Nghiên cứu đặc điểm sinh học và kỹ thuật nhân giống phục vụ bảo tồn hai loài lan nghệ tâm (dendrobium loddigesii rolfe), hạc vỹ (dendrobium aphyllum (roxb ) fisher) của việt nam

Bảng 3.22 Ảnh hưởng của nồng độ ABA đến thời gian bảo quản của hạt nhân tạo lanHạc vỹ...94 Bảng 3.23 Ảnh hưởng của natri benzoat, topsin - M và carbendazim đến khả năng sống sót của hạt

NGUYỄN THỊ LÀI

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG PHỤC VỤ BẢO TỒN HAI LOÀI LAN NGHỆ TÂM

(Dendrobium loddigesii Rolfe), HẠC VỸ (Dendrobium aphyllum

(Roxb.) Fisher) CỦA VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI - 2019

Fisher) CỦA VIỆT NAM

Chuyên ngành: Khoa học cây trồng

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:

1 GS.TS Vũ Mạnh Hải

2 TS Phạm Hương Sơn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoahọc của GS TS Vũ Mạnh Hải và TS Phạm Hương Sơn, sự giúp đỡ của lãnh đạo,cán bộ nghiên cứu thuộc Trung tâm Sinh học Thực nghiệm - Viện Ứng dụng Côngnghệ - Bộ Khoa học và Công nghệ; Trung tâm Tài nguyên thực vật Các thông tintrích dẫn sử dụng trong luận án đều được ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Lài

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy,

cô giáo, các tập thể, cá nhân cùng bạn bè đồng nghiệp

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS TS Vũ Mạnh Hải và TS PhạmHương Sơn đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

và hoàn thiện luận án

Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban lãnh đạo, các cán bộnghiên cứu Trung tâm Sinh học Thực nghiệm - Viện Ứng dụng Công nghệ, Trungtâm Tài nguyên thực vật, Ban Đào tạo sau đại học, Viện Khoa học Nông nghiệpViệt Nam đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành công trìnhnghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên khích lệ,giúp đỡ về vật chất và tinh thần để tôi hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Lài

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Nguồn gốc và phân bố của hai loài lan Nghệ tâm ( D loddigesii ) và Hạc vỹ ( D.

aphyllum ) của Việt Nam 4

1.2 Một số đặc điểm thực vật học chính của hai loài lan Nghệ tâm ( D loddigesii ) và Hạc vỹ ( D aphyllum ) .4

1.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của chi lan Hoàng thảo ( Dendrobium ) .5

1.4 Giá trị sử dụng và thực trạng khai thác hai loài lan Nghệ tâm ( D loddigesii) và

Hạc vỹ ( D aphyllum ) ở Việt Nam 6

1.5 Tình hình sản xuất và tiêu thụ lan Hoàng thảo ( Dendrobium ) trên thế giới và ở Việt Nam 7

1.5.1 Sản xuất và tiêu thụ lan Hoàng thảo ( Dendrobium ) trên thế giới 7

1.5.2 Sản xuất và tiêu thụ hoa lan Hoàng thảo ( Dendrobium ) ở Việt Nam 8

1.6 Cơ sở khoa học về nhân giống và tạo hạt giống nhân tạo 9

1.6.1 Bảo tồn hoa lan 9

1.6.2 Các kỹ thuật về nhân giống và tạo hạt giống nhân tạo hoa lan 10

1.7 Nghiên cứu thực vật học và nhân giống lan Hoàng thảo ( Dendrobium ) trên thế giới và ở Việt Nam 20

1.7.1 Nghiên cứu thực vật học và nhân giống lan Hoàng thảo ( Dendrobium ) trên thế giới 20

1.7.2 Nghiên cứu thực vật học và nhân giống lan Hoàng thảo ( Dendrobium ) ở

Việt Nam 33

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 39

NGHIÊN CỨU 39

2.1 Vật liệu nghiên cứu 39

2.2 Nội dung nghiên cứu 41

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai loài lan Nghệ tâm ( D loddigesii) và

Hạc vỹ ( D aphyllum ) .41

2.2.2 Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro , kỹ thuật tạo hạt nhân tạo và nhân giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản lan Nghệ tâm ( D loddigesii) và Hạc vỹ ( D aphyllum ) phục vụ cho công tác bảo tồn 41

