Sử dụng phương pháp phân lập và kiểm tra tính kháng đồng thời của Trichoderma đối với các chủng nấm trong môi trường PGA, chúng tôi đã nghiên cứu khả năng kháng của các chủng Trichoderma đối với một số mầm bệnh nấm của thanh long. Kết quả nghiên cứu cho thấy các chủng Trichoderma T10, T14, T24 có sức đề kháng tốt với mầm bệnh nấm NBT01, NBT03 và NBT04 được phân lập từ các mẫu bệnh thối của thanh long, thân cây khô và đốm nâu. Các bào tử của các chủng Trichoderma này không chỉ chứng minh khả năng kháng các mầm bệnh nấm trong môi trường PGA mà còn trên mô trái cây trong cả hai trường hợp: bệnh nấm đồng thời và mô trái cây đã cho thấy hội chứng.
Journal of Thu Dau Mot university, No4(6) – 2012 NGHIEÂN CỨU KHẢ NĂNG PHÒNG, TRỊ MỘT SỐ NẤM BỆNH Ở THANH LONG BẰNG TRICHODERMA Trương Minh Tường(1), Trần Ngọc Hùng(2) (1) Trường Đại học Nông Lâm TP HCM, (2) Trường Đại học Thủ Dầu Một TÓM TẮT Sử dụng phương pháp phân lập thử đối kháng đồng thời Trichoderma với chủng nấm bệnh môi trường PGA, nghiên cứu khả đối kháng chủng Trichoderma với số nấm bệnh long Kết nghiên cứu cho thấy chủng Trichoderma T10, T14, T24 có khả đối kháng tốt với nấm bệnh NBT01, NBT03 NBT04 phân lập từ mẫu long bò bệnh thối trái, héo dây đồng tiền Bào tử chủng Trichoderma khả đối kháng với nấm bệnh môi trường PGA mà đối kháng tốt mô long hai trường hợp: gây nhiễm nấm bệnh đồng thời mô long có biển phát bệnh Từ khóa: nấm bệnh, khả đối kháng, chủng Trichoderma * Đặt vấn đề nhiều nơi Trong đó, liệu pháp đặc trò bệnh long phương pháp sinh Thanh long loại học hướng nhà nghiên cứu trái xuất có giá trò kinh tế cao quan tâm Theo số liệu thống kê đầu năm 2011, ước tính diện tích trồng long Trichoderma có khả đối kháng nước vào khoảng 21.000 ha; đó, riêng tốt với nhiều loại nấm bệnh thực vật Việc sử tỉnh Bình Thuận chiếm khoảng 72%, số dụng Trichoderma để phòng trừ bệnh lại trồng số tỉnh miền Tây Nam trồng hướng nghiên cứu Bộ Long An, Tiền Giang nhà khoa học quan tâm việc tìm giải pháp thay thuốc hóa học Trong báo Cách phòng, trò loại nấm bệnh này, sử dụng phương pháp phân long chủ yếu sử dụng lập thử đối kháng đồng thời thuốc hóa học Biện pháp không Trichoderma với chủng nấm bệnh ảnh hưởng đến sức khỏe người sử dụng môi trường PGA để nghiên cứu khả đối dư lượng thuốc tồn dư mà kháng chủng Trichoderma với làm giảm giá trò trái long Đặc số nấm bệnh long biệt có chủ trương mở Vật liệu phương pháp rộng xuất sang thò trường khó tính Nhật, Mỹ châu Âu Sản xuất 2.1 Vật liệu long theo tiêu chuẩn VietGap Giống Trichoderma sp phòng thí GlobalGap áp dụng rộng rãi nghiệm chi nhánh Công ty TNHH Gia 16 Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số 4(6) - 2012 Tường tỉnh Bình Dương cung cấp; gồm 13 tránh tượng nhiễm chéo phát tán chủng, ký hiệu T05, T06, T07, T08, T09, mần bệnh khắp nơi T10, T14, T16, T18, T19, T20, T24, T25 – Quan saùt ngày đánh giá biểu Thanh long bệnh long bò bệnh gây bệnh so bệnh đồng tiền, thối trái xanh bệnh héo sánh với đặc điểm bệnh tự nhiên dây thu nhận xã Qn Long huyện Chợ 2.2.2 Khảo sát khả đối kháng Gạo, tỉnh Tiền Giang đồng thời Trichoderma với chủng nấm bệnh môi trường PGA Môi trường PGA: khoai tây (200g), glucose (20g), agar (20g), nước cất vừa đủ (1 lít) – Cấy nấm bệnh chủng nấm 2.2 Phương pháp Trichoderma điểm đối xứng qua 2.2.1 Phân lập kiểm tra khả tâm đóa petri, điểm cấy cách mép đóa 1,5cm Đóa đối chứng đóa cấy gây bệnh chủng nấm bệnh riêng nấm bệnh Ủ nhiệt độ phòng, quan Phân lập nấm bệnh: sát ngày ghi nhận kết – Chọn mô thực vật bò bệnh để – Sau tiến hành thử đối kháng, phân lập Không sử dụng mô bò theo dõi đóa cấy hai bệnh lâu bề mặt mô bệnh vòng tròn đối kháng Trichoderma thường có nhiều nấm vi khuẩn hoại nấm bệnh tiếp xúc sinh phát triển – Công thức tính hiệu ức chế theo – Rửa mẫu thân nước Soytong (1988): H = (Ddc – D)/ Ddc x 100 để loại bỏ đất bụi tạp chất khác [H: Hiệu ức chế (%) Khử trùng bề mặt thân cồn D: Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh trung etyl 70% bình đóa đối kháng (cm) – Dùng dụng cụ khử trùng cắt Ddc: Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh trung miếng cấy nhỏ (khoảng × mm) bình đóa đối chứng (cm) từ phần ranh giới mô khỏe mô 2.2.3 Các phương pháp khác bệnh, sau cấy lên môi trường PGA, đặt – Khảo sát khả đối kháng miếng cấy gần mép đóa Trichoderma chủng nấm bệnh – Kiểm tra đóa cấy hàng ngày, phát triển trước môi trường PGA tản nấm phát triển từ mẫu thực vật – Khảo sát khả đối kháng nhiễm bệnh, cấy truyền chúng sang môi Trichoderma với chủng nấm bệnh trường PGA mô long Kiểm tra khả gây bệnh: Kết – Phun quét bào tử nấm bệnh lên 3.1 Phân lập nấm bệnh long bệnh Tiến hành đồng thời mô lành mô bò 3.1.1 Phân lập, làm gây vết thương Chúng lấy mẫu long khác nhiều khu vườn khác – Che chắn, bao gói cẩn thận để bào tử Trên sở mẫu bệnh lấy từ quả, thân bò không lây lan sang khác nhằm 17 Journal of Thu Dau Mot university, No4(6) – 2012 bệnh long Chúng tiến Bào tử có màu xám, nằm xen lẫn với hành phân lập môi trường chọn lọc có khuẩn ty Khuẩn lạc có đường kính 9,0 cm bổ sung kháng sinh, nuôi cấy nhiệt độ sau 24 nuôi cấy phòng Các chủng sau phân lập làm NBT04: Khuẩn lạc hình tròn Khuẩn ty môi trường PGA Kết thu dạng tơ, mọc thành lớp chồng lên chủng nấm bệnh, ký hiệu: mẫu nhau, màu trắng xám Không thấy bào tử nấm bệnh thối trái xanh phân lập nấm rõ ràng Khuẩn lạc có đường kính 2,3 cm bệnh NBT01, bệnh vàng héo dây NBT03 sau 24 nuôi cấy bệnh đồng tiền NBT02, NBT04 Bước đầu ta dự đoán tác nhân gây bệnh thối trái xanh NBT01, bệnh vàng héo dây NBT03 bệnh đồng tiền NBT02 NBT04 gây 3.1.2 Kiểm tra khả gây bệnh giống nấm bệnh phân lập Tiến hành gây bệnh trực tiếp lên trái A nhánh long bào tử nấm B bệnh thu nuôi cấy môi