Nghiên cứu điều kiện nuôi sinh khối vi tảo thalassiosira pseudonana để ứng dụng làm thức ăn cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN VĂN CÔNG NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI SINH KHỐI VI TẢO Thalassiosira pseudonana ĐỂ ỨNG DỤNG LÀM THỨC ĂN CHO ẤU TRÙNG TÔM THẺ CHÂN TRẮNG Ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 9420201 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI - 2019 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS TS ĐỖ THỊ HOA VIÊN PGS TS ĐẶNG DIỄM HỒNG Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi: ., ngày tháng năm 2019 Có thể tìm hiểu Luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN Nguyen Van Cong, Dinh Thi Le Giang, Nguyen Kim Duong, Tran Dinh Quang, Do Thi Hoa Vien (2016) Effects of feed on the survival rate, growth rate and metamorphosis time of the white leg shrimp larvae (Litopenaeus vannamei Boone, 1931) at zoea stage Journal of Science and Technology, Vietnam Academy of Science and Technology 54 (4A), p 205 212 Nguyễn Văn Cơng, Đinh Thị Lệ Giang, Nguyễn Kim Đường, Trần Đình Quang, Đỗ Thị Hoa Viên (2016) Ảnh hưởng mật độ nuôi đến tỉ lệ sống, sinh trưởng thời gian biến thái ấu trùng tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei Boone, 1931) giai đoạn zoea Hội nghị Khoa học trẻ Thủy sản toàn quốc lần thứ VII Youth fish 2016, p 142 - 150 Nguyễn Văn Cơng, Nguyễn Kim Đường, Trần Đình Quang, Đỗ Thị Hoa Viên (2017) Kỹ thuật nhân nuôi sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana Hội nghị Khoa học trẻ Thủy sản toàn quốc lần thứ VIII Youth fish 2017, p 77 - 90, Nhà xuất Nông nghiệp Nguyen Van Cong, Do Thi Hoa Vien, Dang Diem Hong (2018) Fatty acid profile and nutrition values of the microalga (Thalassiosira pseudonana) used in white shrimp culture Vietnam Journal of Science and Technology, Vietnam Academy of Science and Technology 56 (4A), p 138 - 145 Nguyễn Văn Công, Đỗ Thị Hoa Viên, Đặng Diễm Hồng (2018) Định tên hai loài vi tảo biển (Thalassiosira pseudonana Thalassiosira weissflogii) dựa hình thái tế bào phân tích gen 18S rRNA Hội nghị Khoa học Cơng nghệ sinh học tồn quốc 2018, p 21 - 27, Nhà xuất Khoa học Tự nhiên Công nghệ Nguyễn Văn Công, Nguyễn Kim Đường, Trần Đình Quang, Đỗ Thị Hoa Viên (2018) Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng lên phát triển vi tảo Thalassiosira pseudonana Tạp chí Sinh học 40 (2se), p - 10 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Hiện nay, trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng (TTCT) việc nuôi sinh khối vi tảo gặp nhiều khó khăn dễ bị nhiễm vi sinh vật tảo tạp, nguồn giống ban đầu chất lượng, môi trường dinh dưỡng dư thừa gây ô nhiễm môi trường nước nuôi, mật độ tế bào (MĐTB) đạt cực đại thấp, tảo tàn lụi nhanh, tốc độ sinh trưởng đặc trưng thấp, kích thước tế bào không đồng đều, tế bào bị dị dạng nhiều, sinh khối đạt thấp, chi phí cho ni trồng cao Giai đoạn zoea ấu trùng TTCT sử dụng vi tảo phải giàu dinh dưỡng, kích thước tế bào phải vừa với cỡ miệng ấu trùng tơm Kích thước tế bào vi tảo nhỏ cho phép sử dụng cho ấu trùng TTCT giai đoạn sớm Cung cấp đủ thức ăn tươi sống có chất lượng dinh dưỡng cao 15 ngày đầu ấu trùng TTCT bí cơng nghệ trang trại ni trồng thủy sản (NTTS) Lồi Thalassiosira pseudonana có kích thước tế bào nhỏ so với Thalassiosira weissflogii nhiên ni trồng chúng lại khó khăn Hiện nay, số trang trại NTTS nuôi lồi T weissflogii thành cơng ổn định kích thước lồi lớn, giá trị dinh dưỡng thấp, MĐTB đạt cực đại thấp, thời gian lưu giữ quần thể tảo ngắn, trang trại lại chưa ni lồi T pseudonana Lồi T pseudonana có kích thước tế bào từ - µm, vừa với cỡ miệng ấu trùng TTCT giai đoạn zoea (4 ngày nuôi đầu cho zoea 1, 2, 3) mysis (3 ngày cho mysis 1, 2, 3), giai đoạn từ postlarvae đến postlarvae 12 (nếu có đủ sinh khối tươi sống để cung cấp tốt) Giá