Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân huỷ rơm rạ bằng kĩ thuật PRC DGGE và tạo dòng (Luận văn thạc sĩ)Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân huỷ rơm rạ bằng kĩ thuật PRC DGGE và tạo dòng (Luận văn thạc sĩ)Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân huỷ rơm rạ bằng kĩ thuật PRC DGGE và tạo dòng (Luận văn thạc sĩ)Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân huỷ rơm rạ bằng kĩ thuật PRC DGGE và tạo dòng (Luận văn thạc sĩ)Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân huỷ rơm rạ bằng kĩ thuật PRC DGGE và tạo dòng (Luận văn thạc sĩ)Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân huỷ rơm rạ bằng kĩ thuật PRC DGGE và tạo dòng (Luận văn thạc sĩ)Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân huỷ rơm rạ bằng kĩ thuật PRC DGGE và tạo dòng (Luận văn thạc sĩ)Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân huỷ rơm rạ bằng kĩ thuật PRC DGGE và tạo dòng (Luận văn thạc sĩ)Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân huỷ rơm rạ bằng kĩ thuật PRC DGGE và tạo dòng (Luận văn thạc sĩ)Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân huỷ rơm rạ bằng kĩ thuật PRC DGGE và tạo dòng (Luận văn thạc sĩ)Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân huỷ rơm rạ bằng kĩ thuật PRC DGGE và tạo dòng (Luận văn thạc sĩ)Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân huỷ rơm rạ bằng kĩ thuật PRC DGGE và tạo dòng (Luận văn thạc sĩ)Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân huỷ rơm rạ bằng kĩ thuật PRC DGGE và tạo dòng (Luận văn thạc sĩ)Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân huỷ rơm rạ bằng kĩ thuật PRC DGGE và tạo dòng (Luận văn thạc sĩ)Phân tích cộng đồng vi khuẩn phân huỷ rơm rạ bằng kĩ thuật PRC DGGE và tạo dòng (Luận văn thạc sĩ)
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGÔ ĐỨC DUY PHÂN TÍCH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN PHÂN HỦY RƠM RẠ BẰNG KỸ THUẬT PCR-DGGE VÀ TẠO DÕNG LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGÔ ĐỨC DUY PHÂN TÍCH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN PHÂN HỦY RƠM RẠ BẰNG KỸ THUẬT PCR-DGGE VÀ TẠO DÕNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC : TS HỒNG QUỐC KHÁNH Thành phố Hồ Chí Minh- 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan thông tin đƣợc viết luận văn thực hƣớng dẫn nhiệt tình Ts Hồng Quốc Khánh Mọi kết nghiên cứu nhƣ ý tƣởng, với thông tin nghiên cứu khác đƣợc trích dẫn rõ ràng, cụ thể luận văn Nội dung đề tài luận văn chƣa đƣợc bảo vệ Hội đồng khoa học bảo vệ luận văn Thạc sĩ chƣa đƣợc cơng bố Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm lời cam đoan Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2019 Ngƣời cam đoan Ngô Đức Duy i LỜI CẢM ƠN Luận văn đƣợc hoàn thành nhờ vào hƣớng dẫn nhiệt tình Ts Hồng Quốc Khánh tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Thầy Cảm ơn Ban Lãnh Đạo Viện Sinh học Nhiệt đới tạo điều kiện thuận lợi hoàn thành khóa học, Thầy Giảng viên Học Viện Khoa học Công nghệ Cảm ơn Gs Yasuo Igarashi, Gs Masahura Ishii Trƣờng GSALS (The Graduate School of Agricultural and Life Sciences), Đại