Luận án tiến sĩ Sinh học: Đánh giá hoạt động của một số gen liên quan đến tổng hợp, tích lũy tinh bột và thử nghiệm chuyển gen SSIV vào cây sắn

Thông tin tài liệu

Đây là đề tài nghiên cứu đầu tiên áp dụng công nghệ gen, công nghệ sinh học hiện đại nhằm tạo giống sắn năng suất cao tại Việt Nam dựa trên cơ sở khảo sát, nghiên cứu hệ gen của chính các giống sắn thu thập tại Việt Nam. Do vậy, phạm vi ứng dụng của đề tài không chỉ ở chuyển gen tăng cường khả năng tổng hợp tinh bột vào sắn mà còn có thể ứng dụng ở các cây lương thực dự trữ tinh bột khác như khoai tây, khoai lang.

VIỆN KHOA HỌC VÀVÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆNHÀN HÀNLÂM LÂM KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MINH HỒNG NGUYỄN THỊ MINH HỒNG ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦ A MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP, TÍ CH LŨ Y TINH BỘT VÀ THỬ NGHIỆM CHUYỂN GEN SSIV VÀO CÂY SẮN ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦ A MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP, TÍ CH LŨ Y TINH BỘT VÀ THỬ NGHIỆM CHUYỂN GEN SSIV VÀO CÂY SẮN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NỘI - 2018 HÀHÀ NỘI - 2018 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MINH HỒNG ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦ A MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP, TÍ CH LŨ Y TINH BỘT VÀ THỬ NGHIỆM CHUYỂN GEN SSIV VÀO CÂY SẮN Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Bích Ngọc Viện Cơng nghệ sinh học PGS.TS Chu Hồng Hà Viện Cơng nghệ sinh học HÀ NỘI - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu thân hướng dẫn PGS.TS Phạm Bích Ngọc PGS.TS Chu Hồng Hà Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Tơi xin chịu trách nhiệm hồn tồn số liệu, nội dung trình bày luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả Nguyễn Thị Minh Hồng i LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Bích Ngọc PGS.TS Chu Hoàng Hà hướng dẫn, bảo tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận án Bên cạnh đó, tơi xin chân thành cảm ơn tập thể cán nghiên cứu Phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, phòng Cơng nghệ ADN ứng dụng Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trung tâm tài nguyên thực vật, Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc, Trại thực nghiệm sinh học Cổ Nhuế tạo điều kiện cho tiến hành đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn hỗ trợ tài điều kiện làm việc khuôn khổ đề tài: “Khai thác phân lập nguồn gen có sẵn tập đồn giống sắn Việt Nam nhằm phát triển giống sắn có khả chống chịu bệnh suất cao công nghệ gen” thuộc nhiệm vụ hợp tác quốc tế khoa học công nghệ, Bộ Khoa học Công nghệ; thời gian thực từ 6/2012 đến 6/2015 PGS.TS Phạm Bích Ngọc làm chủ nhiệm Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Bộ phận phụ trách đào tạo tạo điều kiện thuận lợi để học tập, nghiên cứu hồn thiện luận án Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Hồng Đức Thanh Hóa, Lãnh đạo khoa cán môn Khoa học trồng, Bảo vệ thực vật, khoa Nông Lâm Ngư nghiệp, ĐH Hồng Đức tạo điều kiện thuận lợi để yên tâm công tác, học tập hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu đó! Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Minh Hồng ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU 4 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây sắn số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh bột sắn 4 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 4 1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh thái di truyền 5 1.1.3 Giá trị sắn 8 1.1.4 Tình hình sản xuất sắn giới Việt Nam 9 1.1.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh bột sắn 13 13 1.1.6 Một số hướng cải tạo giống sắn 15 15 1.2 Quá trình hình thành tích luỹ tinh bột sắn 19 1.2.1 Cấu tạo vai trò tinh bột thực vật 19 19 1.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột gen liên quan 20 20 1.3 Ứng dụng công nghệ sinh học chọn tạo giống sắn biến đổi gen 27 27 1.3.1 Hệ thống nuôi cấy in vitro sắn 27 27 1.3.2 Một số phương pháp chuyển gen sắn 32 32 1.3.3 Một số nghiên cứu tạo sắn biến đổi gen 35 35 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43 43 2.1 Vật liệu nghiên cứu 43 43 2.1.1 Vật liệu thực vật 43 43 2.1.2 Chủng vi khuẩn, vector 43 43 2.1.3 Hố chất thiết bị thí nghiệm 43 43 2.1.4 Môi trường nuôi cấy 44 44 2.1.5 Thời gian địa điểm nghiên cứu 45 45 2.2 Phương pháp nghiên cứu 45 45 2.2.1 Lựa chọn giống sắn phân nhóm giống sắn dựa vào tiêu đánh giá 45 45 2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử 45 45 2.2.3 Phương pháp phân lập gen promoter 51 51 2.2.4 Các phương pháp thiết kế vector chuyển gen 52 52 2.2.5 Kỹ thuật canh tác, chăm sóc các giố ng sắ n phu ̣c vu ̣ cho nghiên cứu 54 54 iii 2.2.6 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 54 54 2.2.7 Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens 55 55 2.2.8 Phương pháp phân tích có mặt gen chuyển 56 56 2.2.9 Phương pháp phân tích biểu chuyển gen 57 57 2.2.10 Phương pháp phân tích xử lí số liệu 60 60 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 61 61 3.1 Lựa chọn giống sắn phân tích biểu gen liên quan đến trao đổi chất tinh bột 61 61 3.1.1 Lựa chọn giống sắn sử dụng 61 61 3.1.2 Thu mẫu xử lý mẫu sắn 62 62 3.1.3 Tách chiết ARN tổng số 63 62 3.1.4 Tổng hợp cDNA từ ARN tổng số lá, củ sắn giai đoạn phát triển khác đánh giá chất lượng cDNA 64 64 3.1.5 Thu thập thông tin, thiết kế cặp mồi thích hợp để phân tích biểu số gen liên quan tới sinh tổng hợp tích lũy tinh bột 65 65 3.1.6 Phân tích sở liệu biểu gen liên quan đến trình sinh tổng hợp đường tiền chất cho tổng hợp tinh bột củ sắn 66 66 3.2 Phân lập gen SSIV liên quan đến khả tổng hợp tinh bột thiết kế vector chuyển gen 75 3.2.1 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu 75 75 3.2.2 Phân lập gen SSIV sắn 76 76 3.2.3 Thiết kế vector chuyển gen 82 82 3.3 Đánh giá hoạt động vector chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột thuốc 87 87 3.3.1 Chuyển gen SSIV vào thuốc đánh giá hoạt động gen chuyển 87 87 3.3.2 Đánh giá hoạt động gen chuyển 91 92 3.3 Đánh giá hoạt động vector chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột thuốc 87 3.3.1 Chuyển gen SSIV vào thuốc đánh giá hoạt động gen 87 chuyển .87 3.3.2 Đánh giá hoạt động gen chuyển 92 92 iv 3.4 Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào sắn 99 99 3.4.1 Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro sắn 99 99 3.4.2 Xây dựng tối ưu quy trình chuyển gen vào sắn thông qua gen GUS 106 106 3.4.3 Tạo dòng sắn chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột 113 113 Chương BÀ N LUẬN KẾT QUẢ 118 118 4.1 Sự biểu gen quan trọng liên quan đến trao đổi chất tinh bột 118 4.2 Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào thuốc 122 122 4.3 Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào sắn 124 124 4.3.1 Hệ thống tái sinh sắn 124 124 4.3.2 Chuyển gen SSIV vào sắn thông qua A tumefaciens 126 126 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 130 130 TÓM TẮT TIẾNG ANH…………………………………………………… 131 CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ………………………………………… …… 136 TÀI LIỆU THAM KHẢO 137 137 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Giá trị dinh dưỡng sắn Bảng 1.2 Diện tích, suất, sản lượng sắn vùng giới năm 2014 – 2015 10 Diện tích, suất sản lượng sắn Việt Nam từ năm 2010 – 2014 12 Bảng 1.4 Một số cơng trình nghiên cứu tái sinh invitro sắn 29 Bảng 1.5 Tổng kết số cơng trình cơng bố chuyển gen vào sắn 36 Bảng 3.1 Đặc điểm số giống sắn sử dụng phân tích biểu gen 62 Nồng độ độ tinh mẫu RNA tổng số tách chiết từ củ giống sắn 63 Cơ sở dữ liê ̣u các gen liên quan đế n quá trình sinh tổ ng hơ ̣p tinh bô ̣t ở sắ n 66 Bảng 3.4 Trình tự cặp mồi để khuếch đại gen quan tâm 75 Bảng 3.5 Trình tự cặp mồi nhân dòng gen liên quan đến sinh tổng hợp tinh bột thiết kế vector chuyển gen 76 Vị trí sai khác trình tự nucleotide gen SSIV giống KM140 so với gen tham chiếu 78 Vị trí sai khác trình tự axit amin suy diễn protein SSIV gen phân lập 79 Chuyển cấu trúc gen pK7WG2D-35S: SSIV:T35S pBI121C54: SSIV:NOST vào thuốc lá……………………………… 90 Hàm lượng tinh bột tích luỹ rễ thuốc chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S dòng chuyển gen 97 Hàm lượng tinh bột tích luỹ rễ thuốc chuyển gen pBI121 – C54: SSIV: NOST dòng chuyển gen 98 Ảnh hưởng nguồn nguyên liệu môi trường đến khả tạo mô sẹo (sau tuần) 100 Bảng 3.12 Tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi môi trường CI 102 Bảng 3.13 Tỷ lệ phôi soma tạo 104 Bảng 3.14 Khả tái sinh thành hồn chỉnh từ mơ sẹo phơi hóa 105 Bảng 1.3 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Bảng 3.10 Bảng 3.11 vi Bảng 3.15 Bảng 3.16 Bảng 3.17 Bảng 3.18 Bảng 3.19 Ảnh hưởng thời gian nhiễm khuẩn đến hiệu chuyển gen giống sắn KM140 108 Ảnh hưởng Kanamycin đến khả sống sót mơ sẹo chuyển gen GUS giống sắn HB80 KM140 109 Ảnh hưởng Kanamycin đến tỷ lệ rễ chồi giống sắn HB80 KM140 110 Tạo sắn HB80 KM140 chuyển gen GUS thông qua A.tumefaciens 111 Chuyển gen pBI121- C54:SSIV:NOST vào giống sắn KM140 114 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 1.5 Hình 1.6 Hình 2.1 Hình 2.2 Đặc điểm sắn (Manihot esculenta Crantz) Một số phương pháp phổ biến tạo sắn biến đổi gen Cơng thức hóa học tinh bột Q trình sinh tổng hợp tinh bột enzyme liên quan Quy trình tái sinh in vitro thơng qua phơi soma sắn Kết tạo mơ sẹo phơi hố giống sắn TME 14 Trình tự đoạn cmyc vị trí mồi PCR Q trình canh tác và thu hoa ̣ch các giố ng sắ n quan tâm ta ̣i Tra ̣i thực nghiê ̣m sinh học Cổ Nhuế phu ̣c vu ̣ nghiên cứu Hình 2.3 Quy trình kiểm tra hàm lượng tinh bột phương pháp nhuộm iodine Hình 2.4 Đồ thị xây dựng đường chuẩn đánh giá hàm lượng tinh bột từ thuốc chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S Đồ thị xây dựng đường chuẩn đánh giá hàm lượng tinh bột từ rễ thuốc chuyển gen cấu trúc pBI121 – C54:SSIV: NOST Hình ảnh minh họa vị trí củ sắn Hình 2.5 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 Hình 3.9 Hình 3.10 Hình 3.11 Hình 3.12 Hình 3.13 Hình 3.14 RNA tổng số tách chiết từ mẫu củ (A) giống sắn (B) Điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen actin từ cDNA sắn Phân tích mức độ biểu gen AGPS qua giai đoạn phát triển giống sắn real-time PCR 18 20 21 31 32 53 54 58 59 60 62 63 64 67 Phân tích mức độ biểu gen AGPL qua giai đoạn phát triển giống sắn real-time PCR 68 Phân tích mức độ biểu gen GBSS qua giai đoạn phát triển giống sắn real-time PCR 69 Phân tích mức độ biểu gen SSI, SSIII, SSIV qua giai đoạn phát triển giống sắn real-time PCR 71 Phân tích mức độ biểu gen SSII qua giai đoạn phát triển giống sắn real-time PCR 72 Phân tích mức độ biểu gen SBE qua giai đoạn phát triển giống sắn real-time PCR Tách dòng đoạn gen SSIV từ củ sắn Tách dòng promoter C54 sắn Thiết kế vector pK7WG2D-35S:SSIV:T35S Thiết kế vector pBI121/cmyc Thiết kế vector pBI121-C54:SSIV-cmyc:NOST 74 77 81 83 84 85 viii Hình 3.15 Hình 3.16 Hình 3.17 Hình 3.18 Hình 3.19 Hình 3.20 Hình 3.21 Hình 3.22 Hình 3.23 Hình 3.24 Hình 3.25 Hình 3.26 Hình 3.27 Hình 3.28 Hình 3.29 Hình 3.30 Hình 3.31 Hình 3.32 Hình 3.33 Hình 3.34 Quy trình chuyển gen vào thuốc thông qua vi khuẩn A tumefaciens 88 Một số hình ảnh chuyển gen quan tâm vào thuốc thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 89 Kiểm tra dòng thuốc chuyển gen cấu trúc pK7WG2D35S:SSIV:T35S phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F/R 91 Kiểm tra dòng thuốc chuyển gen cấu trúc pBI121C54:SSIV:NOST Kết Southern blot mẫu thuốc chuyển gen SSIV Ảnh điện di RNA tổng số tách từ mẫu thuốc chuyển gen Kết PCR nhân gen actin từ cDNA từ số dòng thuốc chuyển gen 91 92 93 94 Điê ̣n di sản phẩ m RT-PCR gen SSIV dòng thuốc chuyển gen tương ứng 95 Nhuộm iodine số dòng thuốc chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S 96 Nhuộm iodine số dòng thuốc chuyển gen cấu trúc pBI 121 – C54:SSIV: NOST Mô sẹo từ nguồn nguyên liệu khác Các khối mơ sẹo phân hóa giai đoạn mơ phơi khác giống sắn thí nghiệm Chồi sắn tái sinh từ mô sẹo phơi hóa Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn đến khả biến nạp gen GUS giống sắn HB80 KM140 Một số hình ảnh chuyển gen GUS vào giống sắn HB80 KM140 Một số hình ảnh chuyển gen pBI121-C54:SSIV:NOST vào giống sắn KM140 Cây sắn giống KM140 chuyển gen SSIV trồng nhà lưới Điện di DNA tổng số dòng sắn chuyển gen mang cấu trúc pBI121-C54:SSIV:NOST 98 101 103 106 107 112 115 115 116 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR dòng sắn chuyển gen với cặp mồi promoter C54F/SSIV-R 116 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR dòng sắn chuyển gen với cặp mồi virF/R 117 ix DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Nghĩa tiếng Anh Ký hiệu µl Microliter µM Micromolar 2.4D axit 2,4-diclophenoxiaxetic Nghĩa tiếng Việt A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens AGPase ADP-glucose pyrophosphorylase AS Acetosyringone BAP – Benzyl amino purine bp Base pair cDNA Complementary DNA CG cặp bazơ nitơ Chuyển gen CIAT International Center for Tropical Agriculture CTAB Cetyltrimethylammonium bromide Trung tâm nông nghiệp nhiệt đới quốc tế Cộng sự, đồng tác giả Cs, et al., DBE Debranching enzyme DNA Deoxiribonucleic Acid Đỏ ĐF enzyme phân rã tinh bột Đỏ địa phương E.coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid EtBr Ethidium Bromid FEC Friable embryo callus Mơ sẹo phơi hóa GBSS granule-bound synthetase enzyme tổng hợp amylose GUS β –Glucuronidase gene Gen GUS HSPs Heat shock proteins IBA Indol -3- butyric acid Kb Kilo base Kinetin – fufuryl amino purine Km Kanamycin x KM140 KM140 (KM98-1 x KM36) LB Luria –Bertani Môi trường LB M Marker Thang chuẩn mRNA messenger RNA RNA thông tin MS Murashige and Skoog Môi trường MS MTCL Mg Miligam mg/L; mg/mL; ng/g Miligam/lit; miligam/mililit; nanogam/gam NAA α – Napthyl acetic acid nptII Neomycin photphotranspherase gene OD Optical density Mật độ quang học PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp Picloram 4-amino-3,4,5 tricloro pyridine - 2cacboxylic acid RM Rooted Medium RT-PCR Realtime polymerase chain reaction SBE Starch branching enzyme enzyme phân nhánh tinh bột SS Starch synthase Enzyme sinh tổng hợp tinh bột SSIV Starch synthase IV Enzyme sinh tổng hợp tinh bột nhóm IV T-DNA Transfer-DNA DNA vận chuyển Môi trường rễ Trắng HB Trắng Hòa Bình Trắng NA Trắng Nghệ An WP Working package Dòng khơng chuyển gen WT X-gluc Nội dung 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide xi MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) loại lương thực chủ lực quan trọng nhiều nước giới chúng khả cung cấp carbonhydrate cao, chí điều kiện ngoại cảnh bất lợi lượng mưa thấp, hạn hán đất nghèo dinh dưỡng Hiện nay, bối cảnh biến đổi khí hậu làm trái đất nóng lên, nước biển dâng cao, đe dọa an ninh lương thực giới cạn kiệt nguồn nguyên liệu hóa thạch sắn coi trồng đem lại giải pháp kép nhằm đạt hai mục tiêu: góp phần đảm bảo an ninh lương thực cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học, bước thay nhiên liệu hóa thạch Trong kế hoạch năm 2015 - 2020, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đưa chủ trương giảm diện tích trồng sắn nâng cao suất trồng sắn Kế hoạch đề diện tích trồng sắn trì ổn định khoảng 500.000 vào năm 2015 ổn định diện tích 450.000 vào năm 2020, suất đạt khoảng 21 tấn/ha Nếu đạt theo kế hoạch với mức sản lượng 11 triệu xảy tình trạng tranh mua nguyên liệu nhà máy sản xuất ethanol với nhà máy thức ăn chăn nuôi, nhà máy sản xuất tinh bột sắn lượng sắn dùng cho xuất Tinh bột thành phần quan trọng thực vật nguồn lương thực nguyên liệu công nghiệp Hiện nay, việc cải tiến trồng theo hướng tăng hàm lượng tinh bột hướng nghiên cứu quan trọng nhà khoa học quan tâm hàng đầu Do vậy, nghiên cứu tìm hiểu đường tổng hợp phân hủy tinh bột trồng nói chung sắn nói riêng góp phần thúc đẩy mục tiêu cải tạo hàm lượng tinh bột Như vậy, ứng dụng công nghệ sinh học nhằm xây dựng hệ thống tái sinh in vitro chuyển gen tạo sắn có hàm lượng tinh bột cao, phù hợp với mục đích sử dụng phục vụ cho cơng nghiệp xuất vấn đề cấp thiết nước ta Ngoài ra, hướng nghiên cứu sâu mức độ sinh học phân tử di truyền học sắn chưa quan tâm phát triển nhiều Đặc biệt, chưa có những nghiên cứu sâu mức độ sinh học phân tử nhằm khai thác nguồn gen quý sẵn có từ giống sắn Việt Nam, phục vụ cho công tác cải tạo giống sắn công nghệ gen Xuất phát từ thực tế trên, đề xuất nhiệm vụ nghiên cứu “Đánh giá hoa ̣t đô ̣ng của mô ̣t số gen liên quan đến tổ ng hơ ̣p, tích lũy tinh bô ̣t thử nghiệm chuyển gen SSIV vào sắn” Mục tiêu nghiên cứu Bước đầu chuyển gen tăng cường sinh tổng hợp tinh bột SSIV điều khiển promotor đặc hiệu C54 vào giống sắn KM140 nhờ A.tumefaciens thông qua FEC Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Lựa chọn giống sắn phân tích biểu gen liên quan đến trao đổi chất tinh bột Nội dung 2: Phân lập gen SSIV liên quan đế n khả tổ ng hơ ̣p tinh bô ̣t, thiết kế vector chuyển gen Nội dung 3: Đánh giá khả tổng hợp tinh bô ̣t của gen SSIV thuốc mơ hình Nội dung 4: Chủ n gen SSIV vào sắ n Những đóng góp luận án + Đã phân lập đánh giá hoạt động gen SSIV liên quan đến khả tổng hợp tinh bột từ củ sắn + Đã thu dòng thuốc chuyển gen mang cấu trúc pB121C54:SSIV-cmyc:NOST với mức độ tích lũy hàm lượng tinh bột cao so với dòng thuốc chuyển gen mang cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S từ 19,7 – 48,1% cao 15,6 – 65,7% so với đối chứng + Đây cơng trình chuyển gen tăng cường sinh tổng hợp tinh bột SSIV điều khiển promoter đặc hiệu củ C54 vào mơ sẹo phơi hóa (FEC) giống sắn KM140 thơng qua A tumefaciens Kết bước đầu thu dòng sắn chuyển gen dương tính kiểm tra với PCR 3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án 5.1 Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu thu luận án bao gồm gen hệ thống vector chuyển gen thực vật mang gen liên quan tới trình sinh tổng hợp tinh bột, phân lập từ giống sắn quan trọng đánh giá tiêu nông sinh học Việt Nam; cấu trúc vector mang gen đích, chủng vi khuẩn chứa vector mang gen đích, chủng vi khuẩn chứa vector chuyển gen quy trình đánh giá hoạt động gen chuyển mức độ sinh học phân tử Hơn nữa, hoạt động cấu trúc vector chuyển gen SSIV có tăng khả tích lũy tinh bột đánh giá, kiểm tra thơng qua biến nạp vào mơ hình thuốc lá, sắn giống KM140 Đây tiền đề để phát triển nghiên cứu ứng dụng tạo nên sắn chuyển gen mang tính trạng có lợi 5.2 Ý nghĩa thực tiễn Đây đề tài nghiên cứu áp dụng công nghệ gen, công nghệ sinh học đại nhằm tạo giống sắn suất cao Việt Nam dựa sở khảo sát, nghiên cứu hệ gen giống sắn thu thập Việt Nam Do vậy, phạm vi ứng dụng đề tài không chuyển gen tăng cường khả tổng hợp tinh bột vào sắn mà ứng dụng lương thực dự trữ tinh bột khác khoai tây, khoai lang 4 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY SẮN VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HÀM LƯỢNG TINH BỘT Ở SẮN 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.1.1 Nguồn gốc Với chứng khảo cổ, khẳng định sắn có nguồn gốc vùng nhiệt đới châu Mỹ Latinh, thuộc khu vực sơng Amazon, lồi người trồng cách 5000 năm Nghiên cứu khảo cổ học cho thấy, số di vật củ sắn tìm thấy có niên đại khoảng 2700 năm trước cơng ngun Venezuela khoảng 2000 năm trước công nguyên vùng ven biển Peru Trong đó, lò nướng bánh sắn phức hệ Ualabo có niên đại 1200 năm trước cơng ngun tìm thấy phía Bắc Colombia hạt tinh bột có tuổi khoảng năm 900 - 200 trước cơng ngun phần hóa thạch phát Mexico số di tích khảo cổ học khác chứng tỏ sắn xuất trồng loại nông nghiệp từ lâu đời (Rogers, 1965) Ở Châu Á, sắn du nhập vào Ấn Độ khoảng kỷ XVII, Việt Nam số nước khác khu vực Đông Nam Á vào kỷ XVIII Tuy nhiên, đến kỷ XIX, nghề trồng sắn tiêu thụ sắn thực phát triển với du nhập kỹ thuật chế biến Brazin nô lệ Từ đến nay, diện tích, suất sản lượng sắn ngày tăng (Trần Ngọc Ngoạn, 2007) 1.1.1.2 Phân loại Chi Manihot bao gồm có hoa, hạt kín, có hai mầm, họ thầu dầu Vào năm 1651 Bauhin người dùng danh từ Manihot để chi ông mô tả mẫu thày tu Pháp A Thevet mang từ Brazin về, ơng đặt tên lồi Manihot theveti Có thể cho lồi người ta gọi tên Manihot esculenta Crantz (Rogers, 1965) Năm 1776, Crantz công bố mô tả loài với tên Manihot esculenta, vào mẫu Merian mang từ Surinam năm 1726 Sau nhiều tác giả nghiên cứu chi Manihot với cách phân nhóm khác Đến năm 1938, Cifferi trở lại cách gọi tên Crantz, ông dùng lại tên lồi M.esculenta khơng phân biệt sắn đắng sắn ngọt, ông cung cấp quan niệm giống trồng phổ biến (cultivar) Bảng phân loại cuối Rogers Appan (1973) kết cơng trình nghiên cứu đầy đủ chi Manihot, tiến hành 20 năm với phương pháp phân loại số lượng 1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh thái di truyền 1.1.2.1 Đặc điểm hình thái * Thân Cây sắn thuộc loại thân gỗ, cao từ - m Chiều cao phụ thuộc vào giống, điều kiện chiếu sáng, mức độ thâm canh, mật độ thời vụ trồng Thân sắn có khả phân cành, phân cành có ảnh hưởng đến khả hoa Thân cành già hố gỗ có màu trắng bạc, xám, nâu vàng Số lượng thân phụ thuộc vào cách đặt hom số mắt hom Về mặt cấu tạo, lớp cắt ngang thân sắn có bốn lớp: lõi xốp, tế bào lớn; tiếp đến tầng gỗ; mơ mềm vỏ ngồi lớp biểu bì mỏng Khi nhân vơ tính sắn người ta sử dụng đoạn hom lấy từ thân cây, ngồi việc lựa chọn đoạn hom đẹp, bệnh, phải giữ cho lớp biểu bì khơng bị sây sát lớp có chức bảo vệ cho hom không bị nước (Tribadi cs., 2010; Ceballos & Cruz, 2012) * Lá sắn Lá sắn loại đơn mọc xen kẽ thân, gồm hai phần cuống phiến Cuống dài từ - 30 cm với nhiều màu sắc khác tuỳ theo giống (màu vàng, xanh vàng, hồng, đỏ tươi) Phiến thường chia - thuỳ có khơng chia thuỳ Lá sắn mọc từ hạt phiến thường nguyên vẹn chí thuỳ khơng Các mọc từ hom, từ chỗ phân cành số thuỳ phiến thường giảm Cấu tạo phiến gồm lớp biểu bì phía có tầng cutin dày, tầng mơ dậu, tầng mơ hổng biểu bì Mặt có nhiều khí khổng đường kính khoảng 30 µm có khoảng 700 lỗ/mm (Trần Ngọc Ngoạn, 2007; Tribadi cs., 2010) 6 Hình 1.1: Đặc điểm sắn (Manihot esculenta Crantz) (Nguồ n: Liu cs., 2011) Chú thích: A Cây sắn trồng ruộng; B Củ sắn thu hoạch; C Cụm hoa; D Quả sắn; E Hạt sắn; F Cây nảy mầm từ hạt; G Thân sắn dùng để trồng * Hoa sắn Hoa sắn hoa đơn tính gốc, mọc thành cụm, có cuống mọc từ chỗ phân cành, thân Một số giống sắn khơng có hoa khơng có phân hoá hoa mầm hoa rụng Những cụm hoa sinh từ cành thấp thường rụng sớm Cụm hoa gồm trục dài - 10 cm trục bên hợp lại thành chuỳ (Trần Ngọc Ngoạn, 2007) Hoa có năm đài có màu sắc sặc sỡ, ngồi rìa có lơng Giữa hoa có bầu hoa cánh, chứa nỗn nằm đài Trên bầu có vòi nhuỵ ngắn với đầu nhuỵ uốn cong Hoa đực có đài dính với nửa chiều dài, nhẵn bên có lơng phía ngồi Có khoảng - 10 nhị đực xếp thành hai vòng mọc lên từ thuỳ đĩa phía Bao phấm mềm, hạt phấn ngăn, dày dính, màng ngồi hạt phấn có gai nhỏ (Ceballos and Cruz, 2012) Số lượng hoa giống sắn không giống nhau, thường hoa đực nhiều hoa hoa lại thường nở trước hoa đực để tránh tượng tự thụ phấn Hoa nở cuối thường nở với hoa đực nở Hoa đực thường nở vào trưa hoa thường khép lại vào cuối buổi chiều Bao phấn bắt đầu mở trước hoa nở khoảng mở hoàn toàn trước hoa nở giờ, sau phát tán nhờ gió côn trùng với phạm vi thụ phấn khoảng 30 cm Tuổi thọ hạt phấn tuần thời gian tiếp nhận hạt phấn đầu nhuỵ vòng 24 Sau 24 giờ, đầu nhụy bắt đầu héo, chuyển sang màu nâu, khô rụng chậm sau ngày Thời gian từ lúc thụ phấn đến thụ tinh kéo dài từ 19 (Trần Ngọc Ngoạn 2007; Ceballos and Cruz, 2012) * Quả hạt Quả sắn thuộc loại nang, mở chín, đường kính - 1,5 cm Quả có ngăn tạo thành từ cánh bầu hoa, ngăn chứa hạt Màu sắc thường biến đổi từ lục nhạt, vàng dến lục hay đỏ tía Cuống phình lên chỗ tiếp xúc với Sau chín, tự mở lại trục Hạt sắn hình trứng, tiết diện giống hình tam giác Hạt có vân vết màu đỏ nâu kem xám nhạt (Trần Ngọc Ngoạn 2007; Ceballos & Cruz, 2012) * Rễ sắn Rễ sắn mọc từ hạt từ hom (đoạn thân lựa chọn giữ lại làm giống cho vụ kế tiếp) Rễ mọc từ hạt bắt đầu rễ mọc thẳng cắm xuống đất sau rễ phụ mọc ra, rễ cọc rễ phụ có khả phát triển thành củ Rễ mọc từ hom mọc ngang sau cắm thẳng xuống đất, rễ sắn có hai chức đồng hố dự trữ Rễ đồng hố thường cắm sâu lòng đất dài tới 30 cm để hút nước, chất dinh dưỡng giúp cho vững Rễ dự trữ (rễ củ) rễ tập trung dinh dưỡng mà thành Khi rễ có nhiều rễ sau có số rễ tập trung dinh dưỡng phát triển thành củ Củ sắn thường có dạng hình trụ dài tới 30 cm, có khơng có cuống củ (Ceballos & Cruz, 2012) 1.1.2.2 Đặc điểm sinh thái Cây Sắn (Manihot esculenta Crantz) thuộc chi Manihot, họ Euphorbiaceae sống vùng nhiệt đới di canh đến nhiều khu vực khác giới (Allem., 2002) Sắn phân bố phổ biến từ 33 o vĩ Bắc đến 33o vĩ Nam 8 Sắn biết đến với 100 tên gọi khác nhau, phụ thuộc vào địa lý nơi trồng Ở Mỹ Latinh, sắn có tên gọi yucca (tiếng Tây Ban Nha) mandioca (tiếng Bồ Đào Nha) Cây sắn yêu cầu khoảng nhiệt độ tối thích rộng từ 20 – 40oC Yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng đến tuổi thọ số diện tích Khi nhiệt độ tăng từ 20 – 24oC, tuổi thọ giảm tăng số hình thành Là ưa sáng, sắn thích hợp với thời gian chiếu sáng 12h/ngày để tích luỹ tinh bột củ (Keating cs.,1998) 1.1.2.3 Đặc điểm di truyền Chi Manihot thuộc họ thầu dầu, có tới 300 chi 8000 lồi hầu hết nhiệt đới Đặc điểm họ thầu dầu thường hay có mạch, nhựa mủ Chi Manihot thuộc nhóm Manihotae Tất lồi chi có số lượng nhiễm sắc thể 2n= 36 Rogers & Appan (1973) xây dựng bảng phân loại cho 98 lồi thuộc chi Manihot, phân thành 17 nhóm Sự nhận dạng lồi nhóm dựa vào phân tích nhiều mặt đặc điểm hình thái phận mặt đất Nhờ vào bảng phân loại người ta lập bảng nhận dạng loài chi 1.1.3 Giá trị sắn Sắn lương thực quan trọng giới sau lúa ngô (Kim cs., 2010) Củ sắn có hàm lượng tinh bột cao với khoảng 84 - 87% khối lượng khô, nguồn cung cấp carbonhydrate cho 500 triệu người vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới tỷ người giới Trong củ sắn có số loại axit amin chứa lưu huỳnh lượng không nhiều hàm lượng thấp protein, chất béo, số chất khoáng (P, K, Mg, ) vitamin (B1, B2, ) (Trần Ngọc Ngoạn, 2007) Bên cạnh vai trò cung cấp tinh bột làm thức ăn cho người động vật, sắn góp phần vào đa dạng kinh tế tạo hội cho phát triển công nghiệp nhẹ, công nghiệp thực phẩm nhiên liệu sinh học với 80 quốc gia có khả phát triển ngành công nghiệp từ sắn (Trần Ngọc Ngoạn, 2007; Abrahamian & Kantharajah, 2011) Tinh bột sắn dùng để sản xuất loại bánh, kẹo, bột ngọt, mì ăn liền, làm phụ gia dược phẩm đặc biệt, sắn sử dụng làm nguồn nguyên liệu quan trọng để sản xuất cồn sinh học đem lại hiệu suất hiệu kinh tế cao Thân sắn dùng để sản xuất nấm, nguyên liệu cho công nghiệp xenlulozơ nguyên liệu để sản xuất số sản phẩm khác màng phủ sinh học, chất giữ ẩm, bao bì phụ gia dược phẩm (Trần Ngọc Ngoạn, 2007) Bảng 1.1: Giá trị dinh dưỡng sắn Thành phần Tỷ lệ chất khô (%) Hàm lượng tinh bột (%) Đường tổng số (% FW) Đạm tổng số (%FW) Chất xơ (%FW) Chất béo (%FW) Chất khoáng (%FW) Vitamin A (mg/100gFW) Vitamin C (mg/100gFW) Năng lượng (KJ/100g) Yếu tố hạn chế dinh dưỡng Tỷ lệ trích tinh bột (%) Kích thước hạt bột (micron) Amylose (%) Độ dính tối đa (BU) Nhiệt độ hồ hóa (OC) Sắn 30 - 40 27 - 36 0,5 - 2,5 0,5 - 2,0 1,0 0,5 0,5 - 1,5 17 50 607 Cyanogenes 22 - 25 - 50 15 -29 700 - 1100 49 -73 (Nguồ n: Christopher et al., 1995) Giá trị chủ yếu sắn hàm lượng tinh bột tập trung rễ (củ) Củ sắn giàu chất bột, lượng, khoáng, vitamin C, hạt bột sắn nhỏ mịn, độ dính cao nghèo chất béo nghèo đạm, hàm lượng acid amin không cân đối, thừa arginin thiếu acid amin chứa lưu huỳnh Tùy theo giống sắn, vụ trồng, số tháng thu hoạch sau trồng kỹ thuật phân tích mà tổng số vật chất khơ hàm lượng đạm, béo, khống, xơ, đường, bột có thay đổi 1.1.4 Tình hình sản xuất sắn giới Việt Nam 1.1.4.1 Tình hình sản xuất sắn giới Theo nghiên cứu thị trường sắn toàn cầu Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Quốc tế (FAO) Viện Nghiên cứu Chính sách lương thực giới (IFPRI), 10 với tầm nhìn đến năm 2020 sản lượng sắn tồn cầu ước đạt 275,10 triệu tấn, sản xuất sắn chủ yếu nước phát triển 274,7 triệu tấn, nước phát triển khoảng 0,4 triệu Mức tiêu thụ sắn nước phát triển dự báo đạt 254,60 triệu so với nước phát triển 20,5 triệu Khối lượng sản phẩm sắn toàn cầu sử dụng làm lương thực thực phẩm dự báo nhu cầu 176,3 triệu thức ăn gia súc 53,4 triệu Tốc độ tăng hàng năm nhu cầu sử dụng sản phẩm sắn làm lương thực, thực phẩm thức ăn gia súc đạt tương ứng 1,98% 0,95% Hiện nay, Châu Phi khu vực dẫn đầu sản lượng sắn toàn cầu với dự báo sản lượng năm 2020 đạt 168,6 triệu Trong đó, khối lượng sản phẩm sử dụng làm lương thực thực phẩm 77,2%, làm thức ăn gia súc 4,4% Châu Mỹ Latinh giai đoạn 1993 - 2020, ước tính tốc độ tiêu thụ sản phẩm sắn tăng hàng năm 1,3%, so với châu Phi 2,44% châu Á 0,84 - 0,96% Cây sắn tiếp tục giữ vai trò quan trọng nhiều nước châu Á, đặc biệt nước vùng Đơng Nam Á - nơi sắn có tổng diện tích đứng thứ ba sau lúa ngơ tổng sản lượng đứng thứ ba sau lúa mía (Hồng Kim, 2013) Bảng 1.2: Diện tích, suất, sản lượng sắn khu vực giới năm 2014 – 2015 Diện tích (ha) 2014 Năng suất (tấn/ha) Sản lượng (tấn) 2015 Diện tích Năng suất Sản lượng (ha) (tấn/ha) (tấn) Thế giới 23.939.301 11,004 263.439.862 24.225.200 11,157 270.278.871 Châu Phi 17.260.853 8,364 144.365.483 17.526.870 8,376 146.810.039 Châu Mĩ 2.473.942 12,344 30.537.649 2.542.061 12,921 32.844.935 Châu Á 4.183.664 21,104 88.293.119 4.134.373 21,859 90.372.457 20.842 11,688 243.611 21.896 11,483 251.440 Khu vực Châu Đại Dương (Nguồ n: http://faostat3.fao.org) Theo thống kê Faostat (2015) tổng sản lượng sắn giới 270,2 triệu tấn, tập trung chủ yếu châu Phi với xấp xỉ 147 triệu (tăng khoảng 2,5 triệu so với năm 2014), Nigeria nước có tổng sản lượng cao giới 54,8 triệu tấn, suất trung bình 70 tấn/ha Châu Á có sản lượng 90,3 triệu (cao triệu so với năm 2014), Ấn Độ nước có tổng sản 11 lượng cao với 8,1 triệu suất 35,6 tấn/ha Trong châu Mĩ sản lượng 32,8 triệu (cao 2,3 triệu đạt 2014), với suất trung bình 21,8 tấn/ha (Bảng 1.2) Diện tích canh tác sắn giới tăng năm gần (chỉ có Châu Á giảm nhẹ) 1.1.4.2 Tình hình sản xuất sắn Việt Nam Sắn trồng phổ biến Việt Nam từ lâu xem lương thực thức ăn gia súc quan trọng sau lúa ngô Sắn chủ yếu dùng để bán (48,6%), dùng làm thức ăn gia súc (22,4%), chế biến thủ công (16,8%) khoảng 12,2% dùng tiêu thụ tươi (Trần Ngọc Ngoạn, 2007) Bắt đầu từ năm 2000, sắn chuyển đổi từ lương thực sang cơng nghiệp Sắn có ưu điểm phù hợp với hộ nông dân nhỏ nghèo như: dễ trồng, hợp nhiều loại đất, chịu đất nghèo dinh dưỡng mùa khơ hạn, ngồi sắn nằm đất từ tháng đến năm sau trồng thu hoạch cần thiết, vốn đầu tư thấp, phù hợp khả kinh tế với nhiều hộ gia đình nơng dân nghèo, thiếu lao động, tận dụng đất để lấy ngắn nuôi dài Tại Việt Nam, sắn canh tác phổ biến hầu hết tỉnh vùng sinh thái nông nghiệp từ Bắc đến Nam Diện tích sắn trồng nhiều vùng Đông Nam Bộ, vùng Tây Nguyên, vùng núi trung du phía Bắc, vùng ven biển Nam Trung Bộ vùng ven biển Bắc Trung Bộ Thông thường, sắn trồng vụ vào khoảng từ tháng đến tháng thu hoạch sau khoảng - 10 tháng tùy thuộc điều kiện khí hậu vùng Theo thơng báo Hội nghị tồn cầu sắn 2011 Thái Lan từ năm 2000 đến 2010, diện tích trồng sắn Việt Nam tăng từ 237,6 nghìn tới 560,4 nghìn ha, suất tăng từ 8,36 tấn/ha đến 16,90 tấn/ha sản lượng tăng từ 1,99 lên tới 9,45 triệu Hiện 70% sản lượng dành cho xuất Năm 2010, suất sắn đạt mức cao khoảng 17,0 tấn/ha sản lượng sắn nước đạt 8,52 triệu tấn, tức giảm 0,4% so với năm 2009 diện tích trồng sắn giảm 2,5% 560.000 Dự kiến năm 2020 diện tích giảm 450.000 suất tăng 21,0 tấn/ha Bên cạnh sắn cơng nghiệp có giá trị xuất tiêu thụ nước, nguyên liệu để chế biến bột ngọt, bio-ethanol, mì ăn liền, bánh kẹo, siro, nước giải khát, bao bì, ván ép, phụ gia dược phẩm, màng phủ sinh học chất 12 giữ ẩm cho đất Mỗi năm Việt Nam xuất triệu sản phẩm từ sắn, đứng thứ hai khu vực, sau Thái Lan Tuy nhiên, tỷ lệ hao hụt thu hoạch, vận chuyển lớn, chiếm khoảng 10% tổng sản lượng Toàn quốc có 60 nhà máy chế biến tinh bột sắn với tổng công suất khoảng 3,8 triệu củ tươi/năm nhiều sở chế biến sắn thủ công rải rác hầu hết tỉnh trồng sắn Việt Nam sản xuất năm khoảng 800.000 – 1.200.000 tinh bột sắn, 70% xuất gần 30% tiêu thụ nước Bảng 1.3: Diện tích, suất sản lượng sắn Việt Nam từ năm 2010 – 2016 Năm 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 Diện tích (nghìn ha) 489,0 558,2 551,8 554,1 552,7 567,9 569,9 Năng suất (tấn/ha) 17,3 17,7 17,6 17,9 18,5 18,6 19,1 Sản lượng (nghìn tấn) 8595,6 9897,9 9735,7 9757,6 10209,8 10739,9 10931,8 (Nguồ n: https://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=717) Trung Quốc thị trường đầu lớn cho sản phẩm sắn xuất Việt Nam năm 2010, chiếm tới 94,8% tổng kim ngạch xuất sắn lát Tuy nhiên, năm 2010 nhu cầu tiêu dùng sắn cho ngành chế biến nước tăng mạnh khiến nguồn cung dành cho xuất giảm Theo báo cáo thường niên ngành sắn tinh bột sắn Việt Nam năm 2015 triển vọng 2016 AgroMonitor, tổng cầu sắn củ tươi dành cho ngành sản xuất nước năm 2015 khoảng 10,73 triệu gồm: i) Sản xuất ethanol; ii) Tiêu dùng cho người sản xuất thức ăn chăn nuôi: 3,67 triệu tấn; iii) Sản xuất tinh bột sắn: 1,8 triệu tấn; iv) Lượng sắn củ tươi lại dành cho xuất vào khoảng 200.000 tấ n Việt Nam thời gian gần phát triển sách E5, E10 yêu cầu sản xuất từ 100 đến 150 triệu lít năm Thủ tướng Chính phủ phê duyệt "Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015 tầm nhìn đến năm 2025" nhằm mục đích để sản xuất nhiên liệu sinh học phần thay nhiên liệu truyền thống Điều đóng góp vào an ninh lượng bảo vệ mơi 13 trường Tập đồn dầu khí Việt Nam có kế hoạch xây dựng ba nhà máy sắn sản xuất ethanol miền Bắc (Phú Thọ), miền Trung (Quảng Ngãi) miền Nam (Bình Phước) với tổng cơng suất dự kiến khoảng 300 triệu lít năm Để thực lộ trình sử dụng xăng sinh học E5 đề năm 2015 cần khoảng gần triệu sắn tươi; năm 2020 cần khoảng 5,5 triệu đến năm 2025 cần khoảng 6,8 - 8,0 triệu Nếu vào mức sản lượng sắn vào năm 2025, tất nhà máy vào hoạt động với công suất tối đa, nước thiếu khoảng 2,2 - 2,5 triệu sắn tươi nguyên liệu Sự phát triển ngành sắn cho thấy nhu cầu cấp bách công tác hoạch định chiến lược phát triển dài hạn cho ngành này, có tính đến khía cạnh cân đối cung cầu xuất khẩu, nguồn cung nguyên liệu thức ăn chăn nuôi, sản xuất ethanol, quỹ đất đặc biệt cần có hướng đầu tư nghiên cứu để tăng suất sắn Việt Nam 1.1.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh bột sắn 1.1.5.1 Giống Hàm lượng tinh bột củ sắn yếu tố chất lượng quan trọng định giống có chấp nhận hay khơng Trong q trình chọn tạo giống sắn dòng có hàm lượng tinh bột < 25% không lựa chọn Hàm lượng tinh bột tính trạng khó cải thiện biện pháp kỹ thuật canh tác nhiên lại bị ảnh hưởng nhiều yếu tố: thời gian thu hoạch, giống, lượng mưa… Mỗi giống có khả giữ tinh bột mức độ khác nhau, tuỳ thuộc vào khả mà phân giống ngắn ngày, trung ngày, dài ngày Tại Việt Nam, kết khảo sát 250 giống sắn thống kê 34 giống sắn có hàm lượng tinh bột cao (28 - 29,5%): SM 937-26; KM313-3; Gòn (Phạm Bích Ngọc., 2016), (Phu ̣ lu ̣c 1) Những giống có đặc tính quý cần lưu giữ để làm nguồn gen cho nghiên cứu tiếp theo: chọn bố mẹ cho phép lai, làm nguồn vật liệu đột biến tạo biến dị có lợi cơng tác chọn giống (Nguyễn Hữu Hỷ cs., 2012) 1.1.5.2 Yếu tố quang hợp 14 Sản phẩm thu hoạch chủ yếu sắn củ Ngay sau trồng 28 ngày, lượng lớn hạt tinh bột hình thành mạch gỗ nhu mô rễ củ Tuy nhiên, việc phân tích thời gian khơng có khả phân biệt rễ củ mà sau nhờ vào q trình tích lũy tinh bột để trở thành củ số rễ rễ thường Vào khoảng tuần sau trồng, số rễ củ bắt đầu lớn lên cách nhanh chóng Số củ định từ - tháng sau trồng có thay đổi q trình sinh trưởng hầu hết giống sắn Các tác giả cho củ bắt đầu tích lũy cung cấp hydratcacbon vượt yêu cầu sinh trưởng thân (Keating cs., 1998) Một đặc điểm khác biệt sắn so với ngũ cốc khác sắn có phát triển đồng thời phát triển thân tích lũy tinh bột vào củ Có nghĩa sản phẩm quang hợp phân phối cho trì phát triển thân phình to củ Như vậy, suất sắn củ phụ thuộc vào khả quang hợp phân phối vật chất hình thành cho phận khác Có thể nói có cạnh tranh phận mặt đất mặt đất sử dụng sản phẩm quang hợp 1.1.5.3 Nhiệt độ, ánh sáng Cây sắn yêu cầu khoảng nhiệt độ tối thích rộng từ 20 – 40oC Yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng đến tuổi thọ số diện tích Khi nhiệt độ tăng từ 20 – 24oC, tuổi thọ giảm tăng số hình thành (Keating cs.,1998) Từ tác động đến quan hệ quang hợp hô hấp cây, suất củ Trong điều kiện ngày dài đêm ngắn sắn thường tăng cường tích lũy tinh bột củ Độ dài ngày thích hợp để tích lũy tinh bột củ 12h/ngày Khi bị che bóng 60% ánh sáng so với khơng che bóng, suất củ bị giảm tới 36% (Keating cs., 1998) Mặc dù sắn trồng chịu hạn, chí hạn kéo dài tới - tháng Song hạn hán kéo dài làm suất củ bị giảm đáng kể Do số diện tích giảm nhanh điều kiện khô hạn (CIAT 1987-1989) dẫn đến suất củ khơ trung bình giảm 14%, suất thân giảm 38%, suất sinh vật học giảm 22%, hệ 15 số thu hoạch tăng 9% Nhưng có dòng sắn biểu thị khả chịu hạn tốt dòng CM4013-l, suất củ khơ điều kiện thiếu nước đạt tới 11,5 tấn/ha, tăng 0,6 tấn/ha so với số dòng sắn trồng điều kiện khơng thiếu nước (CIAT, 1992) Các dòng có khả thích ứng với điều kiện thiếu nước đủ nước thường có số diện tích cao số diện tích tối ưu 1.1.5.4 Thời vụ Sắn hàng năm có thời gian sinh trưởng dài, thời vụ trồng có điều kiện khí hậu khác có ảnh hưởng rõ rệt đến trình sinh trưởng suất củ Ở châu Á nói chung có hai thời vụ để trồng sắn vào đầu mùa mưa cuối mùa mưa Vụ thứ thường bắt đầu trồng vào từ tháng đến đầu tháng Vụ thứ hai trồng vào tháng tháng Ở nước ta, nghiên cứu thời vụ trồng sắn tỉnh miền Nam (khí hậu ấm quanh năm, có hai mùa mưa mùa khơ rõ rệt) rút kinh nghiệm quý cần chuẩn bị đất trước mùa mưa bắt đầu, có trận mưa đầu mùa cần nhanh chóng trồng sắn suất sắn giảm rõ rệt trồng sắn muộn (Trần Ngọc Ngoạn, 2007) Hiện tượng sắn hai năm vườn làm giảm hàm lượng tinh bột đáng kể lúc trình phân giải tinh bột củ sắn phát triển mạnh, kích thước phần lõi tăng nhanh, thịt củ hoá gỗ, ảnh hưởng nhiều đến chất lượng tinh bột củ sắn 1.1.6 Một số hướng cải tạo giống sắn 1.1.6.1 Cải tạo giống sắn kỹ thuật lai hữu tính CIAT (Trung tâm quốc tế nông nghiệp nhiệt đới) nơi bảo tồn nguồn gen giống sắn đứng đầu giới Hiện CIAT thu thập, bảo quản 5.782 mẫu giống sắn đăng ký FAO gồm 5.138 mẫu sắn lai CIAT, 163 mẫu giống sắn vùng Châu Á, 19 mẫu giống sắn vùng Châu Phi (Hồng Kim, 2011) Trong có 35 lồi hoang dại thu thập nhằm sử dụng lai tạo giống sắn kháng sâu bệnh giàu protein Những nguồn gen giống sắn nêu CIAT bảo tồn đánh giá cẩn thận khả cho suất, giá trị dinh dưỡng, thời gian sinh trưởng, khả chống chịu sâu bệnh hại thích ứng với thay đổi mơi trường Từ chọn cặp bố mẹ phục vụ cho công tác cải tiến giống sắn để trao đổi lưu giữ nguồn gen với nước 16 Hầu hết nghiên cứu sắn tập trung chủ yếu vào việc chọn tạo giống sắn có suất cao, thời gian sinh trưởng ngắn thông qua phương pháp lai tạo truyền thống Một yếu tố góp phần hiệu việc nâng cao suất sản lượng sắn tăng cường nghiên cứu, nhập nội, lai tạo, ứng dụng công nghệ việc chọn tạo nhân giống sắn lai (Trần Cơng Khanh cs., 2008) Trước năm 1990, Gòn, H34 Xanh Vĩnh Phú giống sắn phổ biến Việt Nam Từ năm 1986 đến năm 1993, Trung tâm Hưng Lộc thu thập tuyển chọn giống sắn HL20, HL23 HL24 canh tác năm tỉnh phía Nam khoảng 70 000 – 80 000 (Trần Công Khanh cs., 2009) Giai đoạn 1991 - 2005, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam phối hợp với Chương trình sắn Việt Nam CIAT nhập nội, tuyển chọn giới thiệu cho sản xuất giống sắn tốt: KM60, KM94, KM95, SM937-26, KM98-1 (Trần Công Khanh, 2008) Tổng diện tích giống sắn Việt Nam năm 2005 ước tính đạt 270.000 ha, chiếm 69,2% tổng diện tích sắn nước Năm 2007, giống sắn lai KM140 phát triển nhà khoa học Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam Ưu điểm giống KM140 thời gian sinh trưởng ngắn 7-10 tháng, hàm lượng bột tương đương KM94 (tỷ lệ tinh bột củ ~ 28%), dạng củ đẹp, thịt củ màu trắng, đắng, dạng thẳng (Trần Công Khanh cs., 2008) Hiện số vùng trồng sắn Việt Nam: Quảng Ngãi, Phú Yên, Kon Tum, Tây Ninh,… xuất sắn nhiễm bệnh chổi rồng có nguy bùng phát người dân có thói quen canh tác giống cũ, bị nhiễm bệnh qua hom giống Cho tới phương pháp lai tạo truyền thống việc áp dụng thị phân tử thành công việc tạo giống sắn có phẩm chất cao Tuy nhiên, thực tiễn sản xuất phương pháp lai tạo truyền thống tồn vấn đề khó giải tuyệt đối để phát triển cải tạo sắn theo hướng mong muốn (Phạm Bích Ngọc., 2016) 1.1.6.2 Chọn tạo giống phương pháp xử lý đột biến – chọn dòng Ở Việt Nam, sắn lúa ngô ba trồng ưu tiên nghiên cứu phát 17 triển tầm nhìn chiến lược đến năm 2020 Bộ Nông nghiệp & Phát triển Nơng thơn Năm 2013, diện tích trồng sắn tồn quốc đạt 544,30 ngàn ha, suất củ tươi bình quân 17,89 tấn/ha, sản lượng 9,74 triệu (FAOSTAT, 2014) So với năm 2000, sản lượng sắn Việt Nam tăng gấp 3,93 lần, suất sắn tăng lên gấp hai lần Tuy nhiên, suất sắn Việt Nam thấp so với số nước Đơng Nam Á như: Lào (25,17 tấn/ha), Indonesia (22,86 tấn/ha), Thái Lan (21,82 tấn/ha) Do vậy, để đáp ứng nhu cầu tăng suất phát triển sắn nước cách bền vững thiết phải có giống sắn phong phú cho suất chất lượng cao, thích hợp với nhiều vùng sinh thái Việt Nam Tuy nhiên, trường hợp sử dụng phương pháp lai hữu tính truyền thống từ bảy đến tám năm tạo giống sắn Do vậy, chọn tạo giống sắn phương pháp đột biến xem phương pháp nhằm khắc phục hạn chế phương pháp lai tạo Gần phương pháp chọn tạo giống sắn phương pháp xử lý đột biến nguồn phóng xạ Coban60 đánh giá qua hệ M4 có dòng triển vọng đạt suất củ tươi cao vượt đối chứng 30 - 50 % dòng KM94-14-4, KM140-3, KM 98-5-10-2 NS, KM 140-5- rút ngắn thời gian chọn tạo giống sắn nghiên cứu thành công Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Hưng Lộc - Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam (Phạm Thị Nhạn, Nguyễn Hữu Hỷ, 2015) 1.1.6.3 Áp dụng công nghệ sinh học tạo sắn chuyển gen Năm 1996, nhóm nghiên cứu độc lập đồng thời cơng bố kết chuyển gen thành công vào sắn Việc cải thiện chất lượng giống sắn tạo giống thông qua phương pháp công nghệ sinh học mở hướng nhờ phương pháp tái sinh hiệu từ mô sẹo sắn chuyển gen sau đồng nuôi cấy với A tumefaciens (Li cs., 1996) Bên cạnh kết q trình tạo mơ sẹo phơi hóa giống sắn TMS 60444, Adira 4, Thai M7, từ tạo sắn hồn chỉnh từ mơ Đặc biệt, nghiên cứu làm giảm đáng kể trình hình thành từ mơ sẹo giống sắn TMS60444 mang gen chuyển kĩ thuật, thông qua hệ thống A tumefaciens súng bắn gen (Raemakers 18 cs., 1996) Và sau quy trình chuyển gen vào sắn thông qua kĩ thuật bắn gen mục tiêu vào mô sẹo nhằm tạo nguyên liệu cho trình chọn lọc tế bào mang gen chuyển Kết tạo chuyển gen từ tế bào thử nghiệm với gen mã hóa cho neomycin phosphotransferase (nptII) beta- glucuronidase (uidA) nuôi mơi trường chọn lọc, sau phân tích phân tử Nghiên cứu rằng, DNA ngoại lai tồn hệ gen sắn cách bền vững lâu dài (Schưpke cs., 1996) Hình 1.2 Một số phương pháp phổ biến tạo sắn biến đổi gen (Nguồn: Taylor cs., 2004) Taylor cs., 2004 mô tả hệ thống sử dụng để chuyển gen vào sắn (Hình 1.2) Ở bốn hệ thống sử dụng loại mơ đích khác làm đối tượng chuyển gen: Mơ chưa trưởng thành, cấu trúc phôi, mảnh mầm mơ sẹo phơi hóa Mơ chưa trưởng thành cấu trúc phơi chuyển gen thơng qua vi khuẩn A tumefaciens mảnh mầm hay mơ sẹo phơi hóa sử dụng thêm súng bắn gen để chuyển gen Sau chuyển gen, mơ đích tái sinh mơi trường chọn lọc để tạo hoàn chỉnh mang gen cần chuyển Các đánh giá phân tích hệ thống chuyển gen cho 19 thấy hệ thống có ưu, nhược điểm riêng Mặc dù vậy, nhà khoa học thường ưu tiên lựa chọn phương pháp chuyển gen sử dụng A tumefaciens thay súng bắn gen lí sử dụng A tumefaciens có chi phí thấp cho kết ổn định Khoảng 50% số chuyển gen thu thông qua A tumefaciens mang gen cần chuyển số 10% sử dụng súng bắn gen Nhờ phát triển phương pháp chuyển gen sử dụng A tumefaciens có cải tiến để chuyển gen vào mơ sẹo phơi hóa, kết cho tần suất biến nạp tái sinh chuyển gen cao phương pháp cũ Cho đến nay, phương pháp sử dụng phổ biến để chuyển gen mong muốn vào sắn Cũng chọn tạo giống trồng khác, vấn đề quan trọng chọn giống sắn tích hợp gen đích mong muốn vào nguồn gen phù hợp Đây khó khăn với công tác tạo giống sắn phương pháp chuyển gen lý giống sắn phản ứng khác điều kiện nuôi cấy in vitro, đặc biệt q trình tạo mơ đích phục vụ biến nạp Do đó, việc nghiên cứu khả tái sinh tạo mơ đích phục vụ biến nạp cần thiết giống sắn triển vọng 1.2 QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH VÀ TÍCH LUỸ TINH BỘT Ở CÂY SẮN 1.2.1 Cấu tạo vai trò tinh bột thực vật 1.2.1.1 Cấu tạo tinh bột Tinh bột, công thức hóa học (C6H10O5)n polysacarit carbohydrate chứa tỷ lệ phần trăm amilose amilopectin thay đổi tùy thuộc vào loại tinh bột, tỷ lệ thường từ 20:80 đến 30:70 Tinh bột có nguồn gốc từ loại khác có tính chất vật lí thành phần hóa học khác Chúng polymer carbohydrat phức tạp glucose (công thức phân tử C6H12O6) Tinh bột thực vật tạo tự nhiên từ quả, củ như: ngũ cốc Tinh bột, với protein chất béo thành phần quan trọng bậc chế độ dinh dưỡng loài người nhiều loài động vật khác Ngồi sử dụng làm thực phẩm, tinh bột dùng cơng nghiệp sản xuất giấy, rượu, băng bó xương 20 A Cấu trúc phân tử amylose B Cấu trúc phân tử amylopectin (glucose-α-1,4-glucose) Hình 1.3 Cơng thức hóa học tinh bột (Ng̀ n: https://doi.org/10.1094/1891127012.001) 1.1.1.2 Vai trò tinh bột thực vật Ở thực vật, quan khơng diễn q trình quang hợp thân, rễ, qủa hạt, sucrose chuyển thành tinh bột dự trữ loại plastid chuyên biệt gọi amyloplasts Tinh bột lưu trữ tái sử dụng để hỗ trợ giai đoạn phát triển khác Các phận thu hoạch trồng chủ lực loài người phần lớn quan lưu trữ tinh bột thực vật Có thể kể đến nhóm hạt ngũ cốc (gạo, ngơ, lúa mì, lúa mạch, lúa miến… ) nhóm quan trọng nhất, loại củ thân (khoai tây, khoai lang, khoai mỡ), rễ củ (sắn, khoai môn) hạt họ đậu Hầu hết tinh bột trồng dùng trực tiếp làm thực phẩm thức ăn cho chăn nuôi Tuy nhiên nhu cầu sử dụng tinh bột cho công nghiệp ngày tăng lên Đặc biệt tinh bột sắn nguồn vật liệu chủ yếu cho hệ nguyên liệu sinh học tương lai đặc tính dễ lên men 1.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột gen liên quan 1.2.2.1 Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột Sinh tổng hợp tinh bột q trình phức tạp, có tham gia biểu nhiều gen có khác biệt loài khác phận khác yếu tố quy định q trình chuyển hố tinh bột, cấu trúc tinh bột thuỷ phân tinh bột Quá trình tổng hợp tinh bột α-1,4 glucan bao gồm ba bước quan trọng xảy lục lạp thể vô sắc: i) cung cấp glucose-6-phosphate (Glc-6-P) vào thể lạp, ii) tổng hợp ADP-glucose (ADPG) từ Glc-1-P, iii) tổng hợp tinh bột từ ADPG (Zeeman, 2010) Bước tổng hợp ADPG từ Glc-1-P ATP 21 xúc tác ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) Một hoạt hóa, starch synthase (SS) chuyển ADPG tới đầu không khử α-1,4 glucan để tạo thành sợi α-1,4 glucan Tiếp theo, sợi α-1,4 glucan dùng chất cho enzyme phân nhánh tinh bột (BE Q-enzyme) tạo liên kết sợi α-1,6 amylopectin Cuối amylopectin tinh thể hóa tạo thành tinh bột tác động enzyme phân rã (DPE), phosphorylase (P-enzyme) glucanotransferase (D-enzyme) Ngoài ra, UDP-glucose: protein glucosyltransferase amylogenin (38 45 kDa) dự đoán tham gia vào bước trình tổng hợp tinh bột (Zeeman, 2010) Hình 1.4 Quá trình sinh tổng hợp tinh bột enzyme liên quan (Nguồ n: https://www.jic.ac.uk/STAFF/trevor-wang/images/full/starchpath2.jpg) 1.2.2.2 Một số gen liên quan đến sinh tổng hợp tinh bột Quá trình sinh tổng hợp tinh bột thực vật việc chuyển hoá glucose - - P ATP thành ADP - glucose xúc tác ADP - glucose pyrophosphorylase (AGPase) ADP - glucose monomer cho trình sinh tổng hợp tinh bột với tham gia nhiều enzyme GBSS (Granule bound starch synthase) đảm nhận trình tổng hợp amylose SS (I - IV) giữ vai 22 trò sinh tổng hợp nên amylopectin Ngồi ra, bên cạnh enzyme SS, có enzyme xúc tác q trình phân nhánh SBE (Starch branching enzyme) hay enzyme phân huỷ tinh bột tham gia vào q trình điều hồ hàm lượng tinh bột thực vật (Geigenberger, 2011) * Nhóm gen AGP Enzym AGPase enzym quan trọng, xúc tác cho bước trình tổng hợp tinh bột chứng minh enzym điều hòa, điều chỉnh tốc độ phản ứng tồn chu trình sinh tổng hợp glycogen vi khuẩn tinh bột thực vật Một loạt đột biến gen AGPase Escherichia coli (glgC16) mã hóa cho dạng điều khiển khác enzyme dùng để biểu mạnh plastid khoai tây chuyển gen, vài dòng có khả tích luỹ tinh bột cao dòng khơng chuyển gen 60% (Hostettle., 2014) Tuy nhiên, với khác sắn, ngơ lồi khác việc tăng tinh bột không đạt mức Các nỗ lực khác việc làm tăng hàm lượng tinh bột ngũ cốc sử dụng thể đột biến tiểu đơn vị lớn AGP phần đóng góp nhỏ vào hoạt động xúc tác enzyme giữ vai trò quan trọng việc xác định tính chất điều khiển enzyme Giroux cs., (1996) thu dòng ngơ biểu Sh2r6hs (một biến thể đột biến gen mã hóa cho tiểu đơn vị lớn AGP), mã hóa cho enzyme không nhạy cảm dị lập thể Hàm lượng tinh bột dòng cao so sánh với dòng đối chứng, nhiên % tinh bột hạt khơng tăng lên thay vào khối lượng hạt tăng lên cách đáng kể (Giroux cs., 1996) Trong nghiên cứu gần đây, Li cs., (2011) biểu gen BT2 mã hóa cho tiểu đơn vị bé APG ngơ SH2 mã hóa cho tiểu đơn vị lớn APG ngô dẫn đến việc tăng cường khối lượng hạt hàm lượng tinh bột Hoạt tính AGPase, enzym tổng hợp tinh bột củ giống sắn Fuxuan (F01) có hàm lượng tinh bột cao cách đáng kể so sánh với giống sắn Huanan (H124) có hàm lượng tinh bột thấp hai giai đoạn hình thành hệ thống rễ phần củ Tuy nhiên, hoạt tính enzym amylase rễ F01 thấp 23 so sánh với H124 trong hai giai đoạn Các kết khả tổng hợp tinh bột cao, khả phân giải tinh bột thấp rễ có liên quan mật thiết đến tích lũy tinh bột cao củ giai đoạn phát triển (Li cs., 2016) Mặc dù chất sử dụng cho trình tổng hợp tinh bột, sucrose, glucose fructose có hàm lượng khác mơ khác sắn, điều không thay đổi khả phát triển cách đồng có trật chúng chuyển đổi lẫn cách liên tục suốt trình tổng hợp tinh bột (Geigenberger., 2011) Ở hai giống sắn F01 H124, giai đoạn phát triển hàm lượng đường sucrose thấp nhiều so với hàm lượng glucose fructose, điều có nghĩa đường sucrose sau tổng hợp chuyển cách kịp thời vận chuyển qua thân vào rễ Khơng tìm thấy đường sucrose dịch nhựa hệ thống phloem thân hai giai đoạn tạo củ tạo tinh bột hồn chỉnh Trong đó, hàm lượng fructose glucose cao dịch nhựa hệ thống phloem thân tương ứng với giai đoạn tương tự Điều phần đường sucrose bị phân giải thành glucose fructose giai đoạn vận chuyển qua thân Khơng có fructose lượng lớn glucose phát dịch nhựa hệ thống phloem thân giai đoạn tạo tinh bột hoàn chỉnh biểu thị fructose bị biến đổi phần thành glucose (Geigenberger., 2011) * Nhóm gen GBSS Các gen SS thực vật bậc cao mã hóa nhóm gen ký hiệu GBSS, SSI, SSII, SSIII, SSIV GBSS gắn chặt với hạt tinh bột chịu trách nhiệm tổng họp amylose Các đột biến khác SS (thường gọi SS hòa tan) tạo chuỗi amylopectin (1 dạng tinh bột polyme hóa) tan plastic phần hòa tan phần gắn với hạt tinh bột Số liệu di truyền sinh hóa đột biến enzyme SS có cấu thành khác vai trò định tổng hợp amylopectin Keeling cs., (1998) enzyme SS có vai trò q trình tổng hợp tinh bột, kiểm sốt thơng lượng dòng chảy thể thống Điều chứng tỏ thực tế hoạt động xúc tác tối đa SS 24 q trình trao đổi chất thơng qua q trình tổng hợp tinh bột vài quan dự trữ tinh bột chứng minh SS nhân tố chủ chốt việc điều chỉnh trình tổng hợp tinh bột Vì vậy, hướng nghiên cứu tối ưu trình tạo trồng có hàm lượng tinh bột cao sử dụng cơng nghệ gen Tuy nhiên, việc biểu gen SS lại sử dụng để làm tăng trình tích lũy tinh bột Điều này, chủ yếu diện khác lớp enzym SS trồng tương tác với tạo thành phức hợp protein giữ vai trò cụ thể trình kiến tạo nên hạt tinh bột (Hennen-Bierwagen cs., 2008) Do đó, thay đổi việc biểu SS đơn lẻ dẫn đến hiệu ứng sâu sắc khó lường khơng cấu trúc hạt tinh bột mà hàm lượng tinh bột, bên cạnh đồng phân SS có vai trò đặc trưng phục thuộc lẫn trình tổng hợp tinh bột Vấn đề chứng minh kết thu khoai tây chuyển gen biểu enzym glycogen synthase E.coli (Enzym xúc tác cho phản ứng tương tự SS) củ có hàm lượng tinh bột so với củ đối chứng Thêm vào đó, tinh bột củ chuyển gen có thay đổi thuộc tính cấu trúc Roldán cs., (2007) báo cáo đột biến SSIV TDNA tích lũy tinh bột hạt lớn lục lạp A.thaliana Bên cạnh đó, Szydlowski cs., (2009) đột biến A.thaliana SSIII/SSIV T-DNA tích lũy tinh bột vơ Các liệu tổng thể cho thấy SSIV giữ vai trò quan trọng trình khởi động hình thành hạt tinh bột q trình tích lũy tinh bột, yếu tố thiết yếu để hình thành số lượng đặn hạt tinh bột tìm thấy đối chứng Phân tích việc phân phối chiều dài chuỗi amylopectin đột biến chuyển gen đột biến enzyme SS đặc trưng dẫn tới kết luận nhóm SSI, SSII, SSIII đóng vai trò việc kéo dài chuỗi ngắn, trung bình dài tương ứng (Zeeman, 2010) Thành phần amylose tinh bột tổng hợp GBSS Các đột biến chuyển gen thiếu enzyme cần thiết để tạo khơng có amylose Các hạt tinh bột khơng có amylose có hình thái bình thường, điều chứng tỏ amylopectin cần thiết cho việc hình thành hạt GBSS khác đột biến khác enzyme 25 SS chỗ vị trí đặc biệt hạt kiểu phản ứng Không giống biến thể synthase tinh bột, GBSS chuyển gốc glucosyl từ thực vật bậc cao Bên cạnh gen nghiên cứu, gen SSIV nghiên cứu ứng dụng nhằm tăng hiệu trình sinh tổng hợp tinh bột Nhiều nghiên cứu gần cho cho thấy SSIV giữ vai trò quan trọng khởi đầu q trình hình thành hạt tinh bột (Szydlowski cs., 2009) Để đánh giá ảnh hưởng việc bất hoạt gen SSIV đến trình sinh tổng hợp thuốc cho thấy chuyển gen MUT - SSIV xuất kiểu hình sinh trưởng so với đối chứng Mặt khác, hàm lượng polysaccharide dự trữ không khác biệt so với đối chứng Tuy nhiên, chuyển gen có suy giảm số lượng hạt tinh bột, với gia tăng kích thước hạt tinh bột (Roldan cs., 2007) Để loại bỏ hoạt động SSIV có việc làm giảm số lượng hạt tinh bột hàm lượng tinh bột A.thaliana gợi ý số lượng hạt tinh bột đại diện cho bước điều chỉnh việc kiểm sốt tích lũy tinh bột (D'Hulst & Mérida, 2010) Xác nhận giả thiết này, Gámez-Arjona et al., (2011) báo cáo biểu SSIV làm tăng hàm lượng tinh bột A.thaliana Hàm lượng tinh bột cao tích lũy vào thời điểm cuối ngày huy động hoàn toàn suốt đêm biểu gen SSIV, điều cho phép hình thành tỷ lệ tinh bột cao so sánh với đối chứng Gámez-Arjona cs., (2011) việc biểu gen SSIV dẫn đến việc tăng kích thước hạt tinh bột hàm lượng tinh bột củ khoai tây chuyển gen trồng nhà kính ngồi đồng ruộng Tiếp theo cơng trình nghiên cứu thuốc đột biến khuyết gen SSIV bên cạnh suy giảm số lượng hạt tinh bột/ lục lạp trưởng thành gây tượng khơng tạo thành tinh bột gia tăng hàm lượng ADP - glucose non (Matilda cs., 2013) Trong báo cáo đây, việc điều khiển biểu gen SS (starch synthase) chứng minh có khả tăng tích luỹ tinh bột Tuy nhiên có nghiên cứu nhóm gen có nhiều lớp gen SS (I - IV) khác thực vật Các lớp gen cho tương tác với phức hợp protein đóng vai trò đặc biệt việc tổng hợp cấu trúc cuối 26 hạt tinh bột Do đó, thay đổi việc biểu gen SS dẫn tới ảnh hưởng phức tạp Điều chứng minh rõ nét qua kết thu khoai tây chuyển gen glycogen synthase có nguồn gốc từ vi khuẩn Củ khoa tây chuyển gen tích luỹ lượng tinh bột so với củ khoai tây có cấu trúc, đặc tính bị biến đổi Shewmaker cs., (1994) SS lớp IV có liên quan đến khởi đầu hình thành hạt tinh bột điều khiển số lượng hạt tinh bột lục lạp A.thaliana Việc loại bỏ protein dẫn đến giảm sút tinh bột toàn tinh bột lục tạp tích luỹ hai hạt tinh bột khổng lồ (Rolda’n cs., 2007) Mặt khác, Subasinghe (2013) nghiên cứu ảnh hưởng việc biểu mức gen SSIV làm tăng tích luỹ tinh bột quan quang hợp quan dự trữ Như vậy, việc tăng cường biểu gen SSIV hứa hẹn hướng làm tăng hàm lượng tinh bột tích luỹ quan tự dưỡng dị dưỡng đường công nghệ sinh học * Nhóm gen SBE Bên cạnh SS có gen SBE (Starch branching enzyme) tham gia vào trình sinh tổng hợp tinh bột Quá trình phân nhánh amylopectin xảy đồng thời với trình kéo dài chuỗi Quá trình phân nhánh xúc tác enzyme phân nhánh (BE) Enzyme cắt chuỗi α-l,4-glucan sẵn có chuyển đoạn cắt mang đơn vị glucose nhiều tới vị trí C6 gốc glucosyl chuỗi glucan khác BE thực vật bậc cao bao gồm hai nhóm I II Nhóm I vận chuyển chuỗi dài Phân tích di truyền hai nhóm BE có vai trò đặc biệt tổng hợp amylopectin * Nhóm gen DBE Ngồi enzym tổng hợp tinh bột có enzyme phân huỷ Enzym khử phân nhánh DBE (De-branching enzym) có khả làm điểm phân nhánh có vai trò quan trọng việc định cấu trúc amylopectin Ở thực vật có hai loại DBE: isoamylase (ISA) limitdextrinase (LDA, hay gọi pullulanase) Hai loại khác trình tự amino acid chất, ISA có 27 nhóm ISA1, ISA2, ISA3; ISA1 ISA2 liên quan chặt với tổng hợp amylopectin Vai trò LDA ISA3 phân hủy tinh bột ISA1 hoạt động mạnh chất chuỗi glucan tương đối dài amylopectin bị hòa tan, LDA ISA3 có hoạt tính cao với chuỗi glucan ngắn β-limit dextrins ISA2 dường khơng có hoạt tính xúc tác mà tác dụng điều tiết ổn định ISA1 không tham gia trực tiếp vào trình hủy phân nhánh (Burton cs., 2002) Trong đột biến chuyển gen thiếu hụt ISA1, tinh bột dạng hạt bị giảm, chí khơng có thay phần glucan tan nước Hiện tượng quan sát số thực vật, ví dụ nội nhũ non ngũ cốc, A.thaliana củ khoai tây Trong A.thaliana khoai tây việc hoạt tính ISA2 có ảnh hưởng giống hoạt tính ISA1 (Wattebled cs., 2008) Đột biến thiếu hoạt tính DBE (tức đột biến đồng thời gen: isal, isa2, isa3, ida), đột biến xảy không phát có mặt hạt tinh bột Kết hoàn toàn đồng với ý kiến cho hoạt tính DBE cần thiết cho việc sinh tổng hợp tinh bột 1.3 ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CHỌN TẠO GIỐNG SẮN BIẾN ĐỔI GEN 1.3.1 Hệ thống nuôi cấy in vitro sắn 1.3.1.1 Phương thức nuôi cấy Phương thức tái sinh sắn in vitro phát sinh thơng qua phát sinh quan trực tiếp (mảnh lá, đỉnh sinh trưởng, chồi nách) tái sinh thông qua mô sẹo, phôi soma, mơ sẹo phơi hố Tuy nhiên, phương thức tái sinh sắn thông qua mô sẹo phôi hóa phổ biến 1.3.1.2 Nguyên liệu Về bản, đặc tính sinh lý mơ cấy giống tế bào phơi khả ni cấy thành cơng cao nhiêu Vì vậy, tế bào mô non mô cấy triển vọng (Lê Trần Bình cs., 1997) Tuy nhiên, nguyên liệu thực vật dùng để nuôi cấy in vitro đa dạng: từ thuỳ non (Li cs., 1996), từ đỉnh chồi (Zhang., 2000; Đỗ Xuân Đồng cs., 2012), từ chồi nách 28 (Evans cs., 2015; Nguyễn Văn Đồng cs., 2014), từ mảnh lá, chồi đỉnh chồi nách (Bull cs., 2009)… Hiện nay, hệ thống tái sinh sắn in