2.2.3 Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc cây con lan Nghệ tâm ( D loddigesii ) và Hạc vỹ ( D aphyllum ) in vitro giai đoạn vườn ươm 42

2.2.4 Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc lan Nghệ tâm ( D loddigesii ) và Hạc vỹ ( D.

aphyllum ) giai đoạn vườn sản xuất 42

2.3 Phương pháp nghiên cứu 43

2.4 Các chỉ tiêu theo dõi 52

2.5 Điều kiện thí nghiệm 53

2.6 Phương pháp xử lý số liệu 54

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 55

3.1 Đặc điểm sinh học của lan Nghệ tâm ( D loddigesii ) và Hạc vỹ ( D.

aphyllum ) 55

3.1.1 Đặc điểm hình thái học của lan Nghệ tâm và Hạc vỹ 55

3.1.2 Cấu tạo vi phẫu của hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ 59

3.1.3 Một số thành phần hóa sinh cơ bản của lan Nghệ tâm ( D loddigesii ) và Hạc vỹ ( D aphyllum ) .67

3.2 Nghiên cứu biện pháp kỹ thuật nhân giống in vitro , tạo hạt giống nhân tạo và nhân giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản hai loài lan Nghệ tâm ( D.

loddigesii ) và Hạc vỹ ( D aphyllum ) 69

3.2.1 Xác định chất khử trùng và thời gian khử trùng của mẫu nuôi cấy 69

3.2.2 Nghiên cứu tạo vật liệu protocorm like bodies (PLBs) từ lát mỏng tế bào nằm ngang (tTCL) 71

3.2.3 Tái sinh chồi từ protocorm like bodies (PLBs) 74

3.2.4 Nghiên cứu tạo cây in vitro hoàn chỉnh 79

3.2.5 Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo 84

3.2.6 Nghiên cứu kỹ thuật bảo quản hạt nhân tạo 90

3.2.7 Nghiên cứu khả năng nhân giống in vitro của hạt nhân tạo sau bảo quản 99 3.2.8 Nghiên cứu tạo cây in vitro hoàn chỉnh từ hạt hạt nhân tạo sau bảo quản 103

3.3 Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc cây con lan Nghệ tâm ( D loddigesii ) và Hạc vỹ ( D aphyllum ) in vitro giai đoạn vườn ươm 108

3.3.1 So sánh sinh trưởng của cây nhân giống in vitro truyền thống và cây nhângiống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản 1093.3.2 Nghiên cứu xác định thời vụ ra ngôi cây con in vitro giai đoạn vườnươm 1113.3.3 Nghiên cứu xác định giá thể cho cây con in vitro ở giai đoạn vườn

ươm 112

3.3.4 Nghiên cứu bổ sung chế phẩm dinh dưỡng cho cây con in vitro ở giai đoạn

vườn ươm 1153.4 Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc cây lan Nghệ tâm ( D loddigesii ) và Hạc vỹ

( D.

aphyllum ) giai đoạn vườn sản suất 118

3.4.1 Nghiên cứu xác định giá thể cho cây ở giai đoạn vườn sản xuất 118

3.4.2 Nghiên cứu chế độ dinh dưỡng cho cây lan ở giai đoạn vườn sản suất 120

3.4.3 Nghiên cứu bổ sung Superthrive cho cây lan ở giai đoạn vườn sảnxuất 122

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 128 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 130 TÀI LIỆU THAM KHẢO 131 PHỤ LỤC 148

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ABA Abscisic Acid

ADN Axit DeoxyriboNucleic

BA 6-Benzylaminopurine

CITES Convention on International Trade in Endangered Species

CV (%) Hệ số biến động (Coeffient of Variants)

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetate

FDA Fluorescein Diacetate

HV Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher)

IBA Indole Butyric Acid

IUCN International Union for Conservation of Nature

2iP 2-isopentyl Adenine

αNAANAA αNAA-Naphthalene Acetic Acid

Kin Kinetin (6-furfuryl-aminopurine)

KC Knudson C (1946)

LSD Least significiant difference (Sai số tối thiểu có ý nghĩa)

MS Murashige and Skoog (1962)

ND New Dogashima (1998)

