Nghiên cứu vai trò của khí CO2 lên sự tăng trưởng và tích lũy hợp chất thứ cấp của cây diệp hạ châu đắng in vitro không chỉ có lợi cho việc sản xuất cây in vitro, mà còn cho việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ cây in vitro. Đốt thân mang 1 lá của cây diệp hạ châu đắng được nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng với mật độ 4 đốt/hộp Magenta GA-7 (V = 370 ml). Nắp hộp có hai lỗ (Φ = 1 cm) và được dán màng Millipore (Φ = 0,45 µm). Môi trường nuôi cấy gồm khoáng đa lượng MS bằng 1/2, vi lượng MS, không bổ sung đường và vitamin. Đốt thân được nuôi 45 ngày trong buồng nuôi cây Percival ở một trong hai nồng độ CO2 (400 µmol mol-1 hoặc 1200 µmol mol-1 ), dưới cường độ ánh sáng 160 µmol m-2 s -1 , thời gian chiếu sáng 16 h d-1 , nhiệt độ trong giai đoạn chiếu sáng/tối là 27/22oC và ẩm độ tương đối là 50%. Cây in vitro ngày thứ 45 được đem ra vườn ươm trồng trong 32 ngày. Cây diệp hạ châu đắng tăng trưởng tốt hơn ở nồng độ CO2 cao trong cả giai đoạn in vitro lẫn ex vitro, gia tăng trọng lượng tươi và khô cũng như đường kính thân và chiều dài rễ đều lớn hơn ở công thức có 1200 µmol mol-1 CO2. Các hợp chất lignan của cây diệp hạ châu đắng in vitro, bao gồm phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin, có hàm lượng (tương ứng 1,27, 0,51 và 2,01 mg g-1 khô) đều cao hơn so với cây ở nồng độ CO2 thấp (tương ứng 0,57, 0,45 và 1,05 mg g-1 khô) ở ngày thứ 45.
Trang 1SỰ TĂNG TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY HỢP CHẤT THỨ CẤP
CỦA CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG NUÔI CẤY QUANG TỰ DƯỠNG
Phạm Minh Duy1, Nguyễn Như Hiến1, Hoàng Ngọc Nhung1
Nguyễn Du Sanh2, Nguyễn Thị Quỳnh1*
(1)
Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)qtnguyen_vn@yahoo.com
(2) Trường đại học Khoa học tự nhiên tp Hồ Chí Minh
TÓM TẮT: Nghiên cứu vai trò của khí CO2 lên sự tăng trưởng và tích lũy hợp chất thứ cấp của cây diệp
hạ châu đắng in vitro không chỉ có lợi cho việc sản xuất cây in vitro, mà còn cho việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ cây in vitro Đốt thân mang 1 lá của cây diệp hạ châu đắng được nuôi cấy in vitro quang tự
dưỡng với mật độ 4 đốt/hộp Magenta GA-7 (V = 370 ml) Nắp hộp có hai lỗ (Φ = 1 cm) và được dán màng Millipore (Φ = 0,45 µm) Môi trường nuôi cấy gồm khoáng đa lượng MS bằng 1/2, vi lượng MS, không bổ sung đường và vitamin Đốt thân được nuôi 45 ngày trong buồng nuôi cây Percival ở một trong hai nồng độ CO2 (400 µmol mol-1 hoặc 1200 µmol mol-1), dưới cường độ ánh sáng 160 µmol m-2 s-1, thời gian chiếu sáng 16 h d-1, nhiệt độ trong giai đoạn chiếu sáng/tối là 27/22oC và ẩm độ tương đối là 50%
Cây in vitro ngày thứ 45 được đem ra vườn ươm trồng trong 32 ngày Cây diệp hạ châu đắng tăng trưởng
tốt hơn ở nồng độ CO2 cao trong cả giai đoạn in vitro lẫn ex vitro, gia tăng trọng lượng tươi và khô cũng
như đường kính thân và chiều dài rễ đều lớn hơn ở công thức có 1200 µmol mol-1 CO2 Các hợp chất
lignan của cây diệp hạ châu đắng in vitro, bao gồm phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin, có hàm
