Nghiên cứu vai trò của khí CO2 lên sự tăng trưởng và tích lũy hợp chất thứ cấp của cây diệp hạ châu đắng in vitro không chỉ có lợi cho việc sản xuất cây in vitro, mà còn cho việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ cây in vitro. Đốt thân mang 1 lá của cây diệp hạ châu đắng được nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng với mật độ 4 đốt/hộp Magenta GA-7 (V = 370 ml). Nắp hộp có hai lỗ (Φ = 1 cm) và được dán màng Millipore (Φ = 0,45 µm). Môi trường nuôi cấy gồm khoáng đa lượng MS bằng 1/2, vi lượng MS, không bổ sung đường và vitamin. Đốt thân được nuôi 45 ngày trong buồng nuôi cây Percival ở một trong hai nồng độ CO2 (400 µmol mol-1 hoặc 1200 µmol mol-1 ), dưới cường độ ánh sáng 160 µmol m-2 s -1 , thời gian chiếu sáng 16 h d-1 , nhiệt độ trong giai đoạn chiếu sáng/tối là 27/22oC và ẩm độ tương đối là 50%. Cây in vitro ngày thứ 45 được đem ra vườn ươm trồng trong 32 ngày. Cây diệp hạ châu đắng tăng trưởng tốt hơn ở nồng độ CO2 cao trong cả giai đoạn in vitro lẫn ex vitro, gia tăng trọng lượng tươi và khô cũng như đường kính thân và chiều dài rễ đều lớn hơn ở công thức có 1200 µmol mol-1 CO2. Các hợp chất lignan của cây diệp hạ châu đắng in vitro, bao gồm phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin, có hàm lượng (tương ứng 1,27, 0,51 và 2,01 mg g-1 khô) đều cao hơn so với cây ở nồng độ CO2 thấp (tương ứng 0,57, 0,45 và 1,05 mg g-1 khô) ở ngày thứ 45.
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 249-256 SỰ TĂNG TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY HỢP CHẤT THỨ CẤP CỦA CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG NUÔI CẤY QUANG TỰ DƯỠNG TRONG ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG GIÀU CO2 Phạm Minh Duy1, Nguyễn Như Hiến1, Hoàng Ngọc Nhung1 Nguyễn Du Sanh2, Nguyễn Thị Quỳnh1* (1) Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, (*)qtnguyen_vn@yahoo.com (2) Trường đại học Khoa học tự nhiên Hồ Chí Minh TĨM TẮT: Nghiên cứu vai trò khí CO2 lên tăng trưởng tích lũy hợp chất thứ cấp diệp hạ châu đắng in vitro khơng có lợi cho việc sản xuất in vitro, mà cho việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ in vitro Đốt thân mang diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng với mật độ đốt/hộp Magenta GA-7 (V = 370 ml) Nắp hộp có hai lỗ (Φ = cm) dán màng Millipore (Φ = 0,45 µm) Mơi trường ni cấy gồm khống đa lượng MS 1/2, vi lượng MS, không bổ sung đường vitamin Đốt thân nuôi 45 ngày buồng nuôi Percival hai nồng độ CO2 (400 µmol mol-1 1200 µmol mol-1), cường độ ánh sáng 160 µmol m-2 s-1, thời gian chiếu sáng 16 h d-1, nhiệt độ giai đoạn chiếu sáng/tối 27/22o C ẩm độ tương đối 50% Cây in vitro ngày thứ 45 đem vườn ươm trồng 32 ngày Cây diệp hạ châu đắng tăng trưởng tốt nồng độ CO2 cao giai đoạn in vitro lẫn ex vitro, gia tăng trọng lượng tươi khơ đường kính thân chiều dài rễ lớn cơng thức có 1200 µmol mol-1 CO2 Các hợp chất lignan diệp hạ châu đắng in vitro, bao gồm phyllanthin, hypophyllanthin niranthin, có