Nhóm 1 SP khảo sát nồng độ đường sucrose

khảo sát nồng độ đường sucrose , nồng độ 200gl , 300gl, 100g l, 20gl Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng sucrose lên động học sinh trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae được thực hiện ở phòng thí nghiệm vi sinh – Trường Đại học Sư Phạm Kĩ Thuật Thành phố Hồ Chí Minh, được đánh giá dựa vào các thông số động học của sinh trưởng của nấm men: tốc độ sinh trưởng, hàm lượng đường tổng, tỉ lệ tế bào nấm men sống chết theo thời gian...Trong nghiên cứu này, chủng nấm men được thực hiện theo kĩ thuật nuôi cấy mẻ trong môi trường dịch chiết cà chua bổ sung peptone 1 gl với các hàm lượng sucrose 20 gl, 100 gl , 200 gl, 300 gl. Thí nghiệm nuôi cấy trên bình lắc, có tốc độ sinh trưởng cao nhất khi được nuôi cấy trong môi trường có hàm lượng sucrose 200 gl, nhiệt độ 30 oC, pH 5.0, chế độ lắc 240 rpm, tỉ lệ giống cấy 5%, nguồn carbon là sucrose, nguồn nitơ là peptone, thời gian nuôi cấy 11 giờ và số lượng tế bào trong pha log là 57,71.106 tế bào, tốc độ sinh trưởng là 0,2722 h1. Việc nghiên cứu môi trường tối ưu cho nấm men sinh trưởng, phát triển giúp thu lượng sinh khối lớn với hiệu suất cao mang lại hiệu quả kinh tế.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP HCM  KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC VÀ THỰC PHẨM ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ĐƯỜNG SUCROSE ĐẾN ĐỘNG HỌC SINH TRƯỞNG CỦA SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRONG Q TRÌNH NI CẤY MẺ GVHD: Ts Trịnh Khánh Sơn Nhóm 1_Lớp 169160 SVTH: Trần Thị Như Hảo 16116126 Hà Thị Trinh 16116187 Trương Thị Thu 16116176 Trần Thị Sao Mai 16116148 Nguyễn Thị Yến 16116200 Hồng Ngọc Thương 16116179 Tp Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2019 Nghiên cứu thực chủng nấm men thương mại Sachharomyces cerevisiae (instant dry yeast, sản xuất công ty AB Mauri Vietnam Limited) Mơi trường hoạt hóa nhân giống: Nấm men (0.1 g) hoạt hóa nhân giống 100 ml môi trường M1 vô trùng máy lắc 30 oC 24 với tốc độ 240 rpm Môi trường M1 chuẩn bị bao gồm thành phần sau đây: 100g cà chua, sucrose 200 g/l, pepton g/l, thêm 1000 ml nước cất, đun sôi 30 phút, sau thu nhận phần dịch trong, định lượng đủ 1000ml Môi trường điều chỉnh độ pH dung dịch NaOH 0.1N, phân phối vào bình ni cấy tiệt trùng (121 oC, 15 phút) Điều kiện sinh trưởng: Sau trình nhân giống, nấm men (10 ml) bổ sung vào 190 ml môi trường M1 thay đổi điều kiện sucrose với mức 20 g/l, 100 g/l, 200 g/l, 300 g/l tiệt trùng (121 oC, 15 phút) để khảo sát ảnh hưởng nồng độ sucrose đến động học sinh trưởng nấm men trình trình ni cấy mẻ suốt 12 Q trình ni cấy mẻ tiến hành nhiệt độ phòng (30oC) máy lắc 240 rpm Phương pháp A Khảo sát thông số động học sinh trưởng nấm men môi trường nuôi cấy mẻ ảnh hưởng nồng độ đường sucrose khác Nghiên cứu sử dụng buồng đếm hồng cầu (hemocytometer) để định lượng nấm men với độ phóng đại x100 đến x400 Huyền phù nấm men nhuộm với dung dịch methylen blue để phân