NT Nghệ tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe)

OD Optical Density

PAA Phenoxy Acetic Acid

PLBs Protocorm like bodies

SH Schenk and Hildebrandt (1972)

TCLs Thin cell layers – Các lát mỏng tế bào

tTCL Traverse thin cell layer- Lát mỏng tế bào nằm ngangTDZ Thidiazuron (N-phenyl-N,-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea)TTC Tetrazolium

TNDTTV Tài nguyên di truyền thực vật

THT Than hoạt tính

UNCED United Nations Conference on Environment and

Development (Hội nghị Liên Hiệp quốc về môi trường

và phát triển)

VW Vacin and Went (1949)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Đặc điểm thực vật chính của hai loài lan nghiên cứu 4

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái rễ, lá và thân của lan Nghệ tâm và Hạc vỹ 56

Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái hoa của hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ 57

Bảng 3.3 Kích thước các lớp mô trong cấu tạo vi phẫu rễ Nghệ tâm và Hạc vỹ 61

Bảng 3.4 Cấu tạo vi phẫu thân Nghệ tâm và Hạc vỹ 63

Bảng 3.5 Cấu tạo vi phẫu lá Nghệ tâm và Hạc vỹ 64

Bảng 3.6 Kết quả định lượng một số thành phần hóa sinh cơ bản có trong hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ 68

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng NaOCl lên mẫu cấy 69

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của chất kháng sinh cefotaxime (cef) và 3% NaOCl đến khả năng sống và vô trùng của mẫu cấy 70

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của BA 72

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của tổ hợp (BA + αNAANAA) đến khả năng tạo PLBs từ lát mỏng tế bào nằm ngang (tTCL) 73

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của tổ hợp (BA + IBA) đến khả năng tái sinh chồi từ PLBs 75 Bảng 3.12 Ảnh hưởng của dịch nghiền bí ngô đến khả năng tái sinh chồi từ PLBs 76 Bảng 3.13 Ảnh hưởng của bột tảo Spirulina đến khả năng tái sinh chồi từ PLBs 77

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ chồi lan Nghệ tâm và Hạc vỹ in

vitro 79

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của PAA đến khả năng tạo rễ chồi Nghệ tâm và Hạc vỹ 80

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch sodium alginate và CaCl2 2H2 O đến sự hình thành vỏ hạt nhân tạo lan Nghệ tâm và Hạc vỹ 86

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate (%) và CaCl2 2H2 O (mM) đến tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo lan Nghệ tâm và Hạc vỹ 86

Bảng 3.18 Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với dung dịch 100 mM CaCl 2H2 2 O đến khả năng nảy mầm và khả năng sinh trưởng của hạt nhân tạo 87

Bảng 3.19 Ảnh hưởng của BA, tổ hợp BA + IBA đến khả năng nảy mầm và sinh trưởng của hạt nhân tạo 89

Bảng 3.20 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian bảo quản của hạt nhân tạo 91

Bảng 3.21 Ảnh hưởng của nồng độ ABA đến thời gian bảo quản của hạt nhân tạo lan Nghệ tâm 93

Bảng 3.22 Ảnh hưởng của nồng độ ABA đến thời gian bảo quản của hạt nhân tạo lan

Hạc vỹ 94

Bảng 3.23 Ảnh hưởng của natri benzoat, topsin - M và carbendazim đến khả năng

sống sót của hạt nhân tạo sau bảo quản lan Nghệ tâm 96

Bảng 3.24 Ảnh hưởng của natri benzoat, topsin - M và carbendazim đến khả năng

sống sót của hạt nhân tạo sau bảo quản lan Hạc vỹ 97Bảng 3.25 Ảnh hưởng của tổ hợp BA + PAA đến quá trình nhân nhanh protocorm và

chồi sau bảo quản 100Bảng 3.26 Ảnh hưởng của dịch nghiền cà chua đến khả năng nhân nhanh protocorm

và chồi của hạt nhân tạo sau quá trình bảo quản 102Bảng 3.27 Ảnh hưởng của PAA đến khả năng tạo rễ của chồi 104Bảng 3.28 Sinh trưởng của cây nhân giống in vitro truyền thống và cây nhân giống

in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản 109

Bảng 3.29 Ảnh hưởng của các thời vụ ra cây đến tỷ lệ sống và khả năng sinh trưởng

của cây in vitro giai đoạn vườn ươm 111Bảng 3.30 Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sinh trưởng của cây in vitro ở giai