trường PGA Sau ngày, thu kết quả: – NBT01: vùng bệnh bò thối, màu xám đen, vùng mô xung quanh mô thối có màu vàng, lan rộng vùng mô khác, có bào tử màu đen – NBT03: vết thương phồng lên, quang C D Hình 1: Các loại nấm bệnh phân lập (A) NBT01; (B) NBT02; (C) NBT03; (D) NBT04 vết thương xì mủ màu vàng – NBT04: vùng bệnh thối rộng hình mắt cua, xung quanh có màu vàng, có NBT01: Khuẩn lạc hình tròn Khuẩn màu đen ty hình sợi, mọc thành lớp Màu Các chủng nấm bệnh NBT01, NBT03 trắng Bào tử có dạng túi, màu đen Sau NBT04 có khả gây bệnh lại 24 nuôi cấy, khuẩn lạc có đường kính long có triệu chứng tương tự 8,6 cm với mẫu dùng để phân lập ban đầu Điều NBT02: Khuẩn lạc hình tròn không chứng tỏ NBT01, NBT03 NBT04 đều, có nhiều vân gỗ Khuẩn ty mọc sát tác nhân gây bệnh mặt thạch, màu trắng kem Bào tử màu long NBT02 không gây bệnh mẫu trắng Khuẩn lạc có đường kính 2,2 cm sau dây trái long Đây 24 nuôi cấy tạp nhiễm trình phân lập NBT03: Khuẩn lạc hình hoa, chia loại nấm hoại sinh nên thành nhiều thùy Khuẩn ty dạng sợi, mọc không lựa chọn loài nấm thành lớp, nhô cao, màu trắng ngà trình nghiên cứu 18 Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số 4(6) - 2012 Hình 2: Mẫu bệnh tự nhiên dùng để phân lập.(A) bệnh thối trái xanh (B) bệnh thối vàng dây (C) bệnh đồng tiền; long gây bệnh nhân tạo (D) NBT01 gây bệnh thối trái xanh (E) NBT03 gây bệnh thối vàng dây (F) NBT04 gây bệnh đồng tiền 3.2 Khảo sát hiệu đối kháng bệnh: NBT01, NBT03 NBT04 có khả chủng Trichoderma với gây bệnh long cấy đồng thời nấm chủng nấm bệnh môi trường PGA bệnh Trichoderma lên đóa petri, ủ nhiệt độ phòng Theo dõi ngày 3.2.1 Đối kháng đồng thời quan sát đối kháng Trichoderma với Dùng 13 chủng Trichoderma Chi loại nấm bệnh Kết thể nhánh công ty TNHH Gia Tường cung cấp để hình 3, 4, thử nghiệm tính đối kháng với chủng nấm 110 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T14 T16 T18 T19 T20 T24 T25 100 Hiệu ức chế (%) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Thời gian (ngày) Hình 3: Biểu đồ hiệu ức chế chủng Trichoderma với chủng NBT01 Biểu đồ hình cho thấy, phần lớn ngoại trừ T06, chủng Trichoderma chủng Trichoderma thể tính đối lại có hiệu suất ức chế 50% Ở ngày kháng rõ ràng sau ngày Ở ngày thứ 3, thứ chủng T20 có tượng bò nấm bệnh 19 Journal of Thu Dau Mot university, No4(6) – 2012 đối kháng ngược lại (hiệu đối kháng chủng lại Dựa vào khả đối giảm) Tuy nhiên, nhận thấy vào kháng mạnh thời gian ngắn nhất, ngày thứ chủng T10, T14, T18, T24 nhận thấy chủng T10, T14, có hiệu xuất ức chế 50% thể T18 T24 có khả ứng dụng vào sản tính đối kháng rõ ràng, trội so với 110.00 100.00 90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 xuaát Hiệu ức chế (%) T5 T6 T7 T8 T9 T10 T14 T16 T18 T19 T20 T24 T25 Thời gian (ngày) Hình 4: Biểu đồ hiệu ức chế chủng Trichoderma với chủng NBT03 Biểu đồ hình cho