vitro tiến hành nghiên cứu nhiều giống sắn, chủ yếu sử dụng để tái sinh chuyển gen (Bảng 1.4) 1.3.1.3 Môi trường nuôi cấy Nghiên cứu mơi trường ni cấy giữ vị trí quan trọng lịch sử phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật Cơ sở cho việc xây dựng môi trường nuôi cấy việc xem xét thành phần dinh dưỡng cần thiết cho trình sinh trưởng phát triển Đã có nhiều loại môi trường nghiên cứu phù hợp cho việc ni cấy lồi, phận tùy theo mục đích ni cấy Cho đến có hàng trăm loại môi trường dinh dưỡng xây dựng thử nghiệm có kết Theo nghiên cứu công bố, môi trường nuôi cấy in vitro sắn tiến hành chủ yếu môi trường MS MS biến đổi (Raemakers cs., 2001); môi trường CAM, môi trường CIM (Bull cs., 2009; Evans cs., 2015) 1.3.1.4 Điều kiện nuôi cấy Yêu cầu nhiệt độ cho sinh trưởng phát triển lồi khơng Tuy vậy, nhiệt độ phòng thí nghiệm ln trì 25oC – 28oC Đối với nuôi cấy in vitro sắn, điều kiện nhiệt độ khơng có nhiều khác biệt với điều kiện nuôi cấy mô thông thường, nhiệt độ tối ưu 28oC độ ẩm thích hợp 70 80% (Bull et al., 2009) Ánh sáng ảnh hưởng mạnh đến q trình phát sinh hình thái mơ ni cấy Cường độ ánh sáng phổ biến cho nhiều loại thực vật dao động 1000 - 5000 lux Với cường độ ánh sáng lớn chồi sinh trưởng chậm lại tăng cường trình tạo rễ Đối với trình ni cấy tạo mơ sẹo hay phơi soma mía, cơng trình ghi nhận điều kiện tối hoàn toàn, đến giai đoạn tái sinh rễ đưa điều kiện sáng (Biradar cs., 2009) 29 Bảng 1.4 : Một số cơng trình nghiên cứu tái sinh in vitro sắn Giống sắn Nguyên liệu thực vật Phương thức tái sinh Tác giả Mcol 22, MPer 183 TMS60444 Thuỳ non Tái sinh qua phôi soma Li cs, 1998 Mcol 22, Mcol 1505, TMS 90853 Đỉnh sinh trưởng, non Tái sinh qua phôi soma Sofiari cs, 1997 Mcol 22 Đỉnh sinh trưởng Tái sinh qua phôi soma Groll cs., 2001 TMS 60444, TME 127, TME 8, TME 203, TME 282 Đỉnh sinh trưởng Tái sinh qua phôi soma Taylor cs., 2001 Nanzhi 188 Thuỳ non Tái sinh qua phôi soma Guohua and Qiusheng, 2002 MCOL 22 TMS60444 Chồi nách Tái sinh qua phôi soma Zhang and Puonti – Kaerlas, 2005 TME1, TME2, TME 5, TME 8, TME 12 Đỉnh sinh trưởng thuỳ non Tái sinh qua phôi soma TME8, TME 594, TME 596 Đỉnh chồi nách thuỳ non Tái sinh qua phôi soma TME13, TME 91, TME 92, 127 Đỉnh sinh trưởng thuỳ non Tái sinh qua phôi soma Agua Moma, Amansa Burro, Aparecida, Mata Fome, Rosa, Saica, Rosinha Hanatee Chồi đỉnh, chồi nách Tái sinh qua phôi soma KU 50, Hanatee Đỉnh sinh trưởng thuỳ non Tái sinh qua phôi soma Saelim cs., 2006 Mcol22, T5, KU 50 Đỉnh sinh trưởng thuỳ non Tái sinh qua phôi soma Zhang cs., 2001 CMC 40, TME 203, TME 208 Đỉnh sinh trưởng thuỳ non Tái sinh qua phôi soma Zhang cs., 2006 TMS60444 Mảnh lá, đỉnh sinh trưởng, đỉnh chồi nách Tái sinh qua phôi soma Bull cs., 2009 TME 3, TME 4, TMS 0572, H 165 Đỉnh chồi nách thuỳ non Tái sinh qua phôi soma Beena cs., 2014 KM140, KM94 Đỉnh chồi Tái sinh qua phôi soma Đỗ Xuân Đồng cs., 2014 TMS60444, KM 140 Chồi nách Tái sinh qua phôi soma Nguyễn Văn Đồng cs., 2014 TME 14 Chồi nách thuỳ non Tái sinh qua phôi soma Evans cs., 2015 Hankoua cs., 2005 Atehnkeng cs., 2006 Hankoua cs., 2006 Feitosa cs., 2007 30 1.3.1.5 Hệ thống nuôi cấy * Tái sinh trực tiếp Con đường nghiên cứu tổ hợp chất điều hoà sinh trưởng đến hiệu tái sinh chuyển gen giống sắn (Colombia No.800, Lianbera, Venezuela No.255, Ecuado No.133 and Mexico No.35) nghiên cứu nuôi cấy mô phân sinh đỉnh môi trường MS có bổ sung BA, GA3, NAA nồng độ 5.10-7; 10-7; 10-6 Kết GA3 kết hợp với NAA dẫn đến hình thành rễ BA kết hợp với NAA tạo mơ sẹo hình thành chồi (Kartha cs., 1973) Tương tự giống sắn MCol 22; MCol 155; Mper 183; TMS 60.444 môi trường phù hợp cho tái sinh chồi MS bổ sung 1.0 mg/l BA 0.5 mg/l IBA với tỷ lệ tái sinh trung bình 8,7 chồi / mẫu cấy (Li cs., 1998) Đỉnh sinh trưởng nguyên liệu tái sinh phổ biến, Biradar cs., (2009); Rupinder cs., (2017) sử dụng đỉnh sinh trưởng giống mía CoC-671 làm ngun liệu ni cấy Q trình ni cấy khởi đầu, đỉnh sinh trưởng môi trường MS có bổ sung mg/l BAP, sau 7-10 ngày, đa chồi bắt đầu xuất nhân nhanh cá thể * Tái sinh qua mô sẹo phôi soma Phôi soma tạo thành mơi trường có bổ sung Auxin với nồng độ thấp so với trình hình thành mơ sẹo Sau q trình tái sinh, số lượng chồi tăng theo cấp số nhân Trong cơng trình chuyển gen, yếu tố quan trọng để chuyển gen thành cơng phải có hệ thống tái sinh in vitro hiệu Phôi soma ứng dụng nhiều công nghệ chuyển gen, phơi tạo với số lượng lớn thời gian ngắn, khả tái sinh cao điều kiện chuyển gen khác Cho đến ngày nay, hầu hết cơng trình nghiên cứu chuyển gen dựa hiệu tái sinh thông qua phôi soma (Rupinder, 2015; 2017), ngồi phơi soma ứng dụng việc lựa chọn biến dị soma, kỹ thuật tạo đột biến gen (Suprasanna & Bapat, 2006; Suprasanna cs., 2007) Tỷ lệ hình thành phơi soma đạt cao (82 ± 1.7%) giống sắn KM94 mơi trường MS có bổ sung 12 31 mg/l Picloram (Đỗ Xuân Đồng cs., 2012); đạt 92,22% giống sắn KM 140 mơi trường MS có bổ sung 12 mg/l Picloram (Tống Thị Hường cs., 2017) Hệ thống tái sinh qua mô sẹo, phôi soma cho có nhiều ưu điểm so với phương thức tái sinh trực tiếp nhiều tác giả tập trung nghiên cứu với mục đích xây dựng hệ thống chuyển gen hiệu giống sắn khác Tuy nhiên, phát sinh phôi soma tái sinh với tỷ lệ cao giới hạn vài giống sắn Cây sắn TMS 60444 tái sinh quan từ đỉnh sinh trưởng, chồi nách, thuỳ non nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 10 mg/l BAP Kết hình thành mơ sẹo tuần giảm xuất mô sẹo dễ hỏng (Bull cs., 2009) Mô thực vật (Từ sắn khỏe mạnh 1-2 tháng tuổi) Tạo mô sẹo môi trường bổ sung auxin Trong điều kiện tối Tạo phôi soma môi trường bổ sung auxin nồng độ thấp Trong điều kiện tối Tái sinh Môi trường bổ sung chất thuộc nhóm cytokinin, điều kiện sáng Ra rễ (Bổ sung auxin) Trong điều kiện sáng Hình 1.5: Quy trình tái sinh in vitro thơng qua phơi soma sắn Bên cạnh kỹ thuật tạo mơ sẹo phơi hố (FEC) khơng tạo giống bệnh mà nghiên cứu phát sinh hình thái phơi vơ tính, nhân sinh khối tế bào dịch lỏng, nuôi cấy dung hợp tế bào trần để tạo giống lai tứ bội thể, nghiên cứu chuyển gen bảo quản nguồn gen Mô sẹo phôi hố xem loại mơ mà tái sinh tạo chồi bình thường với tỷ lệ nhiều 32 so với cấu trúc mô khác Ở giống sắn TMS 60444 tỷ lệ tạo mô sẹo phôi hoá 64% (Nguyễn Văn Đồng cs., 2014); giống KM 297 mơ sẹo phơi hố đạt 30 ± 3% nuôi cấy môi trường MS + mg/l picloram (Vũ Văn Kiên, Nguyễn Du Sanh, 2011) giống sắn TME14 đạt tỷ lệ mơ sẹo phơi hố cao (51 – 75%) (Evans cs., 2015) Hình 1.6 Kết tạo mơ sẹo phơi hố giống sắn TME 14 (Nguồ n: Evans cs., 2015) Ở nước ta, các nghiên cứu in vitro về sắn mới chỉ tâ ̣p trung vào viê ̣c nhân nhanh, trì tiń h tra ̣ng tố t, sa ̣ch bê ̣nh nhằ m thu đươ ̣c giố ng sắn với suấ t, sản lươ ̣ng, chấ t lươ ̣ng đáp ứng yêu cầ u của các nhà trồ ng tro ̣t (Nguyễn Thị Thuý Hằng cs., 2011) Tuy nhiên, công tác cho ̣n ta ̣o giố ng sắn mới bằ ng công nghê ̣ chuyển gen hiê ̣n còn mới ở Viê ̣t Nam Kế t quả nghiên cứu chuyể n gen còn rấ t khiêm tố n, đă ̣c biê ̣t là chuyể n gen tăng hàm lượng tinh bột vào sắn Hiện nay, có mô ̣t số it́ nghiên cứu bước đầ u tạo mơ sẹo phơi hố phục vụ chuyển gen (Vũ Văn Kiên Nguyễn Du Sanh, 2011; Đỗ Xuân Đồng cs., 2012; Nguyễn Văn Đồng cs., 2014) cơng trình nghiên cứu chuyển gen kháng nấm Chitinase gluconase vào sắn (Quách Vũ Quỳnh Hương cs., 2006) 1.3.2 Một số phương pháp chuyển gen sắn Những cơng trình nghiên cứu chuyển gen vào sắn xây dựng với hai phương pháp khác nhau: phương pháp dùng súng bắn gen (Schopke cs., 33 Raemakers cs., 1996; Munyikwa cs., 1998; Zhang cs., 2000a; Zhang & Puonti-Kaerlas., 2000; Bùi Lan Anh cs., 2008) chuyển gen nhờ Agrobacterium (Li cs., 1996; Gonzalez cs., 1998; Sarria cs., 2000; Zhao cs., 2011) nghiên cứu thành công Ở phương pháp chuyển gen trực tiếp vào sắn cho số kết định Tuy nhiên, nhược điểm phương pháp phải xử lí mơ/tế bào trước thao tác dẫn tới tỉ lệ tái sinh sau chuyển gen thấp Hơn nữa, khả chèn vào gen thấp nên gen chuyển thường có nhiều khả di truyền cho hệ khơng cao Bên cạnh phương pháp chuyển gen qua Agrobacterium dựa chế tự nhiên, gen chuyển định hướng gắn vào gen, thao tác đơn giản sử dụng phổ biến chuyển gen thực vật, có sắn 1.3.2.1 Chuyển gen súng bắn gen Trong số nghiên cứu cuối kỷ XX, súng bắn gen sử dụng để chuyển gen cho sắn nhờ kỹ thuật gen gắn vào hạt có kích thước micro bắn vào tế bào huyền phù có khả tạo phơi nhằm tạo ngun liệu cho q trình chọn lọc tế bào mang gen chuyển Thử nghiệm với gen mã hóa cho neomycin phosphotransferase (nptII) beta- glucuronidase (uidA) ni mơi trường chọn lọc sau phân tích phân tử, nghiên cứu DNA ngoại lai tồn hệ gen sắn bền vững lâu dài Từ tế bào nuôi cấy tái sinh thành chuyển gen thành thục phơi mơi trường thích hợp Kết dòng chuyển gen cho thấy dương tính với thuốc thử GUS paromomycin tái tạo, hai số xác nhận phân tích Southern blot (Schopke cs., 1996) Cũng có số cơng bố kết chuyển gen súng bắn gen như: giống sắn TMS60444 với plasmid pHB1 pJIT100 (Munyikwa cs., 1998), chuyển gen vào mầm soma giống sắn: CMC40, MPer183, MCol22 TMS60444 (Zhang cs., 2003; 2006 ) hay chuyển gen bar – gen kháng thuốc diệt cỏ nhờ sử dụng súng bắn gen để đưa DNA vào mảnh sắn (Bùi Lan Anh cs., 2008) nhiên phương pháp tốn khả tạo thể 34 khảm (Schopke cs., 1996) 1.3.2.2 Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn A.tumefaciens Chuyển gen thông qua A.tumefaciens phương pháp chuyển gen gián tiếp hữu hiệu dùng để chuyển gen thực vật Phương pháp dùng Ti – plasmid A tumefaciens làm vector đưa DNA vào tế bào Trước nhà nghiên cứu cho rằng, hệ thống chuyển gen gián tiếp nhờ A.tumefaciens không dễ dàng có hiệu thấp thực vật lớp mầm bao gồm ngũ cốc giới lúa, lúa mì, ngơ Phương pháp chuyển gen thường dùng cho loại hai mầm A.tumefaciens mẫn cảm với loại có tần suất chuyển nạp gen cao nhiều so với mầm (Nguyễn Đức Thành., 2003) Tuy nhiên, việc chuyển gen thông qua A.tumefaciens trở thành công cụ hữu hiệu công nghệ chuyển gen thực vật, kể hai mầm mầm Đây phương thức chuyển gen có hiệu hẳn phương pháp chuyển gen trực tiếp gián tiếp khác dễ sử dụng, tốn kém, hiệu chuyển gen cao mà số lượng copy vào hệ gen ít, thường có tạo thuận lợi cho việc phân tích chuyển gen khơng gây thương tổn tế bào (Anwar cs., 2011) Đối với sắn, giới có nhiều cơng trình chuyển gen thành công nhờ A.tumefaciens mở hướng cải thiện chất lượng giống sắn tạo giống thông qua phương pháp công nghệ sinh học công bố: Li cs., (1996) đưa phương pháp tái sinh hiệu từ mô sẹo giống sắn MCol22 sau đồng nuôi cấy với A.tumefaciens; Gonzalez cs (1998) thành công chuyển gen nptII, uidAint vào mơ sẹo phơi hố giống sắn TMS60444 Reamakers cs., (1996) tạo mô sẹo phơi hóa giống sắn TMS 60444, Adira 4, Thai and M7, từ tạo sắn hồn chỉnh từ mơ Đặc biệt, nghiên cứu làm giảm đáng kể thời gian hình thành từ mô sẹo giống sắn TMS60444 mang gen chuyển kĩ thuật, thông qua hệ thống A.tumefaciens súng bắn gen (Raemakers cs., 2001) Nhờ cải tiến phương pháp sử dụng A tumefaciens để chuyển gen vào mơ sẹo phơi hóa (Li cs.,1996), kết nghiên cứu sau thu kết chuyển gen với tần 35 suất biến nạp tái sinh chuyển gen cao phương pháp trước Hiện nay, phương pháp sử dụng phổ biến để chuyển gen mong muốn vào sắn (Bull cs., 2009; Zhao cs., 2011; Evans cs., 2015) Ở Việt Nam, phương pháp chuyển gen thông qua A.tumefaciens sử dụng rộng rãi để chuyển gen vào trồng đạt số thành tựu đáng kể Gen Cry1A chuyển thành công vào hông cải thông qua A tumefaciens EHA 105 để kháng sâu xanh Heliothis armigera (Lê Tấn Đức cs., 2007) Thiết kế vector chuyển gen cryIA (c) thành công vào bắp cải báo cáo (Đặng Trọng Lương cs., 2001) Cây thuốc lá, lúa, cải ngọt, Paulownia mang gen kháng sâu đơn cryIA(b), cryIA(c) gen kháng sâu lai cryIA (b), cryIB kháng số loài sâu thuộc họ cánh vảy (Lê Tấn Đức cs., 2007) Khả tái sinh biến nạp thông qua nách mầm giống đậu tương (Glycine max L.) DT12 DT84 A.tumefaciens nghiên cứu (Nguyễn Thu Hiền cs., 2010), Cây xoan ta (Melia azdazach L.) chuyển gen mã hoá gibberellin 20 – oxidase A tumefaciens (Đỗ Xuân Đồng cs., 2011) Quy trình chuyển gen thông qua A.tumefaciens vào xoan ta (Melia azedarach L.) tối ưu với hiệu suất cao, đạt 81,15% (Bùi Văn Thắng cs., 2013) Quy trình chuyển gen hiệu vào phơi soma giống mía ROC22 (Saccharum officinarum L.) thông qua vi khuẩn A tumefaciens báo cáo (Phan Thị Thu Hiền cs., 2015) Nghiên cứu tạo khoai lang chuyển gen kháng bọ hà thông qua vi khuẩn A tumefaciens (Vũ Thị Lan cs., 2015) Nghiên cứu chuyển gen cry 8Db vào khoai lang nhờ vi khuẩn A Tumefaciens (Phạm Bích Ngọc cs., 2015) Tuy nhiên, chuyển gen thơng qua vi khuẩn A tumefaciens vào số giống sắn Việt Nam có số cơng trình cơng bố Vì vậy, hướng cần quan tâm sớm nhà nghiên cứu 1.3.3 Một số nghiên cứu tạo sắn biến đổi gen Cùng với phát triển công nghệ sinh học vào sắn, việc khai thác hệ gen chức sử dụng kỹ thuật di truyền để giải vấn đề liên quan tới 36 cải tạo giống sắn đóng vai trò đẩy mạnh diện tích thâm canh ứng dụng cơng nghiệp sắn tồn giới Bảng 1.5: Tổng kết số cơng trình cơng bố chuyển gen vào sắn Mơ đích Phương pháp chuyển gen MS Agrobacterium TMS 60444 NCHP Súng bắn gen hpt, nptII, uidAint nptII, uidA Col22 NCHP Súng bắn gen luc, pat Cây CG TMS 60444 NCHP Súng bắn gen luc, AGPase, pat Cây CG TMS 60444 NCHP nptII, uidAint Cây CG Gonza´ lez cs 1998 nptII, bar , uidA Cây CG Sarria cs 2000 Giống MCol22 Agrobacterium Agrobacterium Gen Kết bật Tài liệu tham khảo Cây CG Li v cs 1996 Cõy CG Schoăpke v cs 1996 Raemakers cs 1996 Munyikwa cs 1998 MPer183 MS MCol22, TMS60444 MS Súng bắn gen hpt, uidAint Cây CG Zhang cs 2000a TMS60444 NCHP Agrobacterium uidAint, hpt, pmi Cây CG Zhang cs 2000b TMS60444 NCHP Súng bắn gen uidAint, hpt, pmi Cây CG Zhang and Puonti-Kaerlas 2000 NCHP Agrobacterium uidAint, hpt Cây CG Zhang cs 2003b NCHP Agrobacterium uidAint, hpt Cây CG MSPH Agrobacterium nptII Cây CG Zhang et al 2003a Siritunga and Sayre 2003 MSPH Agrobacterium nptII Cây CG TMS60444 MSPH Agrobacterium nptII Cây CG TMS60444 NCHP Agrobacterium nptII Cây CG TMS60444 NCHP Agrobacterium GBSS-as2 and GBSS-as7 Cây CG TMS60444 MS Agrobacterium nptII TMS71173 MS Agrobacterium nptII TMS60444 NCHP Agrobacterium hpt TMS60444 MSPH Agrobacterium GUSplus TMS60444, Adira 4, Thai 5, M7 MCol1505 TMS60444 MCol 2215 Siritunga and Sayre 2004 Siritunga and Sayre cs 2004 Chellappan cs 2004 Zhang cs 2005 Raemakers cs 2005 Cây CG Ihemere cs 2006 Vanderschuren cs Cây CG 2007a Quy trình CG Bull cs 2009 Cây CG 37 TMS60444 NCHP Agrobacterium hpt Cây CG KU 50 TMS60444 TMS60444 TMS60444 TMS60444 TMS60444 TMS60444 MS NCHP MS NCHP NCHP NCHP MSPH Agrobacterium Agrobacterium Agrobacterium Agrobacterium Agrobacterium Agrobacterium Agrobacterium ipt pCP2 nptII nptII hpt nptII GUS Cây CG Cây CG Cây CG Cây CG Cây CG Cây CG Cây CG TMS60444 MSPH Agrobacterium GFP Cây CG TME14 MSPH Agrobacterium Cây CG TMS60444 MSPH Agrobacterium nptII, GUS AtZIP1, AtMTP1 Cây CG Vanderschuren cs 2009 Saelim cs 2009 Beltran cs 2010 Zhang cs 2010 Abhary cs 2011 Zhao cs 2011 Yadav cs 2011 Taylor cs 2012 Nguyễn Văn Đồng cs.2014 Evans cs 2015 Gaitán - Solís cs 2015 Ghi chú: MS: mô sẹo; NCHP: Nuôi cấy huyền phù; MSPH: Mơ sẹo phơi hố; CG: chuyển gen Trong khoảng thời gian 20 năm tính từ sắn chuyển gen báo cáo đến có nhiều thành tựu đáng kể thu công tác cải tạo giống sắn công nghệ chuyển gen Bên cạnh giống sắn mơ hình sử dụng phổ biến nghiên cứu, giống sắn thương mại bắt đầu đưa vào thử nghiệm Hầu hết cơng trình cơng bố chuyển gen nhờ Agrobacterium sắn chuyển vào giống sắn mơ hình TMS60444, gen chuyển gen GUS gen chọn lọc Chỉ có số cơng trình Munyikwa cs., (1998); Zhang cs., (2005) có kết chuyển vào gen đích (AGPase, GBSS-as2 GBSS-as7) Sự cải tiến đặc điểm sắn đóng vai trò quan trọng, định xu hướng nghiên cứu tương lai (Liu cs., 2011) 1.3.3.1 Kháng virus sâu bệnh Đối với trồng nhân giống vô tính, bệnh hại sâu bệnh virus lây truyền thông qua lây nhiễm vào thân truyền từ hệ sang hệ khác, nguyên nhân làm giảm suất Ví dụ: CMD (CMDCassava Mosaic Disease) bệnh khảm sắn virus gây phổ biến Châu Phi, CMD làm giảm suất từ 20 - 95% tính diện tích gieo trồng (Legg Fauquet., 2004) Để phát triển sắn kháng bệnh khảm, nhà nhân giống sử dụng quần thể giống kháng bệnh từ sắn hoang dại (Manihot glaziovii) để thu 38 giống kháng CMD, giống trồng rộng rãi vùng có dịch lớn vùng Châu Phi Từ đó, ảnh hưởng dịch bệnh sản lượng sắn giảm thiểu, nghề trồng sắn bắt đầu phục hồi Ngoài ra, hai vector sử dụng pILTAB9001 pILTAB9002 mang gen hoang dại gen đột biến AC1 ACMV-Kenya để tạo dòng chuyển gen vào TMS60444 tăng cường khả kháng bệnh khảm sắn (Chellappan cs., 2004) Phân tích khảo nghiệm ban đầu cho kết chuyển gen có khả kháng số bệnh geminivirus Châu Phi Ở sắn, bệnh sọc nâu bệnh nghiêm trọng virus gây Châu Phi, đặc biệt vùng biển miền Đông Châu Phi Một số phòng thí nghiệm triển khai tạo dòng sắn chuyển gen kháng bệnh cách chuyển gen mã hóa cho protein vỏ virus thơng qua siRNA (small interfering RNA) nhằm đảm bảo sản lượng sắn tương lai (Patil cs., 2011; Yadav cs., 2011) Ngồi virus, vi khuẩn gây bệnh sắn có côn trùng gây hại như: rệp sáp, ve bét xanh, sâu đục thân bướm trắng; giun tròn ký sinh nốt rễ tác nhân gây bệnh phổ biến sắn Do đó, diện tích thâm canh giống sắn có khả kháng sâu tăng nhanh Các protein diệt côn trùng protein Bt Cry, chất ức chế protease, chất ức chế α-amylase lectin thực vật lựa chọn cho hướng nghiên cứu biểu cao sản phẩm tốt để tăng khả kháng côn trùng sắn chuyển gen (Liu cs., 2011) 1.3.3.2 Cải thiện khả chống stress Cây sắn loài nhiệt đới, sinh trưởng chủ yếu vùng nhiệt đới cận nhiệt đới 30 độ Bắc Nam xích đạo, độ cao 2300 m Cây sắn dễ bị ảnh hưởng stress lạnh, bị stress lạnh thường bị sụt giảm sản lượng củ rõ rệt Vì vậy, trì sắn mùa đơng khó khăn với người nơng dân chúng nhạy cảm với nhiệt độ thấp Do đó, cải thiện giống sắn có khả chống chịu phát triển ổn định điều kiện nhiệt độ thấp tăng diện tích thâm canh sắn thời gian tới vấn đề cần thiết Dựa số nghiên cứu gần cho thấy biểu mức độ cao gen mã hóa cho nhân tố hoạt hóa 39 phiên mã - nhân tố liên kết với yếu tố phản ứng nước/C-repeat điều hòa promoter cảm ứng nhiệt độ thấp promoter CaMV 35S cải thiện đáng kể khả chống chịu nhiệt độ thấp sắn (Zhang cs., 2011) Ngoài ra, vấn đề thiếu nước gián đoạn xảy vùng nhiệt đới cận nhiệt đới yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sinh trưởng suất sắn Để thích nghi với thay đổi mơi trường, sắn thường rụng để trì sống Cơng trình nghiên cứu sử dụng promoter cảm ứng già hóa gen SAG12 để biểu gen ipt sắn chuyển gen cho thấy không kéo dài thời gian sống mà cải tiến khả chống chịu stress hạn hán (Zhang cs., 2010) Ngồi có nhiều gen liên quan đến khả chống chịu stress sắn xác định việc sử dụng phân tích chuyên sâu mức độ gen mức phiên mã (Li cs., 2010; Yang cs., 2011) Việc xác định chức gen giúp hiểu chế phân tử tính chống chịu với yếu tố stress khác mơi trường, từ hình thành nên nghiên cứu nhằm cải tiến di truyền sắn 1.3.3.3 Giảm độc tính cyanide Siritunga cs., (2003) sử dụng promoter đặc hiệu từ A.thaliana để điều khiển biểu antisense gen cytocrom P450 (CYP79D1 CYP79D2) Hàm lượng linamarin chuyển gen giảm từ 60 - 90% so với đối chứng, giảm tới 99% củ tiến hành kiểm tra in vitro Điều nhận định vận chuyển linamarin theo chiều từ rễ Năm 1998 có cơng bố mức độ hàm lượng vận chuyển hydroxynitrile lyase củ sắn 6% so với (White cs., 1998) Sự biểu mức hydroxynitrile lyase giảm hàm lượng acetone cyanohydrin củ, làm tăng nhanh trình giải độc (Siritunga cs., 2003) Để thực mục đích trên, cDNA gen mã hóa cho hydroxynitrile lyase dòng hóa vào vector chuyển gen MCol2215, gen promoter CaMV 35S yếu tố kết thúc trình tự ribulose bisphotphat carboxylase từ đậu Hà Lan, vector sử dụng để chuyển gen (Siritunga and Sayre., 2004) Trong nghiên cứu này, hoạt động hydroxynitrile lyase tăng từ 40-135% chuyển gen có hàm lượng 40 800-1300% rễ, hàm lượng tổng số linamarin lotaustralin toàn thể thực vật không thay đổi Sau thu hoạch, khả giải độc củ tăng lên Ngoài ra, Jørgensen cs., (2005) thiết kế thí nghiệm tương tự sử dụng kỹ thuật RNAi phát hàm lượng cyanogenic glucoside củ sắn giảm tới 92% Các sắn chuyển gen nghiên cứu trồng thử nghiệm đồng ruộng Nigeria 1.3.3.4 Tăng hàm lượng chất lượng dinh dưỡng Hàm lượng tinh bột củ sắn cao protein lại thấp Tăng cường hàm lượng protein củ sắn cải thiện cân dinh dưỡng chế độ ăn kiêng người dân sử dụng sắn nguồn lương thực, vùng Trung Tây Phi vấn đề cần quan tâm Zhang cs., (2003) công bố sắn chuyển gen cải thiện hàm lượng protein (ASP1), giàu axit amin thiết yếu, gen điều khiển promoter CaMV 35S Sự biểu ASP1 mức độ RNA protein phát chuyển gen Kết thu chuyển gen cho thấy gia tăng hàm lượng proline serine lá; hàm lượng axit aspartic, alanine methionine lại giảm xuống so sánh với không chuyển gen Điều định hướng để thực nghiên cứu cải thiện hàm lượng protein thời gian Ngoài số nhà khoa học sử dụng promoter patatin để điều khiển biểu protein dung hợp zeolin (là kết hợp protein phaseolin từ đậu cô ve protein γ-zein ngô), kết hình thành proteosom ổn định lưới nội chất, làm tăng rõ rệt hàm lượng axit amin protein củ sắn Ở sắn chuyển gen cho thấy thành phần biến thể axit amin hàm lượng cyanide dạng khử (Abhary cs., 2011) Do vậy, phương pháp chuyển gen để tăng hàm lượng protein sắn thực tiễn hữu ích để giảm thiếu hụt protein cho vùng có nhu cầu Cùng với hỗ trợ quỹ Bill Melinda Gates năm hỗ trợ chương trình hành động tồn cầu, dự án BioCassava Plus phát triển số lượng lớn dòng sắn chuyển gen có thêm nhiều đặc tính: khả kháng 41 virus, cải thiện hàm lượng protein, gia tăng hàm lượng vitamin A, sắt, kẽm Một số dòng khảo sát quy mơ đồng ruộng (Sayre cs., 2011) Cùng với hỗ trợ dự án Harvest Plus, nghiên cứu dinh dưỡng sắn khuyến khích vấn đề nhân giống làm tăng hàm lượng β-caroten (Oliveira cs., 2010) 1.3.3.5 Cải thiện hàm lượng chất lượng tinh bột Do sắn trồng có nhiều tinh bột nên chất lượng tinh bột sắn đặc điểm nông học quan trọng Hàm lượng amylopectin củ sắn dao động từ 70 - 80% hàm lượng amylose từ 20 - 30% phụ thuộc vào kiểu gen điều kiện sinh trưởng Tỷ lệ amylose amylopectin quy định đặc tính hạt tinh bột ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm bắt nguồn từ tinh bột ứng dụng ngành công nghiệp (Ví dụ: dược phẩm, hóa học sản xuất giấy, ethanol,…) Quá trình sinh tổng hợp tinh bột quy định ba enzyme quan trọng: AGPase, sartch synthase (SS) starch branching enzyme (SBE) phân lập (Munyikwa cs., 1997; Baguma cs., 2003; Roldan cs., 2007; Gamez cs., 2011; Carciofi cs., 2012) Các nghiên cứu cho thấy ức chế kết hoạt động AGPase việc chấm dứt phần tồn phần tổng hợp tinh bột Do đó, việc cải thiện hoạt động AGPase góp phần vào q trình chuyển hố đường với tinh bột sau tác động làm tăng hàm lượng tinh bột sắn nâng cao suất, chất lượng sắn tương lai (Ihemere cs., 2006; Matilda cs., 2013; You-Zhi cs., 2016) Tóm lại, tinh bột thành phần quan trọng thực vật nguồn lương thực nguyên liệu công nghiệp Cải tiến trồng theo hướng tăng hàm lượng tinh bột hướng nghiên cứu quan trọng nhà khoa học quan tâm hàng đầu Do vậy, nghiên cứu tìm hiểu đường tổng hợp phân hủy tinh bột trồng nói chung sắn nói riêng góp phần thúc đẩy mục tiêu cải tạo hàm lượng tinh bột Và quan trọng hơn, nghiên cứu mơ hình lồi lương thực khác khơng cung cấp đủ thơng tin cho mục đích Bởi trình khác 42 loài, phận khác cây, bao gồm nhân tố điều khiển trao đổi chất tinh bột, cấu trúc tinh bột đường phân hủy tinh bột khác Xuất phát từ sở trên, gen liên quan tới trình sinh tổng hợp tinh bột nghiên cứu đối tượng sắn Việt Nam Phân lập - gen để thiết kế hệ thống vector chuyển gen hữu hiệu chuyển vào sắn nhằm cải tạo sắn theo hướng tăng hàm lượng tinh bột 43 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1 Vật liệu thực vật - Các giống sắn thu thập từ nguồn: Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam Trung tâm tài nguyên thực vật, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam (Phụ lục 1) - Giống thuốc K326 Phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học cung cấp 2.1.2 Chủng vi khuẩn, vector - Chủng vi khuẩ n Agrobacterium tumefaciens C58/pGV2260, vi khuẩn Escherichia coli DH5(α) Phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp - Vector tách dòng pBT để tách dòng đoạn gen quan tâm, vector chuyển gen pBI121 Phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp; vector pK7WG2D (Ghent Uni Belgium); vector nhân dòng pENTRTM/DTOPO® (Invitrogen) (Phụ lục 3) 2.1.3 Hố chất thiết bị thí nghiệm * Hóa chất dùng cho sinh học phân tử Dung dịch TAE 1X (40 mM Tris, 20mM acetic acid mM EDTA); Agarose 0,8%; Ethidium bromide 0,5 µg/ml, thang ADN 1kb (Thermo); kit tinh ADN Gene JET gel extraction (Thermo) Kit tách chiết plasmid (QIAprep Spin Miniprep Kit) hãng QIAGEN (Đức); Gateway® LR ClonaseTM II Enzyme mix Kit (Invitrogen, Cat No: 911791 – 020) * Hóa chất dùng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật chuyển gen Các hóa chất đa lượng, vi lượng, vitamin, chất điều hòa sinh trưởng BAP, kinetin, IBA, NAA, Yeast extract, Bacto pepton, Trypton, NaCl, Agarose, Sucrose, Tris HCL, EDTA, MgSO4, Glycerol, Glycine betaine, Proline, Kanamycin, 44 Rifamycin, Cefotaxime, X-gluc loại hóa chất thơng dụng khác cung cấp hãng Sigma (Mỹ), Merck (Đức) Wako (Nhật Bản) * Thiết bị thí nghiệm Các thiết bị dùng nuôi cấy mô tế bào thực vật chuyển gen: box cấy vơ trùng, bình ni cây, nồi khử trùng, máy nuôi lắc, máy đo pH, máy đo OD Các thiết bị dùng sinh học phân tử: pipetman, máy soi gel (Bio-Rad), máy chụp ảnh điện di (Amersham Pharmacia Biotech), máy li tâm (Eppendorf), điện di (Bio-Rad), máy hút chân không (Savant), máy PCR System 9700 (Appied Biosystem), bể ổn nhiệt, máy biến nạp xung điện, máy voltex v.v trang thiết bị khác Phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, phòng Cơng nghệ ADN ứng dụng Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.1.4 Môi trường nuôi cấy * Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Môi trường Thành phần môi trường LB đặc g/l Yeast extract; 10 g/l trypton; 10g/l NaCl; 16 g/l agar; pH = LB lỏng g/l Yeast extract; 10 g/l trypton; 10g/l NaCl; pH = * Môi trường nuôi cấy chọn lọc sắn chuyển gen Môi trường Tạo mô sẹo Cảm ứng tạo phôi Đồng nuôi cấy Chọn lọc chuyển gen Tái sinh chồi chuyển gen Tạo hoàn chỉnh Ký Thành phần môi trường hiệu CP CI2 CI2 CI2 CN2 MR MS + 10 mg/l picloram + 20 g/l sucrose + 2,6 g/l gellan, pH = 5,8 MS + mg/l picloram + 0,2mg/l IBA + 20 g/l sucrose + 2,8 g/l gelan; pH = 5,8 MS + mg/l picloram + 0,2mg/l IBA + 20 g/l sucrose + 2,8 g/l gelan + 100µM AS; pH = 5,8 MS + mg/l picloram + 0,2mg/l IBA + 20 g/l sucrose + 2,8 g/l gelan + 60 mg/l Km + 500 mg/l cefotaxime; pH = 5,8 MS + 0,3mg/l BAP + 20 g/l sucrose + 2,8 g/l gelan + 60 mg/l Km, pH = 5,8 MS + 20 g/l sucrose + 2,8 g/l gelan + 50 mg/l Km; pH = 5,8 45 2.1.5 Thời gian địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: tháng 4/2013 – 10/2017 Địa điểm: Các thí nghiệm thực Phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, Phòng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen Trại thực nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Lựa chọn giống sắn phân nhóm giống sắn dựa vào tiêu đánh giá Cùng với hỗ trợ Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc, Viện KHKT Nông nghiệp Miền Nam chúng tơi có kết phân loại 250 dòng/giống sắn đại diện nhóm có hàm lượng tinh bột cao (>28%), trung bình (25-28%) thấp ( 3,5 kb (Hình 3.10C) Sau dòng khuẩn lạc nuôi lượng lớn để tách chiết plasmid phục vụ cho việc giải trình tự gen Kết đọc trình tự gen cho thấy, sản phẩm gen tách dòng từ mẫu nghiên cứu có kích thước 3189 bp (Phụ lục 2) Trong gen phân lập có độ tương đồng với gen 79 tham chiếu với mã Manes.15G118600 phytozome 99%, khác 11 vị trí (120, 223, 282, 734, 841, 1574, 1982, 2520, 2913, 3051, 3094) giống Đỏ ĐF 13 vị trí (229, 253, 254, 288, 734, 1268, 1353, 1622, 1761, 2941, 3051, 3086, 3094) giống KM140 (Bảng 3.6) Trình tự gen phân lập mã hoá cho 1061 axit amin suy diễn, so sánh với trình tự axit amin gen tham chiếu với mã cassava4.1_000719m khác vi ̣trí của giố ng Đỏ ĐF: vi ̣trí 280 thay thế E, vi ̣ trí 524 thay thế L, vi ̣ trí 660 thay thế S và khác ở 12 vị trí của giớ ng KM140 có: vị trí 51 axit amin S, vị trí 76 thay S, vị trí 84 thay D, vị trí 85 thêm axit amin I, vị trí 95 thay D, vị trí 244 thay G, vị trí 422 thay I, vị trí 450 thay R, vị trí 540 thay R, vị trí 979 thay L, vị trí 1028 thay K vị trí 1031 thay N (Bảng 3.7) Bảng 3.7 Vị trí sai khác trình tự axit amin suy diễn protein SSIV gen phân lập STT 10 11 12 13 14 15 Vị trí 51 76 84 85 95 244 280 422 450 524 540 660 979 1028 1031 SSIV Đỏ ĐF S R I E E E V Q L K S F R D SSIV KM140 Mất S S D Thêm I D G Q I R M R W L K N Gen tham chiếu S R I E E Q V Q M K W F R D Từ kết phân tích chứng tỏ phân lập thành công gen SSIV từ giống sắn Đỏ ĐF KM140 Vì giố ng KM140 hiê ̣n là mô ̣t những giố ng sắ n có suấ t cao, chố ng chiụ với sâu bê ̣nh tố t, là giố ng phổ biế n trồ ng cả nước và tỷ lê ̣ giố ng của hai giố ng này so với gen tham chiế u là 99% 80 Do vâ ̣y, chúng tơi gửi đăng ký trình tự gen SSIV phân lập từ giống sắn KM140 ngân hàng gen với mã số KT033500 3.2.2.4 Phân lập promoter điều khiển biểu gen đặc hiệu củ sắn Dựa vào trình tự promoter