoa học chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume). .. Blume) Việt Nam phân bố loài, thành phần hoạt chất loài 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Là sở khoa học cho việc phát triển bền vững số loài chi Kim tuyến ( Anoectochilus Blume) Việt Nam Những điểm luận án. .. mầm Kim tuyến trung bộ, Kim tuyến lyle Kim tuyến tơ Kết nghiên cứu ảnh hưởng mơi trường khống chất điều hồ sinh trưởng đến khả nảy mầm ba loài Kim tuyến (Kim tuyến trung bộ, Kim tuyến lyle Kim tuyến