đoạn vườn ươm 113

Bảng 3.31 Ảnh hưởng của một số loại chế phẩm dinh dưỡng khác nhau đến khả năng

sinh trưởng của cây in vitro giai đoạn vườn ươm 116

Bảng 3.32 Ảnh hưởng của loại giá thể đến khả năng sinh trưởng của lan Nghệ tâm và

Hạc vỹ giai đoạn vườn sản suất 118

Bảng 3.33 Ảnh hưởng của một số loại chế phẩm dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng

của lan Nghệ tâm giai đoạn vườn sản suất 120Bảng 3.34 Ảnh hưởng của loại chế phẩm dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng của

lan Hạc vỹ giai đoạn vườn sản suất 121Bảng 3.35 Ảnh hưởng của liều lượng phun Superthrive đến khả năng khả năng sinh

trưởng của lan Nghệ tâm ở giai đoạn vườn sản suất 123Bảng 3.36 Ảnh hưởng của liều lượng phun Superthrive đến khả năng khả năng sinh

trưởng của lan Hạc vỹ ở giai đoạn vườn sản suất 124

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây hoa lan Nghệ tâm và Hạc vỹ 5

Hình 3.1 Thân, lá và rễ cây Nghệ tâm ( D loddigesii ) .55

Hình 3.2 Thân, lá và rễ cây Hạc vỹ ( D aphyllum ) .55

Hình 3.3 Lát cắt ngang qua rễ Nghệ tâm và Hạc vỹ 60

Hình 3.4 Lát cắt ngang qua thân Nghệ tâm và Hạc vỹ 62

Hình 3.5 Lát cắt ngang qua lá Nghệ tâm và Hạc vỹ 64

Hình 3.6 Đặc điểm hình thái và cấu tạo hoa của Nghệ tâm và Hạc vỹ 66

Hình 3.7 Mẫu nảy chồi sau 6 tuần nuôi cấy 71

Hình 3.8 Khả năng phát sinh PLBs từ tTCL 74

Hình 3.9 Tái sinh chồi từ PLBs 78

Hình 3.10 Tạo cây lan Nghệ tâm in vitro hoàn chỉnh 81

Hình 3.11 Tạo cây lan Hạc vỹ in vitro hoàn chỉnh 81

Hình 3.12 Sơ đồ tóm tắt quy trình nhân giống lan Nghệ tâm bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào 83

Hình 3.13 Sơ đồ tóm tắt quy trình nhân giống lan Hạc vỹ bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào 84

Hình 3.14 Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với dung dịch 100 mM CaCl 2H2 2 O đến khả năng nảy mầm của hạt nhân tạo 88

Hình 3.15 A - protocorm like bodies ; B, C - hạt nhân tạo; D - Hạt nhân tạo được bảo quản (sau 24 tuần) 98

Hình 3.16 Sơ đồ tóm tắt quy trình tạo hạt giống nhân tạo hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ 99

Hình 3.17 Ảnh hưởng của dịch nghiền cà chua đến khả năng nhân nhanh protocorm của hạt nhân tạo sau quá trình bảo quản 103

Hình 3.18 Nhân nhanh protocorm và chồi sau quá trình bảo quản hạt giống nhân tạo 103

Hình 3.19 Ảnh hưởng của PAA đến khả năng tạo rễ của chồi lan Nghệ tâm 105

Hình 3.20 Ảnh hưởng của PAA đến khả năng tạo rễ của lan Hạc vỹ 105

Hình 3.21 Cây in vitro đưa ra vườn ươm 106

Hình 3.22 Sơ đồ tóm tắt quy trình nhân giống in vitro sau bảo quản hạt nhân tạo lan Nghệ tâm và Hạc vỹ 108

Hình 3.23 Sinh trưởng của cây nhân giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản và

cây nhân giống in vitro thông thường 110Hình 3.24 Ảnh hưởng của các thời vụ ra cây đến tỷ lệ sống của cây in vitro 112

ở giai đoạn vườn ươm 112Hình 3.25 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây in vitro ở giai đoạn vườn