thấy, phần lớn chủng T10, T14, T16, T18, T24 T25 chủng Trichoderma thể tính đối có hiệu xuất ức chế 50% thể kháng rõ ràng sau ngày Ở ngày thứ 3, tính đối kháng rõ ràng, trội so với ngoại trừ T06, chủng Trichoderma chủng lại Dựa vào khả đối lại có hiệu suất ức chế 50% Ở kháng mạnh thời gian ngắn nhất, ngày thứ 4, chủng T06, T20 T09 có nhận thấy chủng có khả tượng bò nấm bệnh đối kháng ngược (hiệu ứng dụng vào sản xuất đối kháng giảm) Vào ngày thứ caùc 120.00 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T14 T16 T18 T19 T20 T24 T25 Hiệu ức chế (%) 100.00 80.00 60.00 40.00 20.00 0.00 Thời gian (ngày) Hình 5: Biểu đồ hiệu ức chế chủng Trichoderma với chủng NBT04 20 Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số 4(6) - 2012 Biểu đồ hình cho thấy, phần lớn chủng Trichoderma chưa thể tính đối 100% kháng với chủng nấm bệnh Đây điều kiện để lựa kháng rõ ràng ngày, ngày Ở ngày thứ chọn dòng cụ thể để tiếp tục sử dụng 4, chủng T10, T14, T24 T25 có hiệu xuất ức chế 100% thể tính đối kháng rõ ràng, trội so với chủng lại cho việc nghiên cứu Điều nói lên tính chuyên biệt nấm Trichoderma việc đối kháng với loại nấm bệnh cụ thể Trên sở dựa vào khả đối kháng Một dòng nấm có khả đối kháng cao mạnh thời gian ngắn nhất, nhận thấy chủng T10, T14, T24 T25 có với loại nấm bệnh, loại trồng hay vùng sinh thái chưa hẳn có khả ứng dụng vào sản xuất hiệu sử dụng cho điều kiện khác Khi so sánh chủng Trichoderma với nhau, nhận thấy phần (Lavell Spain, 2001) Đây hạn chế việc sử dụng sản phẩm sinh học so với sản phẩm thuốc hóa học Vì để nâng lớn chúng đối kháng tất chủng nấm bệnh mức độ đối kháng khác cao hiệu kiểm soát sinh học chế phẩm Trichoderma cần phải phối trộn nhiều Có chủng không đối kháng với NBT03 (T06), kháng yếu với NBT01 NBT04 (T05 T08) Trong số chủng Trichoderma có chủng Trichoderma khác Qua kết thu được, chọn khả đối kháng, T10, T14 T24 có chủng Trichoderma T10, T14 T24 có tính đối kháng mạnh chủng khác với hiệu ức chế phần lớn đạt từ 70 - khả đối kháng mạnh với loại nấm bệnh để tiếp tục thí nghiệm Hình 6: Đối kháng chủng Tricho-derma với nấm bệnh môi trường PGA 3.2.2 Đối kháng bào tử Trichoderma với nấm bệnh sau phát triển Sau nuôi cấy nấm bệnh ta tiến hành phun dòch bào tử trực tiếp lên bề mặt khuẩn lạc nấm bệnh Kết thu thể bảng Trichoderma NBT01 NBT03 Khả Th T10 + T14 + T24 + T10 + T14 + T24 + 21 Trichoderma Trichoderma bệnh t ết chế Journal of Thu Dau Mot university, No4(6) – 2012 NBT04 T10 + T14 + T24 + Nhận xét: Các chủng Trichoderma T10, Trichoderma t nấm bệnh NBT01, NBT03, NBT04 T14 T24 có khả đối kháng với nấm bệnh phát triển Hình 7: Đối kháng Trichoderma nấm bệnh NBT03 phát triển (A) Đối chứng; (B) Có xử lí Trichoderma 3.3 Kết thử nghiệm đối kháng long hai trường hợp: Trichoderma bào tử Trichoderma với nấm bệnh mô nấm bệnh gây nhiễm đồng thời; xử lí long