lượng (tương ứng 1,27, 0,51 và 2,01 mg g-1 khô) đều cao hơn so với cây ở nồng độ CO2 thấp (tương ứng 0,57, 0,45 và 1,05 mg g-1 khô) ở ngày thứ 45
Từ khóa: Phyllanthus amarus, dioxit cacbon, hợp chất thứ cấp, hiệu suất quang hợp thuần, ex vitro, in
vitro, quang tự dưỡng
MỞ ĐẦU
Xu hướng phát triển hiện nay của nền y học
trên thế giới là quay về nghiên cứu và sử dụng
những loại thuốc bào chế từ các loài cây dược
liệu trong thiên nhiên Cây diệp hạ châu đắng
[Phyllanthus amarus (Shumm et Thonn.)] thuộc
họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), là một trong
những loài cây dược liệu đang rất được chú ý vì
những dược tính quan trọng như chống virus và
bảo vệ gan Loài cây này sống phổ biến ở các
vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của châu Phi,
châu Mỹ và châu Á, trong đó có Việt Nam Diệp
hạ châu đắng có chứa rất nhiều hợp chất thứ cấp
có dược tính, trong đó, quan trọng nhất là các
lignan chỉ có ở chi Phyllanthus như phyllanthin,
hypophyllanthin và niranthin Nhiều nghiên cứu
đã khẳng định, những loại lignan này có khả
năng ức chế kháng nguyên bề mặt HBsAg của
virus HBV [4], giảm đau [5], tăng loại thải uric
acid [9] và bảo vệ tế bào gan [7, 2]
Để phục vụ cho việc nghiên cứu và sản xuất
dược liệu ở Việt Nam, cây diệp hạ châu đắng đã
bắt đầu được đưa vào trồng với số lượng lớn
trên đồng ruộng ở một số tỉnh như Phú Yên và Lâm Đồng Mặc dù vậy, phương pháp canh tác bằng gieo hạt có hiệu quả chưa cao vì tỷ lệ nảy mầm thấp, chất lượng cây giống không đồng đều, hạt bị nhiễm bệnh Phương pháp nuôi cấy
mô có tiềm năng ứng dụng nhằm cung cấp một lượng lớn cây giống đồng đều, sạch bệnh, nhưng vẫn còn một số nhược điểm như cây con chịu sáng kém, thoát hơi nước nhanh, dễ chết khi ra vườn ươm khiến cho việc ứng dụng phương pháp này trong sản xuất vẫn còn hạn chế Nhiều nghiên cứu đã xác định rằng, những nhược điểm trên bắt nguồn từ việc cây được nuôi cấy trên môi trường có đường, trong bình kín, khiến cho cây quang hợp kém, có nhiều bất thường về sinh lý [6]
Phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng
là một phương pháp mới, ra đời vào những năm
80 của thế kỷ XX Phương pháp này cho phép
cây in vitro tự quang hợp và sinh trưởng trong điều kiện gần tương tự như ex vitro, giúp giảm
những bất thường về hình thái và sinh lý của cây mà phương pháp truyền thống thường gây
Trang 2ra Nuôi cấy mô quang tự dưỡng có tiềm năng
ứng dụng trong việc cung cấp nguồn giống cho
canh tác đối với cây diệp hạ châu đắng nói riêng
và cây dược liệu nói chung và xa hơn nữa là
trong việc sản xuất hợp chất thứ cấp in vitro từ
loài cây này Tuy nhiên, để tối ưu hóa quy trình
sản xuất, cần phải có những nghiên cứu chi tiết
về ảnh hưởng của các yếu tố môi trường vật lý
in vitro, trong đó, có nồng độ CO2 không khí lên
sự tăng trưởng và tích lũy hợp chất thứ cấp ở
cây diệp hạ châu đắng trong điều kiện nuôi cấy
mô quang tự dưỡng
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thí nghiệm gồm hai giai đoạn: (1) nuôi cấy
in vitro quang tự dưỡng trong 45 ngày và (2)
giai đoạn vườn ươm 32 ngày Vật liệu nuôi cấy
là đốt thân của cây diệp hạ châu đắng in vitro
mang một lá mở (khối lượng tươi trung bình 44