biệt tế bào nấm men sống chết Khi đếm số lượng ta đưa dịch pha loãng vào phòng đếm, đậy kính lên trên, sau tiến hành đếm số lượng kính hiển vi Trong suốt q trình ni cấy, thứ 0, kiểm tra ghi nhận thông số: (a) mật độ tế bào/ml, (b) tỉ lệ tế bào sống, (c) tỉ lệ tế bào nảy chồi Các thơng số động học tính tốn đưa kết luận Phương pháp đếm trực tiếp buồng đếm hồng cầu đưa số liệu nhanh chóng, giúp quan sát hình thái tế bào Tuy nhiên, phương pháp không xác định với mẫu có số lượng vi khuẩn q nhỏ, độ xác khơng cao khơng phân biệt tế bào sống tế bào chết Phương pháp phân tích phương sai yếu tố one - way ANOVA phần mềm SPSS sử dụng để phân tích liệu thu thập q trình làm thí nghiệm B Phương pháp định lượng đường tổng số (hoặc % sucrose) Song song với trình khảo sát động học sinh trưởng nấm men, lấy lượng nhỏ huyền phù dung dịch bình ni cấy, đun cách thủy vòng 10 phút ly tâm với tốc độ 3000 vòng/ phút vòng 10 phút Lượng đường tổng số đo Brix kế thông số ghi lại để mô tả, so sánh, giải thích biện luận 3.Kết Kết A Động học sinh trưởng Saccharomyces cerevisiae nồng độ đường khác Khi thực đo mẫu giống nuôi cấy nồng độ đường 200g/l sau 24 tất lần làm thí nghiệm ta thu tổng số lượng tế bào, phần trăm tế bào sống, phần trăm tế bào chết, phần trăm tế bào nảy chồi % độ brix Dùng kết đem kiểm định thống kê với yếu tố, kết khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê bốn mẫu đo Điều giúp khẳng định lại điều kiện nhân giống kết giống dùng để cấy vào môi trường thực thí nghiệm khơng có sai khác Tương tự, giống cho vào môi trường thí nghiệm ni cấy chuẩn bị sẵn bốn nồng độ đường khác nhau, thứ ta thực ghi nhận kết tổng số tế bào sống, phần trăm tế bào chết phần trăm tế bào nảy chồi, lấy kết đem kiểm nghiệm thống kê, kết khơng có khác biệt có ý nghĩa thời điểm Hai lần đo khẳng định rõ ràng thiết kế thí nghiệm định hướng Bảng Kết so sánh thông số động học giống thứ 24 (với độ tin cậy 95%) 300g/l 200g/l 100g/l 20g/l Tế bào Sống (%) 86.190.21a 86.290.26a 86.400.19a 86.350.19a Tế bào Chết (%) 13.810.21b 13.710.26b 13.600.30b 13.490.19b Tế bào nảy chồi (%) 4.610.58c 3.90.29c 4.000.28c 4.280.47c Độ brix (%) 15.070.96d 14.950.58d 15.050.13d 15.080.13d 18.5 18.0 17.5 f(x) = - 0x^3 + 0.02x^2 + 0.25x + 15.41 f(x)= ==0.9 - 0.01x^3 + 0.13x^2 - 0.13x + 15.53 f(x) 0x^3 - 0.04x^2 + 0.49x + 15.51 R² R² R² == 0.85 0.93 f(x) = - 0x^3 + 0.03x^2 + 0.2x + 15.32 R² = 0.89 N*10^6/ML 17.0 16.5 200g/l Polynomial ( 200g/l) 16.0 15.5 15.0 14.5 14.0 13.5 10 12 t (h) Đường cong sinh trưởng nấm men nồng độ đường khác thể Hình Ở điều kiện nồng độ sucrose 20 g/l , 200 g/l, 300g/l, sinh trưởng nấm men không trải qua pha lag Với điều kiện đường 20 g/l, tốc độ sinh trưởng nấm men thấp so với nồng độ lại Pha log điều kiện có chiều dài trung bình, độ dốc thấp, nấm men có khả sinh trưởng yếu Ở nồng độ sucrose 100 g/l nấm men thể rõ ràng bốn giai đoạn trình sinh trưởng Độ dốc pha log cao, thời gian diễn ngắn Khi sinh trưởng điều kiện nồng độ sucrose môi trường 