Trichoderma sau mô long có biểu bệnh Sau ngày quan sát, Tiến hành thử nghiệm khả đối kháng bào tử kết thu thể bảng chủng Trichoderma với nấm bệnh mô Bảng 2: Khả đối kháng đồng thời bào tử Trichoderma với nấm bệnh Xứ lý Trichoderma đồng thời Xử lý Trichoderma có biểu bệnh - Trên thân: Vết thương lan rộng, mô xung quanh bị thối - Trên trái: Vết thương lan rộng, bị thối thành đốm lớn - Trên thân: Vết thương lành lại, mơ xung quanh bình thường - Trên trái: Vết thương lành lại, tạo sẹo nhỏ NBT03 - Trên thân: Vết thương xưng phù lan rộng - Trên trái: Vết thương xưng phù, bị ghẻ đốm - Trên thân: Vết thương lành lại tạo sẹo - Trên trái: Vết thương lành lại - Trên thân: Vết thối không lan sau thời gian khơ lại - Trên trái: Vết bệnh ngưng phát triển khô lại - Trên thân: Vết thương xưng phù tạo sẹo - Trên trái: Vết thương xưng phù khơ NBT04 - Trên thân: Vết thương lan rộng có hình mắt cua, thối đen, xung quanh bị vàng - Trên trái: bị thối giống đồng tiền - Trên thân: Vết thương lành lại, tạo sẹo nhỏ - Trên trái: Vết thương lành lại, tạo sẹo nhỏ Nấm bệnh NBT01 Đặc điểm lô đối chứng - Trên thân: Vết thương khô lại, mô xung quanh vàng - Trên trái: Vết thương khô lại, tạo sẹo Nhận xét: Kết cho thấy bào tử có biểu bệnh Đối với mô chủng Trichoderma có khả đối long có biểu bệnh, nhận kháng ức chế tốt với nấm bệnh không thấy, thạch PGA mà mô Trichoderma, vết bệnh ngừng lây lan long Khi xử lí đồng thời, dần khô lại Trichoderma kí sinh giết Trichoderma phát triển ức chế không cho chết nấm bệnh, ngăn không cho nấm bệnh nấm bệnh phát triển, mô long không tiếp tục phát triển Hiện tượng vết thương 22 sau xử lí với chế phẩm Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số 4(6) - 2012 khô lại cho thấy tác dụng đối – Hầu hết chủng Trichoderma kháng giết chết nấm bệnh, Trichoderma nghiên cứu có khả đối kháng với có tác dụng kích thích làm lành vết nấm bệnh môi trường thạch PGA thương Bào tử chủng Trichoderma Trong đó, chủng T10, T14 T24 đối có tiềm sản xuất tạo chế kháng mạnh (100% sau ngày) phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh – Các chủng Trichoderma có khả Kết luận đối kháng với nấm bệnh mô long nên ứng dụng để phòng – Nấm bệnh NBT01, NBT03, NBT04 trò nấm bệnh long tác nhân gây bệnh thối xanh, vàng héo dây bệnh đồng tiền * RESEARCH OF PREVENTION AND TREATMENT OF SOME FUNGAL PATHOGENS IN DRAGON FRUIT BY USING TRICHODERMA Truong Minh Tuong(1), Tran Ngoc Hung(2) (1) Nong Lam University, (2) Thu Dau Mot University ABSTRACT Using the method of isolating and testing the simultaneous resistance of Trichoderma to fungal strains in PGA environment, we studied the resistance capability of Trichoderma strains to some fungal pathogens of dragon fruit Research results showed that Trichoderma strains T10, T14, T24 have good resistance to fungal pathogens NBT01, NBT03 and NBT04 which