trị dinh dưỡng T pseudonana cao, hàm lượng lipít từ 20,60 - 24,67% sinh khối khơ (SKK) đó, axít béo bão hòa (SFAs, saturated fatty acid) chiếm 36,72% so với axít béo tổng số (TFA, total fatty acid), axít béo khơng bão hòa nối đối (MUFAs, monounsaturated fatty acid) chiếm 44,67% so với TFA, axít béo khơng bão hòa đa nối đơi (PUFAs, polyunsaturated fatty acid) chiếm 12,85% so với TFA axít eicosapentaenoic (EPA, eicosapentaenoic acid) chiếm 2,15% so với TFA [8]; hàm lượng protein đạt (18 - 30% SKK), carbohydrate (17 - 26% SKK) [5] Ngồi ra, sinh khối vi tảo giàu chất khống đa vi lượng giúp tơm tiêu thụ thức ăn tốt giữ lượng hiệu hơn, từ giúp tơm tăng trưởng nhanh ổn định, rút ngắn thời gian biến thái có tỉ lệ sống cao Hơn nữa, vi tảo T pseudonana có khả sinh trưởng phát triển ổn định hệ thống ni trồng, chúng có MĐTB đạt cực đại cao 0,82 x 106 tb/mL [5] thời gian lưu giữ, cấy chuyển dài Đây ưu điểm bật để lưu giữ ổn định thời gian kéo dài quần thể tảo Thời gian lưu giữ nhiệt độ thường kéo dài từ - tháng giúp cho trại sản xuất giống TTCT chủ động nguồn giống, thời gian cấy chuyển sàng lọc lại giống dễ dàng, dễ bảo quản giống Do vậy, sản xuất sinh khối T pseudonana làm thức ăn sống để cung cấp đủ dinh dưỡng cho ấu trùng TTCT yếu tố định đến tỉ lệ sống, tăng trưởng, thời gian biến thái nâng cao chất lượng tôm giống Ở Việt Nam có số cơng trình nghiên cứu khả ứng dụng T pseudonana nhiều lĩnh vực khác kết nghiên cứu nhìn chung chưa mang tính hệ thống Nguồn giống chủ yếu nhập ngoại; tảo chưa phân lập lại bị nhiễm tạp vi sinh vật; việc lưu giữ tảo giống chưa nuôi trồng T pseudonana quy mơ lớn sử dụng lồi cho TTCT Việc chứng minh tính an tồn sinh khối T pseudonana nuôi trồng sử dụng chúng cho sản xuất giống TTCT Việt Nam hoàn tồn Việt Nam Chính vậy, trại sản xuất giống TTCT, việc phân lập lại tảo bị nhiễm vi sinh vật tảo tạp, lưu giữ giống, nghiên cứu điều kiện thích hợp cho ni sinh khối T pseudonana thành công nâng cao chất lượng sinh khối tươi sống chúng hệ thống nuôi hở quan trọng cần thiết cho việc tạo nguồn thức ăn để nâng cao suất chất lượng giống TTCT điều kiện Việt Nam Xuất phát từ thực trạng nghiên cứu tính cấp thiết nêu trên, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu điều kiện nuôi sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana để ứng dụng làm thức ăn cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng” Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình cơng nghệ thích hợp ni sinh khối Thalassiosira pseudonana quy mơ phòng thí nghiệm pilot điều kiện trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng thu sinh khối đủ tiêu chuẩn làm nguyên liệu thức ăn tươi sống cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng Nội dung nghiên cứu - Phân lập lại tảo bị nhiễm vi sinh vật tảo tạp, lưu giữ, nghiên cứu đặc điểm sinh học, thành phần dinh dưỡng Thalassiosira pseudonana quy mơ bình thủy tinh 0,25 - L bể composite 0,2 - 3,5 m3 - Xây dựng quy trình cơng nghệ tối ưu ni sinh khối Thalassiosira pseudonana quy mơ bình thủy tinh 0,25 - L bể composite 0,2 - 3,5 m3 - Nghiên cứu độc tính cấp độc tính bán trường diễn tác dụng sinh dược sinh khối Thalassiosira pseudonana đạt tiêu chuẩn an toàn làm thức ăn cho loài động vật thủy sản - Nghiên cứu sử dụng sinh khối Thalassiosira pseudonana tươi sống nuôi trồng làm thức ăn cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng trang trại sản xuất giống Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án - Kết nghiên cứu thu Luận án cung cấp sở liệu đặc điểm sinh học Thalassiosira pseudonana cho tập đoàn giống vi tảo nuôi trồng Việt Nam; số liệu khoa học thu cho phép làm chủ quy trình nhân ni sinh khối điều kiện phòng thí nghiệm, khả cung cấp sinh khối tươi sống ổn định mang tính bền vững quy mơ bể composite 3,5 m3 - Các kết Luận án có ý nghĩa thực tiễn cung cấp dẫn