200g/l, ta thấy nấm men có thời gian diễn pha log dài nhất, độ dốc cao, mật độ tế bào sinh cao Đối với đường cong sinh trưởng nấm men điều kiện 300g/l, pha log diễn dài, độ dốc thấp hơn, pha giảm tốc pha log pha ổn định dài, thời gian bước vào pha ổn định muộn Hình Đường cong sinh trưởng S cerevisiae nồng độ đường khác 60 f(x) = 5.13 exp( 0.27 x ) R² = 0.86 50 Cell/ml*10^6 40 f(x) = 6.81f(x) exp(= 4.41 0.26 exp( x ) 0.28 x ) R² = 0.91 R² = 0.85 30 f(x) = 4.48 exp( 0.25 x ) R² = 0.85 20 200g/l Exponential (200g/l) 10 0 10 t (h) Hình Đường cong sinh trưởng pha log S cerevisiae nồng độ đường khác Hình thể sinh trưởng nấm men kì tăng trưởng Có thể thấy nấm men nồng độ đường 200 g/l có tốc độ tăng trưởng cao thời gian dài Trong đó, nồng độ đường 20 g/l, pha tăng trưởng nấm men bị rút ngắn tốc độ tăng trưởng Thời gian đạt mật độ tế bào cực đại pha log mẫu đường có nhanh chậm khác cụ thể mẫu đường 300g/l-7h, 200g/l-9h, 100g/l-8h, 20g/l-7h Sự kiểm định thống kê cho kết mật độ tế bào cực đại nuôi cấy nồng độ đường khác có khác biệt mang ý nghĩa thống kê cụ thể nồng độ hồn tồn sử dụng sai khác để đánh giá phần sau báo 35.00 30.00 200g/l Logarithmic (200g/l) 25.00 f(x) f(x) = - 0.05x^3 + 0.5x^2 + 3.09 = 6.92 ln(x) + 4.82++1.36x f(x) ==0.9 0.04x^3 +- 0.04x^2 0.44x^2 0.83x+ +3.52 6.89 R² f(x)=R² 0.02x^3 + 3.8x = 0.81 R² = 0.78 R² = 0.73 f(x) = - 0.05x^3 + 0.28x^2 + 2.5x + 1.95 R² = 0.7 % 20.00 15.00 10.00 5.00 0.00 10 12 t (h) Hình Biểu đồ thể tỉ lệ nảy chồi S cerevisiae nồng độ đường khác Dựa Hình ta nhận thấy giai đoạn đầu, tất nồng độ đường có gia tăng tỉ lệ tế bào nảy chồi Lượng tỉ lệ tế bào nảy chồi đạt cực đại giai đoạn gần cuối pha log có chiều hướng suy giảm pha ổn định Trong pha tăng trưởng, tỉ lệ tế bào nảy chồi cực đại nồng độ đường sucrose 20 g/l thấp thời gian đạt tỷ lệ ngắn Ở nồng độ 100g/l, tỉ lệ tế bào nảy chồi đạt cực đại thời gian ngắn Trong đó, nồng độ đường 200 g/l 300 g/l, tỉ lệ nảy chồi cực đại lớn thời gian trì sinh tế bào kéo dài so với nồng độ đường 20 g/l 100 g/l Ở nồng độ 300 g/l, tỉ lệ nảy chồi thời gian đầu cao tốc độ tăng tế bào lại thấp so với trường hợp nấm men 200 g/l Dựa Hình ta thấy, tỉ lệ tế bào nấm men chết nuôi cấy điều kiện 300 g/l cao trì suốt q trình lên men, có xu hướng tăng từ cuối pha log Ở nồng độ đường 200 g/l 20 g/l, số lượng tế bào chết giảm cách nhanh chóng tăng lên thứ giai đoạn chuyển từ pha log sang pha ổn đinh Bên cạnh đó, nồng độ đường 100 g/l, tỉ lệ tế bào chết lại trì mức cao, có sườn thoải thời gian pha lag tỉ lệ giảm giảm mạnh sinh trưởng bước vào pha log, nồng độ đường khác tỉ lệ chết có dấu hiệu tăng lên cuối pha log (giờ thứ 7) 20 18 16 % f(x) = 0.03x^3 - 0.24x^2 - 1.55x + 16.52 R² = =0.8 - 0.01x^3 + 0.42x^2 - 4.46x + 15.37 14 f(x) f(x) 0.02x^3 R² = ==0.75 f(x) 0.01x^3 ++ 0.65x^2 0.37x^2 5.4x 2.52x+ +14.63 14.25 R² == 0.89 R² 0.82 12 200g/l Polynomial (200g/l) 10 0 10 12 t(h) Hình Biểu đồ thể tỉ lệ tế bào chết S cerevisiae nồng độ đường khác Bảng 2: Các thông