mg/đốt, khối lượng khô trung bình 6,25
mg/đốt) Các đốt thân được nuôi cấy trong hộp
Magenta GA-7 (Sigma, Hoa Kỳ) với mật độ 4
đốt/hộp Nắp hộp đục 2 lỗ (ф = 1 cm) giúp sự
trao đổi khí, mỗi lỗ được dán một màng
Millipore (Nihon Millipore Ltd., Nhật Bản) với
đường kính lỗ màng 0,45 µm Môi trường nuôi
cấy bao gồm khoáng đa lượng MS giảm 1/2, vi
lượng MS, bổ sung thêm 200 mg/l KNO3 và
200 mg/l KH2PO4 Thể tích môi trường ban đầu
là 55 ml/hộp và bổ sung thêm 15 ml/hộp vào
ngày thứ 27 Giá thể sử dụng là perlite (Công ty
Cell Green, Thuận An, Bình Dương) với khối
lượng 29,5 mg/hộp pH trước khi khử trùng là
5,8 Thí nghiệm gồm hai công thức về nồng độ
CO2 (thấp 400 µmol mol-1 hoặc cao 1200 µmol
mol-1), mỗi công thức gồm 3 hộp với 3 lần lặp
lại Các hộp được đặt trong tủ khí hậu Percival
(model PGC-9/2, Percival Scientific, Inc., Mỹ)
dưới cường độ ánh sáng 160 µmol m-2 s-1, thời
gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ ngày/đêm
là 27oC/22oC và ẩm độ tương đối trung bình là
50% Vào ngày thứ 45, các chỉ tiêu sinh trưởng
trong giai đoạn in vitro được thu và hàm lượng
một số hợp chất lignan (phyllanthin,
hypophyllanthin, niranthin) được xác định bằng
phương pháp HPLC với cột RP-18, pha động:
MeOH-H2O, detector UV 220 nm và so sánh
với các lignan chuẩn ở thời gian lưu 31, 35 và
48 phút
Cây diệp hạ châu đắng in vitro được đưa ra
điều kiện vườn ươm trong 32 ngày Mỗi công thức gồm 10 cây với 3 lần lặp lại Cây được trồng vào bầu đất chứa giá thể là đất sạch Lavamix (công ty TNHH TM & DV Hữu Thuận) trộn với perlite theo tỉ lệ 3:2 và đặt dưới điều kiện CO2 không khí, ánh sáng (60 µmol
m-2 s-1 lúc 8 giờ, 127 µmol m-2 s-1 lúc 12 giờ, 33 µmol m-2 s-1 lúc 16 giờ), nhiệt độ trung bình trong ngày 32,5oC, độ ẩm tương đối trung bình 54% Cây được phun sương giảm dần từ 5 lần/ngày, mỗi lần 15 phút cho đến khi ngưng phun sương từ ngày 15 trở đi và được thay thế bằng tưới đẫm gốc 2 lần/ngày vào lúc 8 giờ sáng và 16 giờ chiều Phân N-P-K (20-20-20) được bổ sung thêm với lượng 0,2 g/l vào các ngày thứ 22, 25 và 28, dưới hình thức phun qua
lá Các chỉ tiêu sinh trưởng được đo vào ngày thứ 32 Các số liệu về chỉ tiêu tăng trưởng được
xử lý thống kê bằng phần mềm MSTATC (Đại học bang Michigan, Hoa Kỳ)
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Sự tăng cường CO2 trong quá trình nuôi cấy
đã cho thấy tác động tích cực rõ rệt lên cây diệp
hạ châu đắng nuôi cấy in vitro bằng phương pháp
quang tự dưỡng Gia tăng khối lượng tươi và khô vào ngày thứ 45 của cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy trong điều kiện nồng độ CO2 cao đạt tương ứng là 880 mg/cây và 89,4 mg/cây, trong khi, cây nuôi cấy trong điều kiện CO2 thấp chỉ đạt
550 mg/cây và 68,8 mg/cây (bảng 1) Cây nuôi cấy ở nồng độ CO2 cao đạt tốc độ tăng trưởng tương đối đến 0,06 ngày-1, trong khi cây nuôi cấy
ở điều kiện bình thường chỉ đạt 0,055 ngày-1 Đường kính thân, chiều dài rễ, chiều cao cây và hàm lượng chlorophyll ở cây dưới điều kiện nồng độ CO2 cao đều lớn hơn so với cây ở nồng
độ CO2 thấp (bảng 2) Tuy sự khác biệt nồng độ