hàm lượng (tương ứng 1,27, 0,51 2,01 mg g-1 khô) cao so với nồng độ CO2 thấp (tương ứng 0,57, 0,45 1,05 mg g-1 khơ) ngày thứ 45 Từ khóa: Phyllanthus amarus, dioxit cacbon, hợp chất thứ cấp, hiệu suất quang hợp thuần, ex vitro, in vitro, quang tự dưỡng MỞ ĐẦU Xu hướng phát triển y học giới quay nghiên cứu sử dụng loại thuốc bào chế từ loài dược liệu thiên nhiên Cây diệp hạ châu đắng [Phyllanthus amarus (Shumm et Thonn.)] thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), loài dược liệu ý dược tính quan trọng chống virus bảo vệ gan Loài sống phổ biến vùng nhiệt đới cận nhiệt đới châu Phi, châu Mỹ châu Á, có Việt Nam Diệp hạ châu đắng có chứa nhiều hợp chất thứ cấp có dược tính, đó, quan trọng lignan có chi Phyllanthus phyllanthin, hypophyllanthin niranthin Nhiều nghiên cứu khẳng định, loại lignan có khả ức chế kháng nguyên bề mặt HBsAg virus HBV [4], giảm đau [5], tăng loại thải uric acid [9] bảo vệ tế bào gan [7, 2] Để phục vụ cho việc nghiên cứu sản xuất dược liệu Việt Nam, diệp hạ châu đắng bắt đầu đưa vào trồng với số lượng lớn đồng ruộng số tỉnh Phú Yên Lâm Đồng Mặc dù vậy, phương pháp canh tác gieo hạt có hiệu chưa cao tỷ lệ nảy mầm thấp, chất lượng giống không đồng đều, hạt bị nhiễm bệnh Phương pháp ni cấy mơ có tiềm ứng dụng nhằm cung cấp lượng lớn giống đồng đều, bệnh, số nhược điểm chịu sáng kém, thoát nước nhanh, dễ chết vườn ươm khiến cho việc ứng dụng phương pháp sản xuất hạn chế Nhiều nghiên cứu xác định rằng, nhược điểm bắt nguồn từ việc ni cấy mơi trường có đường, bình kín, khiến cho quang hợp kém, có nhiều bất thường sinh lý [6] Phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng phương pháp mới, đời vào năm 80 kỷ XX Phương pháp cho phép in vitro tự quang hợp sinh trưởng điều kiện gần tương tự ex vitro, giúp giảm bất thường hình thái sinh lý mà phương pháp truyền thống thường gây 249 Pham Minh Duy et al Nuôi cấy mơ quang tự dưỡng có tiềm ứng dụng việc cung cấp nguồn giống cho canh tác diệp hạ châu đắng nói riêng dược liệu nói chung xa việc sản xuất hợp chất thứ cấp in vitro từ loài Tuy nhiên, để tối ưu hóa quy trình sản xuất, cần phải có nghiên cứu chi tiết ảnh hưởng yếu tố môi trường vật lý in vitro, đó, có nồng độ CO2 khơng khí lên tăng trưởng tích lũy hợp chất thứ cấp diệp hạ châu đắng điều kiện nuôi cấy mô quang tự dưỡng PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thí nghiệm gồm hai giai đoạn: (1) ni cấy in vitro quang tự dưỡng 45 ngày (2) giai đoạn vườn ươm 32 ngày Vật liệu nuôi cấy đốt thân diệp hạ châu đắng in vitro mang mở (khối lượng tươi trung bình 44 mg/đốt, khối lượng khơ trung bình 6,25 mg/đốt) Các đốt thân nuôi cấy hộp Magenta GA-7 (Sigma, Hoa Kỳ) với mật độ đốt/hộp Nắp hộp đục lỗ (ф = cm) giúp trao đổi khí, lỗ dán màng Millipore (Nihon Millipore Ltd., Nhật Bản) với đường kính lỗ màng 0,45 µm Mơi trường ni cấy bao gồm khống đa lượng MS giảm 1/2, vi lượng MS, bổ sung thêm 200 mg/l KNO3 200 mg/l KH2PO4 Thể tích mơi trường ban đầu 55 ml/hộp bổ sung thêm 15 ml/hộp vào ngày