số động học S cerevisiae nồng độ đường khác (với độ tin cậy 95%) 300g/l 200g/l 100g/l 20g/l N0 (Cell/ml) 6.90 x106 4.98 x106 4.68 x106 4.94 x106 NT (Cell/ml) 42.32 x106 57.71 x106 34.10 x106 25.75 x106 Td (h/lần) 2.68a 2.55b 2.44c 2.94d µ (h-1) 0.2591a 0.2722b 0.2693c 0.2359d YN/s (cell/(ml.g)) 4.84 x 106 a 7.47 x106 b 8.11 x106 c 22.33 x106 d rN (cell/(ml.h)) 9.18 x 106 a 14.35 x 106 b 10.44 x 106 c 4.9 x 106 d rs (g/h) 2.10a 1.54b 1.01c 0.25d Y’N/S (cell/(ml.g)) 4.37 x 106 a 9.92 x 106 b 10.34 x 106 c 19.6 x 106 d Trong đó: N0: Mật độ tế bào thời điểm ban đầu pha log Nt: Mật độ tế bào thời điểm cuối pha log Td: Thời gian hệ µ: Tốc độ sinh trưởng tế bào YN/S: Hiệu suất lý thuyết tạo thành tế bào dựa lượng chất rN: Tốc độ hình thành tế bào theo thời gian rs: Tốc độ tiêu hao chất theo thời gian Y’N/S: Hiệu suất tạo thành sản phẩm đơn vị chất Bảng trình bày số liệu tính tốn pha log saccharomyces cerevisiae bốn nồng độ đường khác Theo tốc độ sinh trưởng nồng độ đường 200g/l cao ứng với độ dốc lớn kéo dài đồ thị pha log, thấp nồng độ đường 20g/l ứng với đồ thị pha log có độ dốc thấp ngắn Hiệu suất tạo thành tế bào tính theo chất có khác biệt hiệu suất cao tạo nồng độ đường giới hạn (20g/l) thấp nồng độ 300g/l Tốc độ tạo thành sản phẩm cao nồng độ đường 300 giảm dần theo chiều giảm nồng độ đường, tốc độ tạo thành tế bào cao nồng độ đường 200g/l ứng với pha log dài sườn dốc, thấp nồng độ đường 20g/l ứng với pha log ngắn sườn thoải Bên cạnh hiệu suất tạo thành sản phẩm tính theo tế bào lớn nồng độ đường 300g/l có xu hướng giảm dần theo chiều giảm nồng độ đường Với kết giúp nghiên cứu đưa kết luận nồng độ đường thích hợp tùy vào mục đích mong muốn B Xác định lượng đường tổng nấm men sử dụng trình lên men 35 30 25 200g/l Polynomial ( 200g/l) 100g/l f(x) = 0.09x^2 - 1.65x + 29.47 R² = 0.98 % 20 15 10 f(x) = 0.06x^2 - 1.32x + 18.46 R² = 0.91 f(x) = 0.01x^2 - 0.56x + 10.55 R² = 0.98 f(x) = - 0.02x^2 - 0.02x + 3.07 R² = 0.96 10 12 t (h) Hình 5: Biểu đồ thể lượng đường tổng số q trình ni cấy mẻ S cerevisiae nồng độ đường khác Lượng đường sử dụng nấm men suốt trình lên men thể Hình Trong điều kiện ni cấy mơi trường có nồng độ 300g/l, lượng đường mà nấm men sử dụng có xu hướng giảm nhanh rõ rệt nồng độ đường cao sau trình nghiên cứu kết thúc Ở nồng độ đường môi trường 100 g/l giảm nhanh nhiều giai đoạn diễn pha log trình sinh trưởng Trong mơi trường có nồng độ đường 200 g/l, lượng đường mà nấm men sử dụng có xu hướng giảm tương đối sau nghiên cứu kết thúc Mơi trường có nồng độ đường 20 g/l giảm chậm nhất, có chênh lệch suốt q trình nghiên cứu 7 Hình , Hình , Hình Hình thể mối quan hệ nồng độ chất làm ảnh hưởng tới lượng tế bào sinh ra, số lượng tế bào chết tăng trưởng tế bào nấm men Trong giai đoạn pha log, tỉ lệ tế bào sinh lớn nhiều so với tỉ lệ tế bào chết đi, đường cong sinh trưởng có xu hướng tăng Khi tỉ lệ tế bào sinh lượng tế bào đi, sinh trưởng nấm men bước vào pha ổn định Đồng thời, hàm lượng đường giảm theo