học Tokyo Nhật Bản, hỗ trợ kỹ thuật tài cho nghiên cứu thuộc dự án “Kết hợp bền vững nông nghiệp địa phƣơng với công nghiệp chế biến biomass” JICA (Japan International Cooperation Agency), JST (Japan Science and Technology Agency) Đại học Bách Khoa TP.HCM Lời cảm ơn Anh Chị đồng nghiệp; Ts Kouji Yoshida, Ts Mannix Pedro, Makoto Ato, Chihaya Yamada, Đào Thị Thu Hiền, Hoàng Ngọc Phƣơng Thảo, Nguyễn Hoàng An, Nguyễn Ngọc Liên, Ts Nguyễn Hồng Dũng Em phòng Vi sinh hỗ trợ nhiều nghiên cứu Với chia vui buồn từ bạn Học viên Cao học động lực cho tơi hồn thành luận văn Đặc biệt gửi lời cảm ơn tới Mẹ Cha, vợ Trần Thị Hồng Vân, Ngô Đức Anh, Ngô Đức Dũng nhiều Anh Chị Gia đình ln ủng hộ điều kiện Ngô Đức Duy ii LỜI NÓI ĐẦU Hiện định danh chủng vi sinh khơng nhiều khó khăn nhƣ trƣớc, phát triển kỹ thuật sinh học phân tử đại với phƣơng pháp đa dạng độ xác cao Phần lớn định loại lồi trƣớc ln dựa vào trình phân lập chủng sàng lọc đặc tính quan trọng cho mục đích nghiên cứu Tuy nhiên có nghiên cứu đỏi hỏi biết rõ thành phần loài vi sinh tồn mẫu vật, trình thay đổi thành phần, số lƣợng chủng loài phụ thuộc nhiều vào thành phần chất, điều kiện sống trình trao đổi chất Trong tự nhiên vi sinh vật đa dạng, mức độ thay đổi theo điều kiện mơi trƣờng, phức tạp tính di truyền cộng đồng vi sinh thông qua việc xác định gene trƣớc tiên dựa kỹ thuật sinh học phân tử Nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc sử dụng hầu hết lĩnh vực nghiên cứu gene công nghệ sinh học, có kỹ thuật phân tích PCR-DGGE tách độc lập riêng biệt trình tự gene với độ chuẩn xác khác biệt nuclotide Chính mà sử dụng kỹ thuật DGGE xác định cộng đồng vi khuẩn mẫu mà không cần giai đoạn phân lập làm chủng, bên cạnh kết hợp với kỹ thuật Tạo dòng nghiên cứu giúp hiệu suất nghiên cứu cao tăng tính ứng dụng đa dạng phƣơng pháp sinh học phân tử phân tích cộng đồng vi sinh vật Mục tiêu nội dung nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp PCRDGGE tạo dòng để xác định cộng đồng vi khuẩn rơm trƣớc sau ủ Nhằm phân tích đánh giá khả biến động đa dạng vi khuẩn có nguồn rơm ủ dựa kỹ thuật sinh học phân tử Tạo tảng cho việc phân lập, tuyển chọn loài vi khuẩn nhƣ chịu nhiệt, sinh cellulase định hƣớng nghiên cứu ứng dụng cho việc sản xuất nhiên liệu sinh học tƣơng lai iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT APS: Ammonium Persulfate BA: Bis-Acrylamine bp: base pairs CTAB: Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide DFB: Diffusion buffer DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DNA: Deoxylribonucleic acid dNTPs: Deoxyrinonucleotide triphosphates EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetic Acid PCR: Polymerase Chain Reaction PFGE: Pulse Field Gel Electrophoresis RAPD: Random amplified polymorphic DNA RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphisms RNA: Ribonucleic acid SDS: Sodium dodecyl sulfate TAE: Tris Acetic TEMED: Tetramethyl ethylene diamine UF: Urea Formamide UV: Ultra violet iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thống kê sản lƣợng gạo sản xuất Thế giới Bảng 1.2 Thành phần cấu tạo chung rơm rạ Bảng 1.3 Thành phần hóa học