thứ 27 Giá thể sử dụng perlite (Cơng ty Cell Green, Thuận An, Bình Dương) với khối lượng 29,5 mg/hộp pH trước khử trùng 5,8 Thí nghiệm gồm hai cơng thức nồng độ CO2 (thấp 400 µmol mol-1 cao 1200 µmol mol-1), công thức gồm hộp với lần lặp lại Các hộp đặt tủ khí hậu Percival (model PGC-9/2, Percival Scientific, Inc., Mỹ) cường độ ánh sáng 160 µmol m-2 s-1, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ ngày/đêm 27oC/22oC ẩm độ tương đối trung bình 50% Vào ngày thứ 45, tiêu sinh trưởng giai đoạn in vitro thu hàm lượng số hợp chất lignan (phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin) xác định phương pháp HPLC với cột RP-18, pha động: MeOH-H2O, detector UV 220 nm so sánh với lignan chuẩn thời gian lưu 31, 35 48 phút 250 Cây diệp hạ châu đắng in vitro đưa điều kiện vườn ươm 32 ngày Mỗi công thức gồm 10 với lần lặp lại Cây trồng vào bầu đất chứa giá thể đất Lavamix (công ty TNHH TM & DV Hữu Thuận) trộn với perlite theo tỉ lệ 3:2 đặt điều kiện CO2 khơng khí, ánh sáng (60 µmol m-2 s-1 lúc giờ, 127 µmol m-2 s-1 lúc 12 giờ, 33 µmol m-2 s-1 lúc 16 giờ), nhiệt độ trung bình ngày 32,5oC, độ ẩm tương đối trung bình 54% Cây phun sương giảm dần từ lần/ngày, lần 15 phút ngưng phun sương từ ngày 15 trở thay tưới đẫm gốc lần/ngày vào lúc sáng 16 chiều Phân N-P-K (20-20-20) bổ sung thêm với lượng 0,2 g/l vào ngày thứ 22, 25 28, hình thức phun qua Các tiêu sinh trưởng đo vào ngày thứ 32 Các số liệu tiêu tăng trưởng xử lý thống kê phần mềm MSTATC (Đại học bang Michigan, Hoa Kỳ) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sự tăng cường CO2 trình ni cấy cho thấy tác động tích cực rõ rệt lên diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro phương pháp quang tự dưỡng Gia tăng khối lượng tươi khô vào ngày thứ 45 diệp hạ châu đắng nuôi cấy điều kiện nồng độ CO2 cao đạt tương ứng 880 mg/cây 89,4 mg/cây, khi, nuôi cấy điều kiện CO2 thấp đạt 550 mg/cây 68,8 mg/cây (bảng 1) Cây nuôi cấy nồng độ CO2 cao đạt tốc độ tăng trưởng tương đối đến 0,06 ngày-1, ni cấy điều kiện bình thường đạt 0,055 ngày-1 Đường kính thân, chiều dài rễ, chiều cao hàm lượng chlorophyll điều kiện nồng độ CO2 cao lớn so với nồng độ CO2 thấp (bảng 2) Tuy khác biệt nồng độ CO2 không tạo khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê số mở, kích thước diệp hạ châu đắng lớn cách rõ rệt tăng trưởng điều kiện nồng độ CO2 cao so với nồng độ CO2 thấp (hình 1) Ở điều kiện nồng độ CO2 1200 µmol mol-1, hình thái diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro không cho thấy có bất thường so với nuôi cấy quang tự dưỡng nồng độ CO2 thấp Những kết tương tự kết TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 249-256 số tác giả Nguyễn Trí Minh nnk (2008) [8] dâu tây (Fragaria annanassa Duch.), Burikam Chaiyasirisuwan (1991) [1] đu đủ, Solárová & Pospíšilová (1997) [11] thuốc cẩm chướng, Yoon et al (2008) [14] lan hồ điệp Bảng Gia tăng khối lượng tươi (GTKLT) khô (GTKLK), % chất khô (CK) tốc độ tăng trưởng tương đối (RGR) diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro nồng độ CO2 khác GTKLT GTKLK Số mở/cây RGR Công thức % CK (mg) (mg) (ngày-1 ) CO2 thấp 550 68,8 12,8 11,7 0,055 CO2 cao 880 89,4 10,4 10,7 0,060 ANOVAx ** ** * NS ** CV (%) 2,95 6,18 5,97 10,65 1,87 x NS, *, **: khơng khác biệt, khác biệt có ý nghĩa mức P ≤ 0,05 0,01 Bảng Số mở/cây, đường kính (ĐK) thân, chiều dài (CD) rễ, chiều cao (CC) cây, hàm lượng chlorophyll (Chl) a + b tỉ lệ chlorophyll a/b diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro nồng độ CO2 khác ĐK thân CD rễ CC Chl a + b Công thức Chl a/b (mm/cây) (mm/cây) (mm/cây) (mg/g khô) CO2 thấp 117 48 83 21,8 2,47 CO2 cao 153 63 117 27,4 2,38 ANOVAx ** ** * ** NS CV (%) 1,91 5,46 9,68 0,23 2,68 x NS, *, **: khơng khác biệt, khác biệt có ý nghĩa mức P ≤ 0,05 0,01 CO2 thấp CO2 cao Hình Cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy hai nồng độ CO2 khác ngày thứ 45 251 Pham Minh Duy et al cấy nồng độ CO2 thấp (7,55 µmol mol-1 h-1) Kết tương tự kết Nguyen et al (1999) [10] cà phê (Coffea arabusta) nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng, chứng minh nồng độ CO2 cao (1400 - 1500 µmol mol-1 ) làm tăng hiệu suất quang hợp cà phê in vitro Ngồi ra, nồng độ CO2 cao góp phần ức chế quang hô hấp [13], giúp tăng hiệu suất sử dụng ánh sáng giảm lãng phí lượng Bên cạnh đó, George & Davies (2008) [3] ghi nhận rằng, nồng độ CO2 cao (1-10%) ức chế hoàn toàn ảnh hưởng ethylen lên thực vật Như vậy, tăng trưởng diệp hạ châu đắng nồng độ CO2 cao thúc đẩy khả ức chế ethylen khơng hiệu lực Sự tăng trưởng vượt trội diệp hạ châu đắng điều kiện nồng độ CO2 cao khả tự dưỡng gia tăng dẫn đến việc sử dụng CO2 hiệu Theo Kozai & Kubota (2005) [6], nồng độ CO2 bình ni cấy giảm thấp giai đoạn chiếu sáng, điều làm ức chế khả quang hợp cây, hộp nuôi có màng trao đổi khí Với phòng ni có nồng độ CO2 cao, thiếu hụt CO2 bù đắp giúp cho cố định CO2 từ khơng khí điều kiện ni cấy quang tự dưỡng gia tăng, thể gia tăng hiệu suất quang hợp (Pn) theo thời gian ni cấy (hình 2) Vào ngày thứ 42, hiệu suất quang hợp nuôi cấy nồng độ CO2 cao 14,51 µmol mol-1 h-1, gấp gần hai lần so với nuôi 18 -1 14 12 -1 Pn (µmol mol h /cây) 16 10 15 20 25 30 35 40 45 Ngày CO2 thấp CO2 cao Hình Hiệu suất quang hợp (Pn ) diệp hạ châu đắng theo thời gian nuôi cấy hai nồng độ CO2 khác Khi xác định hàm lượng số hợp chất lignan diệp hạ châu đắng nuôi cấy hai điều kiện nồng độ CO2, chúng tơi nhận thấy có gia tăng rõ rệt hàm lượng phyllanthin (hơn hai lần từ 0,57 mg g-1 khô lên 1,27 mg g-1 khô) niranthin (tăng hai lần từ 1,05 mg g-1 khô lên 2,01 mg g-1 khơ), đó, hàm lượng hypophyllanthin tăng không đáng kể, từ 0,45 mg g-1 khô lên 0,51 mg g-1 khơ (hình 3) Sự gia tăng tích lũy hợp chất 252 lignan nồng độ CO2 cao, tăng cường quang hợp, tạo nhiều vật chất dạng sơ cấp phần vật chất chuyển hóa thành hợp chất thứ cấp diệp hạ châu đắng, lignan Stuhlfauth et al (2001) [12] đạt kết tương tự với Digitalis lanata, nuôi cấy điều kiện tăng cường CO2, Digitalis lanata