thời gian với sinh trưởng nấm men, nồng độ đường khác lượng nấm men thu được, thời gian diễn pha log hàm lượng đường giảm theo tỷ lệ khác Mỗi nồng độ đường có đặc điểm khác nhau, tùy mục đích q trình lên men mà chọn nồng độ cho phù hợp Nếu muốn trình diễn nhanh chọn đường 100g/l, tương tự muốn trình diễn nhanh dài chọn đường 200g/l phù hợp 4.Giải thích bàn luận Đường cong sinh trưởng tiêu thụ đường có mối tương quan với số lượng chất lượng nấm men, bị ảnh hưởng yếu tố: chất nồng độ đường, nồng độ oxy, thành phần độ pH môi trường (W Praphailong, 1997) Phân tích liệu thu từ thí nghiệm ta thấy Saccharomyces cerecisiae lên men tất dung dịch nuôi cấy với nồng độ đường sucrose ban đầu khác sử dụng thí nghiệm Giới hạn nồng độ đường ảnh hưởng lên sinh trưởng nấm men chứng minh nồng độ >50% wt/v sucrose (a w>0.92) điều kiện thí nghiệm tương đương (W Praphailong, 1997) Trong thí nghiệm nồng độ đường thay đổi 20 g/l, 100 g/l, 200 g/l 300 g/l (tương đương với 2%, 10%, 20% 30% wt/v) nên không xảy ức chế nồng độ đường lên sinh trưởng nấm men từ thời điểm đầu ni cấy Khơng xác định có ức chế xảy khoảng thời gian nuôi cấy 11 tiếng môi trường Dựa vào kết thu được, ta nhận thấy nồng độ chất ban đầu có ảnh hưởng tới tốc độ sinh trưởng, tỷ lệ tế bào nảy chồi tỷ lệ tế bào chết chủng S.cerevisiae nuôi cấy môi trường dịch chiết cà chua Cùng với đó, nồng độ đường môi trường nuôi cấy giảm theo thời gian Kết phù hợp với nghiên cứu Attilio Converti cộng (1984) nghiên cứu động học sinh trưởng Saccharomyces cerevisiae nồng độ đường khác Đối với môi trường nồng độ đường 200 g/l, tốc độ tăng trưởng tương đối cao số lượng tế bào thu cuối pha log nhiều, tốc độ tạo thành tế bào theo thời gian lớn điều kiện nuôi cấy, điều cho thấy nồng độ đường 200 g/l thích hợp cho ni cấy thu sinh khối tế bào thí nghiệm So sánh kết tốc độ sinh trưởng tổng tế bào nấm men trình ni cấy ta có nồng độ đường 200 g/l tối ưu so với 300 g/l theo nghiên cứu Cecilia Laluce Attilio Converti nồng độ đường 200 g/l tối ưu điều kiện thí nghiệm tương đương, kết thí nghiệm giống với thí nghiệm nghiên cứu “Ảnh hưởng nhiệt độ, pH nồng độ đường lên tốc độ sinh trưởng sinh khối tế bào nấm men rượu” Charoen Charoenchai cộng thực (1998) Đường cong phần trăm chồi sinh tỷ lệ với đường cong tốc độ sinh trưởng Đặc biệt giai đoạn pha log, lượng chồi sinh nhiều, tế bào nhanh chóng phân chia tạo nhiều tế bào sống Nồng độ đường sẵn có mơi trường lên men cần thiết, ví dụ nồng độ đường cao sản xuất công nghiệp tăng hàm lượng ethanol cần thu vào lên men kết thúc Tuy nhiên, nồng độ đường cao làm tế bào nấm men chịu phải áp suất thẩm thấu, làm ảnh hưởng tới hiệu suất lên men (Ishmayana, 2011) Đối với loại nấm men này, sucrose vận chuyển vào tế bào thông qua hai cách thủy phân bên tế bào sản phẩm thủy phân vận chuyển vào tế bào, theo cách vận chuyển trực tiếp tế bào hồn tồn thích nghi điều kiện thích hợp (Mwesigye, 1996) Từ hình nhận thấy rằng, nồng độ chất nồng độ khác giảm dần, điểm đường đầu