CO2 không tạo được sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê về số lá mở, kích thước lá ở cây diệp hạ châu đắng lớn hơn một cách rõ rệt khi cây tăng trưởng ở điều kiện nồng độ CO2 cao so với cây ở nồng độ CO2 thấp (hình 1)
Ở điều kiện nồng độ CO2 1200 µmol mol-1,
hình thái của cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro không cho thấy có sự bất thường nào so
với cây nuôi cấy quang tự dưỡng ở nồng độ CO2 thấp Những kết quả trên cũng tương tự như kết
Trang 3quả của một số tác giả Nguyễn Trí Minh và nnk
(2008) [8] trên cây dâu tây (Fragaria
annanassa Duch.), Burikam Chaiyasirisuwan
(1991) [1] trên cây đu đủ, Solárová &
Pospíšilová (1997) [11] trên cây thuốc lá và cây cẩm chướng, Yoon et al (2008) [14] trên cây lan hồ điệp
Bảng 1 Gia tăng khối lượng tươi (GTKLT) và khô (GTKLK), % chất khô (CK) và tốc độ tăng
trưởng tương đối (RGR) của cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro ở các nồng độ CO2 khác nhau
(mg)
GTKLK
Số lá mở/cây RGR
(ngày-1)
x
NS, *, **: không khác biệt, khác biệt có ý nghĩa ở mức P ≤ 0,05 và 0,01
Bảng 2 Số lá mở/cây, đường kính (ĐK) thân, chiều dài (CD) rễ, chiều cao (CC) cây, hàm lượng
chlorophyll (Chl) a + b và tỉ lệ chlorophyll a/b của cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro ở các
nồng độ CO2 khác nhau
Công thức ĐK thân
(mm/cây)
CD rễ (mm/cây)
CC cây (mm/cây)
Chl a + b (mg/g lá khô) Chl a/b
x
NS, *, **: không khác biệt, khác biệt có ý nghĩa ở mức P ≤ 0,05 và 0,01
Hình 1 Cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy ở hai nồng độ CO2 khác nhau ngày thứ 45
CO2 thấp CO2 cao
Trang 4Sự tăng trưởng vượt trội của cây diệp hạ
châu đắng ở điều kiện nồng độ CO2 cao có thể
do khả năng tự dưỡng của cây gia tăng dẫn đến
việc sử dụng CO2 hiệu quả hơn Theo Kozai &
Kubota (2005) [6], nồng độ CO2 trong bình nuôi
cấy giảm rất thấp trong giai đoạn chiếu sáng, và
điều này làm ức chế khả năng quang hợp của
cây, ngay cả khi hộp nuôi cây có màng trao đổi
khí Với phòng nuôi cây có nồng độ CO2 cao,
sự thiếu hụt CO2 sẽ được bù đắp và giúp cho sự
cố định CO2 từ không khí của cây trong điều
kiện nuôi cấy quang tự dưỡng gia tăng, thể hiện
bằng sự gia tăng hiệu suất quang hợp thuần (Pn)
của cây theo thời gian nuôi cấy (hình 2) Vào
ngày thứ 42, hiệu suất quang hợp thuần của cây
được nuôi cấy ở nồng độ CO2 cao là 14,51 µmol
mol-1 h-1, gấp gần hai lần so với cây được nuôi
cấy ở nồng độ CO2 thấp (7,55 µmol mol-1 h-1) Kết quả này tương tự như kết quả của Nguyen
et al (1999) [10] trên cây cà phê (Coffea arabusta) nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng, đã
chứng minh rằng nồng độ CO2 cao (1400 - 1500 µmol mol-1) làm tăng hiệu suất quang hợp thuần
của cây cà phê in vitro Ngoài ra, nồng độ CO2 cao còn góp phần ức chế quang hô hấp [13], giúp cây tăng hiệu suất sử dụng ánh sáng và giảm lãng phí năng lượng Bên cạnh đó, George
& Davies (2008) [3] cũng ghi nhận rằng, nồng
độ CO2 cao (1-10%) có thể ức chế hoàn toàn ảnh hưởng của ethylen lên thực vật Như vậy,
sự tăng trưởng của cây diệp hạ châu đắng ở nồng độ CO2 cao có thể được thúc đẩy do khả năng ức chế của ethylen không còn hiệu lực
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Ngày
-1 /c â
.