rơm rạ Bảng 1.4 Số liệu thống kê sản lƣợng gạo rơm rạ giới Bảng 1.5 Phƣơng pháp PCR với mồi chuyên biệt xác định số bệnh lúa mì 17 Bảng 2.1 Các cặp mồi cho vi khuẩn sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 27 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 27 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR vùng gene V3 28 Bảng 2.5 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR gene V3 29 Bảng 2.6 Chuẩn bị cách pha nồng độ bảng gel polyacrylamine 30 Bảng 2.7 Tỷ lệ phối trộn nồng độ gel polyacrylamide vào hai xilanh 31 Bảng 2.8: Thành phần Big – dye PCR 35 v DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 1.1.Diện tích gieo trồng, suất sản lƣợng gạo Việt Nam……….3 Hình 1.2 Qui trình phân giải cellulose thành glucose 10 Hình 2.1 Một số hình ảnh thu nhận lấy mẫu rơm 22 Hình 2.2 Qui trình thực nghiên cứu 25 Hình 2.3 Qui trình ly trích thu nhận DNA từ mẫu rơm 26 Hình 2.4 Qui trình thu nong mơi trƣờng LB để tạo khuẩn lạc có màu xanh mà khuẩn lạc có biểu màu trắng 44 Hình 3.6 Kết thu nhận sản phẩm tạo dòng, khuẩn lạc có màu trắng đoạn gene chèn vào vector pGEM@-T Easy vetor biến nạp vào E.coli (A, B) chọn khuẩn lạc có màu trắng cấy chuyền mơi trƣờng LB (C) có chứa Ampicillin, PIG X-Gal Kết chứng minh khuẩn lạc có màu trắng khuẩn lạc chuyển thành cơng vector pGEM@-T Easy có chứa đoạn gene V3 Tiếp tục chọn khoảng 30 khuẩn lạc màu trắng thực cấy chuyền lập lại nhằm mục đích kiểm tra tính ổn định vector chuyển vào vi khuẩn E.coli JM109 mà khơng bị đào thải qua vòng đời sinh sản chủng E.coli JM109 3.7 Kết thu nhận vùng gene V3 sau tạo dòng Chọn khoảng 30 khuẩn lạccó màu trắng cấy qua nhiều lần sử dụng qui trình QIAGEN plasmid kít tách chiết thu nhận lại vector sau PCR cho kết sản phẩm gene V3 hình 3.7(A,B) 45 Hình 3.7 Kết 32 sản phẩm PCR đoạn gene V3 thể gel agarose 1% đƣợc ly trích thu nhận từ vi kuẩn E.coli JM109 đƣợc chèn vào vector pGEM@-T Easy (A B) 3.8 Kết kiểm tra gene V3 sau tạo dòng kỹ thuật DGGE Lấy kết sản phẩm PCR hình 3.7(A, B) thực phƣơng pháp DGGE từ kết vị trí mẫu gene V3 cho thấy gene tƣơng ứng với vị trí gene Rn1, đoạn gene 11, 26 tƣơng ứng gene Rn2, tƣơng tự đoạn gene 6, 8,10,12,14, 21, 23, 25, 27 29 tƣơng ứng vị trí gene Rn3, phần lại 1, 2, 3, 4, 9, 13, 15, 16, 17,18, 19, 20, 24, 27 30 tƣơng ứng với gene Rn4 So sánh sản phẩm DGGE với hình 3.5D cho thấy vị trí đoạn gene phƣơng pháp DGGE tạo dòng điều cho kết giống ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO VI N HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI T NAM HỌC VI N KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGÔ ĐỨC DUY PHÂN TÍCH CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN PHÂN HỦY RƠM RẠ BẰNG KỸ THUẬT PCR -DGGE VÀ TẠO... pháp PCRDGGE tạo dòng để xác định cộng đồng vi khuẩn rơm trƣớc sau ủ Nhằm phân tích đánh giá khả biến động đa dạng vi khuẩn có nguồn rơm ủ dựa kỹ thuật sinh học phân tử Tạo tảng cho vi c phân lập,... mẫu Rơm (R) cho thấy tính đa dạng vi khuẩn mẫu chƣa thơng qua ủ khoảng chi lại khoảng chi vi khuẩn sau giai đoạn ủ Kỹ thuật phân tích PCR -DGGE Tạo dòng áp dụng cho vi c phân tích cộng đồng vi khuẩn