cho sinh khối lượng cardenolide cao gấp 160% so với bình thường TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 249-256 Phyllanthin 2.01 Hypophyllanthin -1 Hàm lượng lignan (mg g khô) 2.5 Niranthin 1.5 1.27 1.05 0.57 0.5 0.51 0.45 CO2 thấp CO2 cao Cơng thức Nghiệm thức Hình Hàm lượng hợp chất lignan diệp hạ châu đắng hai nồng độ CO2 khác vào ngày thứ 45 Bảng Tỷ lệ sống, gia tăng khối lượng tươi (GTKLT) khô (GTKLK) tốc độ tăng trưởng tương đối (RGR) diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro nồng độ CO2 khác giai đoạn ex vitro Tỉ lệ sống (%) CO2 thấp 0,67 CO2 cao 0,92 ANOVAx ** CV (%) 5,15 x **: khác biệt có ý nghĩa mức P ≤ 0,01 Công thức GTKLT (mg) 544 948 ** 2,69 GTKLK (mg) 103,7 201,7 ** 7,51 RGR (ngày-1) 0,022 0,035 ** 8,43 Bảng Đường kính (ĐK) thân, gia tăng chiều dài rễ (CDR), gia tăng số mở/cây (SLM/C) số chồi diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro nồng độ CO2 khác giai đoạn ex vitro ĐK thân Gia tăng CDR (mm/cây) (mm/cây) CO2 thấp 1,14 68 CO2 cao 1,68 157 ANOVAx ** ** CV (%) 3,78 5,45 x **: khác biệt có ý nghĩa mức P ≤ 0,01 Cơng thức Tương tự giai đoạn in vitro, diệp hạ châu đắng công thức nồng độ CO2 cao tăng trưởng tốt so với công thức lại sau 32 ngày đưa vườn ươm (hình 4) Cây cơng thức nồng độ CO2 cao có tỉ lệ sống Gia tăng SLM/C 11,5 30,2 ** 17,50 Số chồi (chồi/cây) 1,1 4,5 ** 22,59 cao, đạt 92%, đồng thời tốc độ tăng trưởng tương đối đạt đến 0,035 ngày-1, công thức nồng độ CO2 thấp đạt tỷ lệ sống 67% tốc độ tăng trưởng tương đối thấp (0,022 ngày-1 ) (bảng 3) Sự gia tăng 253 Pham Minh Duy et al khối lượng tươi khô, chiều dài rễ, số mở/cây, đường kính thân số chồi công thức nồng độ CO2 cao giai đoạn in vitro lớn cách có ý nghĩa mặt thống kê đưa vườn ươm (bảng & 4) Ngoài ra, diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro điều kiện nồng độ CO2 cao phân nhánh nhiều đưa điều kiện ex vitro (bảng 4, hình 4), đạt đến 4,5 chồi/cây vào ngày thứ 32, công thức CO2 thấp gần không phân nhánh (số chồi trung bình 1,1 chồi/cây) Việc ni cấy in vitro điều kiện nồng độ CO2 cao giúp diệp hạ châu đắng tích CO2 thấp lũy tảng vật chất tốt, rễ thân phát triển mạnh khiến thích nghi tốt với điều kiện ex vitro Các kết tương tự kết Nguyễn Trí Minh nnk (2008) [8] đưa dâu tây nuôi cấy in vitro nồng độ CO2 400 µmol mol-1 1000 µmol mol-1 vườn ươm Solárová Pospíšilová (1997) [11] thu kết tương tự với thuốc hoa cẩm chướng, tác giả nhận định rằng, nhờ phát triển lớn tảng vật chất tích lũy tốt vào lúc đưa ex vitro mà tăng cường CO2 in vitro phát triển mạnh môi trường ex vitro CO2 cao Hình Cây diệp hạ châu đắng giai đoạn ex vitro ngày thứ 32 KẾT LUẬN Cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro môi trường giàu CO2 (1200 µmol mol-1) tăng trưởng tốt tạo nhiều hợp chất phyllanthin, hypophyllanthin niranthin so với nuôi cấy điều kiện CO2 khơng khí thấp (400 µmol mol-1) Khi đưa vườn ươm, 254 nuôi cấy in vitro nồng độ CO2 cao tiếp tục trì tăng trưởng tốt so với nuôi cấy in vitro nồng độ CO2 thấp Kết thí nghiệm ứng dụng vào sản xuất hợp chất thứ cấp in vitro diệp hạ châu đắng Lời cảm ơn: Đề tài hỗ trợ kinh phí từ Sở Khoa học Cơng nghệ Hồ Chí Minh TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 249-256 (2010-2012), với hỗ trợ trang thiết bị từ phòng Thí nghiệm Trọng điểm phía Nam Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Burikam S and Chaiyasirisuwan C., 1991 Effect of CO2 enrichment and sucrose concentrations on growth of papaya shoots cultured in vitro Nat Sci Suppl., 25: 5-8 Chirdchupunseree H and Pramyothin P., 2010 Protective activity of phyllanthin in ethanol-treated primary culture of rat hepatocytes J Ethnopharmacol., 218(1), 172-176 George E.F and Davies W., 2008 Effects of the Physical Environment In: George E F., Hall M A and Klerk G J De (eds.) Plant Propagation by Tissue Culture, 3rd Edition The Background, Springer, Dordrecht, Netherlands, 1: 424-455 Huang R L., Huang Y L., Ou J C., Chen C C., Hsu F L.and Chang C., 2003 Screening of 25 compounds isolated from Phyllanthus species for anti-human hepatitis B virus in vitro, Phytother Res., 17(5), 449-453 Kassuya C A., Silvestre A., Menezes-deLima O Jr., Marotta D M., Rehder V L and Calixto J B., 2006 Antiinflammatory and antiallodynic actions of the lignan niranthin isolated from Phyllanthus amarus: Evidence for interaction with platelet activating factor receptor, Eur J Pharmacol 546(1-3), 182-188 Kozai T and Kubota C., 2005 In vitro aerial environments and their effects on growth and development of plants In: Kozai T., Afreen F and Zobayed S M A (eds.) Photoautotrophic (Sugar-free medium) Micropropagation as a New Micropropagation and Transplant Pproduction System, Springer, Netherlands, pp: 31-51 Krithika R., Mohankumar R., Verma R J., Shrivastav P S., Mohamad I L., Gunasekaran P and Narasimhan S., 2009 Isolation, characterization and antioxidative effect of phyllanthin against CCl4-induced toxicity in HepG2 cell line Chem Biol Interact., 181(3), 351-358 Nguyễn Trí Minh, Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Văn Uyển, 2008 Ảnh hưởng cường độ ánh sáng hàm lượng CO2 lên khả sinh trưởng in vitro ex vitro dâu tây (Fragaria ananassa Duch.) Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 6(1): 233-239 Murugaiyaha V and Chan K L., 2009 Mechanisms of antihyperuricemic effect of Phyllanthus niruri and its lignan constituents J Ethnopharmacol., 124(2), 233-239 10 Nguyen T Q., Kozai T., Niu G and Nguyen V U., 1999 Photosynthetic characteristics of coffee (Coffea arabusta) plantlets in vitro in response to different CO2 concentrations and light intensities, Plant Cell Tiss Org Cult., 55: 133-139 11 Solárová J and Pospíšilová J., 1997 Effect of carbon dioxide enrichment during in vitro cultivation and acclimation to ex vitro conditions, Biol Plant., 39(1), 23-30 12 Stuhlfauth T., Klug K and Fock H P., 1987 The production of secondary metabolites by Digitalis lanata during CO2 enrichment and water stress, Phytochem., 