ươm 114Hình 3.26 Cây in vitro lan Nghệ tâm giá thể rêu + đá bọt (50:50) 114Hình 3.27 Cây in vitro lan Hạc vỹ trên giá thể rêu + xơ dừa (70:30) 115Hình 3.28 Ảnh hưởng của loại chế phẩm dinh dưỡng đến chiều cao của cây in vitro

giai đoạn vườn ươm 116Hình 3.29 Ảnh hưởng của loại chế phẩm dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng của

cây in vitro giai đoạn vườn ươm 117

Hình 3.30 Ảnh hưởng của loại giá thể đến chiều cao cây của lan Nghệ tâm và Hạc vỹ

giai đoạn vườn sản suất 119

Hình 3.31 Ảnh hưởng của một số loại chế phẩm dinh dưỡng đến đường kính thân của

lan Nghệ tâm và Hạc vỹ giai đoạn vườn sản suất 122Hình 3.32 Ảnh hưởng của liều lượng phun Superthrive đến chiều cao cây của lan

Nghệ tâm và Hạc vỹ ở giai đoạn vườn sản suất 124Hình 3.33 Thí nghiệm phun Superthrive trên cây lan Nghệ tâm 125Hình 3.34 Thí nghiệm phun Superthrive trên cây lan Hạc vỹ 125Hình 3 35 Sơ đồ tóm tắt quy trình kỹ thuật trồng hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ

in

vitro ở giai đoạn vườn ươm và vườn sản xuất 127

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Chi Hoàng thảo (Dendrobium) là một trong những chi lớn nhất của họ Lan (Orchidaceae), ước tính có khoảng 1.184 loài (Leitch et al., 2009) và được phân bố

từ vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á Thái Bình Dương đến New Zealand

(Govaerts et al., 2011) Ở Việt Nam, chi lan Hoàng thảo có khoảng 110 loài (Leonid

et al., 2013) và được đánh giá cao vì hoa có sự đa dạng về kiểu dáng, màu sắc, hoa

nở vào nhiều thời điểm khác nhau với độ bền dài, có thể lên đến 10 tuần Cũng

chính vì vậy mà nhiều loài lan thuộc chi Dendrobium ở Việt Nam đã bị khai thác

cạn kiệt phục vụ nhu cầu trang trí, thưởng ngoạn Ngoài giá trị làm cảnh, một số loài

Dendrobium còn được sử dụng làm thực phẩm, đồ uống, gia vị, hương thơm, thuốc

chữa bệnh và cả trong đời sống tinh thần như nghệ thuật, tôn giáo (Arditti andPridgeon, 2013)

Nghệ tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe) và Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher) thuộc chi Hoàng thảo (Dendrobium) là hai loài lan rừng đẹp, có giá

trị y học và giá trị thương mại cao Theo y học cổ truyền Trung Quốc, Nghệ tâm cótác dụng ngăn ngừa tế bào ung thư dạ dày, ung thư phổi, chất chống đông máu (Tsai

et al., 2010); ung thư tuyến giáp, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thực quản, ung thư

tuyến tụy, có tác dụng điều trị bệnh tiểu đường (Veronika Cakova et al., 2017); làm trắng da (Ho Kyung Jung et al., 2015) Hạc vỹ dùng trị ho, đau họng, bỏng lửa, toàn

cây điều trị kinh phong trẻ em, ăn uống bị ngộ độc (Sách Đỏ Việt Nam, 2007).Trong xu thế nhu cầu sử dụng làm cây hoa cảnh và dược liệu tăng mạnh nhữngnăm gần đây, hai loài Nghệ tâm và Hạc vỹ đã bị khai thác ồ ạt, dẫn đến nguồn nguyênliệu đang trở nên cạn kiệt Mặt khác, do tỷ lệ nảy mầm từ hạt trong tự nhiên rất thấp vàvùng phân bố của Nghệ tâm và Hạc vỹ bị thu hẹp nên hai loài lan này đang trong tìnhtrạng gần như mất dần trong tự nhiên và được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam năm 2007