were isolated from diseased samples of rotten dragon fruit, withered stem and brown spots Spores of these Trichoderma strains not only demonstrate the resistance to fungal pathogens in PGA environment but also on the fruit’s tissue in both cases: simultaneous fungal diseases and the fruit’s tissue has shown syndrome Keywords: fungal disease, resistance capability, Trichoderma strains TÀI LIỆU THAM KHAÛO [1] Lester W Burgess, Len Tesoriero, Timothy E Knight Phan Thúy Hiền (2009), Cẩm nang chuẩn đoán bệnh Việt Nam, Australian Centre for International Agricultural Research [2] Abou-Zeid A.M., Altalhi A.D and Abd El-Fattah R.I (2008), Fungal control of pathogenicfungi isolated from some wild plants in Taif Governorate, Saudi Arabia, Mal J Microbiol., Vol 4: 30-39 [3] Antal, Z., L., Manczinger, G Szakaacs, R.P Tengerdy and L Ferenczy (2000), Colony growth, in vitro antagonism and secretion of extracellular enzymes in coldtolerant strains of Trichoderma species, Mycol Res., 104: 545-549 [4] A Sivan, Y elad and Amal A Al-Mousa (2008), Evaluation of antifungal activity of vitavax and Trichoderma viride against two wheat root rot pathogens, Journal of applied Biosciences, Vol 6: 140-149 23 Journal of Thu Dau Mot university, No4(6) – 2012 [5] Emma W Gachomo and Simeon O Kotchoni (2008), The use of Trichoderma harzianum and T viride as potential biocontrol agents against peanut microflora and their effectiveness reducing aflatoxin contamination of infected kernels, Biotechnology, Vol 7:439-447 [6] Enrique Monte (2001), Understanding Trichoderma: between biotechnology and Microbial ecology, Int Microbiol, Vol 4: 1-4 [7] Kullnig-Gradinger, C.M., G Szakacs and C.P Kubicek (2002), Phylogeny and evolution of the fungal genus Trichoderma-a multigene approach, Mycol Res., 106: 757-767 [8] Robert E.paull, Dragon Fruit, Department of Tropical plant and soil sciences, University of Hawaii at Manoa, Honolulu, HI [9] Ronghua Cao, Xiaoguang liu, Kexiang Gao, Kurt Mendgen, zhensheng kang, Jainfeng Gao, Yang Dai and Xue Wang (2009), Mycoparasitism of endophytic fungi isolated from reed and soilborne Phytopathogenic fungi and production of cell walldegrading enzymes in vitro, Curr Microbiol, Springer Science 24 ... – Khảo sát khả đối kháng nhiễm bệnh, cấy truyền chúng sang môi Trichoderma với chủng nấm bệnh trường PGA mô long Kiểm tra khả gây bệnh: Kết – Phun quét bào tử nấm bệnh lên 3.1 Phân lập nấm bệnh. .. học phòng trừ nấm bệnh – Các chủng Trichoderma có khả Kết luận đối kháng với nấm bệnh mô long nên ứng dụng để phòng – Nấm bệnh NBT01, NBT03, NBT04 trò nấm bệnh long tác nhân gây bệnh thối xanh,... (F) NBT04 gây bệnh đồng tiền 3.2 Khảo sát hiệu đối kháng bệnh: NBT01, NBT03 NBT04 có khả chủng Trichoderma với gây bệnh long cấy đồng thời nấm chủng nấm bệnh môi trường PGA bệnh Trichoderma lên