C54 cơng bố NCBI (AY217352, Hình 3.11A) thiết kế cặp mồi C54pro/PstI_F C54pro/XbaI_R để nhân dòng phản ứng PCR Trên trình tự mồi bổ sung thêm vị trí cắt enzyme PstI XbaI để thuận tiện cho việc thiết kế vector Do vậy, quy trình PCR thực qua hai bước: thứ nhất, chạy chu kỳ 550C, sau 27 chu kỳ 600C Kết thúc phản ứng, sản phẩm PCR điện di gel để thu hồi sản phẩm PCR đặc hiệu (Hình 3.11B) Sản phẩm PCR promoter C54 gắn vào vector pBT Để kiểm tra khuẩn lạc dương tính trước tiến hành tách dòng gen, chúng tơi tiến hành phản ứng PCR với mồi pUC18F/R Khi PCR với mồi PUC18, kích thước sản phẩm PCR thu cao đoạn chèn 164 bp vị trí mồi PUC18 Vì vậy, phản ứng PCR khuẩn lạc dương tính thu băng có kích thước ~1215 bp Kết clonyPCR cho thấy, khuẩn lạc số 1, 2, 4, 6, dương tính (Hình 3.11.C) Khuẩn lạc số chọn nuôi lỏng tách plasmid Để kiểm tra kích thước đoạn chèn, tiến hành cắt plasmid với enzyme XbaI PstI Phản ứng cắt dương tính điện di kiểm tra xuất hai băng DNA có kích thước tính tốn ban đầu (băng vector ~2700 bp băng C54 có kích thước 1047 bp), plasmid thu hai khuẩn lạc số đạt yêu cầu (Hình 3.11.D), plasmid tách từ khuẩn lạc số đem giải trình tự Kết phân tích trình tự cho thấy tương đồng đến 99% so với trình tự C54 (AY217353) công bố Genbank (NCBI) (Phụ lục 2.3) Ngồi ra, kết phân tích sử dụng phần mềm TSSP (softberry.com) chứng minh promoter C54 phân lập có đầy đủ yếu tố vùng chức so với promoter tham chiếu (Phụ lục 2.4) Như vậy, phân lập thành công promoter C54 điều khiển biểu gen đặc hiệu củ sắn 81 Hình 3.11 Tách dòng promoter C54 sắn Chú thích: A Sơ đồ Promoter C54 vị trí mồi PCR B Sản phẩm PCR nhân dòng promoter C54 C Ảnh điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc với mồi pUC18F/R (1,2,4,6,7 dòng dương tính; 3,5,8,9,10,11,12,13,14,15 dòng âm tính); D Ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid pBT::C54 với enzyme XbaI PstI Tóm lại: Từ kết phân tích chứng tỏ phân lập thành công gen SSIV từ giống sắn KM140 Đỏ ĐP Tuy nhiên, so sánh vị trí sai khác trình tự axit amin suy diễn protein SSIV giống có sai khác không đáng kể (~1%) Mặt khác, giống sắn KM140 giống sắn có hàm lượng tinh bột chưa phải cao (26,1 – 28,4%) giống sắn có suất cao, sâu bệnh phổ biến nhiều địa phương nước Do giống sắn tiếp tục lựa chọn phục vụ cho nghiên cứu tạo sắn chuyển gen Trình tự gen SSIV phân lập từ giống sắn KM140 đăng kí ngân hàng GenBank với mã số KT033500 82 3.2.3 Thiết kế vector chuyển gen 3.2.3.1 Thiết kế vector pK7WG2D-35S:SSIV:T35S Kỹ thuật Gateway phương pháp nhân dòng phổ biến tiện ích dựa sở phản ứng tái tổ hợp đặc hiệu vị trí điểm chuyên biệt DNA phage vi khuẩn gọi điểm gắn Với kỹ thuật này, nhiều gen đích di chuyển từ dòng gốc vào vector đích biểu theo chiều khung đọc bước thao tác mà sử dụng enzyme cắt giới hạn Ngoài pK7WG2D vector thuộc hệ thống Gateway với cấu trúc gồm vùng chứa đoạn xen attR1-ccdB-attR2 Vì vậy, sản phẩm phản ứng LR plasmid có chứa vị trí tái tổ hợp mang gen đích có chiều mong muốn Thành phần bước thực phản ứng LR thực theo hướng dẫn Kit Gateway® LR Clonase™ II Enzyme Mix Invitrogen với vector đích pK7WG2D entry clone vector pENTR/SSIV thiết kế thành công Sản phẩm phản ứng sử dụng để biến nạp vào tế bào khả biến E coli One Shot TOP10 chọn lọc mơi trường có bổ sung Spectinomycin 100 µg/ml Để sàng lọc dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pK7WG2D/SSIV mong muốn cần thực phản ứng colony-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F SSIV-Frag_R khuếch đại đoạn ngắn gần kb gen SSIV Các dòng khuẩn lạc cho kết PCR dương tính chọn để ni cấy tiến hành tách chiết plasmid, sau cắt kiểm tra enzyme giới hạn EcoRI Kết điện di sản phẩm phản ứng cắt cho thấy chọn dòng plasmid tái tổ hợp pK7WG2D-35S:SSIV:T35S cho băng DNA kích thước theo tính tốn lý thuyết là: 10661bp, 2201bp 1486bp, chứng tỏ vector pK7WG2D35S:SSIV:T35S thiết kế thành cơng (Hình 3.12A,B) Vector chuyển gen pK7WG2D-35S:SSIV:T35S thiết kế sử dụng để biến nạp vào tế bào khả biến chủng A tumefaciens Sản phẩm q trình biến nạp ni mơi trường YMB có bổ sung kháng sinh chọn lọc 100 mg/l Spectinomycin, ủ 280C Sau ngày thu lượng lớn khuẩn lạc đĩa thạch Sau sàng lọc phương pháp colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F SSIV-Frag_R, dòng A tumefaciens mang cấu trúc chuyển gen 83 sau ni lỏng ml LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc, lắc 280C qua đêm, sau giữ Glycerol 20% bảo quản tủ -840C Kế t quả điê ̣n di sản phẩm PCR cho thấ y số dòng khuẩ n la ̣c 1, 2, 3, 4, mang xuất băng PCR kić h thước khoảng 960 bp, đúng với kić h thước lý thuyế t của đoạn gen PCR mồi SSIV-Frag_F SSIV-Frag_R Kế t quả trên, chứng tỏ các dòng vi khuẩn đã mang gen cầ n chuyể n (Hình 3.12C) A B C Hình 3.12 Thiết kế vector pK7WG2D-35S:SSIV:T35S Chú thích: A Kết điện di PCR khuẩn lạc sử dụng mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F/R B Kiểm tra sản phẩm cắt plasmid pK7WG2D-35S:SSIV:T35S EcoRI C Kết điện di PCR dòng khuẩn lạc mang vector pK7WG2D-35S:SSIV:T35S 3.2.3.2 Thiết kế vector pBI121-C54:SSIV:NOST Khuếch đại trình tự nucleotide đoạn cmyc phản ứng PCR với mồi Cmyc-HindIII-F1, SacI-Cmyc-R3 Cmyc-SacI-R2 từ vector tách dòng mang AGPopt_cmyc Trình tự cmyc vị trí cắt enzyme tổng hợp dựa vào phản ứng PCR Trên ảnh điện di thu băng đặc hiệu (79 bp) tính tốn ban đầu (Hình 3.13A) Vector pBI121 cắt hoàn toàn với enzyme HindIII SacI Kết phân tích ảnh điện di cho thấy xuất vector pBI121 đựơc phân cắt thành băng tương ứng với tính tốn ban đầu (12 kb 2,765 kb) (Hình 3.13B) Phân đoạn 12 kb tinh để phục vụ thí nghiệm Đoạn cmyc xử lý với HindIII SacI, sản phẩm cắt tinh kit tinh PCR Các phân đoạn 12 kb 75 bp bước nối thành công phản ứng nối ligase Sản phẩm ghép nối biến nạp vào Ecoli DH5α 84 Sản phẩm nối pBI121/cmyc biến nạp thành công vào E.coli DH5α Trên vector pBI121 có sẵn vị trí mồi M13F M13R, vậy, để kiểm tra kết biến nạp cần phải tiến hành PCR khuẩn lạc với hai mồi vector (M13F, M13R) với hai mồi đoạn chèn (Cmyc-SacI-R2, Cmyc-HindIII-F1) Kết cho thấy tất khuẩn lạc chọn dương tính với PCR khuẩn lạc Như vậy, pBI121/Cmyc thiết kế thành cơng (Hình 3.13C,D) A B C D Hình 3.13 Thiết kế vector pBI121/cmyc Chú thích: (A) Ảnh điện di sản phẩm PCR tổng hợp cmyc (B) Ảnh điện di sản phẩm cắt vector pBI121 với HindIII SacI (C) Ảnh điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc E.coli biến nạp pBI121/cmyc (D) Sơ đồ vùng T-DNA vector pBI121/cmyc vị trí mồi PCR M50bp: Marker 50 bp Ở mục 3.2.1.3, promoter C54 tách dòng thành công vào pBT cặp mồi C54pro/PstI_F C54pro/XbaI_R Tuy nhiên để gắn C54 trực tiếp vào pBICmyc cần tạo hai điểm cắt XmaI XbaI hai đầu Vì vậy, thí nghiệm 85 này, mồi XmaI-C54-F sử dụng thay cho C54pro/PstI_F Phản ứng thực với khuôn plasmid pBT/C54 enzyme Pfu DNA polymerase Khuếch đại gen SSIV phản ứng PCR với mồi XbaI-SSIV-F SSIVScaI-R Vùng CDS SSIV tổng hợp phản ứng PCR với mồi XbaI-SSIV-F SSIV-ScaI-R enzyme Pfu DNA polymerase Trên điện di, thu băng 3220 bp (Hình 3.14A) Khuếch đại promoter C54 mồi XmaI-C54-F C54Pro/XbaI-R từ DNA tổng số tách từ sắn E Hình 3.14 Thiết kế vector pBI121-C54:SSIV-cmyc:NOST Chú thích: (A) Ảnh điện di sản phẩm PCR gen SSIV (B) Ảnh điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc E.coli biến nạp pB121-C54:SSIV-cmyc:NOST mồi XmaI-C54F C54Pro/XbaI-R (C) Ảnh diện di sản phẩm cắt pB121-C54:SSIV-cmyc:NOST với XmaI ScaI (D) Ảnh điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc Agrobacterium biến nạp pB121-C54:SSIV-cmyc:NOST mồi XmaI-C54-F C54Pro/XbaI-R (E) Sơ đồ vùng T-DNA vector pB121-C54:SSIV-cmyc:NOST 86 Đoạn promoter C54 xử lý với enzyme XmaI XbaI; SSIV với XbaI SacI; pBI-Cmyc với XmaI SacI Các sản phẩm sau xử lý enzyme giới hạn tinh kit tinh sản phẩm PCR Ghép nối sản phẩm cắt Promoter C54, SSIV vector pBI121/cmyc phản ứng ligase đoạn DNA: Promoter C54 (1kb), SSIV (3220 bp), pBI121/cmyc (12 kb) Sản phẩm ghép nối sử dụng để biến nạp vào E.coli DH5α Chọn lọc dòng khuẩn lạc dương tính phản ứng PCR với mồi XmaI-C54-F C54Pro/XbaI-R Kết PCR khuẩn lạc dương tính (Hình 3.14B) Như vậy, bước đầu khẳng định tạo pBI121/C54/SSIV, nhiên để có kết xác cần tiến hành xử lý enzyme cắt hạn chế để kiểm tra phân đoạn Xử lý plasmid pBI121-C54:SSIV-cmyc:NOST với enzyme XmaI ScaI: Plasmid pBI121- C54:SSIV-cmyc:NOST tách từ khuẩn lạc dương tính với PCR bước cắt với XmaI ScaI Trên ảnh điện di thu hai băng tương ứng với tính tốn lý thuyết (12 kb pBI 4,2 kb C54:SSIV), (Hình 3.14C) Biến nạp pB121-C54:SSIV-cmyc:NOST vào A tumefaciens C58: Vector pB121-C54:SSIV-cmyc:NOST tách từ khuẩn lạc sử dụng để biến nạp vào A tumefaciens C58 xung điện, cấy trải khuẩn lên đĩa YEB bổ sung 50 mg/l Kanamycin 50 mg/l rifampicin Chọn lọc dòng khuẩn lạc dương tính phản ứng PCR với mồi XmaI-C54-F C54Pro/XbaI-R Kết thu dương tính tất khuẩn lạc chọn (Hình 3.14D) Điều chứng tỏ thiết kế thành công vector pB121-C54:SSIV-cmyc:NOST, sẵn sàng phục vụ cho việc chuyển gen (Hình 3.14E) Tóm lại: Thiết kế vector chuyển gen thực vật là: pK7WG2D35S:SSIV:T35S mang gen mã hóa enzyme tăng cường sinh tổng hợp tinh bột điều khiển promoter cố định 35S pBI121-C54:SSIV:NOST mang gen mã hóa enzyme tăng cường sinh tổng hợp tinh bột củ sắn điều khiển promoter đặc hiệu C54 87 3.3 ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA CÁC VECTOR CHUYỂN GEN SSIV TĂNG CƯỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT TRÊN CÂY THUỐC LÁ Do lựa chọn gen SSIV để phân lập, giải trình tự, thiết kế vector chuyển gen (Mục 3.2), bước cần đánh giá hoạt động promoter biểu đặc hiệu rễ thuốc thông qua cấu trúc vector là: pK7WG2D-35S:SSIV:T35S pBI121-C54:SSIV-cmyc:NOST 3.3.1 Chuyển gen tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào thuốc đánh giá hoạt động gen chuyển 3.3.1.1 Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào thuốc Trong chuyển gen thực vật, thuốc xem mơ hình phục vụ cho nghiên cứu đánh giá chức gen Do hệ thống tái sinh tiếp nhận gen ngoại lai thuốc hiệu quả, thời gian phân hóa từ mơ đến tạo hồn chỉnh ngắn, mặt khác thuốc ngắn ngày, dễ trồng chăm sóc nên dễ dàng thu hạt để nghiên cứu hệ Bởi vậy, nghiên cứu chọn thuốc làm mơ hình để đánh giá cấu trúc vector chuyển gen tăng cường sinh tổng hợp tích lũy tinh bột thiết kế Như trình bày phần 3.3.2, promoter C54 chứng minh có liên quan đến biểu đặc hiệu mô mạch trình phát triển thứ cấp rễ dự trữ nên cấu trúc chuyển gen tăng cường sinh tổng hợp tích lũy tinh bột điều khiển cấu trúc gen thiết kế thích hợp cho mục đích chuyển gen vào sắn tương lai Trong thí nghiệm chuyển gen vào mơ hình thuốc có sử dụng cấu trúc chuyển gen đích thiết kế là: pK7WG2D-35S:SSIV:T35S pBI121-C54:SSIV-cmyc:NOST Tồn quy trình chuyển gen vào thuốc K326 thơng qua vi khuẩn A tumefaciens trình bày hình 3.15 số hình ảnh minh họa hình 3.16 Quy trình chuyển gen có tổng thời gian từ 110 – 150 ngày bao gồm bước: Từ chuẩn bị vật liệu chuyển gen, vi khuẩn chuyển gen, chuyển gen, diệt khuẩn, tái sinh chồi chuyển gen, tái sinh chồi chuyển gen, tạo hoàn chỉnh đưa trồng giá thể TN1 Kết thí nghiệm thu bảng 3.8 88 Chuẩn bị vật liệu chuyển gen Cây thuốc in vitro – tuần tuổi 21 – 28 ngày Chuẩn bị vi khuẩn chuyển gen A tumefaciens Nuôi lỏng vi khuẩn A.tumefaciens OD600nm= 0,6 – ngày Chuyển gen - Nguyên liệu chuyển gen: Mảnh bánh tẻ kích thước 1x1 cm - Nhiễm khuẩn: 20 phút - Đồng nuôi cấy 48 MT: MS + 1mg/l BAP – ngày Diệt khuẩn Diệt khuẩn dung dịch 500 mg/l cefotaxime 21 – 28 ngày Tái sinh chồi chuyển gen Tái sinh chồi chuyển gen môi trường chọn lọc MS + 1mg/l BAP + 50 mg/l Kanamycine 30 – 35 ngày Tạo hoàn chỉnh (ra rễ) Chồi chuyển lên môi trường rễ chọn lọc MS + 0,1NAA + 50 mg/l Kanamycin 14 – 21 ngày Ra trồng bầu đất Sử dụng giá thể TN1 giá thể trấu hun pha cát tỷ lệ 1:1 20 – 30 ngày 110 – 150 ngày Hình 3.15 Quy trình chuyển gen vào thuốc thơng qua vi khuẩn A tumefaciens 89 Hình 3.16 Một số hình ảnh chuyển gen quan tâm vào thuốc thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 90 Bảng 3.8 Chuyển cấu trúc gen pK7WG2D-35S:SSIV:T35S pBI121C54:SSIV:NOST vào thuốc Gen pK7WG2D35S:SSIV:T35S Lơ thí Số mảnh nghiệm biến nạp Tổng Số chồi rễ/MT rễ + 50 mg/l Kana Số sống sót bầu 50 35 30 30 50 29 25 23 50 31 27 24 150 95 82 77 50 31 28 26 50 30 26 25 50 24 19 18 150 85 73 69 Tổng pBI121C54:SSIV:NOST Số mẫu tạo chồi/MT tái sinh + 50 mg/l Kana Kết thống kê cho thấy sau chuyển gen vào 300 mảnh thuốc K326 thông qua A tumefaciens lơ thí nghiệm với cấu trúc gen thiết kế thu 77 chuyển gen pK7WG2D-35S:SSIV:T35S 69 chuyển gen pBI121-C54:SSIV-cmyc:NOST môi trường chọn lọc kanamycin (Bảng 3.8) Ngược lại, mảnh thuốc không chuyển gen cấy môi trường chọn lọc có kanamycin (làm đối chứng), 100% mẫu bị chết khơng tái sinh chồi Đây kết có tiềm cho tái sinh rễ mơi trường chọn lọc dòng chuyển gen Lựa chọn 30 chồi thuốc phát triển thành hoàn chỉnh, đủ lớn, cao khoảng - cm chuyển từ điều kiện nuôi cấy in vitro bầu đất trồng nhà kính, phục vụ cho phân tích (Hình 3.16) 3.3.1.2 Sàng lọc dòng thuốc chuyển gen phương pháp PCR PCR kỹ thuật phổ biến đơn giản để bước đầu sàng lọc dòng chuyển gen Kết phản ứng cho phép khẳng định tồn hay không gen chuyển genome kiểm tra Trong nghiên cứu này, dòng thuốc chuyển gen với cấu trúc gen pK7WG2D-35S:SSIV:T35S thu 91 pBI121-C54:SSIV:NOST thu rễ để phân tích PCR với cặp mồi đặc hiệu (Hình 3.17, Hình 3.18) Hình 3.17 Kiểm tra dòng thuốc chuyển gen cấu trúc pK7WG2D35S:SSIV:T35S phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F/R Chú thích: ĐC (-): không chuyển gen; ĐC(+): plasmid mang gen tương ứng; dòng chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S (1-13: dòng S4, S5, S7, S10, S11, S16, S22, S24, S28, S31, S32, S39, S40); M: thang DNA chuẩn kb kb plus (Thermoscientific) Hình 3.18 Kiểm tra dòng thuốc chuyển gen cấu trúc pBI121C54:SSIV:NOST phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu Xmal-C54_F C54 pro/XbaI_F (1054bp) Chú thích: ĐC (-): khơng chuyển gen; ĐC(+): plasmid mang gen tương ứng; dòng chuyển gen cấu trúc pBI121-C54:SSIV:NOST (1-11: dòng C1, C3, C7, C10, C11, C15, C22, S25, C28, C30, C33); M: thang DNA chuẩn kb kb plus (Thermoscientific) Kết phản ứng PCR thu 12/13 dòng thuốc chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S 11/11 dòng thuốc chuyển gen cấu trúc pBI121C54:SSIV:NOST Các dòng cho kết PCR dương tính với cặp mồi SSIVFrag_F/R sản phẩm đoạn DNA có kích thước tương ứng 1089 bp 92 Đối với dòng thuốc xác định có mang gen chuyển, nhóm nghiên cứu tiếp tục tiến hành bước phân tích để đánh giá khả hoạt động gen chuyển kỹ thuật sinh học phân tử 3.3.2 Đánh giá hoạt động gen chuyển 3.3.2.1 Phân tích dòng chuyển gen kỹ thuật Southern blot Kết phân tích Southern blot thành cơng 7/7 mẫu chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S 7/7 mẫu chuyển gen mang cấu trúc pBI121C54:SSIV:NOST Trên màng lai sau màng, băng tương ứng với copy sử dụng enzyme cắt XbaI (đối với cấu trúc SSIV), điểm cắt enzyme cấu trúc gen chuyển nằm đầu đoạn gen đích Mẫu WT biểu âm tính, chứng tỏ phản ứng lai đặc hiệu, mẫu dò khơng liên kết với gen nội sinh Hình 3.19 Kết Southern blot mẫu thuốc chuyển gen SSIV Chú thích: A: dòng chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S (1-7: dòng S5, S7, S11, S24, S32, S31, S40); B: dòng chuyển gen cấu trúc pBI121-C54:SSIV:NOST (các dòng C1, C3, C8, C10, C22, C30, C35); (WT): không chuyển gen; (P): plasmid mang gen tương ứng; M: thang DNA kb plus (Thermoscientific) Với cấu trúc chuyển gen pK7WG2D-35S:SSIV:T35S, kết cho thấy dòng chuyển gen phân tích mang gen chuyển có dòng (S5, S7, S11, S32, S40) mang copy gen chuyển genome, dòng (S24) mang copy dòng (S31) mang copy (Hình 19A) Với cấu trúc pBI121- 93 C54:SSIV:NOST, kết cho thấy dòng chuyển gen phân tích mang gen chuyển, có dòng (C3, C8, C22 C30) mang copy gen chuyển genome, dòng (C1, C35) mang copy gen chuyển genome, dòng (C10) mang copy genome (Hình 3.19B) 3.3.2.2 Đánh giá biểu gen chuyển RT-PCR Kết tách chiết RNA tổng số từ dòng thuốc chuyển gen Khác với ADN, ARN loại phân tử không bền, dễ bị phân hủy ribonuclease (RNase) Hơn RNase lại có mặt khắp nơi, có hoạt tính mạnh bền (thậm chí việc xử lí nhiệt 100oC khơng làm hoạt tính RNase) Từ lí việc tách chiết ARN đòi hỏi nhiều biện pháp thận trọng để tránh tạp nhiễm chứa RNase từ môi trường Tất dụng cụ phải xử lí cẩn thận trước tiến hành thí nghiệm: cối chày sứ xử lý 200oC giờ, ống eppendorf, đầu tip… xử lý DEPC 0,1% Các hóa chất khác pha nước DEPC 0,01% Hình 3.20 Ảnh điện di RNA tổng số tách từ mẫu thuốc chuyển gen Kết điện di gel agarose 1% (Hình 3.20) cho thấy tách chiết thành công RNA tổng số từ dòng thuốc chuyển gen RNA tổng số tách chiết từ mẫu có băng 28S rRNA, 18S rRNA 5S rRNA/5.8S rRNA Như vậy, RNA tổng số thu đảm bảo độ tinh sạch, nồng độ, nguyên vẹn phân tử Kết tổng hợp cDNA RNA dễ bị phân hủy RNase có mặt khắp nơi mơi trường phòng thí nghiệm Vì vậy, việc bảo quản RNA ln đòi hỏi nghiêm ngặt -80oC chất lượng mẫu RNA nhân tố quan trọng định chất lượng cDNA tổng hợp 94 Trong thí nghiệm này, RNA sau tách chiết sau bảo quản -800C hai tuần sử dụng để tổng hợp cDNA cDNA tổng số tổng hợp kit First Strand cDNA Synthesis Kit hãng Thermo Scientific sử dụng mồi random hexamers Để đánh giá chất lượng sản phẩm cDNA, µl cDNA dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi khuếch đại gen actin thuốc actin_F (CCATTCTTCGTTTGGACCTT) actin_R (TTCTGGGCAACGGAACCT) Theo tính toán lý thuyế t, cặp mồi nhân đoạn gen có kích thước gần 200 bp Kết điện di sản phẩm phản ứng PCR (Hình 3.21) cho thấy đường chạy xuất băng DNA sáng sắc nét kích thước dự tính chứng tỏ gen actin khuếch đại thành cơng từ cDNA dòng thuốc chuyển gen Như vậy, tổng hợp nguồn cDNA từ làm nguyên liệu cho thí nghiệm phân tích phiên mã gen chuyển dòng thuốc chuyển gen Hình 3.21 Kết PCR nhân gen actin từ cDNA từ số dòng thuốc chuyển gen, M: thang DNA chuẩn 50 bp (ThermoScientific) Kết đánh giá biểu gen chuyển RT-PCR Đối với cấu trúc gen chuyển, chọn cho kết lai Southern blot dương tính để phân tích biểu gen chuyển Sả n phẩ m cDNA tổ ng hơ p̣ thành công từ RNA đươ ̣c dù ng là m nguyên liê ̣u cho phản ứ ng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen chuyển SSIV SSIVFrag_F/R Lượng khuôn cDNA đươ ̣c đưa và o mỗ i phả n ứ ng là Do vâ ̣y, dòng thuốc chuyển gen gen chuyển hoạt động phiên mã RNA kiể m tra bằ ng RT-PCR có tín hiê ̣u kh́ ch đa ̣i có kích thước 1089 bp tương ứng với gen chuyển SSIV Ngược lại, gen 95 chuyển không hoạt động, tức khơng có phiên mã RNA mẫu cho kết âm tính với phản ứng RT-PCR Kế t quả điê ̣n di sản phẩ m RT-PCR cho thấ y dòng thuốc chuyển gen gen chuyển khuếch đại thành công đúng kić h thước theo tin ́ h toán lý thuyế t Trong đớ i chứng khơng chủ n gen cho kết âm tính với RT-PCR Như gen SSIV thuốc chuyển gen phiên mã tạo sản phẩm mRNA Tuy vậy, mức độ biểu gen chuyển dòng chuyển gen khác Cụ thể, dòng S32 chuyển gen SSIV (Hình 3.22) trực quan thấy mức độ phiên mã gen chuyển thấp dòng lại Tuy nhiên để đánh giá xác mức độ biểu gen chuyển cần thực thêm phân tích chuyên sâu khác real-time PCR Hình 3.22 Điê ̣n di sản phẩ m RT-PCR dòng thuốc chuyển gen SSIV tương ứng Chú thích: ĐC- : đối chứng không chuyển gen, ĐC+ : vector chuyển gen mang cấu trúc gen chuyển, M: thang DNA chuẩn kb (ThermoScientific) 3.3.2.3 Đánh giá hoạt động gen chuyển phương pháp phân tích hàm lượng tinh bột Trong điều kiện in vitro, non cung cấp đầy đủ dinh dưỡng ánh sáng, đặc biệt có đường, đánh giá tích lũy tinh bột in vitro khơng xác Thơng thường, trồng điều kiện nhà lưới không cần thiết phải chiết lượng đường tự khỏi mẫu nồng độ đường tự thấp (0,1 - 0,5%) Do vậy, để kết xác cần phải tiến hành trồng tất mẫu bồn sinh trưởng để đảm bảo thống điều kiện thời gian chiếu sáng, nhiệt độ, độ ẩm… sau 96 tiến hành thu độ tuổi dòng chuyển gen WT độ tuổi, thời gian (nhiệt độ 27oC, độ ẩm 70%, điều kiện chiếu 16h sáng/ 8h tối) Tiếp theo, đánh giá so sánh sơ hàm lượng tinh bột dòng thuốc chuyển gen dòng đối chứng WT phương pháp nhuộm iodine Đánh giá hoạt động gen SSIV với cấu trúc K7WG2D-35S:SSIV:T35S dòng thuốc Kết nhuộm iodine dòng T0 chuyển gen SSIV (S5, S7, S11, S24, S31, S32, S40) cho thấy phần lớn dòng thuốc chuyển gen có hàm lượng tinh bột tích lũy cao nhiều so với đối chứng (WT) bắt có màu đậm đậm dòng S5, S31(Hình 3.23) Như vậy, phương pháp đơn giản hữu hiệu để bước đầu sàng lọc, lựa chọn dòng chuyển gen tiềm để tiếp tục thực bước phân tích định lượng phức tạp xác S7 Hình 3.23 Nhuộm iodine số dòng thuốc chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S (S5, S7, S11, S24, S31, S32, S40) Tiếp theo, dòng thuốc chuyển gen có hàm lượng tinh bột vượt trội lựa chọn phương pháp nhuộm iodine tiếp tục lựa chọn để phân tích dựa định lượng hàm lượng tinh bột hay hàm lượng đường hòa tan có mẫu thực vật Anthrone kết dựa vào đồ thị xây dựng đường chuẩn với y = 0,8553x + 0,0193 R2 = 0,9913 (Mục 2.2.9.2) Kết xác định hàm lượng tinh bột tích lũy dòng thuốc chuyển gen cho thấy hầu hết dòng thuốc chuyển gen SSIV tích lũy lượng tinh bột lớn từ 26,9 - 67,9% lượng tinh bột đối chứng không chuyển gen (Bảng 3.9) 97 Bảng 3.9: Hàm lượng tinh bột tích luỹ rễ thuốc chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S dòng chuyển gen Tên dòng S5 S7 S11 S24 S31 S32 S40 WT Hàm lượng tinh bột/khối lượng mẫu khô (mg/g) Lá Rễ 578,117 556,050 517,280 582,715 593,621 546,790 684,115 407,460 27,796 26,297 26,897 28.756 26,117 28,255 26,867 24,438 Tỉ lệ tinh bột mẫu tăng so với đối chứng (%) Lá Rễ 41,883 36,467 26,912 43,011 45,688 34,195 67,923 0,000 13,743 7,608 10,062 17,610 6,822 15,620 9,939 0,000 Ghi chú: WT: chưa chuyển gen S5, S7, S11, S24, S31, S32, S40: dòng chuyển gen SSIV Ngồi ra, hàm lượng tinh bột tích lũy rễ dòng thuốc chuyển gen cho thấy hầu hết rễ dòng thuốc chuyển gen SSIV tích lũy lượng tinh bột lớn từ 6,8 - 17,6% lượng tinh bột rễ đối chứng không chuyển gen Cụ thể dòng S24 có hàm lượng tinh bột rễ đạt cao (17,6%), tiếp đến S32 (15,6%), S5 (13,7%) Nhìn chung hàm lượng tinh bột tích lũy rễ dòng chuyển gen cao từ 6,8 – 45,6% so với dòng khơng chuyển gen Điều giải thích vị trí gen chuyển tích hợp genome chủ khác dẫn đến sai khác hoạt động gen chuyển, ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp tích lũy tinh bột Bên cạnh đó, yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển điều kiện chiếu sáng, nhiệt độ, độ ẩm, chế độ dinh dưỡng ảnh hưởng đến đồng hóa tinh bột Kết cho phép khẳng định dòng thuốc chuyển gen SSIV có mức độ tích lũy tinh bột rễ cao đối chứng không chuyển gen Đánh giá hoạt động gen SSIV với cấu trúc pBI 121 – C54:SSIV:NOST dòng thuốc Tương tự, dòng thuốc chuyển gen pBI 121 – C54:SSIV:NOST nuôi dưỡng bồn sinh trưởng với điều kiện tối ưu để thu rễ nhằm đánh giá 98 hàm lượng tinh bột (Bảng 3.10) kết dựa vào đồ thị xây dựng đường chuẩn với y = 0,9246x + 0,0072 R2 = 0,99337 (Mục 2.2.9.2) Bảng 3.10 Hàm lượng tinh bột tích luỹ rễ thuốc chuyển gen Tên dòng C1 C3 C8 C10 C22 C30 C35 WT pBI121 – C54:SSIV:NOST dòng chuyển gen Hàm lượng tinh bột/khối lượng Tỉ lệ tinh bột mẫu tăng mẫu khô (mg/g) so với đối chứng (%) 42,379 65,713 39,923 56,162 36,410 42,421 32,341 26,505 33,821 32,305 36,404 42,398 38,579 50,905 25, 565 0,000 Ghi chú: WT: chưa chuyển gen; C1, C3, C8, C10, C22, C30, C35: dòng chuyển gen SSIV Hình 3.24 Nhuộm iodine số dòng thuốc chuyển gen cấu trúc pBI121 – C54:SSIV:NOST (C1, C3, C8, C10, C22, C30, C35) Kết xác định hàm lượng tinh bột tích lũy rễ dòng thuốc chuyển gen cho thấy hầu hết rễ dòng thuốc chuyển gen SSIV tích lũy lượng tinh bột lớn từ 26,5 - 65,7% lượng tinh bột rễ đối chứng khơng chuyển gen Nhìn chung hàm lượng tinh bột tích lũy rễ dòng chuyển gen cao so với dòng khơng chuyển gen Như vậy, promotor biểu đặc hiệu củ sắn biểu chuyển vào thuốc kết thu qua trình sinh tổng hợp tinh bột thể rõ điều Kết cho phép 99 khẳng định cấu trúc gen pBI 121 – C54:SSIV: NOST dòng thuốc chuyển gen SSIV có mức độ tích lũy tinh bột rễ cao đối chứng khơng chuyển gen Tóm lại: Đây phương pháp đơn giản hữu hiệu để bước đầu sàng lọc, lựa chọn dòng chuyển gen SSIV thơng qua cấu trúc gen: pK7WG2D-35S:SSIV:T35S pBI 121 - C54:SSIV: NOST thu kết chuyển gen có hàm lượng tinh bột cao đối chứng không chuyển gen Cụ thể hàm lượng tinh bột rễ tăng 6,8 - 17,6% thuốc chuyển gen mang cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S tăng 26,5 - 65,7% thuốc chuyển gen mang cấu trúc pBI 121 - C54:SSIV: NOST Do đó, cần tiếp tục nghiên cứu sử dụng cấu trúc gen pBI 121 - C54:SSIV: NOST chuyển gen vào sắn nhằm mục đích thu chuyển gen tăng hàm lượng tinh bột 3.4 CHUYỂN GEN SSIV TĂNG CƯỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT VÀO CÂY SẮN Theo nhiều nghiên cứu, để ứng dụng kỹ thuật chuyển gen vào sắn thành cơng cơng việc quan trọng hàng đầu phải nghiên cứu hoàn thiện hệ thống tái sinh trình biến nạp xảy khơng tái sinh thành thí nghiệm biến nạp chưa thành cơng Cây sắn nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro từ nguồn vật liệu đa dạng như: thuỳ non, đỉnh chồi con, chồi nách, mảnh lá… tỷ lệ chất lượng thu tái sinh thông qua FEC giống sắn khác mơi trường khác khác Chính vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu hồn thiện hệ thống tái sinh giống sắn Việt Nam để phục vụ cho trình chuyển gen SSIV sau 3.4.1 Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro sắn 3.4.1.1 Nghiên cứu tạo mô sẹo từ nguồn vật liệu khác sắn Từ kết nghiên cứu cho thấy giống sắn phát triển hình thành mơ sẹo tốt ni cấy mơi trường có bổ sung 2,4-D, picloram đặt mẫu tối Tuy nhiên, tỷ lệ hình thành mô sẹo giống sắn nghiên cứu từ 100 đỉnh chồi, non, cuống giống sắn khác khác có khác biệt hai môi trường nuôi cấy CP CD (Bảng 3.11) Lá non giống sắn sử dụng để nghiên cứu sàng lọc nguồn nguyên liệu thực vật phù hợp cho tái sinh từ mô sẹo Kết thu cho thấy tỷ lệ tạo mô sẹo giống sắn nghiên cứu môi trường nuôi cấy CP CD sau tuần cho tỷ lệ 82,1 – 100% cao giống sắn KM140 (100%) Ngoài non, nguồn nguyên liệu đỉnh chồi cho kết tạo mô sẹo môi trường nuôi cấy giống sắn sau tuần đạt tỷ lệ cao (87,2 – 100%) Đặc biệt giống KM140 HB80 tỷ lệ tạo mô sẹo 100% Tuy nhiên, nghiên cứu tạo mô sẹo dựa nguồn vật liệu cuống kết thu tỷ lệ tạo mô sẹo thấp nhiều so với non đỉnh chồi, tỷ lệ thu 55,12 – 72,32% (trên môi trường CP) 52,30 – 70,64 % (trên mơi trường CD), mơ sẹo chủ yếu hình thành đầu cuống có mầu nâu đen, ướt, nhớt Bên cạnh đó, tốc độ sinh trưởng mơ sẹo từ cuống chậm so với non đỉnh chồi Bảng 3.11: Ảnh hưởng nguồn nguyên liệu môi trường đến khả tạo mô sẹo (sau tuần) Mơi trường CP CD Tỷ lệ hình thành mô sẹo (%) Nguyên liệu KM140 HB80 Lá non 100,00 ± 0,00 99,20 ± 0,49 Đỉnh chồi 100,00 ± 0,00 Cuống Trắng NA 89,62 ± 0,44 Đỏ ĐF Trắng HB 88,60 ± 0,43 90,04 ± 0,44 100,00 ± 0,00 97,55 ± 0,48 87,24 ± 0,4 90,26 ± 0,45 72,32 ± 0,35 62,33 ± 0,31 69,73 ± 0,34 64,82 ± 0,32 55,12 ± 0,27 Lá non 100,00 ± 0,00 97,25 ± 0,48 90,36 ± 0,45 86,45 ± 0,43 82,13 ± 0,41 Đỉnh chồi 100,00 ± 0,00 100,00 ± 0,00 92,11 ± 0,46 88,90 ± 0,44 84,35 ± 0,42 Cuống 70,64 ± 0,34 60,16 ± 0,30 63,16 ± 0,31 52,30 ± 0,26 68,74 ± 0,34 Lá non, đỉnh chồi sau cảm ứng mô sẹo hầu hết khối mơ có màu trắng kem, vàng tươi, mơ sẹo hình thành hạt nhỏ li ti xốp, có màu trắng, vàng nhạt, sinh trưởng tốt môi trường CP môi trường CD mô 101 sẹo lại có màu nâu, ướt, nhớt, sinh trưởng Bên cạnh đó, tốc độ sinh trưởng mơ sẹo từ cuống chậm so với tốc độ sinh trưởng từ non, đỉnh chồi, mô sẹo chủ yếu hình thành đầu cuống có mầu nâu đen, ướt, nhớt Do dó, chúng tơi khơng lựa chọn nguồn nguyên liệu để tiến hành thí nghiệm (Hình 25A2; B2) Từ kết nghiên cứu cho thấy, nguyên liệu phù hợp để tạo mô sẹo giống sắn địa phương đỉnh chồi, tỷ lệ tạo mô sẹo đạt > 80%, mơ sẹo sinh trưởng, phát triển tốt (Hình 25A3, B3) Môi trường CP (MS bổ sung 10 mg/l Picloram) phù hợp để đánh giá tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi soma nguồn vật liệu mảnh non đỉnh chồi Hình 3.25: Mơ sẹo từ nguồn nguyên liệu khác Chú thích: A1, A2, A3: Mảnh lá, cuống đỉnh chồi cấy môi trường tạo mô sẹo CP; B1, B2, B3: Mô sẹo lá, cuống đỉnh chồi môi trường CP (sau tuần) 3.4.1.2 Ảnh hưởng chất điều hoà sinh trưởng (Picloram IBA) đến khả phát sinh phơi Ở thí nghiệm này, mơ sẹo từ đỉnh chồi giống sắn thu môi trường CP sau tuần bắt đầu xuất phôi giai đoạn chuyển lên môi trường CI1-4 Tỷ lệ tạo phôi thể sau 4, 6, tuần nuôi cấy (Bảng 3.12) 102 Bảng 3.12: Tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi môi trường CI1-4 (sau 4, 6, tuần) Tỉ lệ tạo phôi (%) Tên giống KM140 HB80 Trắng NA Đỏ ĐF Trắng HB Môi trường CI1 CI2 CI3 CI4 CI1 CI2 CI3 CI4 CI1 CI2 CI3 CI4 CI1 CI2 CI3 CI4 CI1 CI2 CI3 CI4 tuần 20,63 ± 0,11 34,90 ± 0,17 23,75± 0,11 30,61 ± 0,15 25,84 ± 0,12 30,42 ± 0,15 35,25 ± 0,17 33,46 ± 0,16 17,22 ± 0,08 21,40 ± 0,12 22,67 ± 0,11 25,45 ± 0,12 15.33 ± 0,23 16,41 ± 0,15 18,92 ± 0,21 20,50 ± 0,33 18,16 ± 0,22 21,91 ± 0,34 24,68 ± 0,18 22,82 ± 0,21 tuần 43,80 ± 0,20 57,31 ± 0,28 44,26 ± 0,22 45,92 ± 0,23 56,27 ± 0,26 69,34 ± 0,33 66,38 ± 0,32 60,11 ± 0,31 38,66 ± 0,19 55,32 ± 0,27 40,20 ± 0,20 35,11 ± 0,17 29,64 ± 0,18 32,52 ± 0,26 37,73 ± 0,21 40,27 ± 0,18 33,44 ± 0,22 38,72 ± 0,11 40,50 ± 0,19 41,31 ± 0,25 tuần 61,22 ± 0,30 76,40 ± 0,38 68,17 ± 0,34 50,22 ± 0,25 69,76 ± 0,34 80,41 ± 0,41 72,15 ± 0,35 69,32 ± 0,32 59,73 ± 0,29 60,37 ± 0,30 58,24 ± 0,27 50,01 ± 0,23 41,17 ± 0,34 34,53 ± 0,19 46,86 ± 0,25 52,22 ± 0,38 49,78 ± 0,37 50,21 ± 0,26 53,43 ± 0,13 55,57 ± 0,35 Trong nghiên cứu, hầu hết giống sắn có xu tăng dần tỷ lệ tạo phôi soma sau 4,6,8 tuần đạt cao tuần thứ Tuy nhiên tỷ lệ phơi soma cơng thức có bổ sung IBA khác Giống sắn KM140 HB80 có tỷ lệ tạo phôi soma cao môi trường CI2 là: 76,40% 80,41% Khi nồng độ IBA tăng lên 0,3 – 0,4 mg/l, khả tạo phôi bắt đầu có xu hướng giảm xuống 68,17% - 50,22% (KM140) 72,15% - 69,32% (HB80) Tương tự, giống Trắng NA, Đỏ DDF Trắng HB, tỷ lệ tạo phôi đạt (41,17 - 60,37%) Tuy nhiên, tỷ lệ thấp so sánh với giống KM140 HB80 Khi tăng nồng độ IBA lên 0,4mg/l khả tạo phơi soma có xu hướng giảm điều lý giải nồng độ auxin cao gây ức chế trình phân 103 chia khung tế bào điều kiện gây phản ứng stress tế bào gây kìm hãm làm giảm khả tạo phơi soma Có lẽ tăng auxin cytokinin nội sinh giai đoạn giúp cho phát triển phơi tăng cao Hình 3.26: Các khối mơ sẹo phân hóa giai đoạn mơ phơi khác giống sắn thí nghiệm (sau tuần) Chú thích: A: KM140; B: HB80; C: Trắng NA; D: Đỏ ĐF; E: HB; bar: 0,1 cm Song song với việc nghiên cứu tỷ lệ tạo phôi soma giống sắn (Bảng 3.12) quan sát, đánh giá đặc điểm mơ sẹo phơi hố độ tuổi khác sau 4, 6, tuần Ở giống sắn KM140 khối mô màu xanh nhạt, tua dài, chuẩn bị chuyển sang giai đoạn kéo dài tạo thành cây, HB80 Trắng HB tuần thứ khối mô vàng tươi, tế bào khơng đồng hình dạng kích thước; giống Trắng NA Đỏ ĐF khối mơ có màu trắng kem, hình dạng tua ngắn, mơ non (Hình 3.26) Các khối mơ có xu hướng tăng dần tuần 4, 6, sang tuần thứ tỷ lệ tạo phôi khối mơ đạt cao cơng thức thí nghiệm giống Thời điểm mô chuyển màu nâu đậm giống KM140 HB80, có nhiều dịch nhầy, khơng có tượng gia tăng kích thước; ba giống lại Đỏ ĐF, Trắng NA, Trắng HB xuất màu nâu, đốm đen khô dần Như vậy, tỷ lệ mơ sẹo có khả phát sinh phôi đạt cao giống KM140 HB80 (76,40 – 80,41%) thấp giống Đỏ ĐF (34,53%) sau tuần 104 3.4.1.3 Kết tạo từ phôi soma Những cụm phôi trưởng thành chuyển lên mơi trường thích hợp để kích thích phôi soma nảy mầm Sau khoảng - 10 tuần mơi trường ni cấy cụm phơi hóa bắt đầu bật chồi, lúc chồi thật xuất phát triển nhanh Điều chứng tỏ giống sắn địa phương có khả tái sinh thơng qua đường phôi soma khả tái sinh tốt, thể chỗ chồi tạo thành có hình thái bình thường, sinh trưởng phát triển mạnh Trên giống sắn cụm phơi soma có tỷ lệ nảy mầm định tất cơng thức (Bảng 3.13) Giống HB80 KM140 có tỷ lệ phôi soma tạo thành cao đạt 68,72 – 81,08% môi trường CN2 (MS bổ sung nồng độ 0,3 mg/l BAP) so với môi trường không bổ sung BAP 23,60 32,02% tương tự giống Trắng NA tỷ lệ phôi soma tạo thành bổ sung 0.3 mg/l BAP 40,02% Bảng 3.13 Tỷ lệ phôi soma tạo (sau tuần) Giống Môi Tỷ lệ phôi soma tạo thành (%) Trắng NA Đỏ ĐF Trắng HB KM140 HB80 CN1 23,60 ± 0,18 32,02 ± 0,16 20,33 ± 0,10 19,22 ± 0,34 20,14 ± 0,22 CN2 68,72 ± 0,30 81,08 ± 0,40 40,02 ± 0,19 25,60 ± 0,17 28,42 ± 0,11 CN3 39,00 ± 0,19 41,73 ± 0,20 32,64 ± 0,16 33,81 ± 0,12 32,76 ± 0,31 CN4 27,07 ± 0,13 38,12 ± 0,19 30,88 ± 0,15 29,27 ± 0,28 35,51 ± 0,24 trường Tuy nhiên, giống Đỏ ĐF, Trắng HB tỷ lệ tạo môi trường CN2 giảm đáng kể (25,60 - 28,42%) Bên cạnh đó, tăng nồng độ BAP lên 0,6 mg/l 0,9 mg/l nhận thấy tỉ lệ cụm phơi trưởng thành tạo có chiều hướng giảm giống KM140, HB80 Trắng NA lại tăng giống Đỏ ĐF Trắng HB Trên mơi trường CN4 có giống Trắng HB tỷ lệ tạo tăng lên 35,51%, giống lại giảm Như vậy, nồng độ BAP không tỷ lệ thuận với tỷ lệ bật chồi, nồng độ BAP tăng tỷ lệ bật chồi không tăng mà giảm 105 giống KM140, HB80, Trắng NA, Đỏ ĐF tăng nhẹ Trắng HB lại gây biến dị mẫu chồi, làm ảnh hưởng đến trình hình thành chất lượng sắn 3.4.1.4 Khả tạo hoàn chỉnh Các chồi tái sinh từ giống sắn đạt chiều cao từ 1,5 cm đến 2,0 cm chuyển sang môi trường MS để tạo rễ sau tuần nuôi cấy, khả rễ nhanh đạt tỷ lệ 80% giống sau tuần đạt 100% sau tuần Số lượng rễ dao động từ đến rễ/chồi, dài - cm/rễ Những cơng thức thí nghiệm mơi trường MS có bổ sung chất ĐTST chồi sắn rễ tuần thứ số lượng rễ ít, mập ngắn Như vậy, sắn phù hợp với rễ môi trường MS không cần bổ sung chất điều tiết sinh trưởng Tuy nhiên để đưa quy trình tái sinh hồn chỉnh từ mơ sẹo phơi hóa cần đánh giá tỷ lệ tái sinh hồn chỉnh giống sắn thí nghiệm (Bảng 3.14) Bảng 3.14 Khả tái sinh thành hồn chỉnh từ mơ sẹo phơi hóa Giống Cụm mơ sẹo phơi hố Các tiêu theo dõi Thời gian xuất Tỷ lệ tái sinh Thời gian xuất rễ hoàn chỉnh chồi (ngày) (ngày) (%) 20,7 56,3 61,5 KM140 150 HB80 150 23,8 58,7 60,3 Trắng NA 150 24,3 64,2 35,8 Đỏ ĐF 150 28,9 67,5 21,0 Trắng HB 150 27,1 62,8 24,2 25,0 62,9 41,5 Trung bình Ở hầu hết cụm mơ sẹo phơi hóa q trình tái sinh thành hồn chỉnh từ giống sắn nuôi cấy môi trường kích thích phơi soma nảy mầm có bổ sung BAP với nồng độ 0,3mg/l có khả bật chồi sau 20 – 29 ngày Tuy nhiên, số 750 cụm mơ sẹo phơi hóa giống sắn nhận thấy tỷ lệ tái sinh tạo chồi bình thường, phát triển tốt khoảng 40% chồi tiếp tục chuyển đến môi trường rễ MS (Hình 3.27) Sau khoảng thời gian 56 - 63 ngày rễ bắt đầu xuất từ chồi phát triển tốt giống sắn nghiên cứu tỷ lệ tái sinh hoàn chỉnh từ 21,0 – 61,5% 106 Hình 3.27 Chồi sắn tái sinh từ mơ sẹo phơi hóa Chú thích: A,B: cụm chồi nảy mầm; C: con; D: sắn mơi trường rễ Cây sắn hồn chỉnh đưa khỏi phòng thí nghiệm để dần thích nghi với điều kiện tự dưỡng cách trồng giá thể TN1 trấu hun với tỉ lệ 6:4, tránh ánh sáng chiếu trực xạ chăm sóc điều kiện cung cấp đầy đủ nước dinh dưỡng Tỷ lệ sống, sinh trưởng phát triển tốt vườn ươm trung bình giống đạt 95% 3.4.2 Xây dựng tối ưu quy trình chuyển gen vào sắn thông qua gen GUS 3.4.2.1 Xác định mật độ tế bào vi khuẩn A.tumefaciens (OD 600nm) Từ kết nghiên cứu nguồn nguyên liệu mơi trường phù hợp cho q trình tạo mơ sẹo phơi hóa, chúng tơi lựa chọn đỉnh chồi giống sắn KM140 HB80 hai giống sắn có khả tái sinh tốt, sâu bệnh thuộc nhóm sắn có suất cao (28 - 30 tấn/ha), hàm lượng tinh bột (26 28%) trồng phổ biến nhiều địa phương nước Ngoài ra, hai giống sắn có khả tái sinh từ mơ sẹo phơi hóa cao giống sắn nghiên cứu (Mục 3.4.1) Do vậy, hai giống sắn chọn nguồn nguyên liệu phục vụ cho thí nghiệm chuyển gen Đỉnh chồi giống sắn KM140 HB80 cho lây nhiễm với chủng vi khuẩn A tumefaciens C58 mật độ vi khuẩn 0,4; 0.6; 0,8; 1,0 Kết thu cho thấy tỷ lệ biểu gen GUS tạm thời mẫu chuyển gen sau đồng nuôi cấy phụ thuộc vào mật độ vi khuẩn sử dụng biến nạp Ở mật độ vi khuẩn OD 600nm = 0,4; 0,8 1,0 hiệu chuyển gen thấp mật độ vi khuẩn OD 600nm = 0,6 Cụ thể, tỷ lệ biểu gen GUS tạm thời mật độ OD = 0,4 đạt 15,0% -19,0% Tuy nhiên, tỷ lệ biến nạp thấp mật độ OD = 1,0 đạt 7,0 – 107 8,0% Ở hai giống sắn nghiên cứu HB80 KM140 tỷ lệ biểu gen GUS tạm thời cao đạt 33,0 – 46,0% nồng độ vi khuẩn OD = 0,6 (Hình 3.28) Ngoài ra, mức độ biểu gen GUS tạm thời nguyên liệu chuyển gen có màu xanh chàm đặc trưng thể rõ (Hình 3.29C, D) 60 50 40 HB80 30 KM140 20 10 0.4 0.6 0.8 Hình 3.28: Ảnh hưởng mật độ tế bào vi khuẩn A.tumefaciens đến khả biến nạp gen GUS giống sắn HB80 KM140 Chú thích: Mỗi thí nghiệm lặp lại lần, lần 50 mẫu Các cột biểu đồ biểu thị độ lệch chuẩn giá trị trung bình 3.4.2.2 Xác định thời gian nhiễm A tumefaciens với mẫu thực vật Thời gian nhiễm khuẩn yếu tố quan trọng q trình biến nạp gen Ngồi thời gian biến nạp phụ thuộc vào lồi thực vật loại mô Trong biến nạp phải cần đủ thời gian để vi khuẩn tiếp xúc với mơ thực vật, vi khuẩn có hội để xâm nhập chuyển gen cần quan tâm Tuy nhiên, thời gian lây nhiễm dài ảnh hưởng tới sức sống mẫu ngược lại, thời gian lây nhiễm ngắn ảnh hưởng tới hiệu chuyển gen Các nghiên cứu chuyển gen vào sắn tiến hành nguồn nguyên liệu khác thời gian lây nhiễm khuẩn A tumefaciens khác Trong nghiên cứu khảo sát thời gian lây nhiễm vi khuẩn A.tumefaciens mang gen GUS khoảng thời gian 10, 15, 20 phút mô 108 sẹo giống sắn KM140 để lựa chọn thời gian phù hợp cho thí nghiệm chuyển gen (Bảng 3.15) Bảng 3.15: Ảnh hưởng thời gian nhiễm khuẩn đến hiệu chuyển gen giống sắn KM140 Giống HB80 KM140 HB80 Thời gian nhiễm khuẩn 10 phút 15 phút KM140 HB80 KM140 20 phút 24 Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) 26,7 Mô sẹo chuyển gen (%) 33,5 80 27 33,8 37,1 90 40 44,4 42,2 80 31 38,9 46,4 90 28 31,1 29,5 80 20 25,0 33,9 Số mẫu Mẫu tạo mô sẹo 90 Ở khoảng thời gian lây nhiễm khác thu số mẫu tạo mô sẹo, tỷ lệ tạo mô sẹo số mô sẹo chuyển gen giống sắn HB80 KM140 khác Thời gian nhiễm khuẩn 10 phút cho tỷ lệ tạo mô sẹo 33,5 - 33,7% đạt cao thời gian nhiễm khuẩn 15 phút (38,7%) Sau tăng thời gian nhiễm khuẩn lên 20 phút thu tỷ lệ tạo mơ sẹo có xu hướng giảm (25%) Sau tuần, lấy ngẫu nhiên - khối mô/đĩa nhuộm với X-gluc để kiểm tra tỷ lệ biểu gen GUS giai đoạn mô sẹo Kết thu tỷ lệ biểu cao 42,2 - 46,4% khoảng thời gian nhiễm khuẩn 15 phút, vùng mô sẹo sau nhuộm X – gluc bắt màu xanh tràm đặc trưng vùng mơ biểu hoạt tính gen GUS (Hình 3.31) Do vậy, thời gian nhiễm khuẩn 15 phút phù hợp cho thí nghiệm chuyển gen vào hai giống sắn HB80 KM140 3.4.2.3 Xác định nồng độ kanamycin thích hợp cho chọn lọc mơ sẹo tái sinh chồi Sau lựa chọn nguồn vật liệu nghiên cứu tối ưu đỉnh sinh trưởng, mật độ vi khuẩn A tumefaciens OD 600 nm = 0,6 thời gian biến nạp 15 phút để chuyển gen cho hai giống sắn HB80 KM140 Bước để sàng lọc chuyển gen sau biến nạp cần phải bổ sung Km nồng độ thích hợp (Bảng 3.16) 109 Từ kết thu sau tiến hành thí nghiệm chuyển gen GUS mơi trường CI2 có bổ sung Km Chúng tơi nhận thấy khả sống sót mơ sẹo giống sắn sau 4,6,8 tuần có xu hướng giảm dần hai giống sắn thí nghiệm Tỷ lệ tạo mơ sẹo sau tuần đạt cao HB80 71,74% KM140 74,91 % môi trường bổ sung 40 mg/l Km Sau tuần, tỷ lệ mô sẹo sống sót giảm đáng kể tất công thức môi trường mg/l; 80 mg/l; 100 mg/l Km, khối mô lúc chuyển sang màu đen, mềm (0 mg/l Km) hay trắng, cứng (80 mg/l Km; 100 mg/l Km), mô không sinh trưởng dần bị chết Tuy nhiên, môi trường bổ sung 60 mg/l Km sau tuần tỷ lệ tạo mô sẹo giống sắn HB80 đạt trung bình (54,56%) tỷ lệ mơ sẹo sống sót lại đạt cao (35,53 %) sau tuần (25,11%) sau tuần, khối mơ mềm, xốp, có màu vàng nhạt có khả tái sinh Đối với giống sắn KM140 tỷ lệ tạo mơ sẹo mơ sẹo sống sót sau 4,6,8 tuần môi trường bổ sung 60 mg/l Km thấp giống HB80 cao công thức bổ sung Km khác, tỷ lệ mô sẹo sống sót sau tuần đạt 20,42% Như vậy, nồng độ Km phù hợp cho chọn lọc mô sẹo chuyển gen 60 mg/l hai giống sắn HB80 KM140 Bảng 3.16: Ảnh hưởng Kanamycin đến khả sống sót mơ sẹo chuyển gen GUS giống sắn HB80 KM140 Giống HB80 KM140 Km Số Tỷ lệ tạo mô Tỷ lệ mô sẹo Tỷ lệ mô sẹo (mg/l) mẫu sẹo (%) sống sót (%) sống sót (%) sau tuần sau tuần sau tuần 40 60 80 100 40 60 80 100 50 250 220 190 210 50 218 245 197 150 30,66 ± 3,05 71,74 ± 3,76 54,56 ±3,20 7,77 ± 0,45 0,00 34,18 ± 3,93 74,91 ± 4,57 45,83 ± 1,92 11,95 ± 1,40 0,00 3,82 ± 0,70 21,80 ± 2,81 35,53 ± 2,31 0,00 0,00 0,00 9,51± 0,7 26,46 ± 3,52 0,00 0,00 0,00 8,15 ± 0,75 25,11 ± 3.15 0,00 0,00 0,00 0,00 20,42 ± 3,20 0,00 0,00 Đặc điểm mẫu Mềm, xốp, đen Mềm, xốp, trắng Mềm, xốp, vàng nhạt Cứng, vàng Cứng, đen Mềm, xốp, đen Xốp, đen Mềm, xốp, vàng nhạt Cứng, trắng Cứng, đen 110 3.4.2.4 Xác định nồng độ Kanamycin thích hợp cho chọn lọc chồi chuyển gen Một số mô sẹo tái sinh chồi hai giống sắn HB80 KM140 cần tiếp tục nuôi cấy chọn lọc môi trường rễ có bổ sung Km từ – 100 mg/l để tạo hoàn chỉnh (Bảng 3.17) Trên môi trường đối chứng (Km mg/l) khả sinh trưởng tạo rễ chồi hai giống sắn HB80 KM140 100% Khả tạo rễ phát triển chồi mơi trường có bổ sung Km từ 50 – 100 mg/l có ảnh hưởng rõ rệt Tỷ lệ sống sót hai giống sắn HB80 KM140 nồng độ Km 50mg/l đạt 28,33 – 33,33%, chồi sinh trưởng chậm, mảnh, vàng xanh nhạt Mặt khác, môi trường bổ sung 100 mg/l Km không hấp thụ chất dinh dưỡng nên chồi không tạo rễ, bị vàng chết sau 30 ngày Vì vậy, nồng độ Km thích hợp chọn lọc chồi chuyển gen cho hai giống sắn HB80 KM140 50 mg/l Bảng 3.17: Ảnh hưởng Kanamycin đến tỷ lệ rễ chồi sắn HB80 KM140 Giống HB80 KM140 Kanamycin Tỷ lệ rễ (%) Đặc điểm chồi (sau 30 ngày) Đặc điểm rễ 100,00 Dài, mảnh Xanh thẫm, to 50 28,33 ± 3,07 Ngắn, mập Lá mảnh, xanh nhạt 100 0,00 Không tạo rễ Lá vàng, chết 100,00 Dài, mảnh, nhiều Xanh thẫm, to 50 33,33 ± 6,35 Ngắn, mập Lá mảnh, vàng 100 0,00 Khơng tạo rễ Lá vàng, chết Chú thích: Mỗi thí nghiệm lặp lại lần, lần 20 mẫu 3.4.2.5 Tạo sắn chuyển gen GUS thông qua A tumefaciens Từ kết nghiên cứu tối ưu điều kiện ảnh hưởng đến hiệu chuyển gen xây dựng quy trình chuyển gen vào giống sắn HB80 KM140 thông qua chủng vi khuẩn A tumefaciens C58 mang vector chứa gen GUS 111 Dựa theo quy trình biến nạp vào đỉnh chồi xây dựng, chúng tơi đánh giá hiệu chuyển gen hai giống sắn sau (Bảng 3.18) Kết thu lơ thí nghiệm với tổng số mẫu biến nạp 868 mẫu (KM140) 955 mẫu (HB80) Sau thời gian – tuần số mẫu tạo mô sẹo cao 624 mẫu (đạt 71,6%) giống KM140 715 mẫu (đạt 75,1%) giống HB80 Khi chuyển sang giai đoạn chọn lọc, số phơi soma sống sót thu 218 mẫu (đạt 25,1%) giống KM140 186 mẫu (đạt 19,5%) giống HB80 Lấy ngẫu nhiên số phôi soma sống sót để kiểm tra biểu gen GUS mức độ mơ hóa, kết cho thấy hầu hết mô nhuộm X-gluc đầu bắt màu xanh tràm đặc trưng Điều chứng tỏ gen GUS chuyển vào tế bào phôi soma nhân lên mơi trường ni cấy (Hình 3.29 C, D) Tiếp theo, chuyển phơi soma sống sót lên mơi trường mơi trường nuôi cấy tái sinh CN, kết thu 54 chồi sắn (KM140) 37 chồi (HB80) tái sinh Những chồi sau chuyển sang mơi trường tạo hoàn chỉnh MS để đánh giá khả rễ, kết thu 14 giống sắn KM140 13 giống sắn HB80 chuyển gen rễ, hiệu suất tái sinh đạt 1,36 – 1,61% (14/868 13/955) Đỉnh chồi, cuống chuyển gen mang nhuộm X-gluc thu có màu xanh tràm đặc trưng Điều chứng tỏ có sắn mang gen GUS (Hình 3.29 E, F, G) Bảng 3.18: Tạo sắn HB80 KM140 chuyển gen GUS thông qua A tumefaciens Giống KM140 HB80 Số mẫu biến nạp 360 Số mẫu phát sinh phơi soma 259 Số phơi soma sống sót 91 22 Số chồi rễ Số chuyển gen 240 172 60 15 268 193 67 17 Tổng 868 624 218 54 14 310 232 61 12 2 355 266 69 14 290 217 56 11 Tổng 955 715 186 37 13 Lơ thí nghiệm Số chồi tái sinh Chú thích: Cây chuyển gen dương tính nhuộm X-gluc 112 Hình 3.29: Một số hình ảnh chuyển gen GUS vào giống sắn HB80 KM 140 Chú thích: A: Đỉnh chồi làm vật liệu chuyển gen; B: Mô sẹo chuyển gen môi trường chọn lọc; C: Mô sẹo chuyển gen biểu gen GUS giống sắn HB80 KM140 (D); E, F:Mẫu biểu tạm thời gen GUS lá,thân giống sắn HB80; G: Mẫu biểu tạm thời gen GUS đỉnh sinh trưởng giống sắn KM 140, H: Cây sắn tái sinh chồi Từ kết tối ưu số yếu tố quy trình chuyển gen, chúng tơi đưa sơ đồ quy trình chuyển gen vào sắn thơng qua A tumefaciens sau: Bước 1: Chuẩn bị vật liệu chuyển gen (2 – tuần) Nhân chồi giống sắn HB80 KM140 môi trường MS tạo sắn in vitro nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu đỉnh chồi phục vụ cho chuyển gen Vật liệu chuyển gen đỉnh chồi in vitro - tuần tuổi cắt thành mẫu có kích thước 0,3 - 0,5 cm, đưa vào môi trường CP cảm ứng tạo mô sẹo - tuần Các mô sẹo sau - tuần bắt đầu xuất phôi chuyển sang môi trường CI1-4 để tạo phôi cung cấp nguyên liệu phục vụ cho chuyển gen (4 - tuần) Bước 2: Chuẩn bị huyền phù A tumefaciens (2 - ngày) Nuôi lỏng chủng vi khuẩn A tumefaciens C58/pCB mang vector chuyển gen nuôi tạo dịch huyền phù chuyển gen vi khuẩn môi trường LB lỏng với mật độ tế bào vi khuẩn OD600nm 0,6; nhiệt độ 28oC Bước 3: Chuyển gen (2 - ngày) Lựa chọn phôi giai đoạn phôi non, khối mô vàng tươi, tua dài lây nhiễm với dịch huyền phù A tumefaciens 15 phút có bổ sung 100µM AS; Thấm khô 113 mẫu đặt môi trường đồng ni cấy CI2 có bổ sung 100µM AS - ngày tối, nhiệt độ phòng 25 – 27oC Bước 4: Diệt khuẩn chọn lọc phôi soma (3 - tuần) Rửa khuẩn chuyển phôi lên môi trường nuôi cấy chọn lọc CI2 môi trường MS có bổ sung 5mg/l picloram, 0,2mg/l IBA, 500 mg/l cefotaxime, 60 mg/l Km Nuôi điều kiện ánh sáng, nhiệt độ phòng ni từ 25 - 27oC Bước 5: Tái sinh chồi chuyển gen (6 - tuần) Phơi soma sống sót ni cấy mơi trường tái sinh chồi CN2 môi trường MS bổ sung 0,3 mg/l BAP, 60 mg/l Km, cấy chuyển tuần/lần chồi sắn tái sinh Bước 6: Tạo hoàn chỉnh Chồi sắn tái sinh đươc chọn lọc môi trường rễ chọn lọc (MR) môi trường MS bổ sung 50 mg/l Km, nhiệt độ 25 - 27oC để chọn lọc chuyển gen Bước 7: Ra (3 - tuần) Những chồi sống sót chuyển sang môi trường MS để sinh trưởng, phát triển Khi đạt chiều cao - cm, có - với rễ khỏe mạnh trồng bầu với giá thể TN1 đặt bồn sinh trưởng 3.4.3 Tạo dòng sắn chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột 3.4.3.1 Tạo dòng sắn chuyển gen pBI121-C54:SSIV:NOST Từ phân tích mục 3.2.4 đánh giá nhóm gen quan trọng liên quan đến q trình sinh tổng hợp tích lũy tinh bột sắn, gen SSIV gen tiềm góp phần định hàm lượng tinh bột củ sắn Việc áp dụng công nghệ sinh học lên sắn để nghiên cứu biểu gen đặc hiệu mô quan quan trọng hàng đầu muốn cải tiến gen đích Gen SSIV cho có liên quan đến Pt2L4 - protein giàu acid gluctamic sắn, phiên mã gen phát rễ củ khơng có Kết cho thấy promoter C54 hoạt động chủ yếu mạch dây, tầng phát sinh gỗ mạch gỗ mô mạch lá, cuống lá, thân hệ thống rễ Đặc biệt, biểu mạnh β-glucuronidase phát tế bào nhu mô giàu tinh bột rễ dự trữ chuyển gen Những kết chứng minh promoter 114 C54 liên quan đến biểu đặc hiệu mô mạch trình phát triển thứ cấp rễ củ sắn Như vậy, C54 promoter tiềm biểu gen đặc hiệu nhằm cải thiện tính trạng di truyền sắn, ví dụ tăng giá trị dinh dưỡng củ Ngoài ra, kết phân tích khả tích lũy tinh bột thuốc chuyển gen pK7WG2D-35S:SSIV:T35S pBI121-C54:SSIV:NOST thu hàm lượng tinh bột rễ tăng 6,8 - 17,6% thuốc chuyển gen mang cấu trúc pK7WG2D35S:SSIV:T35S tăng 27,7 - 65,7% thuốc chuyển gen mang cấu trúc pBI121 - C54:SSIV:NOST (Mục 3.3.2.3) Do vậy, cần tiếp tục nghiên cứu chuyển gen pBI121-C54:SSIV:NOST chứa gen SSIV với mục đích tạo sắn chuyển gen tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào giống sắn KM140 khả tái sinh hiệu chuyển gen GUS giống sắn cao so với giống khác (Bảng 3.19; Hình 3.30) Bảng 3.19: Chuyển gen pBI121-C54: SSIV:NOST vào giống sắn KM140 Lơ thí nghiệm ĐC Tổng Số mẫu tạo Số mẫu tạo Số mô sẹo phôi mẫu MT CP MT CI 50 50 36 300 297 207 350 350 249 300 300 236 270 265 195 250 250 188 1520 1512 1111 Số mơ sống sót MTCL CI CN MR 12 121 134 115 107 95 572 39 3 18 Số chồi rễ MTMS 2 2 Chú thích: ĐC: mẫu khơng nhiễm A tumefaciens, MTCL: CI; CN: bổ sung 60 mg/l Km; MR: bổ sung 50 mg/l Km Chủng vi khuẩn A tumefaciens C58 mang cấu trúc vector chuyển gen pBI121C54:SSIV:NOST áp dụng quy trình chuyển gen trên, tiến hành biến nạp vào 1520 mẫu thu 18 mẫu mô sẹo tái sinh thành sau giai đoạn chọn lọc Sau chuyển gen chuyển sang mơi trường rễ chọn lọc tạo hồn chỉnh, kết thu chuyển gen rễ đạt 0,59% (9/1520), (Bảng 3.19) 115 Hình 3.30: Một số hình ảnh chuyển gen pBI121-C54: SSIV:NOST vào giống sắn KM140 Chú thích: A: Đỉnh sinh trưởng mơi trường tạo mô sẹo CP; B: Mô sẹo môi trường CI; C: Phôi làm vật liệu chuyển gen; D,E: Mẫu môi trường chọn lọc CI + cefo 500mg/l + Km 60mg/l; F, G: Mẫu môi trường tái sinh CN + Km 60 mg/l; H: Mẫu môi trường rễ MR + Km 50 mg/l Những sắn chuyển gen SSIV mang vector pBI121-C54: SSIV:NOST nuôi cấy mơi trường MS – tuần, có – lá, xanh đậm, cao - cm với rễ khỏe mạnh đưa trồng bầu với giá thể TN1 đặt vào bồn sinh trưởng – tuần Các chuyển gen sinh trưởng phát triển bình thường, khơng có khác biệt hình thái quan sát chuyển gen với khơng chuyển gen (Hình 3.31) Sau chuyển sang chậu lớn trồng nhà lưới WTT W T Hình 3.31: Cây sắn giống KM 140 chuyển gen SSIV trồng nhà lưới 116 3.4.5.2 Phân tích đánh giá dòng sắn chuyển gen kỹ thuật PCR Trong nghiên cứu này, dòng sắn chuyển gen với cấu trúc gen pBI121-C54: SSIV:NOST thu rễ, tách DNA tổng số dùng để phân tích PCR với cặp mồi promoter C54-F/ SSIV Frag-R Kết điện di DNA tổng số dòng sắn chuyển gen thể hình 3.32 Hình 3.32 Điện di DNA tổng số dòng sắn chuyển gen mang cấu trúc pBI121-C54:SSIV:NOST Kết điện di sản phẩm DNA tổng số cho thấy băng điện di sáng rõ Như DNA tổng số dòng sắn chuyển gen đạt tiêu chuẩn để dùng cho phản ứng PCR Phản ứng PCR thực với cặp mồi promoter C54F/SSIV Frag-R Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR dòng sắn chuyển gen mang cấu trúc pBI121-C54: SSIV:NOST với cặp mồi Promoter C54-F/ SSIV-R Kết cho thấy 7/9 dòng sắn kiểm tra có mang cấu trúc gen SSIV Các dòng cho kết PCR dương tính sản phẩm đoạn DNA có kích thước tương ứng 1289 bp (Hình 3.33) Hình 3.33 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR dòng sắn chuyển gen với cặp mồi promoter C54F/ SSIV-R 117 Song song với việc PCR với cặp mồi Promoter C54-F/ SSIV-R, để chắn dòng sắn chuyển gen khơng có tồn khuẩn A.tumefacines cây, DNA tổng số dòng sắn chuyển gen tiếp tục dùng cho phản ứng PCR với cặp mồi virF/R (Hình 3.34) Hình 3.34 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR dòng sắn chuyển gen với cặp mồi virF/R Kết điện di sản phẩm PCR dòng sắn chuyển gen cho thấy tất dòng sắn chuyển gen cho kết âm tính với cặp mồi virF/R (Hình 3.34) Điều chứng tỏ khơng có tồn A.tumefacines dòng sắn chuyển gen Tóm lại: Đã nghiên cứu tối ưu điều kiện ảnh hưởng đến hiệu chuyển gen để xây dựng quy trình chuyển gen vào sắn, tiến hành chuyển gen GUS vào mơ sẹo phơi hóa từ đỉnh chồi giống sắn HB80 KM140 kết thu 0,41 – 0,69% sắn chuyển gen Khi chuyển gen đích SSIV thơng qua vector pBI121C54:SSIV:NOST vào giống sắn KM140, tỷ lệ chuyển gen đạt 0,46% Điều chứng tỏ sắn đối tượng khó để chuyển gen so với đối tượng thực vật khác Đây kết bước đầu khẳng định thành cơng quy trình chuyển gen xây dựng làm tiền đề cho nghiên cứu chuyển gen tăng hàm lượng tinh bột vào số giống sắn Việt Nam 118 Chương BÀ N LUẬN KẾT QUẢ Hiện nay, việc ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải tạo sắn theo hướng tính trạng có lợi như: suất cao, chất lượng phù hợp với mục đích sử dụng nhằm phục vụ công nghiệp xuất vấn đề cấp thiết nước ta Các hướng nghiên cứu mức độ sinh học phân tử di truyền học chưa quan tâm phát triển Đặc biệt, chưa có nghiên cứu sâu sinh học phân tử di truyền học nhằm khai thác nguồn gen quý có sẵn Việt Nam, phục vụ cho công tác cải tạo giống sắn cơng nghệ gen Để góp phần thực mục tiêu trên, luận án tiến hành nghiên cứu nội dung cách có hệ thống từ đánh giá biểu gen quan trọng liên quan đến trao đổi chất tinh bột đến khả tăng cường sinh tổng hợp tinh bột gen SSIV đươ ̣c xác đinh ̣ thuố c lá mơ hin ̀ h, sau xây dựng hệ thống tái sinh in vitro và chuyển gen thông qua A.tumefaciens vào mô ̣t số giố ng sắ n, bước đầ u hồn thiện quy trình chủ n gen SSIV vào sắn 4.1 SỰ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN TRAO ĐỔI CHẤT TINH BỘT Tinh bô ̣t có hai thành phầ n chin ́ h là amylose và amylopectin Cả hai cấu trúc đề u gồ m mô ̣t bô ̣ khung là chuỗi liên kế t α-1,4 glucose, amylose có mức đô ̣ polyme hóa DP chỉ từ 1,000 - 5,000 và ít điể m nhánh (chưa đế n 0,5% các liên kế t α-1,6) thì amylopectin la ̣i là mô ̣t phân tử rấ t lớn (DP từ 5,000-50,000) và phân nhánh nhiề u (liên kế t α-1,6 chiế m 3-4%) (Bresolin cs., 2006) Amylose đươ ̣c tổ ng hơ ̣p bởi ADP-glucose pyrophosphorylase (AGP) và granule-bound starch synthase (GBSS) còn amylopectin đươ ̣c tổ ng hơ ̣p bởi hoa ̣t đô ̣ng phố i kế t hơ ̣p của AGP, các starch synthase (SS) và enzyme phân nhánh tinh bột (starch branching enzyme - SBE) Do đó, nghiên cứu chúng tơi lựa chọn nhóm gen ADP-glucose pyrophosphorylase (AGP), granule-bound starch synthase (GBSSI GBSSII), starch synthase (SSI, SSII, SSIII, SSIV) enzyme phân nhánh tinh bột (SBE) để kiểm tra đánh giá hoạt động gen cấp độ phiên mã phản ứng real-time PCR 119 Viê ̣c xác đinh ̣ các thành viên thuô ̣c mỗi nhóm gen liên quan đế n quá trin ̀ h sinh tổ ng hơ ̣p tinh bô ̣t ở sắ n để ta ̣o sở dữ liê ̣u cho viê ̣c thiế t kế mồ i đươ ̣c thực hiê ̣n bởi bước Bước thứ nhấ t là truy câ ̣p sở dữ liê ̣u NCBI để thu thâ ̣p các trin ̀ h tự nucleotide của các gen AGP, GBSSI, GBSSII, SSI, SSII, SSIII, SSIV và SBE của thực vâ ̣t đã đươ ̣c công bố ngân hàng gen Genbank Bước thứ 2, bằ ng công cu ̣ tìm kiế m Local BLAST searches chúng sử du ̣ng các trin ̀ h tự này làm trình tự truy vấ n sở dữ liê ̣u gen sắ n tải từ Phytozome v10.1 để tìm trình tự cDNA đầ y đủ của các gen giả đinh ̣ tương ứng ở sắ n Ở bước cuố i cùng mỗi trình tự gen giả đinh ̣ đươ ̣c kiể m tra và khẳ ng đinh ̣ bằ ng công cu ̣ Pfam tìm các vùng chức bảo thủ trình tự protein tương ứng Sau khảo sát ̣ gen sắ n, đã xác đinh ̣ đươ ̣c các gen liên quan đế n quá trin ̀ h sinh tổ ng hơ ̣p tinh bô ̣t ở sắ n: AGPS; AGPL; GBSSI; GBSSII; SSI; SSII; SSIII; SSIV; SBE AGPase enzyme xúc tác cho bước trình tổng hợp tinh bột chứng minh enzyme điều hòa quan trọng, điều chỉnh tốc độ phản ứng tồn chu trình sinh tổng hợp glycogen vi khuẩn tinh bột thực vật AGPase xúc tác cho phản ứng biến đổi glucose-1-P ATP thành ADP-glucose pyrophosphate AGPase xác định enzyme dị lập thể, cấu tạo hai tiểu phần lớn (AGPL) hai tiểu phần nhỏ (AGPS) hai gen tương tứng mã hóa.Ngồi ra, gen mã hóa AGPase sắn phân lập giải trình tự thành công (Tichafa cs., 2001) You – Zhi Li cs (2016) chứng minh hai giống sắn chin ́ h ở Quảng Tây – Trung Quố c là: Huanan 124 (H124) có hàm lươ ̣ng tinh bô ̣t thấ p Fuxuan 01(F01) có hàm lươ ̣ng tinh bô ̣t cao thông qua các phân tích về sự khác biê ̣t của hai giố ng sắ n này qua bố n giai đoa ̣n phát triể n (bắ t đầ u từ hom thân đế n trưởng thành) Kế t quả cho thấ y thay đổi hàm lượng đường lá, thân rễ dường khơng có mối liên quan chặt chẽ với tổng hàm lượng tinh bột tích lũy rễ Tuy nhiên, so sánh H124 với F01 có hệ thống bó mạch xylem nách xếp nhỏ gọn hơn; lượng callose xung quanh lưới rây hệ thống phloem và rễ, hoạt tính enzym tham gia tổng hợp tinh bột cao hoạt tính enzym amylase thấp 120 hơn; biểu gen liên quan tăng cường cách đáng kể; tốc độ dòng chảy thân (SFR) cao Như vâ ̣y, tích lũy hàm lượng tinh bột cao rễ kết từ tác động đồng thời khả vận chuyển chất thân cách mạnh mẽ đặc trưng SFR, trình tổng hợp tinh bột mức độ cao trình phân giải mức độ thấp rễ; biểu gen vận chuyển đường mức độ cao (You – Zhi la cs., 2016) Trong nghiên cứu này tiến hành phân lập gen AGPase phân lập từ củ giống sắn Đỏ ĐF, SM937-26, KM140 và Trắng HB đại diện cho nhóm có hàm lượng tinh bột khác thu thập vào giai đoạn phát triển 90 ngày, 180 ngày 270 ngày Trong AGPS2 hoạt động chủ yếu AGPS1 có xu hướng biểu đặc hiệu củ Đối với gen AGPS1, dựa vào kết phân tích mức độ biểu gen củ (Hình 3.4), hoạt động gen AGPS1 củ giống sắn có tăng qua thời kỳ tăng mạnh 270 ngày, gấp 3,3 - 4,2 lần so với giai đoạn khởi đầu Mức độ phiên mã gen nhóm giống sắn có hàm lượng tinh bột cao (Đỏ ĐF, SM937-26 và KM140) có chênh lệch đáng kể (gấp 1,4 - 1,7 lần) so với giống Trắng HB có hàm lượng tinh bột thấp Hoạt động gen AGPS2 giai đoạn khởi đầu 90 ngày, 270 ngày đạt giá trị max AGPL3 bước vào thời kỳ phát triển củ tích lũy tinh bột (giai đoạn 180 - 270 ngày) có tăng mạnh, gấp từ - lần so với giai đoạn 90 ngày (Hình 3.5) Kế t quả này cũng tương tự nghiên cứu hai giố ng sắ n H124, F01 cho thấ y gen AGPS hoạt động mạnh giai đoạn phát triển thân (50 - 110 ngày sau trồng) AGPL hoạt động động mạnh giai đoạn phát triển củ (110 - 240 ngày); (You – Zhi la cs., 2016) Mức độ biểu gen GBSSI đặc hiệu mô củ sắn, trái lại gen GBSSII chịu trách nhiệm việc tổng hợp amylose (Hình 3.6) Ở 270 ngày, mức độ biểu trung bình GBSSI mô củ cao gấp 55 lần gen GBSSII Sự hoạt động gen GBSSII mô củ giống sắn thấp, có giảm dần qua thời kỳ Kết phù hợp với nghiên cứu khác cho thấy biểu gen GBSSI phần lớn bị giới hạn mô củ, phiên mã gen mã 121 hóa GBSSII chủ yếu khoanh vùng lục lạp Đó lý GBSSII chịu trách nhiệm tổng hợp amylose lục lạp (Fujita & Taira, 1998; Vrinten & Nakamura, 2000) Nhóm gen SS (SSI, SSII, SSIII SSIV), isoenzyme SSI, SSII, SSIII liên quan đến kéo dài chuỗi amylopectin SSIV có liên quan đến khởi đầu hình thành kiểm sốt số lượng hạt tinh bột Gamez cs (2011) thu nhận thuốc có khả sinh trưởng, phát triển tốt hàm lượng tinh bột tích lũy cao 30 - 40% so với đối chứng tăng cường biểu gen SSIV (starch sythase IV) Bên cạnh đó, việc biểu gen SSIV cho phép tăng cường đến 50% hàm lượng tinh bột vào thời điểm cuối ngày so với đối chứng Trong nghiên cứu khác đối tượng ngũ cốc, SSI xác định dạng Starch Synthase tồn nội nhũ (Cao cs., 1999) Mức độ phiên mã trung bình gen SSI mẫu củ cao gấp 2,5 lần so với gen SSIII Trong mẫu lá, biểu gen khơng có biến đổi nhiều qua thời kỳ, đồng thời mức độ biểu tương đương Do vậy, kết phân tích mẫu củ mẫu cho thấy khơng có khác biệt đáng kể giống sắn có hàm lượng tinh bột khác đồng thời không cho thấy mối tương quan với hàm lượng tinh bột giống Đối với SSII, mức độ biểu trung bình SSII-1 củ 270 ngày cao gấp 14 lần giai đoạn 180 ngày gấp 21 lần giai đoạn 90 ngày Điều cho thấy gen SSII-1 biểu mạnh mẽ gen SSI SSIII Gen SSIV gen cho thấy có biến đổi rõ ràng mức độ biểu Trong giai đoạn 270 ngày, mức độ phiên mã gen SSIV cao lần giai đoạn 90 ngày cao gấp đôi giai đoạn 180 ngày Đồng thời phiên mã gen SSIV giống Đỏ ĐF, SM937-26 KM140 cao gấp 3,3 lần 2,2 lần so với Trắng HB giống có hàm lượng tinh bột thấp (Hình 3.7) Kết góp phần chứng minh SSIV có tiềm việc kiểm sốt hàm lượng tinh bột tạm thời tinh bột dự trữ thực vật Đối với gen SBE, giống KM140 có biểu gen SBE mạnh 122 mô củ (gấp khoảng 1,1-1,3 lần so với giống SM937-26 Trắng HB) mô (gấp 1,5-1,8 lần giống SM937-26 Đỏ ĐF) khác biệt chưa cho phép khẳng định tiềm sử dụng SBE việc cải tiến hàm lượng tinh bột thực vật Từ kết nghiên cứu biểu gen liên quan đến trao đổi chất tinh bột xác định gen AGPS, AGPL SSIV gen tiềm góp phần định hàm lượng tinh bột củ sắn 4.2 CHUYỂN GEN SSIV TĂNG CƯỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT VÀO CÂY THUỐC LÁ Quá trình sinh tổng hợp tinh bột thực vật việc chuyển hóa glucose-1-P ATP thành ADP-glucose xúc tác ADP-glucosepyrophosphorylase (AGPase) ADP-glucose monomer cho trình sinh tổng hợp tinh bột với tham gia nhiều enzyme Hiện có loại enzyme tham gia sinh tổng hợp tinh bột thực vật xác định nghiên cứu GBSS (Granule-bound starch synthase) đảm nhận trình tổng hợp amylose SS (IIV) giữ vai trò sinh tổng hợp nên sợi amylopectin Ngoài ra, bên cạnh enzyme SS, có enzyme xúc tác q trình phân nhánh SBE (Starch branching enzyme) hay enzyme phân hủy tinh bột tham gia vào q trình điều hòa hàm lượng tinh bột thực vật (Geigenberger, 2011) Bên cạnh gen nghiên cứu, gen SSIV nghiên cứu ứng dụng nhằm tăng hiệu trình sinh tổng hợp tinh bột Nhiều nghiên cứu gần cho thấy SSIV giữ vai trò quan trọng khởi đầu trình hình thành hạt tinh bột (Szydlowski cs., 2009) Roldan cs (2007) đánh giá ảnh hưởng việc bất hoạt gen SSIV đến trình tổng hợp tinh bột thuốc Kết cho thấy thuốc chuyển gen Mut- SSIV xuất kiểu hình sinh trưởng so với đối chứng Mặt khác, hàm lượng polysaccharide dự trữ không khác biệt so với đối chứng Tuy nhiên, chuyển gen có suy giảm số lượng hạt tinh bột với tăng kích thước hạt tinh bột (Roldan cs., 2007) Matilda (2013) cho thấy thuốc đột biến 123 khuyết gen SSIV bên cạnh suy giảm số lượng hạt tinh bột/ lục lạp trưởng thành gây tượng không tạo thành tinh bột gia tăng hàm lượng ADPglucose non (Matilda cs., 2013) Một số nghiên cứu tăng cường biểu gen gen tham gia trình sinh tổng hợp tinh bột thu nhận kết khả quan cải thiện hàm lượng tinh bột tích lũy thực vật Gamez cs (2011) thu nhận thuốc có khả sinh trưởng, phát triển tốt hàm lượng tinh bột tích lũy cao 30 - 40% so với đối chứng tăng cường biểu gen You – Zhi la cs (2016) Bên cạnh đó, việc biểu gen SSIV cho phép tăng cường đến 50% hàm lượng tinh bột vào thời điểm cuối ngày so với đối chứng (Gamez cs., 2011) Carciofi cs (2012) thu nhận dòng mơ sẹo lúa mạch có hàm lượng tinh bột cao 4% so với đối chứng tiến hành chuyển gen GBSS Kết nghiên cứu chuyển cấu trúc gen pK7WG2D-35S:SSIV:T35S pBI121-C54:SSIV-cmyc:NOST biến nạp vào 300 mảnh thuốc thu 77 chuyển gen pK7WG2D-35S:SSIV:T35S 69 chuyển gen pBI121C54:SSIV-cmyc:NOST môi trường chọn lọc kanamycin (Bảng 3.10) Tiếp theo, chúng tơi phân tích Southern blot thành công 7/7 mẫu chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S 7/7 mẫu chuyển gen mang cấu trúc pBI121-C54:SSIV:NOST (Hình 3.19) Bước đầu nhóm nghiên cứu đánh giá hoạt gen SSIV với cấu trúc K7WG2D-35S:SSIV:T35S pBI121-C54:SSIV:NOST dòng thuốc thu kết chuyển gen có hàm lượng tinh bột cao đối chứng không chuyển gen Cụ thể hàm lượng tinh bột rễ tăng 6,8 – 17,6% thuốc chuyển gen mang cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S tăng 27,7 - 65,7% thuốc chuyển gen mang cấu trúc pBI 121 – C54: SSIV: NOST (Bảng 3.9; 3.10) Đây sở để lựa chọn gen SSIV mang cấu trúc pBI 121 – C54: SSIV: NOST chuyển vào sắn 124 4.3 CHUYỂN GEN SSIV TĂNG CƯỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT VÀO CÂY SẮN 4.3.1 Hệ thống tái sinh sắn Ngồi điều kiện mơi trường ni cấy giống thực vật yếu tố quan trọng định đến tăng trưởng phát sinh hình thái tế bào mơ thực vật Bộ phận sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy mô yếu tố định hiệu q trình ni cấy Về lý thuyết, phận thu từ loài thực vật sử dụng để tạo mô sẹo, nhiên mức độ thành công q trình tạo mơ sẹo phụ thuộc vào tính chất đặc trưng chúng Thân cây, lá, rễ, hoa, hạt giống phận khác sử dụng, nhiên phận non thường sử dụng cho hiệu cao Trong nghiên cứu này, chồi nách từ thân sắn in vitro nuôi cấy để nghiên cứu khả tạo mơ sẹo phơi hóa giống sắn khả sinh trưởng nhanh hẳn so với phận khác q trình ni cấy mơ Với nghiên cứu giới, trải qua thời gian dài tìm hiểu hình thành cấu trúc phơi từ mơ sẹo gần nghiên cứu tập trung vào việc tạo mô sẹo phơi hóa Nhờ phát cấu trúc mà nhà khoa học giới cải tạo thành công nhược điểm số giống sắn có cơng nghệ sinh học đại (Zainuddin cs., 2012) Phôi soma thường tạo cách sử dụng auxin môi trường nuôi cấy (Williams & Maheswaran,1986) Giữa auxin khác nhau, 2,4D chất áp dụng phổ biến để tạo phôi soma Tạo phôi soma môi trường có bổ sung picloram báo cáo nhiều loài khác nhau: sắn (Raemakers cs., 1997;), lúa mạch (Groll cs., 2001), lúa mì (Castillo cs., 1998; Mendoza & Kaeppler, 2002), kê (Preeti & Kothari, 2004) Danso cs (2010) cho hai chất 2,4D picloram cho kết trình tạo phôi soma cao (90 – 100%), nhiên môi trường có bổ sung picloram cho q trình tạo phơi soma nhanh vượt trội so với môi trường bổ sung 2,4D picloram tác động đến 125 thành tế bào làm giãn tế bào nhanh 2,4D Feitosa cs (2007) nghiên cứu khả tái sinh số giống sắn Brazil; Nyaboga cs (2013) nghiên cứu giống sắn TME14 thông qua tạo phôi soma cần bổ sung nồng độ 12 mg/l picloram vào môi trường nuôi cấy cho tỷ lệ tạo phôi cao Kone cs (2015) chứng minh khả tất giống sắn địa phương Cameroon có khả tạo phôi với tỷ lệ khác môi trường có bổ sung Picloram 2,4D, nhiên kết cao bổ sung 50 µM/l Picloram Cả hai auxin thường sử dụng tạo phôi soma sắn (Li cs., 1996, Taylor cs., 1996; Zhang & Puonti-Kaerlas., 2005) Như vậy, tuỳ thuộc vào thành phần mơi trường bổ sung chất thuộc nhóm cytokinin khác nhau, khối mơ sẹo phơi hóa tạo từ đến nhiều chồi sau khoảng tuần (Bull cs., 2009) Tại Việt Nam, có số nghiên cứu sử dụng thân non mảnh non sắn để tạo mô sẹo cấu trúc phơi (Đồn Thị Phương Thùy & Bùi Trang Việt (2006), (Bùi Lan Anh cs., 2012), (Vũ Văn Kiên & Nguyễn Du Sanh., 2011) thu kết tốt nghiên cứu giống sắn KM 297 cảm ứng tạo phôi môi trường bổ sung mg/l picloram sau 13 ngày; 12 mg/l picloram sau 14 ngày với giống sắn KM 140 (Tống Thị Hường cs., 2017) Tuy nhiên chưa có nghiên cứu phát cấu trúc mơ sẹo phơi hóa hồn thiện cho tất giống sắn Những nghiên cứu sắn Việt Nam dừng lại việc tạo phôi soma sử dụng nguyên liệu để chuyển gen thường cho hiệu thấp Từ kết xây dựng hệ thống tái sinh phục vụ cho chuyển gen sắn thu nhận kết cụ thể minh chứng cho tỷ lệ tái sinh phụ thuộc vào môi trường ni cấy mà phụ thuộc vào giống Các cơng trình nghiên cứu hệ thống tái sinh sắn thường phức tạp có nhiều giai đoạn nuôi cấy với thành phần môi trường điều kiện khác Trong nghiên cứu này, hệ thống tái sinh tối ưu cho hai giống HB80 KM140 lựa chọn đỉnh sinh trưởng môi trường tạo mô sẹo CP, cảm ứng tạo 126 phôi CI2, phôi soma tạo môi trường CN2 tạo hồn chỉnh mơi trường MS Sau khoảng thời gian 56 – 58 ngày, tỷ lệ tái sinh hoàn chỉnh đạt 60,3 – 61,5% (Bảng 3.14) sử dụng cho nghiên cứu chuyển gen vào hai giống sắn 4.3.2 Chuyển gen SSIV vào sắn thông qua A tumefaciens Bull cs (2009) xây dựng hồn thiện quy trình chuyển gen đáng tin cậy dễ hiểu nhờ vi khuẩn A tumefaciens mơ sẹo phơi hóa (FEC) tái sinh chuyển gen giống sắn mơ hình TMS 60444 Phương pháp chuyển gen nhờ A tumefaciens thông qua FEC tổ hợp gồm hai hệ thống xem phương pháp sử dụng rộng rãi hiệu để sản xuất sắn chuyển gen Tổ hợp ưu việt so với phương pháp chuyển gen súng bắn gen hay chuyển gen thông qua khối mô sẹo chỗ: thứ sử dụng FEC giảm rủi ro việc tái sinh lai so với trình sử dụng phương pháp tái sinh mô, cotyledon (lá mầm); hai chọn lọc (thường sử dụng kháng kháng sinh) FEC cho kết non không chuyển gen tái sinh so với mẫu tái sinh từ chồi (Li cs., 2006; Zhang cs., 2000; ) Kết sở để tiếp tục có định hướng nghiên cứu nhằm mục đích tạo cấu trúc mơ sẹo phơi hóa giống sắn trồng phổ biến Việt Nam Như vậy, đỉnh chồi sắn in vitro phận sắn có khả tạo mơ sẹo chất lượng (Zainuddin cs., 2012) Do đó, chúng sử dụng để nghiên cứu khả tạo mơ sẹo phơi hóa giống sắn Bên cạnh đó, mơ hay quan khác sử dụng để nuôi cấy tạo mô sẹo, nhiên mức độ thành công lại phụ thuộc vào yếu tố khác giống sắn, hệ thống mơi trường ni cấy (Đồn Phương Thùy & Bùi Trang Việt., 2006) Trên giới, nhà khoa học sử dụng nhiều phận khác thân sắn để tạo mô sẹo loại phôi soma Tuy nhiên, việc tạo phôi soma chất lượng yếu tố quan trọng để cải tạo giống sắn phương pháp công nghệ sinh học (Opabode cs., 2014; 2015) 127 Nguyễn Văn Đồng cs (2014) thí nghiệm môi trường MMS cải tiến dựa môi trường dinh dưỡng MS có bổ sung 12 mg/l picloram thử nghiệm để nuôi cấy mô sẹo giống sắn: TMS 60444, KM 140, KM 419, HL 2004-28 Kết cho thấy, môi trường phù hợp với giống TMS 60444 khơng thích ứng với giống sắn lại, điều thể khả sinh trưởng mô sẹo TMS 60444 giai đoạn sau mô sẹo giống lại bị thối hóa chết dần Tỷ lệ tạo mơ sẹo phơi hóa trung bình giống TMS 60444 lên đến 64,3% giống lại có tỷ lệ 0% Lựa chọn khối mơ vàng tươi, tua dài, ngâm mơ sẹo phơi hóa từ 10 20 phút dịch khuẩn chuẩn bị có chứa 100µM AS đồng ni cấy mơi trường Co thời gian – ngày nhiệt độ phòng 25 – 27oC Khối mơ sẹo phơi hóa sau biến nạp nuôi cấy môi trường tái sinh có bổ sung chất chọn lọc để tạo sắn chuyển gen (Hình 3.27) Quy trình tương tự quy trình có nghiên cứu Zainuddin cs (2012) Mục tiêu chung quy trình tạo mơ sẹo phơi hóa để làm nguồn nguyên liệu phục vụ cho chuyển gen mong muốn thơng qua vi khuẩn Agrobacterium Tuy nhiên, quy trình nghiên cứu chúng tơi có cải tiến số thành phần môi trường giai đoạn cảm ứng tạo mơ sẹo phơi hóa để chất lượng mơ sẹo phơi hóa tạo tốt Tỷ lệ Agrobacterium mật độ tế bào chủ yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tần số chuyển T-DNA, nồng độ thấp Agrobacterium làm giảm hiệu lực tần số chuyển T-DNA, nồng độ cao loại vi khuẩn ảnh hưởng đến khả sống sót tế bào thực vật Vì vậy, việc tập hợp tế bào mật độ tế bào Agrobacterium tối ưu vào giống sắn cho phù hợp điều cần thiết để nâng cao hiệu chuyển gen Tỷ lệ biểu gen GUS tạm thời hai giống sắn nghiên cứu HB80 KM140 cao nồng độ vi khuẩn OD 600nm= 0,6 đạt 33,0 - 46,0% (Hình 3.28) Kết phù hợp với công bố chuyển gen vào FEC giống sắn TME 14 có giá trị OD600 0,25 (Nyaboga cs., 2013) giống sắn TMS 60444 có giá trị OD600 0,5 (Bull cs., 2009) Tương tự OD600 = 0,5 lại nồng độ tối ưu chuyển gen 128 htpII kháng hygromyxin gen thị GUSA biểu promotor 35S sắn TMS 60444 giống sắn địa phương: Agric, Oko – iyawo Abbey - ife Thụy Sĩ Zainuddin cs (2012); Ngoài ra, Nguyễn Văn Đồng cs (2014) thu kết chuyển gen GFP tối ưu OD600 = 0,5 cho giống sắn KM 140 Gen chọn lọc nptII kháng Km thường thiết kế vector dùng để chuyển gen thực vật Tuy nhiên, mức độ mẫn cảm mô thực vật với Km thay đổi phụ thuộc vào giống, loài thực vật Kanamicin tác động tới tế bào không chuyển gen theo chế liên kết với tiểu phần nhỏ ribosome tế bào, ức chế trình sinh tổng hợp protein đường sinh tổng hợp khác liên quan, có hoạt động lục lạp Mảnh lá, cụm chồi, khả hấp thu dinh dưỡng, hoạt động lục lạp bị rối loạn nên bị vàng chết dần Vì vậy, Km dùng rộng rãi maker chọn lọc tế bào, mảnh lá, chuyển gen qua giai đoạn Ảnh hưởng Km với nồng độ từ 50 – 100 mg/l đến khả tạo mô sẹo sống sót mơ sẹo chuyển gen nghiên cứu (Bảng 3.16) Môi trường chọn lọc bổ sung 60 mg/l thu mơ sẹo chuyển gen sống sót 20,4 - 25,1% sau tuần hai giống sắn HB80 KM140, môi trường bổ sung Km từ 80 – 100 mg/l mơ sẹo hình thành khơng phát triển được, cứng vàng chuyển sang đen 100% mơ bị chết sau tuần Ngồi ra, bổ sung nồng độ 50 mg/l Km vào môi trường rễ chọn lọc tỷ lệ rễ đạt 28,3 – 33,33% tăng nồng độ lên 100 mg/l Km chồi sống sót sinh trưởng kém, còi cọc, vàng 100% chồi khơng tạo rễ, chết sau 30 ngày Trong nuôi cấy chọn lọc tái sinh sắn chuyển gen số nghiên cứu lại lựa chọn hygromycin kháng sinh chọn lọc mẫu chuyển gen (Bull cs., 2009; Zhang cs., 2000a; Nyaboga cs., 2013) nồng độ 50 mg/ml thông qua FEC Yang đtg (2011) sử dụng 10 mg/l hygromycin để tái sinh khoai lang chuyển gen thơng qua mơ sẹo phơi hóa Mu cs (2012) đă sử dụng 20 mg/l hygromycin để chọn lọc ngô chuyển gen Ghorberl cs (2010) sử dụng 100mg/l hygromycin để chọn lọc cam chuyển gen 129 Để xây dựng quy trình chuyển gen từ kết nghiên cứu tối ưu điều kiện ảnh hưởng đến hiệu chuyển gen thu kết tạo sắn chuyển gen cho hai giống sắn HB80 KM140 (Bảng 3.18) Hiệu suất tái sinh đạt 1,36 – 1,61% hiệu suất chuyển gen GUS đạt 0,41 - 0,69% Đây kết bước đầu khẳng định thành công xây dựng quy trình chuyển gen sở cho bước chuyển gen tăng hàm lượng tinh bột vào sắn Việt Nam Sự biểu gen ngoại lai chủ chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố bao gồm vị trí tích hợp gen chuyển genome vật chủ, số lượng copy, đột biến gen chuyển biến đổi di truyền ngoại gen tượng câm gen (gene silencing) (Yang cs., 2013) Kết PCR dòng sắn chuyển gen với cấu trúc gen pBI121-C54: SSIV:NOST kết cho thấy 7/9 dòng sắn kiểm tra có mang cấu trúc gen SSIV Điều chứng tỏ sắn mang gen chuyển SSIV với hy vọng sắn có hàm lượng tinh bột cao so với khơng chuyển gen (Hình 3.29) Hiệu tái sinh thu thấp sắn nảy mầm phôi giai đoạn mầm Điều gặp số báo cáo phòng thí nghiệm khác Iheme cs (2006) thu 26 chuyển vào 827 phôi giống sắn TMS71173 Tương tự, Chetty cs (2013) thu nhận 33 dòng chuyển gen từ 514 phơi với giống sắn T200 hay Taylor cs (2012) thu nhận 14 chuyển gen vào phôi giống sắn TMS60444 Như thời điểm việc chuyển gen vào sắn thơng qua mơ sẹo phơi hóa (FEC) hướng nhà khoa học giới Tuy nhiên tỷ lệ tạo chuyển gen thấp có khác biệt rõ giống sắn nghiên cứu 130 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Xác định gen AGPS, AGPL SSIV gen góp phần định hàm lượng tinh bột củ sắn thông qua phương pháp real time RTPCR phương pháp tin sinh học Đã thiết kế vector chuyển gen thực vật là: pK7WG2D-35S: SSIV:T35S mang gen mã hóa SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột điều khiển promoter cố định 35S, pBI121-C54:SSIV:NOST mang gen mã hóa enzyme tăng cường sinh tổng hợp tinh bột củ sắn điều khiển promoter đặc hiệu C54 Chuyển cấu trúc vector pK7WG2D-35S:SSIV:T35S pBI121-C54: SSIV:NOST mang gen SSIV liên quan đến trao đổi chất tinh bột thực vật vào thuốc Mức độ tích lũy tinh bột rễ dòng thuốc chuyển gen mang cấu trúc pBI 121 – C54:SSIV: NOST cao nhiều so với dòng thuốc chuyển gen mang cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S cao 27,7 - 65,7% so với WT Xây dựng quy trình chuyển gen tăng cường sinh tổng hợp tinh bột SSIV điều khiển promoter đặc hiệu củ C54 vào mơ sẹo phơi hóa (FEC) giống sắn KM140 thơng qua A.tumefaciens Kết thu dòng sắn giống KM140 dương tính kiểm tra với PCR, tỷ lệ chuyển gen mang cấu trúc pBI 121 – C54:SSIV: NOST đạt 0,46% KIẾN NGHỊ Tiếp tục phân tích, đánh giá khả tăng cường sinh tổng hợp tinh bột củ sắn chuyển gen lại điều kiện nhà lưới Ứng dụng quy trình chuyển gen vào sắn thơng qua FEC nhờ A.tumefaciens vào số giống sắn khác Việt Nam 131 ABSTRACT “ISOLATION AND EVALUATION OF SOME IMPORTANT GENES INVOLVED IN BIOSYNTHESIS AND STARCH ACCUMULATION IN CASSAVA " Cassava is one of the most important crops for many contries due to their ability to provide high carbohydrates in extreme weather conditions such as low rainfall, drought or poor soil fertility Currently, in the context of climate change that causes global warming, rising sea levels, threatening world food security and the exhaustion of fossil fuels, cassava is considered as the prize crop to achieve both goals: contributing to food security and providing raw materials for the biofuel industry, gradually replacing fossil fuels Starch is one of the most important contents in plant and is key material for industry The improvement of plant by increasing starch yield is one of the crucial strategy for reseachers Therefore, the study on the synthetic and degradative starch pathway in plants including cassava will promote the goal that improves the starch yield To the improvement of starch yield, most recent cassava researches mainly use traditional methods to select and cross-breed new cassava varieties from imported and local varieties Whereas, the application of modern biotechnology in cassava study is staying at an early stage and using simple methods such as tissue culture for seedling multiplication, rapid multiplication in vitro of some new varieties Thus, the application of biotechnology to improve cassava in the direction of improvement of yield starch to reach industrial and export requests is an urgent problem in Vietnam Research objectives of the project This is the first study that use a vector habouring SSIV gene under the control of pBI 121 – C54:SSIV: NOST for transformation into Friable embryo callus (FEC) of KM140 cassava via Agrobacterium tumefaciens 132 Research contents Content 1: Selection of cassava variety and analysis of the expression of important genes involved in starch metabolism Content 2: Isolation of 1-2 important genes involved in starch synthesis and transformed vector Content 3: Estimation of starch accumulation of 1-2 related genes in model tobacco Content 4: Transformation of transgenic vector habouring genes which enhance starch accumulation into cassava New contributions of the thesis Sucessful selection and isolation of SSIV gene related to starch biosynthesis and accumulated efficiency from leaf and root cassava Sucessful transformation of transgenic vectors: pK7WG2D-35S:SSIV:T35S pB121-C54:SSIV-cmyc:NOS into tobacco The starch content in root of transgenic tobacco transformed with pBI 121 – C54: SSIV: NOST vector was more than its from transgenic tobacco transformed with pK7WG2D-35S: SSIV:T35S vector from 19,7 % to 48,1% Starch content in roof of transgenic tobacco transformed with recombinant vectors was more than wild type from 15,6 % to 65,7%, respectively This is the first study that use a vector habouring SSIV gene under the control of C54 promoter for transformation into Friable embryo callus (FEC) of KM140 cassava via Agrobacterium tumefaciens The PCR result illustrated that seven transgenic cassava contained SSIV gene Results 4.1 Cassava variety selection and analysis of the expression of important genes involved in starch metabolism Based on the starch contents, 250 cassava varieties were grouped (3 groups), and representative varieties were selected for groups: SM937-26 and Red DP (group 1); KM140 (group 2); White HB (group 3) which represents three sub groups cultivated at the Co Nhue experimental farm for analysis of gene expression levels related to starch biosynthesis in cassava 133 Real time-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) method and bioinformatics analysis method was used to analyze and evaluate the expression of four important gene groups related to biosynthesis and starch accumulation in four representative cassava varieties AGPS, AGPL and SSIV genes were identified as potential genes that contribute to determine starch content of cassava 4.2 Results of isolation of SSIV genes involved in starch synthesis and transgenic vector design The SSIV gene sequence isolated from the KM140 cassava variety was registered with Genbank number of KT033500 Two plant transgenic vectors were constructed including pK7WG2D-35S: SSIV: T35S that carries the gene encoding the enzyme enhancing starch synthesis under the control of the CaMV 35S promoter, and pBI121-C54: SSIV: NOST that carries gene encoding enzyme enhancing starch synthesis in cassava under the control of specific promoter C54 4.3 The results of the evaluation of vectors containing SSIV gene in tobacco plants The two transgenic vectors including pK7WG2D-35S:SSIV:T35S and pBI 121 – C54: SSIV: NOST that contain SSIV gene were transformed into tobacco K326 The results showed that transgenic plants with higher starch content were obtained in compared to non-transgenic plants In detail, starch content in root of transgenic tobacco transformed with pK7WG2D-35S:SSIV:T35S vector was increased from 6,8 to 17,6% Whereas, starch content in root of transgenic tobacco transformed with pBI 121 – C54: SSIV: NOST vector was increased from 26,5 to 65,7% 134 4.4 Transformation of transgenic vectors habouring SSIV gene in cassava 4.4.1 Development of in vitro regeneration of cassava The suitable material for somatic embryo production was the shoot top The KM140 variety had the highest complete regeneration rate among the five cultivars (61.2%) The appropriate medium for callus formation was the MS medium supplemented with 10 mg / l of Picloram (CP) The appropriate medium for embryo formation was the MS medium supplemented with mg/l picloram 0.2 mg/l IBA (CI2) The somatic embryo geminating medium was MS medium supplement with 0.3 mg/l BAP (CN2) The complete plant regeneration medium was MS medium supplement with mg/l CuSO4 The appropriate material for cassava in the greenhouse was TN1: fumigated husk with ratio 6: The average survival rate of nurseries was 95% 4.4.2 Construction and optimization of Gus gene transferring process to cassava Top shoot was transferred to the CP medium to induce callus Callus was transferred to the CI medium to produce embryos as materials for gene transfer The A tumefaciens C58/pCB - gus plus was grown liquid LB medium reach to OD600nm = 0.6 at 28oC Embryos were selected at early stage with fresh yellow and long-tassel tissue mass then infected with A tumefaciens suspension for 15 minutes supplemented with 100 μM AS; The sample was dried and placed on CI culture medium supplemented with 100 μM AS for days at room temperature 25 – 27oC Embryos were washed to remove the bacterial then transferred to selective culture medium supplemented with 500 mg/l cefotaxime, 60 mg/l Km, transplanted every two weeks until regenerated cassava shoots 135 Survival somatic embryos were cultured on CN shoot regeneration medium supplemented with 60 mg/l Km, at temperature 25 – 27oC Regenerated cassava shoots were selected on selective root regeneration medium (MR), MS medium supplemented with 50 mg/l Km, at temperature 25 – 27oC to select transgenic cassava Survival shoots were transferred to MS medium When the plants reach a height of - cm, with 4-5 leaves and healthy roots, they are transferred in pots with TN1 substrate and placed in the growth tank The condition affecting gene transferring efficiency was optimized in order to complete the gene transferring process in the cassava The gus gene was transferred into embryonic callus originated from the shoots of HB80 and KM140 varieties The percentage of transgenic plant obtained was from 0.41 to 0.69% 4.4.3 Generation of SSIV transgenic cassava enhancing starch synthesis The establishment of the gene transferring process for the KM140 cassava variety via the A tumefaciens through FEC has been optimized The results showed that the cassava varieties were positive with PCR test, the ratio of transgenic plants carried 121 - C54: SSIV: NOST vector was 0,46% These results prove that cassava is a very difficult target for transformation via A.tumefaciens These initial results confirming the successful gene transferring process and is the premise for transgenic researchs in order to increase starch content in some cassava varieties in Vietnam 136 NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI Nguyen Thi Minh Hong, Le Thu Ngoc, Nguyen Mau Hung, Pham Bich Ngoc, Chu Hoang Ha (2016) Gene expression profiling of ADP – Glucose pyrophorylase (AGPase) in sink and source organs of some cassava varieties with different starch contents in Viet Nam Tạp chí Cơng nghệ sinh học 14(4): 673682 Nguyễn Thị Minh Hồng, Lê Thu Ngọc, Phạm Bích Ngọc (2017) Khuếch đại gen ssiv mã hoá cho starch synthase (ss) giống sắn KM 140 phương pháp RT- PCR, Tạp chí KH – ĐH Hồng Đức 34(4): 31 - 44 Nguyễn Thị Minh Hồng, Lê Thu Ngọc, Nguyễn Khắc Hưng, Nguyễn Thị Thơm, Phạm Bích Ngọc (2017) Nghiên cứu tạo thuốc chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột thông qua Agrobacterium tumefaciens Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa KHTN và CN, 33(1S): 224 - 230 Nguyễn Thị Minh Hồng, Nguyễn Thị Hoài Thương, Phạm Bích Ngọc, Chu Hồng Hà (2018) Nghiên cứu tái sinh số giống sắn (Manihot esculenta crantz) thông qua mơ sẹo phơi hóa Tạp chí CNSH, 16(1): 119 – 126 3): – 137 TÀI LIỆU THAM KHẢO Abhary M, Siritunga D, Stevens G, Taylor NJ, Fauquet CM (2011) Transgenic biofortification of the starchy staple cassava (Manihot esculenta) generates a novel sink for protein PLOS ONE 6(1): 16-26 Abrahamian P & Kantharajah A (2011) "Effect of Vitamins on in vitro Organogenesis of Plant" American Journal of Plant Sciences, 2: 669-674 Allem AC (2002) “The origins and taxonomy of cassava” Chapter in Hillocks Cassava: Biology, Production and Utilization, CABI, Wallingford United Kingdom: 1–16 Alves AC (2002) “Cassava botany physiology” Chapter in Hillocks, R J et al Cassava: Biology, Production and Utilization, CABI, Wallingford United Kingdom: 67–89 Anwar N, Junko K, Watarabe A (2011) Transgenic sweet potato expressing mammalian cytochrome P450 Plant Cell Tiss Organ Cult 105: 219 – 231 Baguma Y, Sun C, Ahlandsberg S, Mutisya J, Palmqvist S, Rubaihyo PR, Maganbo MJ, Egwang TG, Larsson H, Jansson C (2003) Expression patterns of the gene encoding starch branching enzyme II in the storage roots of cassava (Manihot esculenta Crantz) Plant Science 164:833-839 Biradar S, Biradar D P, Patil V C, Patil, Kambar S S (2009) In vitro plant regeneration using shoot tip cultures in commercial cultivar of sugarcane Karnataka J Agri Sci 22(1): 21-24 Bresolin NS, Li Z, Kosar-Hashemi B, Tetlow IJ, Chatterjee M, Rahman S, Morell MK, Howitt CA (2006) Characterisation of disproportionating enzyme from wheat endosperm Planta 224: 20–31 Bùi Lan Anh, Nguyễn Phan Cẩm Tú, Trần Nguyên Vũ, Bùi Văn Lệ (2008) “Xây dựng quy trình biến nạp gen bar – gen kháng thuốc diệt cỏ vào khoai mì (Manihot esculenta Crantz) phương pháp bắn gen”, Tạp chí phát triển KH & CN, 11 (1): 90 – 95 138 10 Bùi Văn Thắng, Đỗ Xuân Đồng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2013) Quy trình chuyển gen thơng qua Agrobacterium vào xoan ta (Melia azedarach L.) A Tumefaciens đạt hiệu suất cao Tạp chí sinh học 35 (2): 227 - 233 11 Bull SE, Owiti JA, Niklaus M, Becching JR, Gruissem W, Vanderschunren H (2009) A Tumefaciens – mediated transformation of friable embryogenic calli and regeneration of transgenic cassava Natrure protocols 4(12) 1845 – 1854 12 Burton RA, Jenner H, Carrangis L, Fahy B, Fincher GB (2002) Starch granule initiation and growth are altered in barley mutants that lack isoamylase activity Plant J 31: 97-112 13 Cao H, Imparl-Radosevich J, Guan H, Keeling PL, James MG, Myers AM (1999) Identification of the soluble starch synthase activities of maize endosperm Plant Physiology 120: 205-215 14 Carciofi M, Blennow A, Nielsen MM, Holm PB, Hebelstrup KH (2012) Barley callus: a model system for bioengineering of starch in creals Palnt methods 8: 36 15 Castillo A M, Egana B, Sanz J M, Cistue L (1998) Somatic embryogenesis and plant regeneration from barley cultivars grown in Spain Plant Cell Rep 17: 902–906 16 Ceballos H & Cruz G (2012) "Cassava Taxonomy and Morphology", in Cassava in the Third Millenium Modern: Production, Processing, Use and Market System, (Eds) CIAT Vol 377, CIAT Publication: Colombia: 15-28 17 Chellappan P, Masona MV, Vanitharani R, Taylor NJ, Fauquet CM (2004) Broad spectrum resistance to ssDNA viruses associated with transgeneinduced gene silencing in cassava Plant Mol Biol 56: 601–611 18 Chetty C C, Rossin C B, Gruissem W, Vanderschuren H, Rey M (2013) Empowering biotechnology in southern Africa: establishment of a robust transformation platform for the production of transgenic industrypreferred cassava N Biotechnol 30: 136–143 139 19 Cline J, Braman JC and Hogrefe HH (1996) PCR fidelity of Pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases Nucl Acid Res 24:3546– 3551 20 Danso EK, Elegba W, Oduro V, Kpentey P (2010) Comparative study of 2,4-D and picloram on friable embryogenic calli and somatic embryos development in cassava (Malihot esculenta Crantz) IGIB10(2): 94-100 21 D'Hulst & Mérida (2010) The priming of storage glucan synthesis current knowledge and new developments New Phytol 188:13-21 22 Đỗ Xuân Đồng, Bùi Văn Thắng, Hồ Văn Giảng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2011) Cây xoan ta (Melia azdazach L.) chuyển gen mã hoá gibberellin 20 – oxidase A Tumefaciens Tạp chí Cơng nghệ sinh học 9(2): 217 – 222 23 Đỗ Xuân Đồng, Đỗ Hải Lan, Phạm Bích Ngọc, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình, Chu Hồng Hà (2012) Nghiên cứu hệ thống tái sinh sắn (Manihot esculenta Crantz) thông qua phôi soma từ đỉnh chồi, Tạp chí Cơng nghệ sinh học 10 (3): 527 – 533 24 Đoàn Thị Phương Thùy Bùi Trang Việt (2006) Tìm hiểu phát sinh phơi thể hệ từ mơ sẹo có nguồn gốc khoai mì (Manihot esculenta Crantz.) dòng cuống trầu Tạp chí KHKT Nơng Lâm nghiệp, số1: 19- 23 25 Eliana Gaitán-Solís, Nigel Taylor, Dimuth Siritunga, William Stevens, Daniel Schachtman (2015) Overexpression of the transporters AtZIP1and AtMTP1in cassava changes zinc accumulation and partitioning Front Plant Sci 6:492 doi: 10.3389 26 Feitosa