Hình 2 Hiệu suất quang hợp thuần (Pn) của cây diệp hạ châu đắng theo thời gian nuôi cấy ở hai nồng độ CO2 khác nhau
Khi xác định hàm lượng một số hợp chất
lignan trong cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy ở
hai điều kiện nồng độ CO2, chúng tôi nhận thấy
có sự gia tăng rõ rệt trong hàm lượng
phyllanthin (hơn hai lần từ 0,57 mg g-1 khô lên
1,27 mg g-1 khô) và niranthin (tăng hai lần từ
1,05 mg g-1 khô lên 2,01 mg g-1 khô), trong khi
đó, hàm lượng hypophyllanthin tăng không
đáng kể, từ 0,45 mg g-1 khô lên 0,51 mg g-1 khô
(hình 3) Sự gia tăng tích lũy các hợp chất
lignan có thể là do ở nồng độ CO2 cao, cây tăng cường quang hợp, tạo được nhiều vật chất ở dạng sơ cấp và một phần vật chất này ngay lập tức đã được chuyển hóa thành các hợp chất thứ cấp của cây diệp hạ châu đắng, đó là các lignan Stuhlfauth et al (2001) [12] cũng đạt được kết
quả tương tự với cây Digitalis lanata, khi nuôi
cấy dưới điều kiện tăng cường CO2, cây
Digitalis lanata cho sinh khối và lượng
cardenolide cao gấp 160% so với bình thường
Trang 51.05 0.57
2.01
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Nghiệm thức
-1 k hô)
Phyllanthin Hypophyllanthin Niranthin
Hình 3 Hàm lượng các hợp chất lignan của cây diệp hạ châu đắng
ở hai nồng độ CO2 khác nhau vào ngày thứ 45
Bảng 3 Tỷ lệ sống, gia tăng khối lượng tươi (GTKLT) và khô (GTKLK) và tốc độ tăng trưởng tương đối (RGR) của cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro ở các nồng độ CO2 khác nhau trong
giai đoạn ex vitro
Công thức Tỉ lệ sống
(%)
GTKLT (mg)
GTKLK (mg)
RGR (ngày-1)
x
**: khác biệt có ý nghĩa ở mức P ≤ 0,01
Bảng 4 Đường kính (ĐK) thân, gia tăng chiều dài rễ (CDR), gia tăng số lá mở/cây (SLM/C) và số chồi của cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro ở các nồng độ CO2 khác nhau trong giai đoạn ex vitro
Công thức ĐK thân
(mm/cây)
Gia tăng CDR (mm/cây) Gia tăng SLM/C
Số chồi (chồi/cây)
x
**: khác biệt có ý nghĩa ở mức P ≤ 0,01
Tương tự như giai đoạn in vitro, cây diệp hạ
châu đắng ở công thức nồng độ CO2 cao vẫn
tăng trưởng tốt hơn so với cây ở công thức còn
lại sau 32 ngày đưa ra vườn ươm (hình 4) Cây
ở công thức nồng độ CO2 cao có tỉ lệ sống rất
cao, đạt 92%, đồng thời tốc độ tăng trưởng tương đối cũng đạt đến 0,035 ngày-1, trong khi cây ở công thức nồng độ CO2 thấp chỉ đạt tỷ lệ sống 67% và tốc độ tăng trưởng tương đối cũng thấp hơn (0,022 ngày-1) (bảng 3) Sự gia tăng
Công thức
Trang 6khối lượng tươi và khô, chiều dài rễ, số lá
mở/cây, đường kính thân và số chồi của cây ở