liệu khoa học giúp sở sản xuất sinh khối vi tảo làm chủ quy trình ni, thu sinh khối tươi sống đạt chất lượng làm thức ăn cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng Những điểm luận án - Luận án Tiến sĩ cơng trình nghiên cứu có hệ thống việc lưu giữ ni trồng lồi Thalassiosira pseudonana từ phòng thí nghiệm đến quy mơ pilot 3,5 m3 điều kiện Việt Nam - Sinh khối thu từ quy trình cơng nghệ ni trồng lồi Thalassiosira pseudonana đánh giá an toàn, đạt tiêu chuẩn làm thức ăn tươi sống cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng - Đã sử dụng thành công sinh khối Thalassiosira pseudonana tươi sống nuôi để làm thức ăn cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng trại sản xuất giống Việt Nam Đã sử dụng nguồn tôm giống sản xuất sinh khối Thalassiosira pseudonana tươi sống để nuôi thương phẩm tôm thẻ chân trắng thành công Việt Nam Cấu trúc luận án Luận án bao gồm 150 trang với 29 bảng số liệu, 54 hình ảnh liên quan, 147 tài liệu tham khảo Kết cấu luận án gồm: Mở đầu (03 trang), Tổng quan (26 trang), Vật liệu phương pháp nghiên cứu (18 trang), Kết Thảo luận (87 trang), Kết luận Kiến nghị (02 trang), Danh mục cơng trình cơng bố (01 trang), Tài liệu tham khảo (13 trang) Phụ lục (40 trang) CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Hiện nay, có nhiều lồi vi tảo sử dụng trại sản xuất giống tôm biển tôm thẻ chân trắng Thalassiosira weissflogii, Thalassiosira pseudonana, Spirulina platensis, Skeletonema costatum, Chaetoceros calcitrans, Chaetoceros gracilis, Tetraselmis chuii, Tetraselmis suesica, Isochrysis galbana Trong đó, Thalassiosira pseudonana xem nguồn thức ăn sống quan trọng cho ương nuôi ấu trùng tôm [33], [34], [35], [36], [37] Zhukova (2004) [64] nuôi T pseudonana môi trường F/2 20oC, 3,5 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12:12 Kết thu nghiên cứu cho thấy thành phần axít béo thay đổi theo thời gian ni cấy sau: sau ngày nuôi cấy (SFAs đạt 36,1% so với TFA, MUFAs - 20,8% PUFAs - 38,9%), ngày nuôi cấy (SFAs đạt 38,3% so với TFA, MUFAs - 21,3% PUFAs - 37,0%), 10 ngày nuôi cấy (SFAs đạt 34,7% so với TFA, MUFAs - 24,6% PUFAs - 37,0%), 14 ngày nuôi cấy (SFAs đạt 30,6% so với TFA, MUFAs - 21,5% PUFAs - 45,0%) 20 ngày nuôi cấy (SFAs đạt 29,6% so với TFA, MUFAs - 18,2% PUFAs - 48,7%) CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Loài Thalassiosira pseudonana Hasle Heimdal, 1970 giống nhập nội từ Thái Lan trung tâm nghiên cứu Shrimp genetic improvement center - Charoen Pokphand Foods PCL, tảo bị nhiễm vi sinh vật tảo tạp cần phân lập lại, lưu giữ ni cấy điều kiện phòng thí nghiệm Công ty Cổ phần Chăn nuôi C.P Việt Nam để tiếp tục sử dụng nghiên cứu Loài Thalassiosira weissflogii (Grunow) Hasle Fryxell, 1977 giống nhập nội từ Thái Lan trung tâm nghiên cứu Shrimp genetic improvement center - Charoen Pokphand Foods PCL, nuôi sinh khối Công ty Cổ phần Chăn nuôi C.P Việt Nam sử dụng công thức đối chứng cho số thí nghiệm T pseudonana Trạng thái mẫu giống ban đầu T pseudonana T weissflogii: dạng đĩa petri thạch đặc, bọc gói cẩn thận giấy bạc, quan sát kính hiển vi độ phóng đại 400 lần thấy có khuẩn lạc sống có màu sắc đặc trưng tế bào vi tảo Chuột nhắt trắng dòng Swiss trưởng thành, không phân biệt giống, khối lượng 20 - 25 g/con Chuột thí nghiệm ni điều kiện chuồng thoáng mát, chế độ sáng/tối 12/12 giờ, đảm bảo vệ sinh không hạn chế thức ăn nước uống Chuột cống trắng dòng Wistar trưởng thành, không phân biệt giống, trọng lượng 200 ± 20 g/con Trung tâm động vật, Học viện Quân y cung cấp Chuột ni điều kiện chuồng thống mát, đảm bảo vệ sinh, chế độ ăn uống theo nhu cầu chuột cống trắng Chuột theo dõi ổn định vòng - ngày chúng đạt tiêu chuẩn thí nghiệm đưa vào sử dụng Chuột nhắt trắng giống đực, khỏe mạnh 10 - 12 tuần tuổi, trọng lượng 20 - 30 g/con, Ban chăn nuôi động vật Học viện Quân y cung cấp