26(10), 2735-2739 13 Taiz L and Zeiger E., 2002 Photosynthesis: Carbon Reactions In: Plant Physiolog, 3rd edition, Sinauer Associates, Sunderland, England, pp: 152-155 14 Yoon Y J., Mobin M., Hahn E J and Paek K Y., 2008 Impact of in vitro CO2 enrichment and sugar deprivation on acclimatory responses of Phalaenopsis plantlets to ex vitro conditions, Environ Exp Bot., 65(2-3), 183-188 255 Pham Minh Duy et al GROWTH PROMOTION AND SECONDARY METABOLITE ACCUMULATION OF Phyllanthus amarus CULTURED PHOTOAUTOTROPHICALLY UNDER CARBON DIOXIDE ENRICHED CONDITION Pham Minh Duy1, Nguyen Nhu Hien1, Hoang Ngoc Nhung1, Nguyen Du Sanh2, Nguyen Thi Quynh1* (1) (2) Institute of Tropibal Biology, VAST University of Science, Ho Chi Minh city SUMMARY Studying the effect of carbon dioxide on growth and secondary metabolite accumulation of Phyllanthus amarus has brought benefits not only to in vitro plant production, but also to secondary metabolite production from in vitro plants Leafy nodal cuttings of P amarus plants were cultured photoautotrophically with a density of explants/vessel The 370 ml Magenta GA-7 vessel had holes (Φ = cm) on the cap attached by Millipore filters with a pore size of 0.45 µm The culture medium, without sugar and vitamin, was composed of macro-elements 1/2 MS and micro-elements MS Explants were cultured for 45 days in the Percival growth chamber under CO2 concentration of 400 or 1200 µmol mol-1, PPF of 160 µmol m-2 s-1, photoperiod of 16 h d-1, day/night temperature of 27/22oC and relative humidity of 50% On day 45, the in vitro plants were transferred to the ex vitro stage for 32 days The growth of P amarus plants under high CO2 concentration was greater in both in vitro and ex vitro stages compared with those under low CO2 concentration Increased fresh and dry weights, shoot diameter and root length of plants treated with 1200 µmol mol-1 CO2 were larger Lignan compounds accumulated inside in vitro plants including phyllanthin, hypophyllanthin and niranthin (1.27, 0.51 and 2.01 mg g-1 dry weight, respectively) were all higher in high CO2 treatment comparing with those of low CO2 treatment (0.57, 0.45 and 1.05 mg g-1 dry weight, respectively) on day 45 Keywords: Phyllanthus amarus, carbon dioxide, net photosynthetic rate, photoautotrophy, secondary metabolites Ngày nhận bài: 21-6-2012 256 ... tiết ảnh hưởng yếu tố môi trường vật lý in vitro, đó, có nồng độ CO2 khơng khí lên tăng trưởng tích lũy hợp chất thứ cấp diệp hạ châu đắng điều kiện nuôi cấy mơ quang tự dưỡng PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN... thứ 45 diệp hạ châu đắng nuôi cấy điều kiện nồng độ CO2 cao đạt tương ứng 880 mg /cây 89,4 mg /cây, khi, nuôi cấy điều kiện CO2 thấp đạt 550 mg /cây 68,8 mg /cây (bảng 1) Cây nuôi cấy nồng độ CO2 cao... vậy, tăng trưởng diệp hạ châu đắng nồng độ CO2 cao thúc đẩy khả ức chế ethylen khơng hiệu lực Sự tăng trưởng vượt trội diệp hạ châu đắng điều kiện nồng độ CO2 cao khả tự dưỡng gia tăng dẫn đến