(Nguyễn Tiến Hiệp et al., 2009) và hạng mục IUCN (Romand-Monnier, 2013) phải

được bảo vệ Vì vậy, việc nghiên cứu công nghệ nhân giống phục vụ cho công tác bảotồn và phát triển hai loài lan này là rất cần thiết Một trong các biện pháp hữu hiệu đểnhân nhanh và bảo tồn các loài lan quý hiếm nói chung và Nghệ

tâm, Hạc vỹ nói riêng là kỹ thuật nhân giống in vitro và tạo hạt giống nhân tạo, kéo dài

quá trình bảo quản và cung cấp hạt giống cho sản xuất Nhằm góp phần làm phongphú nguồn dược liệu quý của Việt Nam, làm đẹp môi trường cảnh quan, nâng cao thu

nhập cho người trồng lan, chúng tôi thực hiện đề tài:“Nghiên cứu đặc điểm sinh học

và kỹ thuật nhân giống phục vụ bảo tồn hai loài lan Nghệ tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe), Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher) của Việt Nam”.

2 Mục tiêu của đề tài

Nghiên cứu đánh giá các đặc điểm sinh học cơ bản và biện pháp kỹ thuật nhân

giống in vitro phục vụ công tác bảo tồn và phát triển hai loài lan quý Nghệ tâm và

Hạc vỹ, từng bước góp phần vào sản xuất cây dược liệu, cây cảnh có giá trị của ViệtNam

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Các kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp dữ liệu khoa học có giá trị về một

số biện pháp kỹ thuật nhân giống dựa trên các đặc điểm sinh học của hai loài lanNghệ tâm và Hạc vỹ, góp phần bảo tồn, khai thác và phát triển chúng một cách phùhợp trong điều kiện Việt Nam

Các kết quả nghiên cứu có tính hệ thống về đặc điểm nông sinh học, dược tính

và công nghệ tạo hạt giống nhân tạo lan Nghệ tâm và Hạc vỹ là nguồn tư liệu có giátrị, làm cơ sở cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo, bổ sung vào tài liệu giảngdạy chuyên ngành trong các trường đại học, các chương trình phổ biến kiến thứccho cộng đồng

3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Kết quả đề tài đã góp phần tích cực vào công tác bảo tồn hai loài lan dược liệuquý Nghệ tâm và Hạc vỹ của Việt Nam thông qua việc thu thập và lưu giữ với đầy

đủ các thông tin bộ giống gốc bản địa

Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro, đề tài đã nhân giống và tạo được hạt giống nhân

tạo cùng số lượng lớn cây giống sạch bệnh, khỏe với hệ số nhân cao, góp phần mở rộngdiện tích trồng hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ cho mục đích sản xuất dược phẩm và

mỹ phẩm phục vụ nội tiêu và hướng tới xuất khẩu với hiệu quả kinh tế cao

4 Những đóng góp mới của đề tài

- Đề tài là công trình nghiên cứu có hệ thống về các đặc điểm hình thái, cấu trúc

vi phẫu và thành phần hóa sinh của hai loài lan Nghệ tâm (D loddigesii) và Hạc vỹ (D aphyllum) có giá trị làm thuốc và làm cảnh cao.

- Đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cho hai loài lan quý Nghệ tâm

và Hạc vỹ phù hợp với điều kiện của Việt Nam, dễ áp dụng với nguồn nguyên vậtliệu trong nước nên có tính khả thi cao

- Quy trình tạo hạt giống nhân tạo và nhân giống in vitro sau bảo quản hạt hai

loài lan đã kéo dài được thời gian bảo quản với tỷ lệ hạt nảy mầm từ 68% đến 70%,chi phí thấp và giữ được đặc tính giống

- Đã xác định được các biện pháp kỹ thuật cơ bản trong sản xuất cây giống in

vitro và vườn sản xuất làm cơ sở để xây dựng quy trình công nghệ hoàn chỉnh về kỹ

thuật sản suất hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ ở Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nguồn gốc và phân bố của hai loài lan Nghệ tâm (D loddigesii) và Hạc

vỹ (D aphyllum) của Việt Nam

Chi Hoàng thảo (Dendrobium) được đặt tên vào năm 1799, Dendrobium được hiểu

là lan sống trên cây, tiếng Việt Nam gọi là lan Hoàng thảo (Trần Duy Quý, 2005)