để tiến hành thử nghiệm đánh giá tính an tồn dược lý sinh khối T pseudonana Ấu trùng tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei Boone, 1931) giai đoạn nauplii - 5, Bộ phận tôm bố mẹ sản xuất Công ty Cổ phần Chăn nuôi C.P Việt Nam cung cấp đạt chất lượng có tỉ lệ đột biến ≤ 10%, vi khuẩn phát sáng < 1.00 x 103 CFU/g không phát bệnh EHP VPA: AHPND Nguồn giống postlarvae 12 lấy từ Công ty Cổ phần Chăn nuôi C.P Việt Nam kiểm tra cho kết âm tính với loại mầm bệnh nguy hiểm WSD, TS, YHD, IHHN, NHP IMN sử dụng để nuôi thương phẩm tơm thẻ chân trắng 2.1.2 Hóa chất thiết bị Hóa chất: Các loại hố chất HCl, H2O2, Iophor dùng vệ sinh thiết bị hệ thống nuôi Các hóa chất xử lý nước Na2EDTA, CaCO3, NaClO Thiết bị dụng cụ: Đĩa petri, ống nghiệm (CHLB Đức), kính hiển vi quang học, lam kính, lamen, buồng đếm hồng cầu Neubauer số thiết bị chuyên dụng khác dùng cho phòng thí nghiệm 2.2 Các mơi trường nuôi cấy Thành phần môi trường nuôi cấy Thalassiosira pseudonana gồm môi trường dinh dưỡng F2, TMRL, AGP (Algal Growth Potential), Conway Walne 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp chụp ảnh hình thái tế bào Các tế bào vi tảo quan sát chụp ảnh kính hiển vi điện tử quét (SEM) JEOL JSM - 6400 (Nhật Bản) Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương độ phóng đại 15.000 lần Các tế bào đứng riêng rẽ có hình dạng đặc trưng cho loài nghiên cứu chọn để chụp ảnh 2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử Phương pháp sinh học phân tử tiến hành bước sau: Tách chiết DNA tổng số (theo mô tả Hoàng Thị Lan Anh cộng (2010) [108]), phản ứng PCR nhân phần gen 18S rRNA, điện di gel agarose, tinh sản phẩm PCR xác định trình tự gen 2.3.3 Xác định điều kiện ni cấy thích hợp Thalassiosira pseudonana quy mơ phòng thí nghiệm pilot Xác định điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh trưởng Thalassiosira pseudonana quy mơ phòng thí nghiệm (0,25 - L) quy mô pilot bể composite (0,2 - 3,5 m3) + Bố trí thí nghiệm: a Nghiên cứu ảnh hưởng tỉ lệ % môi trường AGP lên phát triển Thalassiosira pseudonana bình thủy tinh 0,25 - L gồm có cơng thức mơi trường AGP 5, 10, 15, 20 25% điều kiện như: độ mặn 30‰, pH 7,0, 5,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ, 25oC, độ kiềm 150 - 180 mg CaCO3/L CĐSK 24/24 với nguồn khí cấp vào xử lý vơ khuẩn Mơi trường AGP pha lỗng theo tỉ lệ nói chọn từ dung dịch AGP đậm đặc, cung cấp mL/L bổ sung silicate mL/L MĐTB ban đầu: 0,2 x 106 tb/mL b Nghiên cứu ảnh hưởng loại môi trường khác lên phát triển Thalassiosira pseudonana bình thủy tinh (0,25 - L) bể composite 0,2 m3 có cơng thức mơi trường AGP 20%, F2, TMRL, Conway Walne Các loại môi trường dinh dưỡng pha lỗng theo cơng thức cho sẵn, cung cấp mL/L bổ sung silicate mL/L Điều kiện mơi trường thí nghiệm: độ mặn 30‰, pH 7,0, 5,0 - 6,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ, 25oC, độ kiềm 150 - 180 mg CaCO3/L CĐSK 24/24 với nguồn khí cấp vào xử lý vơ khuẩn MĐTB ban đầu: 0,2 x 106 tb/mL c Nghiên cứu ảnh hưởng mật độ tế bào ban đầu khác lên phát triển Thalassiosira pseudonana bình thủy tinh (0,25 - L) bể composite (0,2 - 3,5 m3) bố trí với cơng thức 0,1; 0,15; 0,2; 0,25 0,3 x 106 tb/mL MĐTB quan sát kính hiển vi độ phóng đại 400 lần lựa chọn kỹ thông qua thông số MĐTB ổn định, cụm tế bào tế bào đồng đều, đẹp, góc tế bào khơng có dấu hiệu gãy góc, khơng bị vón cục, kết dính, khơng tạo thành hàng, cụm dày đặc có màu sắc đặc trưng tảo đảm bảo độ đồng cao MĐTB ban đầu đem thí nghiệm, tiến hành pha lỗng MĐTB ban đầu theo nghiệm thức chọn nói Điều kiện mơi trường thí nghiệm: mơi trường AGP 20%, độ mặn 30‰, pH 7,0, 5,0 - 10,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ, 25oC, độ kiềm 150 - 180 mg CaCO3/L CĐSK 24/24 với nguồn khí cấp vào xử lý vô khuẩn d Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ lên phát triển Thalassiosira