công thức nồng độ CO2 cao trong giai đoạn in
vitro đều lớn hơn một cách có ý nghĩa về mặt
thống kê khi đưa ra vườn ươm (bảng 3 & 4)
Ngoài ra, cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy in
vitro trong điều kiện nồng độ CO2 cao phân
nhánh rất nhiều khi đưa ra điều kiện ex vitro
(bảng 4, hình 4), đạt đến 4,5 chồi/cây vào ngày
thứ 32, trong khi cây ở công thức CO2 thấp gần
như không phân nhánh (số chồi trung bình là
1,1 chồi/cây)
Việc nuôi cấy in vitro trong điều kiện nồng
độ CO2 cao đã giúp cây diệp hạ châu đắng tích
lũy một nền tảng vật chất tốt, bộ rễ và thân lá phát triển mạnh khiến cây có thể thích nghi tốt
hơn với điều kiện ex vitro Các kết quả này cũng
tương tự như kết quả của Nguyễn Trí Minh và nnk (2008) [8] khi đưa cây dâu tây đã nuôi cấy
in vitro ở các nồng độ CO2 400 µmol mol-1 và
1000 µmol mol-1 ra vườn ươm Solárová Pospíšilová (1997) [11] cũng thu được kết quả tương tự với cây thuốc lá và cây hoa cẩm chướng, và các tác giả này cũng nhận định rằng, chính nhờ sự phát triển lớn hơn và nền tảng vật
chất tích lũy tốt hơn vào lúc đưa ra ex vitro mà
các cây được tăng cường CO2 in vitro đã phát triển mạnh hơn trong môi trường ex vitro
Hình 4 Cây diệp hạ châu đắng ở giai đoạn ex vitro ngày thứ 32
KẾT LUẬN
Cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro
trong môi trường giàu CO2 (1200 µmol mol-1)
tăng trưởng tốt hơn và tạo được nhiều hợp chất
phyllanthin, hypophyllanthin và niranthin hơn so
với cây nuôi cấy ở điều kiện CO2 không khí thấp
(400 µmol mol-1) Khi đưa ra vườn ươm, cây
được nuôi cấy in vitro ở nồng độ CO2 cao tiếp tục duy trì sự tăng trưởng tốt hơn so với cây nuôi
cấy in vitro ở nồng độ CO2 thấp Kết quả của thí nghiệm có thể ứng dụng vào sản xuất hợp chất
thứ cấp in vitro ở cây diệp hạ châu đắng
Lời cảm ơn: Đề tài được hỗ trợ kinh phí từ Sở
Khoa học và Công nghệ tp Hồ Chí Minh
CO2 thấp CO2 cao
Trang 7(2010-2012), cùng với sự hỗ trợ về trang thiết bị
từ phòng Thí nghiệm Trọng điểm phía Nam về
Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học nhiệt
đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Burikam S and Chaiyasirisuwan C., 1991
Effect of CO2 enrichment and sucrose
concentrations on growth of papaya shoots
cultured in vitro Nat Sci Suppl., 25: 5-8.
2 Chirdchupunseree H and Pramyothin P.,
2010 Protective activity of phyllanthin in
ethanol-treated primary culture of rat
hepatocytes J Ethnopharmacol., 218(1),
172-176
3 George E.F and Davies W., 2008 Effects
of the Physical Environment In: George E
F., Hall M A and Klerk G J De (eds.)