T, Bastos JLP, Ponte FA, Juca TL, Campos FAP (2007) Somatic Embryogenesis in Cassava Genotypes from the Northeast of Brazil Terezinha Feitosa Brazilian Archieves Biol Teachnol 50 (2): 201 – 206 27 Flipse E, Huisman JG, de Vries BJ, Bergervoet JE, Jacobsen E, Visser RG (1994) Expression of a wild-type GBSS gene introduced into an amylosefree potato mutant by Agrobacterium tumefaciens and the inheritance of the inserts at the microsporic level Theor Appl Genet 1994 Jun; 88(3-4):369-75 140 28 Fujita N & Taira T (1998) A56-kda protein in a novel granucle- bound starch synthase existing in the pericarps, aleurone layer and embryos of immature seed in diploid wheat (Triticum monococcum L.) Planta 207, 125 -132 29 Gámez-Arjona F M, Li J, Raynaud S, Baroja-Femandez E, Munc (2011) Enhancing the expression of starch synthase class IV leves of borth transitory and long - term storage starch Plant Biotec: 1049 - 1060 30 Garvel NJ, Jarret RL (1991) A modified CTAB DNA extraction procedure for Muss and Lpomoea Plant Mol Biol Rep 9: 262-266 31 Geigenberger P (2011) Regulation of starch biosynthesis in response to a fluctuating enviroment Plant physiology 15: 1566 - 1577 32 Gonzalez AE, Schoăpke C, Taylor NJ, Beachy RN, Fauquet CM (1998) Regeneration of transgenic cassava plants (Manihot esculenta Crantz) through Agrobacterium-mediated transformation of embryogenic suspension cultures Plant Cell Rep 17:827–831 33 Groll J, Mycock DJ, Gray VM, Laminski S (2001) Secondary somatic embryogenesis of cassava on picloram supplemented Media Plant Cell Tiss Org Cult 65: 201-210 34 Hoang Kim, Nguyen Van Bo, Hoang Long, Nguyen Trong Hien, Hernan Ceballos and Reinhardt Howeler (2010) Current situation of cassava in Vietnam In CIAT (R.H Howeler editor) A New Future for Cassava in Asia: Its Use as Food, Feed and Fuel to Benefit the Poor, 8th Asian Cassava Research Workshop October 20-24, 2008 in Vientiane, Lao PDR: 100-112 35 Hoàng Kim, Nguyễn Đăng Mãi (biên tập) (2011) Sắn Việt Nam: Hiện trạng, định hướng giải pháp phát triển năm đầu kỷ 21 Thông tin hội thảo sắn Việt Nam lần thứ 10 thành phố Hồ Chí Minh ngày 13 14/3/2011 Nhà xuất Nông nghiệp (chi nhánh phía Nam), 230 trang (sách chuyên khảo) 141 36 Hobbs S, Kpodar P, Delong CMO (1990) The effect of T-DNA copy number, position and methylation on reporter gene expression in tobacco transformants Plant Molecular Biology 15: 851–864 37 Hostettler CE (2014) Investigation of starch metabolism in Cassava (Manihot esculenta Crantz) Dissertation Swiss Federal Institute of Technology 38 Hennen-Bierwagen TA, Lin Q, Grimaud F (2008) Starch biosynthenic enzymes from develop Zea mays endosperm associate in multisubunit complexes Plant Physiol 146:1892 – 1908 39 Ihemere U, Arias-Garzon D, Lawrence S, Sayre R (2006) Genetic modiﬁcation of cassava for enhanced starch production Plant Biotechnol J 4: 453-65 40 Jørgensen K, Bak S, Busk PK, Sørensen C, Olsen CE, PuontiKaerlas J, Møller BL (2005) Cassava plants with a depleted cyanogenic glucoside content in leaves and tubers Distribution of cyanogenic glucosides, their site of synthesis and transport, and blockage of the biosynthesis by RNA interference technology Plant Physiol 139: 363–374 41 Kartha K K, Gamborg O L, Constanbel F (1973) Regeneration of cassava plant from apical meristems Plant Science Letter: 107 – 113 42 Keeling PL, Wood JR, Tyson RH, Bridges IG (1998) Starch biosynthesis in developing wheat grain: evidence against the direct involvement of triose phosphates in the metabolic pathway Plant Physiol 1998; 87:311-9 43 Koehorst-van Putten H, Sudarmonowati H, Herman M, Pereira- Bertram I, Wolters A, Meima H, Vetten N, Raemakers C and Visser R (2012) "Field testing and exploitation of genetically modified cassava with low-amylose or amylose-free starch in Indonesia" Transgenic Research, 21(1): 39-50 44 Kone M, Oumar D, Behnam K and Vincent N (2015) Somatic embryogenesis and plant regeneration of cassava (Manihot esculenta Crantz) landraces from Cameroon SpringerPlus 2015: 457:477 45 Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Phạm Thị Hạnh, Nguyễn Văn Uyển (2005) Cây thuốc lá, lúa, cải ngọt, Paulownia mang gen kháng sâu đơn cryIA(b), cryIA(c) 142 gen kháng sâu lai cryIA (b), cryIB kháng số loài sâu thuộc họ cánh vảy Tuyển tập báo cáo hội nghị khoa học tồn quốc “Cơng nghệ sinh học nghiên cứu bản”, ĐH Nông nghiệp I, Hà Nội: 201 – 204 46 Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997) Công nghệ sinh học thực vật tiến giống trồng Giáo trình cao học nơng nghiệp, NXB NN 47 Legg JP and Fauquet CM (2004) Cassava mosaic geminiviruses in Africa Plant Mol Biol 56: 585- 599 48 Li Ning, Zhang Shujuan, Zhao Yajie, Li Bei, Zhang Juren (2011) Overexpression of AGPase genes enhances seed weight and starch content in transgenic maize Planta (2011): 241–250 49 Li HQ, Sautter C, Potrykus I, Puonti-Kaerlas J (1996) Genetic transformation of cassava (Manihot esculenta Crantz) Nat Biotechnol 14: 126 -138 50 Liu J, Zheng Q, Ma Q, Gadidasu K K, Zhang P (2011) Cassava genetic transformation and its application in breeding J Integr Plant Biol 53: 552–569 51 Malinova I, Steup M, Fettk J (2013) Carbon transitions from either Calvin cycle or transitory starch to heteroglycans as revealed by14C-labeling experiments using protoplasts from Arabidopsis Physiol Plant (2013)149: 25–44 52 Maqbool SB & Christou P (1999): Multiple traits of agronomic importance in transgenic indica rice plants: analysis of transgene integration patterns, expression evels and stability Molecular Breeding 5: 471–480 53 Matilda C T, Marylin P, Kuan J L, Christopher M H, Regina F, Simona E, John E L, Samuel C Z, Alison M S (2013) Starch synthase is essential for coordination of starch granule formation with chloroplast division during Arabidopsis leaf expansion New Phytologist (2013) 200: 1064-1075 54 Mendoza MG & Kaeppler HF (2002) Auxin and sugar effects on callus induction and plant regeneration frequencies from mature embryos of Wheat (Triticum aestivum) In vitro Cell Dev Biol 38: 39-45 143 55 Mu G, Chang N, Xiang K, Sheng Y, Zhang Z, Pan G (2012) Genetic transformation of Maize female inflowing floral dip method mediated by Agrobacterium Biotechnol 11 (3): 178 – 183 56 Munyikwa T, Langeveld S, Salehuzzaman S, Jacobsen E and Visser R(1998) Cassava starch biosynthesis: new avenues for modifying starch quantity and quality Euphytica 96: 65-75 57 Munyikwa T, Kreuze J, Fregene M, Suurs L, Jacobsen E, Visser R (2001) Isolation and characterisation of cDNAs encoding the large and small subunits of ADP-glucose pyrophosphorylase from cassava (Manihot esculenta Crantz) Euphitica June 2001, Volume 120, Issue 1: 71–83 58 Nguyễn Đức Thành (2003) Chuyển gen thực vật NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 59 Nguyễn Hữu Hỷ, Đinh Văn Cường, Phạm Thị Nhạn, Nguyễn Trọng Hiển, Nguyễn Viết Hưng (2012) Một số kết nghiên cứu sắn giai đoạn 2007 – 2012 Viện KH Kỹ thuật Nông Nghiệp Miền Nam 60 Nguyễn Thị Thuý Hằng, Hoàng Thị Nga, Trương Thị Hoà, Nguyễn Phùng Hà (2011) Kết đánh giá tập đoàn sắn ngân hàng gen trồng quốc gia năm 2010 – 2011 Viện KHNN Việt Nam 61 Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn (2010) Khả tái sinh biến nạp thông qua nách mầm giống đậu tương (Glycine max L.) DT12 DT84 Agrobacterium Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 8(3B): 1305-1310 62 Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Lê Tiến Dũng, Tống Thị Hường, Lê Thị Ngọc Quỳnh, Lê Thị Lý, Vũ Anh Thu, Vũ Hoàng Nam, Vũ Thế Hà, Lê Huy Hàm, Chikako Utsumin, Yoshinori Utsumin, Motoaki Seki (2014) Kết tạo mơ sẹo phơi hố phục vụ cho chuyển gen vào sắn, Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn, 8(1): 29 – 35 63 Nyaboga EN, Njiru JM, Tripathi L (2015) Factors influencing somatic embryogenesis, regeneration, and Agrobacterium - mediated transformation of 144 cassava (Manihot esculenta Crantz) cultivar TME14 Front Plant Sci 6: 411 64 Nyaboga E, Njiru J, Nguu E, Gruissem W, Vanderschuren H, Tripathi L (2013) Unlocking the potential of tropical root crop biotechnology in east Africa by establishing a genetic transformation platform for local farmerpreferred cassava cultivars Front Plant Sci 4:526 doi: 10.3389 65 Oliveira RGA, Carvalho MJL, Nutti RM, Carvalho LVJ, Fukuda WG (2010) “Assessment and degradation study of total carotenoid and ß-carotene in bitter yellow cassava (Manihot esculenta Crantz) varieties” African Journal of Food Science 4(4): 148–155 66 Opabode JT, Ajibola OV, Oyelakin OO, Akinyemiju OA (2015) Somatic embryo‐ genesis and genetic uniformity of regenerated cassava plants from low‐temperature preserved secondary somatic cotyledons Biotech 96: 246 ‐258 67 Opabode JT, Oyelakin OO, Akinyemiju OA, Ingelbrecht IL (2014) Influence of type and age of primary somatic embryo on secondary and cyclic somatic embryogenesis of cassava (Manihot esculenta Crantz) British Biotech J 4: 254‐269 68 Opabode JT, Ajibola OV, Oyelakin OO, Akinyemiju OA (2016) Somatic Embryogenesis and Genetic Uniformity of Cassava Plants Regenerated from Secondary Somatic Cotyledons Preserved in Osmotic Agents Plant Tissue Cult & Biotech 26(1): 47‐54 69 Patil BL, Ogwok E, Wagaba H, Mohammed IU, Yadav JS, Bagewadi B, Taylor NJ, Kreuze JF, Maruthi MN, Alicai T, Fauquet CM (2011) RNAimediated resistance to diverse isolates belonging to two virus species involved in cassava brown streak disease Mol Plant Pathol 12(1), 31–41 70 Phạm Bích Ngọc (2016) Khai thác phân lập nguồn gen có sẵn tập đoàn giống sắn Việt Nam nhằm phát triển giống sắn có khả chống chịu bệnh suất cao công nghệ gen Báo cáo tổng kết đề tài cấp nhà nước Viện Công nghệ sinh học 145 71 Pham Bich Ngoc, Vu Thi Lan, Tran Thu Trang, Nguyen Thi Hoai Thuong, Le Thu Ngoc, Chu Hoang Hà, Le Tran Binh (2015) Agrobacerium-mediated transformation of cry8Db gene in VietNam sweet potato cultivalr Jonral of Life Science 9:262-271 72 Phạm Thị Nhạn, Nguyễn Hữu Hỷ (2015) Nghiên cứu chọn tạo giống sắn phương pháp xử lý đột biến Viện KHNN Việt Nam 73 Phan Thị Thu Hiền, Phạm Bích Ngọc, Chu Hồng Hà (2015) Quy trình chuyển gen hiệu vào phơi soma giống mía ROC22 (Saccharum officinarum L.) thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 31, Số 4S (2015): 108 - 125 74 Phan Trọng Hồng, Nơng Văn Hải, Lê Trần Bình, Chu Hồng Hà (2005) Sử dụng enzyme Xcml để thiết kế vector pBI phục vụ tách dòng đọc trình tự gen Tạp chí CNSH 3:459 - 463 75 Preeti Kaur and Kothari S (2004) In vitro culture of kodo millet: inﬂuence of 2,4-D and picloram incombination with kinetin on callus initiation and regeneration Plant Cell, Tissue and Organ Culture 77:73–79 76 Quách Vũ Quỳnh Hương, Nguyễn Đức Doanh, Nhữ Viết Cường, Hoàng Thị Ngát, Lê Thị Ánh Hồng (2006) Một số kết chuyển gen kháng nấm Chitinase gluconase vào sắn thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn 20: 41 – 44 77 Raemakers CJJM, Sofiari E, Taylor N, Henshaw G, Jacobsen E, Visser RGF (1996) Production of transgenic cassava (Manihot esculenta Cantz) plants by particle bombardment using luciferase activity as selection marker Mol Breed 7, 339–349 78 Raemakers K, Schreuder M, Munyikwa T, Jacobsen E and Visser R (2001) "Progress made in FEC transformation of cassava", Euphytica, 120(1):15-24 79 Raemakers K, Schreuder M, Suurs L, Furrer-Verhorst H, Vincken J- P, de Vetten N, Jacobsen E, Visser RGF (2005) Improved cassava starch by antisense 146 inhibition of granule-bound starch synthase I Mol Breed 16: 163-172 80 Rogers D (1965) Some botanical and ethnological consideration of Manihot esculenta Ecomomic Botany 19 (4): 369 – 377 81 Rogers D and Appan S (1973) FloriaNeotropia Monography No.13 Manihot Manihotoides (Euphorbiaceac) Hafner Press New York 82 Roldan I, Wattebled F, Mercedes Lucas M, Delvalle D, Planchot V, Jimenez S, Perez R, Ball S, Christophe D’Huls, A ngel M (2007) The phenotype of soluble starch synthase IV defective mutants of Arabidopsis thaliana suggests a novel function of elongation enzymes in the control of starch granule formation The plant journal 49: 492 - 504 83 Rupinder Kaur and Manish Kapoor (2015) Plant Regeneration Through Somatic Embryogenesis in Sugarcane Sugar Tech DOI 10.1007/s12355015-0380-3 84 Rupinder Kaur and Manish Kapoor (2017) In Vitro direct plant regeneration using shoot tip explants in sugarcane (Saccharum officinarum L.) for rapid mass cloning Agric Sci Digest., 37(2) 2017: 94-99 85 Sayre R, Beeching J, Cahoon E, Egesi C, Fauquet C, Fellman J, Fregene M, Gruissem W, Mallowa S, Manary M, MaziyaDixon B, Mbanaso A, Schachtman DP, Siritunga D, Taylor N, Vanderschuren H, Zhang P (2011) The BioCassava Plus Program: Biofortification of cassava for sub-Saharan Africa Annu Rev Plant Biol 62, 251–272 86 Schopke C, Taylor N, Carcamo R, Konan N, Marmey P, Henshaw G, Beachy R and Fauquet C (1996) Regeneration of transgenic cassava plants (Manihot esculenta Crantz) from microbombarded embryogenic suspension cultures Nature Biotech 14: 731–735 87 Shewmaker F, Kryndushkin D, Chen B, Tycko R, Wickner RB (2009) Two prion variants of Sup35p have in-register β-sheet structures, independent of hydration Biochemistry 48:5074–5082 147 88 Siritunga D & Sayre RT (2003) Generation of cyanogen-free transgenic cassava Planta 217: 367–373 89 Siritunga D & Sayre RT (2004) Engineering cyanogen synthesis and turnover in cassava (Manihot esculenta) Plant Mol Biol 56: 661- 669 90 Subasinghe RM (2013) Role and regulation of starch phosphorylase and starch synthase IV in starch biosynthesis in maize endosperm amyloplasts Dissertation The University of Guelph, Canada 91 Szydlowski N, Ragel P, Raynaud S, Roldán I, Montero M, Lucas MM (2009) Starch granule initiation in Arabidopsis requires the presence of either class IV or class III starch synthase Plant Cell 21: 2443-57 92 Taylor N, Chavarriaga P, Raemakers K, Siritunga D, Zhang P (2004) Development and application of transgenic technologies in cassava Plant Mol Biol 56:671–688 93 Taylor N, Edwards M, Kiernan R, Davey C, Blakesley D and Henshaw G (1996) Development of friable embryo genic callus and embryogenic suspension cultures in cassava (Manihot esculenta Crantz) Nature Biotech 14: 726–730 94 Taylor NJ, Gaitán‐Solís E, Moll T, Trauterman B, Jones T, Pranjal A, Trembley C, Abernathy V, Corbin D, Fauquet CM (2012) A high‐throughput platform for the production and analysis of transgenic cassava (Manihot esculenta) plants Tropical Plant Biology 5: 127–139 95 Tống Thị Hường, Vũ Anh Thu, Nguyễn Anh Vũ, Nguyễn Văn Đồng (2017) Kết tạo mơ sẹo phơi hóa giống sắn KM 140 Tạp chí NN PTNN, chuyên đề giống trồng vật nuôi, tập 2: 12/2017: 61 – 66 96 Trần Cơng Khanh, Hồng Kim, Võ Văn Tuấn, Nguyễn Hữu Kỷ, Phạm Văn Biên, Đào Huy Chiên, Reinhardt Howeler Hernan Ceballos (2008) Kết chọn tạo phát triển giống sắn KM140 Tạp chí KHKTNLN Trường Đại học Nông Lâm TPHCM, số & 2: 65-71 97 Trần Ngọc Ngoạn (2007) Cây sắn, NXB Nông nghiệp, HN 148 98 Tribadi, Suranto & Sajidan (2010) "Variation of morphological and protein pattern of cassava (Manihot esculenta) varieties of Adira1 and Cabak makao in Ngawi, East Java " Bioscience, 2(1): 14-22 99 Vrinten PL & Nakamura T (2000) Wheat granule-bound starch synthase I and II are encoded by separate genes that are expressed in different tissues Plant Physiology 122: 255–264 100 Vũ Thị Lan, Phạm Bích Ngọc, Chu Hồng Hà, Lê Trần Bình (2015) Nghiên cứu tái sinh chồi trực tiếp từ cuống mảnh giống khoai lang Chiêm Dâu KB1 Tạp chí Khoa học Công nghệ, ĐH QGHN, 31(4S): 177 – 184 101 Vu Thi Lan, Tran Thu Trang, Nguyen Thi Hoai Thuong, Le Thu Ngoc, Pham Bich Ngoc, Chu Hoang Ha, Le Tran Binh (2015) Development of embryogenic regeneration system and its successful utilization for Agrobacterium-mediated transformation of cry8Db gene into selected cultivated sweet potato (Ipomoea batatas L.) of Vietnam Bio – Asia 2015 Conference, 20 – 22 May 2015 @ MaxtriBiopolis, Singapore:49 102 Vũ Văn Kiên, Nguyễn Du Sanh (2011) Khảo sát phát sinh phôi thể hệ khoai mì Tạp chí Phát triển KH & CN Tập 14, Số 103 Wattebled F, Planchot V, Dong Y, Szydlowski N, Pontoire B (2008) Further evidence for the mandatory nature of polysaccharide debranching for the aggregation of semicrystalline starch and for overlapping functions of debranching enzymes in Arabidopsis leaves Plant Physiol 148:1309-23 104 White WLB, Arias-Garzon DI, McMahon JM, Sayre RT (1998) Cayanogenesis in cassava: The role of hydroxynitrile lyase in root cyanide production Plant Physiol 116: 1219–1225 105 Yang X, Li F, Zhang X, Liu K, Wang Q, Zhang C, Liu C, Zhu W, Shan G, Chin CK, Fang W (2013) Integration and characterization of T-DNA insertion in upland cotton Czech J Genet Plant Breed 49(2): 51-57 149 106 You-Zhi Li, Jian-Yu Zhao, San-Min Wu, Xian-Wei Fan, Xing-Lu Luo & Bao-Shan Chen (2016) Characters related to higher starch accumulation in cassava storage roots Scientificreports Dol:10:1038 107 Zainuddin I, Schlegel K, Gruissem W and Vanderschuren H (2012) Robust transformation procedure for the production of transgenic farmer-preferred cassava cultivars Plant Methods 8:24 doi: 10.1186/1746-4811-8-24 108 Zeeman & Samuel C (2010) Starch: Its Metabolism, Evolution, and Biotechnological Modification in Plants Annual Review of Plant Biology 61(1) 109 Zhang P & Puonti-Kaerlas J (2000) PIG-mediated cassava transformation using positive and negative selection Plant Cell Rep 19: 1041–1048 110 Zhang P, Bohl-Zenger S, Puonti-Kaerlas J, Potrykus I, Gruissem W (2003) Two cassava promoters related to vascular expression and storage root formation Planta 218(2):192-203 111 Zhang P, Jaynes JM, Potrykus I, Gruissem W, Puonti-Kaerlas J (2003) Transfer and expression of an artificial storage protein (ASP1) gene in cassava (Manihot esculenta Crantz) Transgenic Res 12, 243-250 112 Zhang P, Wang WQ, Zhang GL, Kaminek M, Dobrev P, Xu J, Gruissem W (2010) Senescence-inducible expression of isopentenyl transferase extends leaf life, increases drought stress resistance and alters cytokinin metabolism in cassava Plant Biol 52: 653–669 113 Zhang Y & Seidel DJ (2011) Challenges in estimating trends in Arctic surface-based inversions from radiosonde data.Geophys Res Lett.,38,L17806, doi:10.1029 114 Zhao & Shan-Shan (2011) Development of waxy cassava with different Biological and physico-chemical characteristics of starches for industrial applications Biotechnology and Bioengineering PHỤ LỤC Danh sách đặc điểm nông sinh học giống sắn thu thập Hưng Lộc, Đồng Nai Stt Tên giống Hàm lượng Tinh bột (%) KM104-7 15.2 29.67 30.5 257 Thẳng, nhánh vừa 230 Trắng Trắng HB 15.2 29.67 13.25 296 Thẳng, nhánh 240 Trắng KM104 17.4 31.32 21 275 Thẳng, nhánh 245 Vàng KM308-3 18.1 31.84 24 318 Thẳng, nhánh 245 Vàng KM241 18.5 32.15 12 357 Thẳng, nhánh vừa 265 Trắng KM244 18.6 32.22 23 301 Thẳng, nhánh vừa 268 Trắng KM306-3 18.6 32.22 18 291 Thẳng, nhánh 230 Trắng KM163 18.7 32.3 44 280 Cong, nhánh 267 Trắng KM225 18.8 32.37 33.75 282 Thẳng, nhánh 240 Trắng 10 KM28 19 32.52 19.5 295 Thẳng, nhánh vừa 270 Trắng 11 KM292-2 19.3 32.75 24.25 321 Thấp xấu, nhánh 230 Vàng 12 KM311-1 19.3 32.75 36 302 Thẳng, nhánh 280 Vàng 13 KM54 19.3 32.75 20.5 205 Nhánh nhiều 279 Trắng 14 KM240 19.5 32.9 25 297 Thẳng, nhánh vừa 264 Trắng 15 KM276 19.5 32.9 25 398 Nhánh 257 Trắng 16 KM209-1 19.6 32.97 47 327 Thẳng, nhánh 240 Trắng 17 KM295 19.6 32.97 21.25 332 Thẳng, nhánh vừa 230 Vàng 18 KM309-1 19.8 33.12 44 329 Thẳng, nhánh 260 Trắng 19 KM309-5 19.8 33.12 33 310 Thẳng, nhánh 280 Trắng 20 KM270 20 33.27 46.5 373 Thẳng, nhánh cao 240 Trắng 21 KM272 20 33.27 18.25 385 Đổ ngã, nhánh vừa 246 Trắng 22 KM263 20.1 33.35 16.5 327 Thẳng, nhánh 240 Trắng 23 KM95 20.1 33.35 29.5 250 Nhánh nhiều 210 Trắng Tỉ lệ chất khô (%) Năng suất củ tươi (tấn/ha) Chiều cao (cm) Đặc điểm Thời gian thu hoạch (ngày) Màu sắc thịt củ 150 24 KM258-1 20.2 33.42 22.5 350 Thẳng, nhánh 252 Trắng 25 KM256 20.3 33.5 30.5 322 Thẳng, nhánh vừa 245 Trắng 26 KM269 20.3 33.5 20.25 307 Thẳng, nhánh vừa 245 Trắng 27 KM292-1 20.5 33.65 40.75 316 Thẳng, nhánh 245 Trắng 28 KM307-1 20.5 33.65 14 283 Nhánh, xấu 240 Trắng 29 KM308-5 20.5 33.65 34 230 Thẳng, nhánh 294 Trắng 30 KM309-4 20.6 33.72 20.5 347 Thẳng, nhánh 275 Vàng 31 KM47 20.6 33.72 22 288 Thẳng, nhánh vừa 312 Trắng 32 KM111 20.7 33.8 24.5 257 Thẳng, nhánh cao 240 Vàng 33 KM277 21 34.02 17 405 Thẳng, nhánh 240 Trắng 34 KM279-2 21 34.02 34.5 360 Thẳng, nhánh 230 Trắng 35 KM302-7 21 34.02 20.5 299 Thẳng, nhánh 265 Trắng 36 KM309-11 21 34.02 15.5 264 Thẳng, nhánh vừa 247 Trắng 37 KM227 21.2 34.17 41 230 Thẳng, nhánh 240 Trắng 38 KM267 21.2 34.17 22.75 291 Thẳng, nhánh vừa 240 Trắng 39 KM300-3 21.2 34.17 27.5 387 Đỗ ngã, nhánh 230 Trắng 40 KM302-9 21.2 34.17 23.75 314 Thẳng, nhánh 240 Vàng 41 KM308-1 21.2 34.17 16.75 290 Thẳng, nhánh vừa 255 Vàng 42 KM250-1 21.3 34.25 25.25 258 Thẳng, nhánh vừa 247 Trắng 43 KM303-1 21.3 34.25 18.75 367 Cong, nhánh vừa 248 Vàng 44 KM308-9 21.3 34.25 20.75 243 Thẳng, nhánh vừa 250 Vàng 45 KM54 21.3 34.25 39.5 373 Cao, nhánh nhiều 258 Trắng 46 KM287-2 21.4 34.32 43.25 407 Thẳng, cao 235 Trắng 47 KM289-5 21.4 34.32 40.25 343 Thẳng, nhánh 235 Trắng 48 KM309-3 21.4 34.32 47.5 290 Thẳng, nhánh vừa 277 Vàng 49 KM311-7 21.4 34.32 23 286 Thẳng, nhánh cao 262 Vàng 50 Sắn miền nam 21.4 34 18.8 343 51 KM252 21.5 34.4 24.5 373 Thẳng, nhánh vừa 210 Trắng 52 KM278-2 21.5 34.4 71.25 405 Thẳng, nhánh vừa 245 Trắng 151 53 KM299-2 21.5 34.4 24.5 403 Đổ ngã, thẳng cao 230 Trắng 54 KM63-1 21.5 34.4 28 388 Thẳng, nhánh 270 Trắng 55 KM303-3 21.7 34.55 12.75 385 Cong, nhánh vừa 245 Trắng 56 KM309-9 21.7 34.55 35.5 313 Thẳng, nhánh 248 Trắng 57 KM52 21.7 34.55 18.25 292 Nhánh nhiều 255 Trắng 58 KM308-7 21.9 34.7 20 244 Thẳng, nhánh vừa 255 Vàng 59 KM61 21.9 34.7 22.5 337 Thẳng, nhánh 264 Vàng 60 KM257 22 34.77 23.5 310 Thẳng, nhánh vừa 245 Trắng 61 KM261 22 34.77 36 266 Thẳng, nhánh vừa 235 Trắng 62 KM278-1 22 34.77 19.5 272 Thẳng, nhánh 245 Trắng 63 KM254-2 22.1 34.85 15 257 Thẳng, nhánh vừa 230 Trắng 64 KM306-5 22.1 34.85 40 312 Thẳng, nhánh 240 Vàng 65 KM309-7 22.2 34.92 33.5 272 Thẳng, nhánh 256 Trắng 66 KM283 22.4 35.07 46.25 390 Thẳng, nhánh vừa 245 Vàng 67 KM308-8 22.4 35.07 24 242 Nhánh, xấu 292 Vàng 68 KM312-2 22.4 35.07 38 300 Thẳng, nhánh cao 265 Trắng 69 KM314-10 22.4 35.07 20.5 269 Nhánh, xấu 290 Trắng 70 KM02-2 22.5 35.15 29,5 307 Thấp xấu nhánh 220 Trắng 71 KM297-6 22.5 35.15 23 412 Thẳng, nhánh vừa 240 Trắng 72 KM314-3 22.5 35.15 17.25 307 Thẳng, nhánh 330 Trắng 73 KM46 22.5 35.15 21.5 241 Thẳng, nhánh 289 Trắng 74 KM 297 22.9 38.8 22.5 256.8 75 KM304-2 22.9 35.45 27.5 339 76 Sắn dù 22.9 39 23.8 335 77 KM302-11 23 35.52 40.75 78 KM316-2 23 35.52 79 KM317-3 23 80 KM60 81 LC 280 Thẳng, nhánh cao 240 Vàng 309 Thẳng, nhánh 240 Trắng 14 281 Thẳng, nhánh vừa 327 Trắng 35.52 21.5 375 Cao, nhánh nhiều 321 Trắng 23 35.52 35 257 Thẳng, nhánh cao 240 Trắng 23 39.9 355 152 82 KM307-4 23.1 35.6 33 234 Thẳng, nhánh 262 Vàng 83 KM310-2 23.1 35.6 22.5 292 Nhánh nhiều 280 Trắng 84 KM258-2 23.2 35.67 22.5 257 Thẳng, nhánh 254 Trắng 85 KM315-2 23.2 35.67 37 353 Cao, nhánh nhiều 281 Trắng 86 KM318-3 23.2 35.67 23 346 Cong, nhánh 314 Trắng 87 KM314-1 23.3 35.75 25 324 Nhánh nhiều 240 Trắng 88 KM314-1 23.3 35.75 25 347 nhánh, xấu 315 Trắng 89 KM143 23.4 35.82 24.25 251 Thẳng, nhánh cao 254 Trắng 90 KM246-2 23.4 35.82 20 308 Thẳng, nhánh vừa 270 Trắng 91 KM30 23.4 35.82 21.75 297 Thẳng, nhánh 245 Vàng 92 KM304-1 23.4 35.82 17.25 352 Thẳng, nhánh 230 Trắng 93 KM248 23.5 35.9 42 274 Thẳng, nhánh vừa 270 Trắng 94 KM298-3 23.5 35.9 26.75 400 Thẳng cao, nhánh 245 Vàng 95 KM305-1 23.5 35.9 27 323 Thẳng, nhánh vừa 245 Trắng 96 KM308-2 23.5 35.9 32.75 314 Thẳng, nhánh vừa 240 Trắng 97 KM315-5 23.5 35.9 30 257 Thẳng, nhánh vừa 328 Trắng 98 KM299-1 23.7 36.05 24.75 367 Thẳng, nhánh cao 240 Vàng 99 KM301-9 23.7 36.05 26.75 307 Thẳng, nhánh vừa 249 Vàng 100 KM305-2 23.7 36.05 31.5 336 Thẳng, nhánh vừa 240 Trắng 101 KM297-5 23.8 36.13 17.25 312 Thẳng, nhánh vừa 245 Trắng 102 KM63-2 23.8 36.13 20.75 404 Thẳng, nhánh vừa 248 Trắng 103 Hòa Mãn 911 24 36.7 40 284 104 KM288 24 36.28 34 334 Thẳng, nhánh cao 210 Trắng 105 KM306-4 24 36.28 26.5 323 Thẳng đẹp,0 nhánh 240 Vàng 106 KM318-2 24 36.28 24.5 354 Cao, nhánh vừa 316 Trắng 107 KM98-1 24 36.28 21.25 282 Thẳng, nhánh cao 254 Vàng 108 KM98-1 24 36.28 37.5 292 Thẳng, nhánh thấp 230 Trắng 109 KM98-5 24 36.28 24,5 308 Thẳng, nhánh thấp 245 Trắng 110 DT1 24.1 37.8 40 377.5 153 111 GM 444-2 24.1 38.6 42 305 112 KM293 24.2 36.43 47 320 Thẳng, nhánh 240 Trắng 113 KM298-2 24.2 36.43 33 298 Thẳng, nhánh vừa 274 Vàng 114 KM304-6 24.2 36.43 21.75 313 Thẳng, nhánh 225 Vàng 115 KM309-6 24.2 36.43 46 303 Thẳng, nhánh cao 373 Trắng 116 KM315-3 24.2 36.43 423 Cao, nhánh 280 Vàng 117 KM43 24.2 36.43 19 254 Thẳng, nhánh 310 Trắng 118 KM228 24.3 36.5 33.5 259 Thẳng, nhánh 240 Trắng 119 KM229 24.3 36.5 32.75 315 Thẳng, nhánh 240 Trắng 120 KM300-2 24.3 36.5 11.5 343 Hơi cong, nhánh 240 Vàng đậm 121 KM301-2 24.3 36.5 10.25 343 Thẳng, nhánh 240 Trắng 122 KM307-2 24.3 36.5 23.75 342 Thẳng, nhánh 240 Trắng 123 KM312-3 24.4 36.58 21 275 Nhánh nhiều 240 Trắng 124 KM316-1 24.4 36.58 37 394 Nhánh, xấu, đổ 316 Trắng 125 Sắn xanh 24.4 38.3 18.4 355 126 KM29 24.5 36.65 28.5 277 Thẳng, nhánh 258 Vàng 127 KM294-4 24.5 36.65 22 429 Thẳng, nhánh vừa 235 Trắng 128 KM301-8 24.5 36.65 26.5 328 Thẳng, nhánh 312 Vàng 129 KM308-4 24.5 36.65 23 320 Thẳng, nhánh 250 Vàng 130 KM309-10 24.5 36.65 18.5 276 Thẳng, nhánh vừa 254 Trắng 131 KM310-6 24.5 36.65 38 276 Thẳng đẹp,0 nhánh 268 Trắng 132 KM312-4 24.5 36.65 20 313 Thẳng, nhánh 265 Vàng 133 ORM 35.8 24.5 39 30 220 134 Thân đen 24.5 38.6 20 295 135 KM 35-1 24.6 36.73 25 256 Thấp, nhánh, xấu 248 Trắng 136 KM273-2 24.6 36.73 29 445 Đổ ngã, nhánh 249 Trắng 137 KM14-1 24.8 36.88 43 284 Thẳng, nhánh cao 264 Trắng 138 KM300-1 24.9 36.95 52.5 415 Hơi cong, nhánh 240 Vàng 139 HB 60 25 37.03 30.5 251 Thẳng nhánh cao 254 Trắng 154 140 Hòa Mãn 125 25 37.4 28 225 141 KM302-13 25 37.03 18 269 Nhánh, xấu 245 Vàng 142 KM7 25 37.03 28 320 Thẳng, nhánh vừa 265 Vàng 143 LC 25.1 37 32 265 144 Chuối vàng 25.2 38.8 8.8 365 145 Nêu Co 25.2 36.9 20 335 146 Sắn trắng 25.2 36.9 20 337.5 147 Sắn trắng MN 25.2 36.9 367.5 148 DT3 25.3 39.6 18 214 149 HG 25.3 37.5 24 317.5 150 Rayong 25.3 37.25 35.7 356 Thẳng, nhánh cao 240 Trắng 151 KM297-4 25.4 37.33 28 281 Thẳng, nhánh 273 Vàng 152 KM308-10 25.4 37.33 15.25 258 Thẳng, nhánh vừa 265 Vàng 153 KM314-6 25.4 37.33 25.5 368 Thẳng, nhánh cao 310 Trắng 154 KM315-4 25.4 37.33 35.5 358 Cao, nhánh vừa 315 Trắng 155 KM5 25.4 37.33 5.5 349 Nhánh nhiều 272 Trắng 156 KM111-1 25.5 37.4 31.5 276 Thẳng, nhánh cao 248 Trắng 157 KM146 25.5 37.4 45 246 Thẳng, nhánh 248 Trắng 158 Bún trắng 25.6 36.3 22.5 320 159 KM108 25.7 37.55 31.5 332 Thẳng, nhánh 280 Vàng 160 KM264 25.7 37.55 25 313 Thẳng, nhánh vừa 260 Trắng 161 KM79 25.7 37.55 37 393 Thẳng, nhánh 335 Trắng 162 Sắn đỏ Nghệ An 25.7 37.3 18.4 341.5 163 KM313-2 25.9 37.7 24.5 325 Thẳng, nhánh 316 Trắng 164 KM318-9 26 37.78 35 367 Thẳng, nhánh vừa 311 Vàng 165 KM 21-10 26.1 39.1 24 340 166 KM94 26.1 37.85 53.5 289 Cong, nhánh gốc 330 Trắng 167 SC 205 26.1 37.85 25.7 340 Thẳng, nhánh cao 311 Trắng 297 155 168 KM294-3 26.2 37.93 33.25 307 Thấp xấu, nhánh 220 Trắng 169 KM302-8 26.2 37.93 32 307 Thẳng, đẹp 240 Trắng 170 KM305-3 26.2 37.93 23 326 Thẳng, nhánh 230 Trắng 171 KM313-7 26.2 37.93 28.75 386 Cao, nhánh, đổ 300 Trắng 172 KM314-8 26.2 37.93 42.5 341 Thẳng, nhánh cao 305 Trắng 173 HL03 26.3 38 24 280 Cong, nhánh 267 Trắng 174 Sắn nếp 26.3 37.2 14 330 175 KM285 26.4 38.08 16.75 370 Thẳng, nhánh 235 Trắng 176 KM68 26.4 38.08 22 173 Nhánh, xấu 256 Trắng 177 KM948-5 26.4 37,65 15.5 267 Thẳng, nhánh 318 Trắng 178 RAY ONG 26.4 36,2 24,0 225 179 SC 205 26.4 37.2 33.6 247.5 180 GM 155-7 26.5 39.6 32 292 181 KM05-1 26.5 38.15 30 429 Thẳng, nhánh vừa 235 Trắng 182 KM309-2 26.5 38.15 16 278 Thẳng, nhánh vừa 268 Vàng 183 KM315-1 26.5 38.15 51.5 387 Thẳng, nhánh cao 284 Trắng 184 KM42 26.5 38.15 42.5 229 Thẳng, nhánh cao 311 Trắng 185 TB-CCC-8 Sắn cần câu 26.7 36.7 26.7 337.5 186 KM289-3 26.9 38.45 19.25 275 Thẳng, nhánh vừa 245 Trắng 187 KM312-5 26.9 38.45 41 297 Xấu, nhánh 260 Trắng 188 KM73 26.9 38.45 14.5 416 Thẳng, nhánh 318 Trắng 189 Sắn trắng 26.9 36.7 27.6 285 190 Sắn đổ 26.9 36.7 3.6 285 191 Chuối đỏ 27 38.6 22.5 345 192 HB 80 27 38.53 26.5 246 Thẳng, nhánh 248 Trắng 193 KM140 27 35.97 50.5 285 Thẳng, nhánh 240 Trắng 194 KM314-4 27 38.53 29 329 Thẳng cao, nhánh 316 Trắng 195 KM318-5 27 38.53 35.5 388 Cong, nhánh vừa 312 Vàng 196 KM318-7 27 38.53 23.5 267 Thẳng, nhánh vừa 312 Trắng 156 197 Xanh Hà Bắc 27 37.5 20,0 193.5 198 Xanh Vĩnh phú 27 38.6 27.5 331.5 Thẳng, nhánh cao 264 Trắng 199 KM302-1 27.2 38.68 28.75 284 Thẳng, nhánh 312 Vàng 200 KM311-2 27.2 38.68 13 250 Nhánh nhiều 270 Vàng 201 KM75 27.2 38.68 15 410 Thẳng, nhánh 312 Trắng 202 HG 27.3 38.3 27.6 329 203 HB 80 27.3 38.8 28 220 204 Rayong 27.3 38.75 15 267 Thẳng, nhánh 300 Trắng 205 KM308-6 