pseudonana bình thủy tinh 0,25 - L bao gồm công thức 15, 20, 25, 30 35oC Sử dụng máy điều hòa chiều cơng suất lớn để điều chỉnh nhiệt độ sử dụng hệ thống tủ container có dải nhiệt độ (-40oC đến 50oC) để bố trí thí nghiệm 15oC Điều kiện mơi trường thí nghiệm: mơi trường AGP 20%, độ mặn 30‰, pH 7,0, 5,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ, độ kiềm 150 - 180 mg CaCO3/L CĐSK 24/24 với nguồn khí cấp vào xử lý vô khuẩn MĐTB ban đầu: 0,2 x 106 tb/mL e Nghiên cứu ảnh hưởng cường độ ánh sáng khác lên phát triển Thalassiosira pseudonana bình thủy tinh (0,25 - L) bể composite (0,2 - 3,5 m3) bố trí với công thức 3,0; 4,0; 5,0; 6,0 7,0 klux Còn bể composite 3,5 m3 thay đổi với mức CĐAS 4,0; 6,0; 8,0; 10,0 12,0 klux Chúng thay đổi khoảng cách chiếu sáng đèn LED (loại 240 W) từ 40 - 130 cm để điều chỉnh CĐAS cho thí nghiệm nói cố định chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 Điều kiện môi trường thí nghiệm: mơi trường AGP 20%, độ mặn 30‰, pH 7,0, 25oC, độ kiềm 150 - 180 mg CaCO3/L CĐSK 24/24 với nguồn khí cấp vào xử lý vô khuẩn MĐTB ban đầu: 0,2 x 106 tb/mL f Nghiên cứu ảnh hưởng pH khác lên phát triển Thalassiosira pseudonana bình thủy tinh 0,25 - L gồm có cơng thức 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 9,0 Để giảm độ pH môi trường nước nuôi thí nghiệm cần sử dụng đá bọt CO2 để sục vào kiểm tra mức độ giảm pH theo Để tăng độ pH môi trường nước ni thí nghiệm cần sử dụng vơi Ca(OH)2 để tạt vào kiểm tra mức độ tăng pH theo giữ mức ổn định suốt thời gian theo dõi thí nghiệm Vơi Ca(OH)2 trước cung cấp vào cần pha loãng với nước chờ lắng sử dụng, cần tiến hành tỉ mỉ, cẩn thận để kiểm sốt pH ổn định thí nghiệm đặt Điều kiện mơi trường thí nghiệm: môi trường AGP 20%, độ mặn 30‰, 25oC, 5,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ, độ kiềm 150 - 180 mg CaCO3/L CĐSK 24/24 với nguồn khí cấp vào xử lý vô khuẩn MĐTB ban đầu: 0,2 x 106 tb/mL g Nghiên cứu ảnh hưởng độ mặn lên phát triển Thalassiosira pseudonana bình thủy tinh (0,25 - L) bể composite (0,2 - 3,5 m3) có cơng thức 15, 20, 25, 30 35‰ Các độ mặn thấp 15, 20 25‰ sử dụng nước để làm giảm độ mặn ổn định độ mặn từ - ngày tiến hành đem vào xử lý để bố trí thí nghiệm Đối với độ mặn 35‰ sử dụng muối (NaCl) để tăng độ mặn cho thí nghiệm Điều kiện mơi trường thí nghiệm: mơi trường AGP 20%, 25oC, 5,0 - 10,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ, pH 7,0, độ kiềm 150 - 180 mg CaCO3/L CĐSK 24/24 với nguồn khí cấp vào xử lý vô khuẩn MĐTB ban đầu: 0,2 x 106 tb/mL h Nghiên cứu ảnh hưởng độ kiềm lên phát triển Thalassiosira pseudonana bình thủy tinh 0,25 - L bao gồm công thức 150, 155, 160, 165, 170, 175 180 ± mg CaCO3/L Sử dụng NaHCO3 (Natri bicarbonat) để tăng CaSO4.2H2O (thạch cao sống) để giảm độ kiềm theo công thức chọn cho thí nghiệm Điều kiện mơi trường thí nghiệm: mơi trường AGP 20%, độ mặn 30‰, 25oC, 5,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 giờ, pH 7,0 CĐSK 24/24 với nguồn khí cấp vào xử lý vơ khuẩn MĐTB ban đầu: 0,2 x 106 tb/mL i Nghiên cứu ảnh hưởng chế độ sục khí khác lên phát triển Thalassiosira pseudonana bình thủy tinh (0,25 - L) bể composite (0,2 - 3,5 m3) bao gồm công thức 15/24, 17/24, 19/24, 21/24, 23/24 24/24 Sử dụng máy thổi khí (GSD GRB - 50, loại 3,7 KW) để sục ngắt khí theo mặc định cho thí nghiệm nói Điều kiện mơi trường thí nghiệm: môi trường AGP 20%, độ mặn 30‰, 25oC, 5,0 - 10,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12 : 12 pH 7,0 MĐTB ban đầu: 0,2 x 106 tb/mL - Tần suất số lượng mẫu lấy: tần suất lấy mẫu lần/ngày, lượng mẫu lấy lần - mL/lần - Thời gian theo dõi thí nghiệm: thí nghiệm theo dõi 14 ngày, công thức lặp lại lần - Xác định sinh trưởng T pseudonana nghiên cứu thông qua mật độ tế bào (x 106 tb/mL), tốc độ sinh trưởng đặc trưng (µ/ngày), kích thước (µm), hình thái tế bào (quan sát kính hiển