Theo Trần Hợp (1998); Leitch et al., (2009) lan Hoàng thảo thuộc chi Hoàng thảo (Dendrobium), họ phong lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales), phân lớp

Hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Liliopsida)

Các loài lan Hoàng thảo có mặt ở tất cả các vùng sinh thái trong cả nước, phân

bố chủ yếu ở vùng núi suốt từ Bắc vào Nam và trên một số đảo ven biển Việt Nam.Các đại diện của chi Hoàng thảo chủ yếu sống phụ sinh trên thân hoặc các cành cây

ở trong rừng hoặc trên các hốc mùn trên đá, thường ở nơi ẩm, mọc ở độ cao 500 1500m so với mực nước biển, nhưng đôi khi mọc ở độ cao 200m hoặc tới 2000m(Dương Đức Huyến, 2007)

-Trên thế giới lan Nghệ tâm phân bố ở Trung Quốc, Lào Ở Việt Nam phân bố

tại Thái Nguyên, Hà Giang, Lai Châu, Nghệ An (Averyanov et al., 2005) Lan Hạc

vỹ phân bố ở Ấn Độ, Nepan, Butan, Trung Quốc, Mianma, Thái Lan, Lào, Malaixia

và ở Việt Nam phân bố tại Lâm Đồng, Khánh Hòa, Lào Cai, Bắc Cạn, Ninh Thuận

(Averyanov et al., 2005; Sách đỏ Việt Nam, 2007).

1.2 Một số đặc điểm thực vật học chính của hai loài lan Nghệ tâm (D

loddigesii) và Hạc vỹ (D aphyllum)

Một số đặc điểm thực vật chính của hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ được trình bày ở bảng 1.1 và minh họa ở hình 1.1

Bảng 1.1 Đặc điểm thực vật chính của hai loài lan nghiên cứu

Đặc điểm Nghệ tâm (D loddigesii) Hạc vỹ (D aphyllum)

Thân Lan sống phụ sinh, mọc bụi Lan sống phụ sinh, thân

nhỏ, thân mềm buông xuống dài buông xuống, mảnh dài 100

cm (Trần Hợp, 1998)

10 - 20 cm, có đốt thưa (TrầnHợp, 1998).

Lá thuôn hình giáo, dài 4 - 6 Lá xếp thành hình mác

Lá cm, rộng 1 - 2 cm, dễ rụng (Trần nhọn, dài 6 - 8 cm, rộng 1,5 - 2

Hợp, 1998) cm (Sách Đỏ Việt Nam, 2007)

Cụm hoa mọc ở nách lá, 1 - 2 Cụm hoa bên, 1 - 3 hoa,hoa, mọc trên các thân mang lá, mọc suốt dọc chiều dài thânmàu hơi đậm (gân đỏ) có đốm không mang lá, màu tím nhạtHoa đậm Cánh môi tròn, mép có hay hơi trắng Cánh môi màu

nhiều lông mịn và ở giữa có màu vàng nhạt có 3 gân Mùa hoavàng nghệ Mùa hoa tháng 4 - 8 tháng 4 - 5 (Trần Hợp, 1998;(Trần Hợp, 1998; Zhu Guanghua Sách Đỏ Việt Nam, 2007)

et al., 2009).

Lan Nghệ tâm (D loddigesii) Lan Hạc vỹ (D aphyllum)

Hình 1.1 Cây hoa lan Nghệ tâm và Hạc vỹ

(Nguồn ảnh: Nguyễn Thị Lài - Trung tâm Sinh học Thực nghiệm)

1.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của chi lan Hoàng thảo (Dendrobium)

- Nhiệt độ

Lan Hoàng thảo thuộc loại cây ưa ấm, sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 24 - 330C Dưới

120C và trên 370C đều làm chậm và ảnh hưởng lớn đến sự ra hoa của cây, do đó ởcác tỉnh phía Bắc có mùa đông lạnh và mùa hè nóng phải hạn chế tác động xấu củanhiệt độ, như mùa đông che phủ nilon quanh nhà trồng lan hoặc bổ sung ánh sángnhân tạo mùa hè che lưới phản quang, có hệ thống tưới phun thích hợp, để tạo điềukiện thông thoáng trong nhà lan giúp cho cây sinh trưởng phát triển tốt (Nguyễn ThịKim Lý, 2009).