27.4 38.83 30 267 Nhánh, xấu 294 Trắng 206 SM 305 27.4 38.83 35 290 Thẳng, nhánh 310 Trắng 207 HL23 27.5 38.08 16.5 283 Nhánh gốc, thẳng 210 Trắng 208 DT2 27.6 36.2 17.6 182.5 209 KM 325 27.6 38.6 40 192.5 210 HL 2003-14 27.7 35.5 16.8 320 211 Canh nông 27.8 35.5 18 345 212 Sắn Tuyên Quang 27.8 39.1 275 213 Trắng Bắc Thái 27.8 39.7 30 353 214 KM 397 27.9 38.4 26.8 185 215 Chuối vàng 28 38 18.8 370 216 GON 28 35.6 17.8 320 Phân cành cao 315 Trắng 217 KM98-5 28 35.67 37.5 316 Thẳng, nhánh cao 248 Trắng 218 SA 06 28.1 39.6 40 321 Thẳng, nhánh 255 Trắng 219 Sắn đỏ 28.2 40,0 18,0 283.5 220 TB-CCC-4 28.2 39.5 41 340 221 KM98-7 28.3 39.5 38.6 405 Nhánh nhiều 310 Trắng 222 KM 98-7 28.32 37.6 34 382.5 223 CM40.18.3 28.4 40.8 24 255 224 TB-CCC-2 Sắn nếp 28.4 39.5 31 298.5 300 264 157 225 KM313-4 28.5 39.65 29 358 Thẳng, nhánh 321 Trắng 226 KM316-4 28.5 39.65 23 336 Nhánh ít, đổ 310 Trắng 227 KM318-8 28.5 39.65 21 349 Nhánh nhiều 310 Trắng 228 SM 232.10 28.5 40.6 36 315 229 HB 60 28.6 36.3 20 195 230 SM 25956.27 28.6 39.5 14.8 255 231 KM310-3 28.7 39.8 30.25 306 Thẳng, nhánh 275 Trắng 232 OMR 39.43.27 28.7 40,1 28,8 263 233 Sắn đỏ miền nam 28.7 39.7 30.8 335 234 KM 140 28.9 39.5 20 231 235 SM 2938-20 28.9 40.8 24 315 236 RAY ONG 29 37.5 20.8 227 237 Sắn học viện 29 38 16.4 345 238 SM 2554.10 29 40.1 22.5 262.5 239 KM505 29.1 40.11 10.75 356 Nhánh nhiều 376 Trắng 240 KM 104-2 29.2 40.6 16.4 365 241 SM 1868.1 29.3 40.8 18 283.5 242 Sắn đỏ ĐF 29.5 41.1 13 281.5 Thẳng, nhánh 255 Đỏ 243 SM937-26 29.5 40.41 45 283 Thẳng, nhánh 252 Trắng 244 BT (60) 29.6 39.2 20 305 245 HL 2002-120 29.7 40.7 22 340 246 KM 108-2 29.7 40.2 22 372.5 247 SM 1561-2 29.7 37.5 19.6 282.5 248 KM 21-12 29.8 35.5 13 385 249 SM 2956.34 29.9 40.5 13.3 232.5 250 KM 94 27,6 38.3 30.4 335 289 305 158 PHỤ LỤC Thông tin trình tự nucleotide gen/đoạn gen phân lập đăng ký Starch synthase IV (SSIV) LOCUS DEFINITION ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM KT033500 3224 bp mRNA linear PLN 18-NOV-2015 Manihot esculenta starch synthase IV (SSIV) mRNA, complete cds KT033500 KT033500.1 GI:952183002 Manihot esculenta (cassava) Manihot esculenta Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; Gunneridae; Pentapetalae; rosids; fabids; Malpighiales; Euphorbiaceae; Crotonoideae; Manihoteae; Manihot REFERENCE (bases to 3224) AUTHORS Le,N.T., Nguyen,D.V., Nguyen,H.M., Nguyen,H.T.M., Pham,N.B and Chu,H.H TITLE Isolation and overexpression of cassava-derived starch synthase class IV for enhanced starch production in plant JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 3224) AUTHORS Le,N.T., Nguyen,D.V., Nguyen,H.M., Nguyen,H.T.M., Pham,N.B and Chu,H.H TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (08-JUN-2015) Plant Cell Biotechnology, Institute of Biotechnology, 18 Hoang Quoc Viet, Hanoi 1000, Vietnam FEATURES Location/Qualifiers source 3224 /organism="Manihot esculenta" /mol_type="mRNA" /db_xref="taxon:3983" 14gene 3224 /gene="SSIV" /note="SSIV" 14CDS 3186 /gene="SSIV" /codon_start=1 /product="starch synthase IV" /protein_id="ALN98281.1" /db_xref="GI:952183003" /translation="MASKLSTWFLSQGFTALNYNFDTNKQTATRFLLPSHRLLPASCK MRQRNLSSQHKRQQLKKASPEQPPNTVGFHSSGGGGGDDDIGDDDNDSETDSTAVHSV PSLNLDVESNEEVVDVSVDVEHAQHTGANDVERNVDMEHVQDVGAKDLYSLTQEMKTL GIDGAEKLSSIPDEMKPLVLNKDGGEQLSSFQLEDLIGMIRNAEKNILLLNQARVHAL EDLERILAEKEILQGEINVLEMKLAGTDARMKVAAQEKMHVELMEDQLGKLRNELAYR VGNQNKLLNEEAPLIQDSTIQNISEELNSLRAENTSLRTDIEALKRELSNVKDTDERV ITLEKECMQLESSVKDLESKLSVSQEDVSKLSSLKVECKDLWEKVGSLQALLDKATKQ ADQAILVLQQNRDLWKKVDKLEESLEEANIYKLSSEKLQQYNELMQQKIKLLEERLQR SDEEIYSYVQLYQESIQEFQDTLNTLKEESKKKALDEPVDDMPWQFWSHLLLMIDGWL LEKKLTLDDAKLLRDMVWKRERRIHDIYLECREKNEHEAVSMFLKLTSSPKSQGLYVV HIAAEMAPVAKVGGLGDVVTGLGKALQKRGHLVEIILPKYDCMQYDGIGNLRALDVVL ESYFDGKLYKNEVWVGTIEGLPVYFIEPHHPGKFFWRGQFYGEHDDFKRFSFFSRAAL ELLLQAGKKPDIIHCHDWQTAFVAPLYWDIYAPKGLNSARICFTCHNFEYQGSAPASE LASCGLDVQQLNRPDRMQDNSAHDRINPIKGAVVFSNIVTTVSPTYAQEVRTSEGGKG LHSTLNFHAKKFIGILNGIDTDVWNPATDTLLEVQYNANDLQGKAENKIATRQHLGLS TADARQPLVGCITRLVPQKGVHLIRHAIYRTLELGGQFLLLGSSPVAHIQREFEGIAN HFQNHEHIRLVLKYDESLAHSIYAASDMFIIPSIFEPCGLTQMIAMRYGSIPIARKTG GLNDSVLDVDDDTIPLQFRNGYTFLNPDEQGVNSALERAFNHYRNDPESWQQLVQKDM NIDFSWESSASQYEELYSKSVARARAAASRS" ORIGIN 159 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 atggcgtcga tttgacacta gcttcttgca aaagcctctc ggtgatgatg agtgtcccaa gatgtggagc catgttcaag ggcatagatg aacaaagatg agaaatgctg cttgaaagaa aaattggcag ctcatggaag aacaaacttt gaggagctca aagagggagc tgcatgcagt gatgtttcaa agtttgcaag cagcaaaatc aacatctata ataaaactat ttataccaag aagaaaaagg ttgcttatga ttgagagata gaaaagaatg caaggattat ttgggagatg attattctgc gatgtggtgt accattgaag agagggcagt gcacttgaat cagacagctt gctagaatat ttggcatctt tcagcacatg acagtatcac tcgacgctta gtgtggaatc ggaaaagcag aggcagccac agacatgcaa ccagttgcac cacattcggc gacatgttca agatatggtt gttgatgatg gagcagggag agctggcagc tcacagtatg tcttaattat agctatcgac ataagcagac aaatgcgaca ctgaacaacc atattggtga gcttgaatct atgctcagca atgttggtgc gagcagagaa gtggagaaca agaaaaatat ttcttgcaga gaactgatgc accaattagg tgaatgagga attcattgag ttagtaatgt tggagtcttc aattgtctag cattgttaga gagatctttg agttatcgtc tggaggaacg aatctataca cactagatga ttgatggttg tggtatggaa agcatgaagc atgtcgtcca ttgtgaccgg caaagtatga tggaatctta gtcttcctgt tctacggaga tgcttcttca ttgttgcacc gttttacctg gtggacttga ataggatcaa ccacctatgc actttcatgc ctgcgactga aaaacaaaat tggttggctg tataccgtac atatacagag tggtattgaa tcatcccatc ccatacccat acacaattcc tgaatagtgc agcttgttca aggagctcta ggtaaatggc gtggtttctg agctacgcga gcgcaatttg tccaaatacc tgatgataat tgatgttgag tacgggtgca aaaagatttg gctttctagt actgtcaagc cctgcttctc gaaggaaata aagaatgaaa aaaactaaga agcccccttg ggcagagaat caaggataca tgtgaaagac cttgaaagtt taaggcaaca gaagaaggtt agaaaagtta tcttcaacga ggaatttcaa acctgtagat gcttcttgag aagagagagg tgtttctatg tattgcagcg tcttggaaaa ctgcatgcaa ttttgatgga ttactttatt acatgatgat agctggcaaa actttattgg tcacaacttt tgtccagcag tcctattaag acaagaagtg caagaagttc tactcttctc agctacaagg cataacaaga gctggagttg ggaatttgag gtatgatgaa tatctttgag tgcaagaaaa tcttcagttt tttagaacgt aaaggacatg ctcaaaatca attttcatgg agtcaagggt ttcttattgc agctctcagc gtaggttttc gattccgaaa agtaatgagg aatgatgtgg tatagtctca attcctgatg tttcaacttg aatcaagctc ttacaaggag gttgctgctc aacgaactgg attcaggaca acatctctga gatgagcgtg ttggaatcca gaatgtaaag aagcaagcag gataaattgg cagcagtata tctgatgaag gatacactta gatatgccct aagaagctaa cgtattcatg tttctcaagc gagatggcac gcactccaaa tatgatggta aaattataca gagcctcatc ttcaaacgct aaaccagaca gatatatacg gagtaccagg ctaaacagac ggtgcagtgg cggacttctg attggaatcc gaagtccagt cagcatcttg ttggtgccac ggaggacaat ggtattgcaa tctctcgctc ccttgtggcc accggtggtc cgaaatggat gcatttaacc aacatagatt gtggccagag aaagccaagg tcacagcttt cttcccatcg ataagagaca attcgagtgg ctgatagcac aagtcgtcga agaggaatgt cccaggaaat aaatgaaacc aggatttgat gggttcatgc aaattaacgt aagaaaagat cttacagggt gcactattca ggactgatat ttataacact aactgtcagt acttgtggga atcaggctat aagaatcctt atgagctaat aaatatattc atactttgaa ggcaattttg cactagatga acatatactt tgacatcatc cagttgctaa agagaggaca ttggcaattt aaaacgaagt accccggcaa tttcattttt taattcattg ccccaaaagg ggagtgcacc cagatagaat tgttctcaaa agggcggaaa taaatggtat acaatgctaa ggttatcaac agaaaggtgt ttctacttct atcactttca attccattta ttacacagat taaatgatag atacattctt attataggaa ttagttggga caagagcggc atct gaactataat attgcttcct gcagctcaag tggtggtggt agcggtgcat tgttagcgta agatatggaa gaaaactttg tttggtctta aggcatgata acttgaagat tttagagatg gcatgtagaa tgggaatcag gaacattagt agaagcactt ggagaaagaa ttctcaggaa aaaggtggga tctagtgttg ggaagaggcc gcagcaaaag ttatgttcag agaagaaagc gagtcattta tgcaaaactg agagtgcagg accaaaaagt ggttggtggc tcttgtggaa aagggcccta atgggttggc gttcttttgg cagccgtgct ccatgactgg attgaattca agcatcagaa gcaggacaac cattgtgaca aggtctccat tgatactgat cgatcttcaa tgcagatgct acatcttatt tggctcaagc gaatcatgag tgcagcatct gatagcaatg tgttttggat gaatcctgat cgatcctgag atcttcagca agcaagtagg promoter C54 LOCUS AY217353 1084 bp DNA linear PLN 26-JUL-2016 DEFINITION Manihot esculenta glutamic acid-rich protein (c54) gene, promoter region and partial cds ACCESSION AY217353 VERSION AY217353.1 KEYWORDS 160 SOURCE Manihot esculenta (cassava) ORGANISM Manihot esculenta Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; Gunneridae; Pentapetalae; rosids; fabids; Malpighiales; Euphorbiaceae; Crotonoideae; Manihoteae; Manihot REFERENCE (bases to 1084) AUTHORS Zhang,P., Bohl-Zenger,S., Puonti-Kaerlas,J., Potrykus,I and Gruissem,W TITLE Two cassava promoters related to vascular expression and storage root formation JOURNAL Planta 218 (2), 192-203 (2003) PUBMED 13680228 REFERENCE (bases to 1084) AUTHORS Zhang,P., Bohl-Zenger,S., Puonti-Kaerlas,J., Potrykus,I and Gruissem,W TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (12-JAN-2003) Institute of Plant Sciences, ETH Zuerich, Universitaetsstrasse 2, Zuerich CH-8092, Switzerland FEATURES Location/Qualifiers source 1084 /organism="Manihot esculenta" /mol_type="genomic DNA" /cultivar="MCol1505" /db_xref="taxon:3983" /note="authority: Manihot esculenta Crantz" gene 962 >1084 /gene="c54" regulatory 962 968 /regulatory_class="TATA_box" /gene="c54" /note="promoter p54/1.0" mRNA 1011 >1084 /gene="c54" /product="glutamic acid-rich protein" CDS 1082 >1084 /gene="c54" /note="expressed during secondary growth of the storage root" /codon_start=1 /product="glutamic acid-rich protein" /protein_id="AAP57706.1" /translation="M" ORIGIN ggatccacgg gtgtgggcca actccaccgc ccaagagaaa acctaaaatg gagaaatttg 61 tcaaagcttt ttcaacttta cagactaggc ataggtcctg gggcaaacag aacagagctc 121 aggacgctgc ctccctgctt gcccacctgg aatcattgtt ctccgcttcc tgcttatgtc 181 atattctccg atgatttttt attttttaat tttgcgtttc tctttctttg caggtaaaat 241 aagcccatct caaattcaga tttgggtaat catgcgattt gagaaacatt atagaaaaaa 301 ggtgatcaac tccaattgtg tgataatttt gtagatgtgg caattaaggt cggtttggct 361 tttataagaa attagaatta accaatttca taattatatc attcatgact attgattata 421 atatctgaca aatcctgtaa tgatttttaa cccatttcag tatgatttac tcatcccatt 481 ctttatggct gcttcaatat acagagttca tgacatgtga atctgaattt aaatattaat 541 ttctctgttt aattaataat taataatcca tttcatataa tttttttaaa ttaattaatt 601 aattaaagaa gaaaataaga agctgggaac atgataataa taaaggtcac ctacattacc 661 gactgcacaa agcacataag cacaaaaaac caaaagaaag atgatggctt agctgaaaaa 721 ggccctccat tatttacact tttcgatcaa aaacaaatat catgggtaat ttaaaaagat 161 781 841 901 961 1021 1081 aaagtacagc tattcctatt taggtagagt ctatataagc cacttcctct tatg ttacttattt gattttgatt tcccacctct cactctcagt ttgcttctca gaaaaaaaat tcagagagat ctccctctca taccctctct ccatttactt ttttaattca gtgaggtcaa catgaagctt ctgcaccaaa ttagtttcta cnattcttaa atcccaagat actggcctct tacactctaa tttcattttc aatgttgatn tcctcttcct actcctctct gctctctctt tcttgctttc // Trình tự nucleotid axit amin suy diễn gen SSIV phân lập hai giống sắn Đỏ ĐF KM140 162 MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | ATGGCGTCGAAGCTATCGACGTGGTTTCTGAGTCAAGGGTTCACAGCTTTGAACTATAATTTTGACACTAATAAGCAGACAGCTACGCGATTCTTATTGC MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | CTTCCCATCGATTGCTTCCTGCTTCTTGCAAAATGCGACAGCGCAATTTGAGTAGCTCTCAGCATAAGAGACAGCAGCTCAAGAAAGCCTCTCCTGAACA G - MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | ACCTCCAAATACCGTAGGTTTTCATTCGCGTGGTGGTGGTGGTGGTGATGAT -ATTGGTGATGATGATAATGATTCCGAAACTGAGAGCACAGCGGTG .C - G A .GAT T MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | CATAGTGTCCCAAGCTTGAATCTTGATGTTGAGAGTAATGAGGAAGTCGTCGATGTTAGCGTAGATGTGGAGCATGCTCAGCATACGGGTGCAAATGATG MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | TGGAGAGGAATGTAGATATGGAACATGTTCAAGATGTTGGTGCAAAAGATTTGTATAGTCTCACCCAGGAAATGAAAACTTTGGGCATAGATGGAGCAGA MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | GAAGCTTTCTAGTATTCCTGATGAAATGAAACCTTTGGTCTTAAACAAAGATGGTGGAGAACAACTGTCAAGCTTTCAACTTGAGGATTTGATAGGCATG MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | ATAAGAAATGCTGAGAAAAATATCCTGCTTCTCAATCAAGCTCGGGTTCATGCACTTGAAGATCTTGAAAGAATTCTTGCAGAGAAGGAAATATTACAAG MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 710 720 730 740 750 760 770 780 790 800 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | GAGAAATTAACGTTTTAGAGATGAAATTGGCAGAAACTGATGCAAGAATGAAAGTTGCTGCTCAAGAAAAGATGCATGTAGAACTCATGGAAGACCAATT .G 163 MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 810 820 830 840 850 860 870 880 890 900 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | AGGAAAACTAAGAAACGAACTGGCTTACAGGGTTGGGAATCAGAACAAACTTTTGAATGAGGAAGCCCCCTTGATTCAGGACAGCACTATTCAGAACATT G MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | AGTGAGGAGCTCAATTCATTGAGGGCAGAGAATACATCTCTGAGGACTGATATAGAAGCACTTAAGAGGGAGCTTAGTAATGTCAAGGATACAGATGAGC MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1100 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | GTGTTATAACACTGGAGAAAGAATGCATGCAGTTGGAGTCTTCTGTGAAAGACTTGGAATCCAAACTGTCAGTTTCTCAGGAAGATGTTTCAAAATTGTC MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | TAGCTTGAAAGTTGAATGTAAAGACTTGTGGGAAAAGGTGGGAAGTTTGCAAGCATTGTTAGATAAGGCAACAAAGCAAGCAGATCAGGCTATTCTAGTG MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | TTGCAGCAAAATCGAGATCTTTGGAAGAAGGTTGATAAATTGGAAGAATCCTTGGAAGAGGCCAACGTCTATAAGTTATCGTCAGAAAAGTTACAGCAGT A MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 1310 1320 1330 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | ATAATGAGCTAATGCAGCAAAAGATAAAACTATTGGAGGAACGTCTTCAACAATCTGATGAAGAAATATATTCTTATGTTCAGTTATACCAAGAATCTAT G MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480 1490 1500 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | ACAGGAATTTCAAGATACACTTAATACTTTGAAAGAAGAAAGCAAGAAAAAGGCACTAGATGAACCTGTAGATGATATGCCCTGGCAATTTTGGAGTCAT MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | TTATTGCTTATGATTGATGGTTGGCTTCTTGAGAAGAAGCTAACACTAGATGATGCAAAACTGTTGAGAGATATGGTATGGAAAAGAGAGAGGCGTATTC C 1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 1690 1700 164 MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | ATGACATATACTTAGAGTGCAAGGAAAAGAATGAGCATGAAGCTGTTTCTATGTTTCTCAAGCTGACATCATCACCAAAAAGTCAAGGATTATATGTCGT G MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 1790 1800 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | CCATATTGCAGCGGAGATGGCACCAGTTGCTAAGGTTGGTGGCTTGGGAGATGTTGTGACTGGTCTTGGAAAAGCACTCCAAAAGAGAGGACATCTTGTG C MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 1810 1820 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1890 1900 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | GAAATTATTCTGCCAAAGTATGACTGCATGCAATATGATGGTATTGGCAATTTAAGGGCCCTAGATGTGGTGTTGGAATCTTATTTTGATGGAAAATTAT MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | ACAAAAACGAAGTATGGGTTGGCACCATTGAAGGTCTTCCTGTTTACTTTATTGAGCCTCATCACCCCGGCAAGTTCTTTTGGAGAGGGCAGTTCTACGG C MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 2010 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 2090 2100 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | AGAACATGATGATTTCAAACGCTTTTCATTTTTCAGCCGTGCTGCACTTGAATTGCTTCTTCAAGCTGGCAAAAAACCAGACATAATTCATTGCCATGAC MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 2110 2120 2130 2140 2150 2160 2170 2180 2190 2200 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | TGGCAGACAGCTTTTGTTGCACCACTTTATTGGGATATATACGCCCCAAAAGGATTGAATTCAGCTAGAATATGTTTTACCTGTCACAACTTTGAGTACC MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 2210 2220 2230 2240 2250 2260 2270 2280 2290 2300 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | AGGGGAGTGCACCAGCATCAGAATTGGCATCTTGTGGACTTGATGTCCAGCAGCTAAACAGACCAGATAGAATGCAGGACAACTCAGCACATGATAGGAT MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 2310 2320 2330 2340 2350 2360 2370 2380 2390 2400 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | CAATCCTATTAAGGGTGCAGTGGTGTTCTCAAACATTGTGACAACAGTATCACCCACCTATGCACAAGAAGTGCGGACTTCTGAGGGCGGAAAAGGTCTC 2410 2420 2430 2440 2450 2460 2470 2480 2490 2500 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | 165 MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) CATTCGACGCTTAACTTTCATGCCAAGAAGTTCATTGGAATCCTAAATGGTATTGATACTGATGTGTGGAATCCTGCGACTGATACTCTTCTCGAAGTCC MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 2510 2520 2530 2540 2550 2560 2570 2580 2590 2600 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | AGTACAATGCTAACGATCTTCAAGGAAAAGCAGAAAACAAAATAGCTACAAGGCAGCATCTTGGGTTATCAACTGCAGATGCTAGGCAGCCACTGGTTGG A MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 2610 2620 2630 2640 2650 2660 2670 2680 2690 2700 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | CTGCATAACAAGATTGGTGCCACAGAAAGGTGTACATCTTATTAGACATGCAATATACCGTACGCTGGAGTTGGGAGGACAATTTCTACTTCTTGGCTCA MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 2710 2720 2730 2740 2750 2760 2770 2780 2790 2800 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | AGCCCAGTTGCACATATACAGAGGGAATTTGAGGGTATTGCAAATCACTTTCAGAATCATGAGCACATTCGGCTGGTATTGAAGTATGATGAATCTCTCG MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 2810 2820 2830 2840 2850 2860 2870 2880 2890 2900 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | CTCATTCCATTTATGCAGCATCTGACATGTTCATCATCCCATCTATCTTTGAGCCTTGTGGCCTTACACAGATGATAGCAATGAGATATGGTTCCATACC MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 2910 2920 2930 2940 2950 2960 2970 2980 2990 3000 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | CATTGCAAGAAAAACCGGTGGTCTAAATGATAGTGTTTTTGATGTTGATGATGACACAATTCCTCTTCAGTTTCGAAATGGATATACATTCTTGAATCCT G G MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 3010 3020 3030 3040 3050 3060 3070 3080 3090 3100 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | GATGAGCAGGGAGTGAATAGTGCTTTAGAACGTGCATTTAACCATTATAGAAACGATCCTGAGAGCTGGCAGCAGCTTGTTCAAAGGGACATGGACATAG G A .A MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 3110 3120 3130 3140 3150 3160 3170 3180 3190 3200 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | ATTTTAGTTGGGAATCTTCAGCATCACAGTATGAGGAGCTCTACTCAAAATCAGTGGCCAGAGCAAGAGCGGCAGCAAGTAGGTCTTAATTATGGTAAAT MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 3210 3220 | | | | | GGCATTTTCATGGAAAGCCAAGGATCT 166 MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | ASKLSTWFLSQGFTALNYNFDTNKQTATRFLLPSHRLLPASCKMRQRNLSSSQHKRQQLKKASPEQPPNTVGFHSRGGGGGDD-IGDDDNDSETESTAVH - - .S .D D MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | SVPSLNLDVESNEEVVDVSVDVEHAQHTGANDVERNVDMEHVQDVGAKDLYSLTQEMKTLGIDGAEKLSSIPDEMKPLVLNKDGGEQLSSFQLEDLIGMI MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | RNAEKNILLLNQARVHALEDLERILAEKEILQGEINVLEMKLAETDARMKVAAQEKMHVELMEDQLGKLRNELAYRVGNQNKLLNEEAPLIQDSTIQNIS .E .G MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | EELNSLRAENTSLRTDIEALKRELSNVKDTDERVITLEKECMQLESSVKDLESKLSVSQEDVSKLSSLKVECKDLWEKVGSLQALLDKATKQADQAILVL MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | QQNRDLWKKVDKLEESLEEANVYKLSSEKLQQYNELMQQKIKLLEERLQQSDEEIYSYVQLYQESIQEFQDTLNTLKEESKKKALDEPVDDMPWQFWSHL I R MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | LLMIDGWLLEKKLTLDDAKLLRDMVWKRERRIHDIYLECKEKNEHEAVSMFLKLTSSPKSQGLYVVHIAAEMAPVAKVGGLGDVVTGLGKALQKRGHLVE .L R MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | IILPKYDCMQYDGIGNLRALDVVLESYFDGKLYKNEVWVGTIEGLPVYFIEPHHPGKFFWRGQFYGEHDDFKRFSFFSRAALELLLQAGKKPDIIHCHDW S MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 710 720 730 740 750 760 770 780 790 800 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | QTAFVAPLYWDIYAPKGLNSARICFTCHNFEYQGSAPASELASCGLDVQQLNRPDRMQDNSAHDRINPIKGAVVFSNIVTTVSPTYAQEVRTSEGGKGLH 810 820 830 840 850 860 870 880 890 900 167 MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | STLNFHAKKFIGILNGIDTDVWNPATDTLLEVQYNANDLQGKAENKIATRQHLGLSTADARQPLVGCITRLVPQKGVHLIRHAIYRTLELGGQFLLLGSS MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | PVAHIQREFEGIANHFQNHEHIRLVLKYDESLAHSIYAASDMFIIPSIFEPCGLTQMIAMRYGSIPIARKTGGLNDSVFDVDDDTIPLQFRNGYTFLNPD L MeSSiv (Manes.15G118600.1) MeSSIV (Do DF) MeSSiv (KM140) 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 | | | | | | | | | | | | | | | EQGVNSALERAFNHYRNDPESWQQLVQRDMDIDFSWESSASQYEELYSKSVARARAAASRS*LW*MAFSWKAKDX .* * .K N * * 168 Kết xác định trình tự promoter C54 phân lập (so sánh với trình tự truy vấn C54 (AY217353)) kết blasn (NCBI) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | C54 Referen C54 Promoter ggatccacgggtgtgggccaactccaccgcccaagagaaaacctaaaatggagaaatttgtcaaagctttttcaactttacagactaggcataggtcctg - 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | C54 Referen C54 Promoter gggcaaacagaacagagctcaggacgctgcctccctgcttgcccacctggaatcattgttctccgcttcctgcttatgtcatattctccgatgatttttt 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | C54 Referen C54 Promoter attttttaattttgcgtttctctttctttgcaggtaaaataagcccatctcaaattcagatttgggtaatcatgcgatttgagaaacattatagaaaaaa 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | C54 Referen C54 Promoter ggtgatcaactccaattgtgtgataattttgtagatgtggcaattaaggtcggtttggcttttataagaaattagaattaaccaatttcataattatatc R 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | C54 Referen C54 Promoter attcatgactattgattataatatctgacaaatcctgtaatgatttttaacccatttcagtatgatttactcatcccattctttatggctgcttcaatat Y 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | C54 Referen C54 Promoter acagagttcatgacatgtgaatctgaatttaaatattaatttctctgtttaattaataattaataatccatttcatataatttttttaaattaattaatt 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | C54 Referen C54 Promoter aattaaagaagaaaataagaagctgggaacatgataataataaaggtcacctacattaccgactgcacaaagcacataagcacaaaaaaccaaaagaaag 710 720 730 740 750 760 770 780 790 800 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | C54 Referen C54 Promoter atgatggcttagctgaaaaaggccctccattatttacacttttcgatcaaaaacaaatatcatgggtaatttaaaaagataaagtacagcttacttattt t .TA C Y 810 820 830 840 850 860 870 880 890 900 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | C54 Referen C54 Promoter gaaaaaaaatttttaattcacnattcttaaaatgttgatntattcctattgattttgatttcagagagatgtgaggtcaaatcccaagattcctcttcct 910 920 930 940 950 960 970 980 990 1000 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | C54 Referen C54 Promoter taggtagagttcccacctctctccctctcacatgaagcttactggcctctactcctctctctatataagccactctcagttaccctctctctgcaccaaa 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 | | | | | | | | | | | | | | | | C54 Referen C54 Promoter tacactctaagctctctcttcacttcctctttgcttctcaccatttacttttagtttctatttcattttctcttgctttctatg 169 Kết phân tích promoter C54 phần mềm TSSP C54 Promoter (sắn đỏ địa phương) C54 Promoter (Tham chiếu) > test sequence > test sequence Length of sequence1041 Thresholds for TATA+ promoters - 0.02, for TATA-/enhancers - 0.04 promoter/enhancer(s) are predicted Length of sequence1073 Thresholds for TATA+ promoters - 0.02, for TATA-/enhancers - 0.04 promoter/enhancer(s) are predicted Promoter Pos: 947 21.81 981 LDF- 0.14 TATA box at Promoter Pos: 947 21.81 981 LDF- Enhancer Pos: 993 LDF- 0.06 Enhancer Pos: 1004 LDF- 0.14 TATA box at 0.08 Transcription factor binding sites/RegSite DB: Transcription factor binding sites/RegSite DB: for promoter at position 981 815 (+) RSP00005 CTWWWWWWGT for promoter at position 981 815 (+) RSP00005 CTWWWWWWGT 979 (+) RSP00016 caTGCAC 876 (-) RSP00026 gcttttgaTGACtTcaaacac 943 (+) RSP00046 atccattcTATATAAGaaacata 790 (+) RSP00098 cttaatatATTTTTAattattttattctcttaa 794 (+) RSP00117 aattATTTTTAaa 979 (+) RSP00016 caTGCAC 876 (-) RSP00026 gcttttgaTGACtTcaaacac 943 (+) RSP00046 atccattcTATATAAGaaacata 794 (+) RSP00117 aattATTTTTAaa 795 (+) RSP00125 aatATTTTTAtt 786 (+) RSP00126 gaaaattttaatATTTTTAtttagtatt 795 (+) RSP00135 aatATTTTTAtc 794 (+) RSP00140 681 (+) RSP00161 aattATTTTTAtt WAAAG 763 (+) RSP00161 732 (-) RSP00161 WAAAG WAAAG 966 (+) RSP00240 918 (+) RSP00252 CAGTTA CACATG 826 (-) RSP00308 798 (+) RSP00339 CAACA RTTTTTR 743 (-) RSP00339 RTTTTTR 864 (+) RSP00383 787 (+) RSP00398 GGTCAAA TTTGAA 863 (+) RSP00467 862 (+) RSP00468 tGGTCAatTc ttGGTCAatTc 908 (-) RSP00469 759 (+) RSP00477 GNGGTG TTTAA 801 (+) RSP00477 820 (-) RSP00477 TTTAA TTTAA 764 (-) RSP00477 796 (+) RSP00508 TTTAA gcaTTTTTatca 801 (-) RSP00508 800 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca gcaTTTTTatca 799 (-) RSP00508 798 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca gcaTTTTTatca 769 (-) RSP00508 745 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca gcaTTTTTatca 681 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca 703 (-) RSP00512 cttgtaacCATCAgccaatcgaccagccaatcattc 795 (+) RSP00125 795 (+) RSP00135 aatATTTTTAtt aatATTTTTAtc 794 (+) RSP00140 681 (+) RSP00161 aattATTTTTAtt WAAAG 706 (+) RSP00161 763 (+) RSP00161 WAAAG WAAAG 769 (+) RSP00161 732 (-) RSP00161 WAAAG WAAAG 966 (+) RSP00240 918 (+) RSP00252 CAGTTA CACATG 774 (-) RSP00265 711 (-) RSP00305 ACTTTA CCTTTT 826 (-) RSP00308 798 (+) RSP00339 CAACA RTTTTTR 743 (-) RSP00339 RTTTTTR 864 (+) RSP00383 787 (+) RSP00398 GGTCAAA TTTGAA 863 (+) RSP00467 862 (+) RSP00468 tGGTCAatTc ttGGTCAatTc 908 (-) RSP00469 759 (+) RSP00477 GNGGTG TTTAA 801 (+) RSP00477 820 (-) RSP00477 TTTAA TTTAA 764 (-) RSP00477 796 (+) RSP00508 TTTAA gcaTTTTTatca 801 (-) RSP00508 800 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca gcaTTTTTatca 799 (-) RSP00508 798 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca gcaTTTTTatca 769 (-) RSP00508 745 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca gcaTTTTTatca 712 (-) RSP00508 681 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca gcaTTTTTatca 170 for promoter at position 815 (+) RSP00005 979 (+) RSP00016 703 (-) RSP00512 cttgtaacCATCAgccaatcgaccagccaatcattc for promoter at position 1004 993 815 (+) RSP00005 979 (+) RSP00016 CTWWWWWWGT caTGCAC CTWWWWWWGT caTGCAC 876 (-) gcttttgaTGACtTcaaacac RSP00026 876 (-) gcttttgaTGACtTcaaacac RSP00026 943 (+) atccattcTATATAAGaaacata RSP00046 943 (+) atccattcTATATAAGaaacata RSP00046 790 (+) cttaatatATTTTTAattattttattctcttaa RSP00098 794 (+) RSP00117 795 (+) RSP00125 aattATTTTTAaa aatATTTTTAtt 795 (+) RSP00135 aatATTTTTAtc 794 (+) RSP00140 706 (+) RSP00161 aattATTTTTAtt WAAAG 763 (+) RSP00161 769 (+) RSP00161 WAAAG WAAAG 794 (+) RSP00117 aattATTTTTAaa 795 (+) RSP00125 aatATTTTTAtt 786 (+) RSP00126 gaaaattttaatATTTTTAtttagtatt 795 (+) RSP00135 aatATTTTTAtc 794 (+) RSP00140 763 (+) RSP00161 aattATTTTTAtt WAAAG 732 (-) RSP00161 966 (+) RSP00240 WAAAG CAGTTA 732 (-) RSP00161 966 (+) RSP00240 WAAAG CAGTTA 918 (+) RSP00252 774 (-) RSP00265 CACATG ACTTTA 918 (+) RSP00252 826 (-) RSP00308 CACATG CAACA 711 (-) RSP00305 826 (-) RSP00308 CCTTTT CAACA 798 (+) RSP00339 743 (-) RSP00339 RTTTTTR RTTTTTR 798 (+) RSP00339 743 (-) RSP00339 RTTTTTR RTTTTTR 864 (+) RSP00383 787 (+) RSP00398 GGTCAAA TTTGAA 864 (+) RSP00383 787 (+) RSP00398 GGTCAAA TTTGAA 863 (+) RSP00467 862 (+) RSP00468 tGGTCAatTc ttGGTCAatTc 863 (+) RSP00467 862 (+) RSP00468 tGGTCAatTc ttGGTCAatTc 908 (-) RSP00469 759 (+) RSP00477 GNGGTG TTTAA 908 (-) RSP00469 759 (+) RSP00477 GNGGTG TTTAA 801 (+) RSP00477 820 (-) RSP00477 TTTAA TTTAA 801 (+) RSP00477 820 (-) RSP00477 TTTAA TTTAA 764 (-) RSP00477 796 (+) RSP00508 TTTAA gcaTTTTTatca 764 (-) RSP00477 796 (+) RSP00508 TTTAA gcaTTTTTatca 801 (-) RSP00508 800 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca gcaTTTTTatca 801 (-) RSP00508 800 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca gcaTTTTTatca 799 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca 799 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca 798 (-) RSP00508 769 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca gcaTTTTTatca 798 (-) RSP00508 769 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca gcaTTTTTatca 745 (-) RSP00508 712 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca gcaTTTTTatca 745 (-) RSP00508 gcaTTTTTatca 703 (-) RSP00512 cttgtaacCATCAgccaatcgaccagccaatcattc 171 Phụ lục Sơ đồ vector mang gen SSIV tổng hợp nhân tạo pK7WG2D-35S:SSIV:T35 pBI121-C54:SSIV:NOST 172 Phụ lục Môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Thành phần CaCl2 CaCl2.6H2O KH2PO4 KNO3 MgSO4 NH4NO3 FeSO4.7H2O EDTA Hoặc FeNaEDTA H3BO3 KI MnSO4.2H2O ZnSO4 CoCl2.6H2O CuSO4.5H2O NaMoO4.2H2O MnSO4.H2O Glycin Thiamin HCl Myo – innositol Pyridoxine HCl Hàm lượng (mg/l) 332,02 440 170 1900,00 180,54 1650,00 27,8 37,3 36,7 6,2 0,83 16,9 8,6 0,025 0,025 0,25 16,9 2,00 0,10 100,00 0,50 173 ... Chuyển gen SSIV vào thuốc đánh giá hoạt động gen chuyển 87 87 3.3.2 Đánh giá hoạt động gen chuyển 91 92 3.3 Đánh giá hoạt động vector chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng... tổng hợp tinh bột thuốc 87 3.3.1 Chuyển gen SSIV vào thuốc đánh giá hoạt động gen 87 chuyển .87 3.3.2 Đánh giá hoạt động gen chuyển 92 92 iv 3.4 Chuyển gen SSIV tăng... HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MINH HỒNG ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦ A MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP, TÍ CH LŨ Y TINH BỘT VÀ THỬ NGHIỆM CHUYỂN GEN SSIV VÀO

Ngày đăng: 10/01/2020, 01:32

Xem thêm: Luận án tiến sĩ Sinh học: Đánh giá hoạt động của một số gen liên quan đến tổng hợp, tích lũy tinh bột và thử nghiệm chuyển gen SSIV vào cây sắn

Luận án tiến sĩ Sinh học: Đánh giá hoạt động của một số gen liên quan đến tổng hợp, tích lũy tinh bột và thử nghiệm chuyển gen SSIV vào cây sắn

Thông tin tài liệu

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

Tài liệu liên quan