vi độ phóng đại 400 lần) màu sắc dịch nuôi cấy (quan sát cảm quan) 2.3.4 Xác định thông số sinh trưởng Thalassiosira pseudonana Sinh trưởng Thalassiosira pseudonana đánh giá thông qua số xác định số lượng tế bào buồng đếm Neubauer (Đức), lượng sinh khối khô (SKK, g/L) hàm lượng sắc tố chlorophyll a, b, carotenoit (μg/L) 2.3.5 Phân tích thành phần sinh hóa sinh khối Thalassiosira pseudonana 2.3.5.1 Phương pháp phân tích hàm lượng lipít tổng số Hàm lượng lipít tổng số phân tích theo phương pháp Bligh Dyer (1959) [117] có số cải tiến cho phù hợp với điều kiện Việt Nam [113] 2.3.5.2 Phương pháp phân tích thành phần hàm lượng axít béo bão hòa khơng bão hòa đa nối đơi Sinh khối Thalassiosira pseudonana phân tích thành phần hàm lượng SFAs PUFAs (EPA, DHA, DPA) sắc kí khí theo mơ tả Đặng Diễm Hồng cộng (2007) [16] thực Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên 2.3.5.3 Phương pháp phân tích thành phần dinh dưỡng kim loại nặng Sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana dùng để phân tích thành phần dinh dưỡng thu hoạch pha log đường cong sinh trưởng sử dụng để phân tích thành phần dinh dưỡng, hàm lượng protein tổng số xác định theo phương pháp Kjeldahl sau nhân với hệ số 6,25 2.3.6 Nghiên cứu ứng dụng Thalassiosira pseudonana sản xuất giống tôm thẻ chân trắng 2.3.6.1 Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp, độc tính bán trường diễn hành vi động vật thực nghiệm sử dụng sinh khối Thalassiosira pseudonana Chúng tiến hành thử độc tính cấp giá trị LD50 CNT, độc tính bán trường diễn CCT SKK Thalassiosira pseudonana xác định theo phương pháp Litchfield - Wincoxon [119] theo hướng dẫn Bộ Y tế Việt Nam [120], hướng dẫn Tổ chức Hợp tác Phát triển Kinh tế (OECD) [121] Tổ chức Y tế giới [122] thực Bộ môn Giải phẫu sinh lý bệnh Học viện Quân y 2.3.6.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng loại thức ăn đến tăng trưởng tỉ lệ sống ấu trùng tôm thẻ chân trắng * Các tiêu theo dõi: Tăng trưởng ấu trùng tôm thẻ chân trắng; thời gian biến thái Z1 - PL1 tỉ lệ sống từ N - PL6 * Bố trí thí nghiệm: Ảnh hưởng loại thức ăn đến tăng trưởng tỉ lệ sống ấu trùng tôm thẻ chân trắng ni bể composite 50 L: Thí nghiệm ảnh hưởng loại thức ăn khác lên nuôi ấu trùng TTCT bố trí với nghiệm thức: Khẩu phần (KP - công thức đối chứng) tảo khô Spirulina + thức ăn tổng hợp (TATH) + Artemia; Khẩu phần (KP - công thức đối chứng dương) tảo tươi Thalassiosira weissflogii + TATH + Artemia; Khẩu phần (KP 3): tảo tươi Thalassiosira pseudonana + TATH + Artemia Mật độ nuôi 150 N/L Trong đó, lơ đối chứng KP1, KP2, lơ thử nghiệm KP3 Lồi T weissflogii ni bể composite 3,5 m3 môi trường AGP 20%, 29 - 30‰, pH 7,5, 27oC, 10,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12:12 giờ, độ kiềm 150 - 180 mg CaCO3/L CĐSK 24/24 Thu hoạch sinh khối T weissflogii tươi sống làm thức ăn cho ấu trùng TTCT với tổng sinh khối T weissflogii tươi sống (khoảng 55 - 58 L cho bể composite 50 L) tổng sinh khối T pseudonana tươi sống (khoảng 55 - 58 L cho bể composite 50 L) MĐTB T weissflogii T pseudonana sử dụng cho thí nghiệm 0,025 - 0,03 x 106 tb/mL.TATH sử dụng nghiên cứu bao gồm thức ăn nhân tạo TNT 100, 200, 300, 400 có kích cỡ hạt khác Thử nghiệm ni ấu trùng tôm thẻ chân trắng bể xi măng thể tích 30 m3 thức ăn tảo tươi Thalassiosira pseudonana + TATH + Artemia (KP 3): Thí nghiệm bố trí với lơ sản xuất, lơ bể xi măng thể tích 30 m3, mật độ 150 N/L Các điều kiện khác giữ nguyên thí nghiệm Chúng sử dụng tổng sinh khối Thalassiosira pseudonana tươi sống khoảng 33 - 35 m3 cho bể xi măng thể tích 30 m3 MĐTB T pseudonana sử dụng thí nghiệm 0,025 - 0,03 x 106 tb/mL 2.3.6.