cuối có chênh lệch không lớn chứng tỏ kết thúc lên men nồng độ đường mức cao, chưa nấm men sử dụng hết Ở nồng độ đường thí nghiệm khơng có nồng độ ngưỡng gây ức chế (W Praphailong, 1997) Ngồi ra, q trình lên men sử dụng tỉ lệ nấm men cao so với báo cáo Attilio Converti cộng nên thời gian đưa vào pha ổn định nhanh lượng chất chưa nấm men sử dụng triệt để, xác định nồng độ đường giảm theo tăng mật độ tế bào nấm men Bài thực nghiệm sử dụng khúc xạ kế để xác định nồng độ đường khơng mang lại độ xác cao nên ảnh hưởng phần tới kết đo nên thay phương pháp khác phenol- sulfuric , 5.Kết luận Qua kết nghiên cứu thực nghiệm thấy nồng độ sucrose có ảnh hưởng lớn tới động học sinh trưởng chủng Saccharomyces cerevisiae Nồng độ sucrose khác trình sinh trưởng pha diễn khác nhau, chúng có đặc điểm định ví dụ nồng độ 100g/l độ dốc pha log cao, nồng độ 200g/l pha log kéo dài,… Vì thế, tùy mục đích mong muốn để chọn lựa nồng độ phù hợp để trình lên men đạt kết tốt Tài liệu tham khảo A.S Batista et al (2004) Sucrose fermentation by Saccharomyces cerevisiae lacking hexose transport Journal of molecular microbiology and biotechnology, 8(1), 26-33.a Atiyeh, H., & Duvnjak, Z (2001) Study of the production of fructose and ethanol from sucrose media by Saccharomyces cerevisiae In:Applied microbiology and biotechnology, 57(3), 407-411 Attilio Converti et al (1984) A Kinetic Study of Saccharomyces Strains: Performance at High Sugar Concentrations Badotti et al (2008) Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae Microbial Cell Factories Cecilia Laluce et al (2009) Optimization of temperature, sugar concentration, and inoculum size to maximize ethanol production without significant decrease in yeast cell viability Biotechnological Products And Process Engineering Appl Microbial Biotech Charoen Charoenchai et al (1998) Effects of Temperature, pH, and Sugar Concentration on the Growth Rates and Cell Biomass of Wine Yeasts 9 L Camacho Ruiz et al (2003) Factors affecting the growth of Saccharomyces cerevisiae in batch culture and in solid sate fermentation In: Electron J Environ Agric Food Chem, 2(5), 531-542 P K Mwesigye and J P Barford (1996) Mechanism of sucrose utilisation by Saccharomyces cerevisiae In: The Journal of General and Applied Microbiology, 42(4), 297-306 S G Solomon et al (2017) Performance of Clarias gariepinus fed Dried Brewer’s yeast (Saccharomyces cerevisiae) slurry in replacement for soybean meal J Nutr Metab 1-8 S Ishmayana et al (2011, November) Fermentation performance of the yeast Saccharomyces cerevisiae in media with high sugar concentration In: Proceedings of the 2nd International Seminar on Chemistry: Chemestry for a Bette W L Marques et al (2016) Sucrose and Saccharomyces cerevisiae: a relationship most sweet FEMS Yeast research, 16(1) W Praphailong and Fleet, G H (1997) The effect of pH, sodium chloride, sucrose, sorbate and benzoate on the growth of food spoilage yeasts Food Microbiology 14, 459–468