Plant Propagation by Tissue Culture, 3rd
Edition The Background, Springer,
Dordrecht, Netherlands, 1: 424-455
4 Huang R L., Huang Y L., Ou J C., Chen C
C., Hsu F L.and Chang C., 2003 Screening
of 25 compounds isolated from Phyllanthus
species for anti-human hepatitis B virus in
vitro, Phytother Res., 17(5), 449-453
5 Kassuya C A., Silvestre A.,
Menezes-de-Lima O Jr., Marotta D M., Rehder V L
and Calixto J B., 2006 Antiinflammatory
and antiallodynic actions of the lignan
niranthin isolated from Phyllanthus amarus:
Evidence for interaction with platelet
activating factor receptor, Eur J
Pharmacol 546(1-3), 182-188
6 Kozai T and Kubota C., 2005 In vitro
aerial environments and their effects on
growth and development of plants In:
Kozai T., Afreen F and Zobayed S M A
(eds.) Photoautotrophic (Sugar-free
medium) Micropropagation as a New
Micropropagation and Transplant
Pproduction System, Springer, Netherlands,
pp: 31-51
7 Krithika R., Mohankumar R., Verma R J., Shrivastav P S., Mohamad I L., Gunasekaran P and Narasimhan S., 2009 Isolation, characterization and antioxidative effect of phyllanthin against CCl4-induced toxicity in HepG2 cell line Chem Biol Interact., 181(3), 351-358
8 Nguyễn Trí Minh, Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Văn Uyển, 2008 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng và hàm lượng CO2 lên
khả năng sinh trưởng in vitro và ex vitro cây dâu tây (Fragaria ananassa Duch.) Tạp chí
Công nghệ sinh học, 6(1): 233-239
9 Murugaiyaha V and Chan K L., 2009 Mechanisms of antihyperuricemic effect of
Phyllanthus niruri and its lignan constituents J Ethnopharmacol., 124(2), 233-239
10 Nguyen T Q., Kozai T., Niu G and Nguyen
V U., 1999 Photosynthetic characteristics
of coffee (Coffea arabusta) plantlets in vitro
in response to different CO2 concentrations and light intensities, Plant Cell Tiss Org Cult., 55: 133-139
11 Solárová J and Pospíšilová J., 1997 Effect
of carbon dioxide enrichment during in vitro cultivation and acclimation to ex vitro
conditions, Biol Plant., 39(1), 23-30
12 Stuhlfauth T., Klug K and Fock H P.,
1987 The production of secondary
metabolites by Digitalis lanata during CO2 enrichment and water stress, Phytochem., 26(10), 2735-2739
13 Taiz L and Zeiger E., 2002 Photosynthesis: Carbon Reactions In: Plant Physiolog, 3rd edition, Sinauer Associates, Sunderland, England, pp: 152-155
14 Yoon Y J., Mobin M., Hahn E J and Paek
K Y., 2008 Impact of in vitro CO2 enrichment and sugar deprivation on acclimatory responses of Phalaenopsis
plantlets to ex vitro conditions, Environ
Exp Bot., 65(2-3), 183-188
Trang 8GROWTH PROMOTION AND SECONDARY METABOLITE ACCUMULATION
OF Phyllanthus amarus CULTURED PHOTOAUTOTROPHICALLY UNDER
CARBON DIOXIDE ENRICHED CONDITION Pham Minh Duy1, Nguyen Nhu Hien1, Hoang Ngoc Nhung1,
Nguyen Du Sanh2, Nguyen Thi Quynh1*
(1) Institute of Tropibal Biology, VAST (2)
University of Science, Ho Chi Minh city
SUMMARY
Studying the effect of carbon dioxide on growth and secondary metabolite accumulation of Phyllanthus amarus has brought benefits not only to in vitro plant production, but also to secondary metabolite production from in vitro plants Leafy nodal cuttings of P amarus plants were cultured photoautotrophically with a
density of 4 explants/vessel The 370 ml Magenta GA-7 vessel had 2 holes (Φ = 1 cm) on the cap attached by
2 Millipore filters with a pore size of 0.45 µm The culture medium, without sugar and vitamin, was composed of macro-elements 1/2 MS and micro-elements MS Explants were cultured for 45 days in the Percival growth chamber under CO2 concentration of 400 or 1200 µmol mol-1, PPF of 160 µmol m-2 s-1, photoperiod of 16 h d-1, day/night temperature of 27/22oC and relative humidity of 50% On day 45, the in vitro plants were transferred to the ex vitro stage for 32 days The growth of P amarus plants under high CO2
concentration was greater in both in vitro and ex vitro stages compared with those under low CO2 concentration Increased fresh and dry weights, shoot diameter and root length of plants treated with 1200 µmol mol-1 CO2 were larger Lignan compounds accumulated inside in vitro plants including phyllanthin,
hypophyllanthin and niranthin (1.27, 0.51 and 2.01 mg g-1 dry weight, respectively) were all higher in high
CO2 treatment comparing with those of low CO2 treatment (0.57, 0.45 and 1.05 mg g-1 dry weight, respectively) on day 45
Keywords: Phyllanthus amarus, carbon dioxide, net photosynthetic rate, photoautotrophy, secondary
metabolites
Ngày nhận bài: 21-6-2012