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng mật độ tôm nuôi đến tăng trưởng tỉ lệ sống ấu trùng tôm thẻ chân trắng * Bố trí thí nghiệm: Ảnh hưởng mật độ tôm nuôi đến tăng trưởng tỉ lệ sống ấu trùng tôm thẻ chân trắng nuôi bể composite 50 L: Thí nghiệm ương ấu trùng tơm thẻ chân trắng bố trí bể composite 50 L với mật độ nuôi 125, 150, 175, 200, 225 250 N/L nuôi điều kiện: 30 - 31‰; 29 - 30oC; 180 - 200 mg CaCO3/L pH 7,9 - 8,2; thức ăn sử dụng tảo tươi Thalassiosira pseudonana + TATH + Artemia Chúng sử dụng tổng sinh khối T pseudonana tươi sống từ 55 - 58 L cho bể composite 50 L MĐTB T pseudonana sử dụng cho thí nghiệm 0,025 - 0,03 x 106 tb/mL Thử nghiệm ảnh hưởng mật độ tôm nuôi thích hợp đến tăng trưởng tỉ lệ sống ấu trùng tôm thẻ chân trắng bể xi măng 30 m3: Thí nghiệm ương ấu trùng tơm thẻ chân trắng nuôi bể xi măng 30 m3 với mật độ nuôi lựa chọn 125, 130, 155 175 N/L Tổng sinh khối Thalassiosira pseudonana tươi sống sử dụng từ 33 - 35 m3 cho bể xi măng thể tích 30 m3 MĐTB T pseudonana sử dụng thí nghiệm 0,025 - 0,03 x 106 tb/mL 2.3.6.4 Phương pháp thử nghiệm nuôi thương phẩm tôm thẻ chân trắng với nguồn giống sản xuất Thalassiosira pseudonana * Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo phương pháp ngẫu nhiên ao gồm công thức, công thức lặp lại lần Kích cỡ giống tơm thẻ chân trắng PL12 thả ni ao có diện tích 6.400 m2 Mật độ thả ban đầu: 86 con/m2 nuôi Công ty Cổ phần Chăn ni C.P Việt Nam Điều kiện thí nghiệm: ao lót bạt có diện tích mật độ thả, chế độ sục khí 24/24 giờ, chế độ thức ăn, chế độ chăm sóc quản lý Đối với ao thuộc lô thử nghiệm sử dụng nguồn giống PL12 sản xuất từ nguồn thức ăn tươi sống Thalassiosira pseudonana ao thuộc lô đối chứng sử dụng nguồn giống PL12 sản xuất từ nguồn thức ăn tươi sống Thalassiosira weissflogii Nguồn sinh khối T weissflogii tươi sống sử dụng để làm thức ăn cho ấu trùng TTCT nuôi bể composite 3,5 m3 môi trường AGP 20%, 29 - 30‰, pH 7,5, 27oC, 10,0 klux với chu kỳ quang sáng : tối 12:12 giờ, độ kiềm 150 - 180 mg CaCO3/L CĐSK 24/24 Thành phần dinh dưỡng sinh khối T weissflogii có hàm lượng PUFAs đạt (34,77 ± 0,08)% so với TFA, EPA đạt (13,17 ± 0,14)%; protein đạt (6,63 ± 0,25)% so với SKK, lipít đạt (10,75 ± 1,17)%, carbohydrate (7,86 ± 0,76)% 2.3.7 Xử lý số liệu nghiên cứu Các số liệu thu thập tính tốn giá trị trung bình, độ lệch chuẩn đồ thị biến thiên chúng vẽ phần mềm Microsoft Excel So sánh phương sai mẫu để đánh giá sai khác thống kê nghiệm thức mức (p0,05 Ghi chú: Lô chứng: uống dung dịch NaCl 0,9% tương ứng với liều 1,00 mL/kg trọng lượng thể/ngày; Lô trị 1: uống vi tảo liều 100 mg/kg trọng lượng thể/ngày (liều dự kiến có tác dụng); Lơ trị 2: uống vi tảo liều 300 mg/kg trọng lượng thể/ngày Mức liều lô trị gấp lần mức liều lô trị Bảng 3.8 Ảnh hưởng T pseudonana lên công thức bạch cầu máu chuột (n = 8, ± SD) Thời điểm xét nghiệm Trước thí nghiệm Sau 28 ngày P trước - sau Lô chứng Lô trị Lô trị Lympho (%) Trung tính Lympho (%) Trung tính Lympho (%) Trung tính (%) (%) (%) 42,41±9,98 38,34±7,81 50,55±9,88 36,24±10,26 42,06±11,46 34,54±10,55 48,91±2,77 40,64±12,24 42,39±12,37 43,08±11,85 47,84±13,95 37,24±5,57 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 Ghi chú: Lô chứng: uống dung dịch NaCl 0,9% tương ứng với liều 1,00 mL/kg trọng lượng thể/ngày; Lô trị 1: uống vi tảo liều 100 mg/kg trọng lượng thể/ngày (liều dự kiến có tác dụng); Lơ trị 2: uống vi tảo liều 300 mg/kg trọng lượng thể/ngày Mức liều lô trị gấp lần mức liều lô trị Như vậy, T pseudonana sử dụng với mức liều thời gian khác nghiên cứu không làm thay đổi tiêu chức tạo máu chuột c Đánh giá mức độ tổn thương tế bào gan chức gan chuột dùng Thalassiosira pseudonana dài ngày Kết nghiên cứu thể bảng 3.9 Bảng 3.9 Đánh giá mức độ tổn thương tế bào chức gan, thận chuột dùng T pseudonana dài ngày (n = 8, ± SD) Thời điểm xét nghiệm Trước thí nghiệm Sau 28 ngày P trước - sau Trước thí nghiệm Sau 28 ngày P trước - sau Trước thí nghiệm Sau 28 ngày Lơ chứng Lơ trị Hoạt độ AST máu chuột (UI/L) 148,13 ± 31,03 141,00 ± 33,16 142,75 ± 21,86 128,88 ± 8,34 >0,05 >0,05 Hoạt độ ALT máu chuột (UI/L) 101,25 ± 9,21 120,63 ± 9,29 106,38 ± 7,42 100,63 ± 9,87 >0,05 >0,05 Nồng độ Ure máu chuột (mg/dL) 7,69 ± 0,68 6,75 ± 1,05 6,09 ± 1,58 5,88 ± 0,67 16 Lô trị 146,25 ± 21,56 146,88 ± 16,73 >0,05 126,88 ± 22,00 107,13 ± 14,26 >0,05 5,00 ± 1,53 4,28 ± 0,79 P trước - sau Trước thí nghiệm Sau 28 ngày P trước - sau >0,05 >0,05 Nồng độ Creatinin máu chuột (mg/dL) 56,25 ± 3,15 55,13 ± 3,18 41,88 ± 5,38 39,75 ± 3,01 >0,05 >0,05 >0,05 54,50 ± 4,00 50,38 ± 25,09 >0,05 Ghi chú: Lô chứng: uống dung dịch NaCl 0,9% tương ứng với liều 1,00 mL/kg trọng lượng thể/ngày; Lô trị 1: uống vi tảo liều 100 mg/kg trọng lượng thể/ngày (liều dự kiến có tác dụng); Lô trị 2: uống vi tảo liều 300 mg/kg trọng lượng thể/ngày Mức liều lô trị gấp lần mức liều lô trị Từ kết khẳng định, T pseudonana với mức liều thời gian sử dụng nghiên cứu không làm thay đổi hoạt độ AST ALT máu chuột nghiên cứu Do đó, T pseudonana khơng gây tổn thương tế bào gan không làm ảnh hưởng đến chức gan chuột nghiên cứu d Đánh giá ảnh hưởng lên chức thận chuột dùng Thalassiosira pseudonana dài ngày Kết trình bày bảng 3.9 Như vậy, T pseudonana với mức liều thời gian sử dụng nghiên cứu (28 ngày) không làm thay đổi nồng độ ure creatinin máu chuột cho thấy chúng không ảnh hưởng lên chức thận chuột e Giải phẫu mô bệnh học gan, thận chuột dùng Thalassiosira pseudonana dài ngày Kết nghiên cứu mô bệnh học gan, thận chuột cho thấy T pseudonana (liều 100 300 mg/kg trọng lượng thể/ngày) dùng đường uống liên tục 28 ngày, không gây tổn thương gan chuột Cấu trúc bè gan bình thường, khơng thấy hình ảnh hoại tử, thối hóa tế bào gan Cấu trúc tế bào ống thận vùng chức khác thận bình thường Như vậy, kết luận T pseudonana an tồn cho tơm thẻ chân trắng chúng sử dụng làm thức ăn tươi sống 3.3.1.3 Hành vi chuột thực nghiệm sau sử dụng sinh khối Thalassiosira pseudonana Các kết nghiên cứu vận động, khả nhận thức trí nhớ chuột sử dụng sinh khối T pseudonana (tương ứng liều 100, 150 mg/kg trọng lượng thể/ngày) không ảnh hưởng đến chức vận động lại tăng khả khám phá giúp tăng cường trí nhớ chuột sau tuần 3.3.2 Sử dụng Thalassiosira pseudonana sản xuất giống tôm thẻ chân trắng 3.3.2.1 Ảnh hưởng loại thức ăn đến sinh trưởng tỉ lệ sống ấu trùng tôm thẻ chân trắng a Ảnh hưởng loại thức ăn đến tăng trưởng tỉ lệ sống ấu trùng tôm thẻ chân trắng ni bể composite 50 lít Hình 3.50 Hình ảnh ni cấy T pseudonana quy mơ phòng thí nghiệm đến pilot, ứng dụng sản xuất giống nuôi thương phẩm tôm thẻ chân trắng (A): đĩa thạch, (B): Ảnh tế bào kính hiển vi quang học ni đĩa, (C): ống nghiệm, (D): bình thủy tinh 0,25 L, (E): bình thủy tinh L, (F): bình thủy tinh L, (G): bể composite 0,2 m3, (H, I): bể composite m3, (K, L, M, N, O): bể composite 3,5 m3, (P, Q): ương nuôi ấu trùng tôm thẻ chân trắng bể xi măng 30 m3, (R, S): nuôi thương phẩm tôm thẻ chân trắng ao có diện tích 6.400 m2 17 Chúng tơi bố trí thí nghiệm nhiều đợt ni khác điều kiện ni có độ mặn 30 - 31‰, 29 - 30oC, 180 - 200 mg CaCO3/L pH 7,9 - 8,2 Mật độ tôm nuôi 150 con/L Các kết thu sinh trưởng, tỉ lệ sống thời gian biến thái ấu trùng tôm thẻ chân trắng thể bảng 3.10 bảng 3.11 Bảng 3.10 Ảnh hưởng số phần thức ăn lên sinh trưởng ấu trùng tôm thẻ chân trắng (số liệu trình bày giá trị trung bình ± SE) NT Chiều dài tồn thân (mm) Z1 Z2 Z3 M1 M3 PL1 PL4 PL8 PL12 KP 1,175  0,003a 1,296  0,003a 1,891  0,005a 2,255  0,004a 3,078  0,001a 4,494  0,002a 5,824  0,003a 7,569  0,003a 8,069  0,001a KP 1,239  0,006b 1,420  0,004b 2,107  0,009b 2,565  0,008b 3,466  0,003b 4,935  0,003b 6,284  0,008b 7,957  0,005b 9,139  0,004b KP 1,285  0,002c 1,648  0,002c 2,637  0,001c 3,184  0,001c 5,348  0,001c 6,704  0,002c 9,778  0,006c 3,587  0,004c 8,463  0,004c Ghi chú: n=30 cá thể cho nhóm; chữ cột khác thể sai khác có ý nghĩa thống kê sinh học (p