- Ẩm độ

Độ ẩm thích hợp cho lan Hoàng thảo từ 50 - 75% Độ ẩm dưới 50% Hoàng thảophát triển kém Nhiệt độ, ánh sáng và độ ẩm có liên quan hài hòa và mật thiết vớinhau để cây sinh trưởng và phát triển tối ưu Trong những tháng mùa hè cần tăng độ

ẩm lên bằng cách phun nước thường xuyên (Sushanta Kumar Naik and UshaBharathi, 2012)

1.4 Giá trị sử dụng và thực trạng khai thác hai loài lan Nghệ tâm (D

loddigesii) và Hạc vỹ (D aphyllum) ở Việt Nam

Chi Hoàng thảo (Dendrobium) lớn thứ hai trong họ lan, có khoảng 1.184 loài và

đã được lai tạo thêm rất nhiều loài mới, phân bố ở các vùng nhiệt đới, tập trungnhiều ở Châu Á và Châu Úc Nếu ở các nước Nam Mỹ tự hào về các loài thuộc chi

Cattleya tuyệt đẹp, thì các nước Đông Nam Á cũng hãnh diện về chi Hoàng thảo vô

cùng phong phú, đa dạng về kiểu dáng hoa, nhiều loài có hương thơm, hoa rất bền

từ 45 - 60 ngày, có loài tới 70 ngày, thậm chí có loài nở suốt quanh năm bởi cácchồi hoa mới luôn thay thế các chồi hoa cũ Chi lan Hoàng thảo có khả năng thíchnghi rộng với điều kiện sống, phân bố rất rộng nên có ý nghĩa thương mại lớn

Trong y học cổ truyền lan Nghệ tâm có tác dụng chống tế bào ung thư dạ dày và

ung thư phổi, chất chống đông máu (Tsai et al., 2010), điều trị bệnh tiểu đường type

2 (Zhang et al., 2011) Lan Hạc vỹ có tác dụng trị ho, đau họng, trị phong kinh ở trẻ

em, ăn uống bị ngộ độc (Sách Đỏ Việt Nam, 2007) Bộ phận được sử dụng làmdược liệu của hai loài lan này chủ yếu là thân lá Lan Nghệ tâm và Hạc vỹ không chỉđược tiêu thụ trong nước mà còn được các thương lái Trung Quốc thu gom và xuấtkhẩu tiểu ngạch Giá của các cây lan này được bán trên thị trường từ 700.000 -900.000 đồng/kg cây tươi

Trên thị trường các loại thực phẩm chức năng có nguồn gốc tự nhiên từ lan Hạc

vỹ, Tam bảo sắc và Thạch hộc rỉ sắt, được bán với giá rất cao 2.000 - 4.000 USD/kg

(Weichao Zhang et al., 2009).

Do có giá trị làm hoa cảnh, dược liệu và giá trị kinh tế cao nên lan Nghệ tâm vàHạc vỹ trong một số năm gần đây đã bị khai thác quá mức dẫn đến nguy cơ mất hẳntrong tự nhiên Năm 2007 lan Hạc vỹ đã có trong danh mục đỏ của “Sách đỏ ViệtNam” Lan Nghệ tâm được báo cáo tại “Hội nghị Sinh thái và Tài nguyên sinh vật,

2009 - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật” là loài thực vật bị đe dọa

1.5 Tình hình sản xuất và tiêu thụ lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế

giới và ở Việt Nam

1.5.1 Sản xuất và tiêu thụ lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới

Hoa Lan chiếm một phần lớn trong thương mại toàn cầu về hoa chậu và hoa cắtcành Ước tính khoảng 10% hoa tươi cắt cành được thương mại trên thị trường quốc

tế Giá trị thương mại trung bình của hoa lan cắt cành từ năm 2007 đến năm 2012 là

483 triệu USD (Jayarama Reddy, 2016) Hawaii, California và Florida là những

vùng trồng Dendrobium trong chậu lớn tại Mỹ Giá trị mặt hàng này ở Hawaii đã

được xác nhận trong nhiều thập kỷ và doanh thu tăng từ 2,4 triệu USD năm 1991lên 5,6 triệu USD trong năm 2000 (De and Debnath Correct, 2011) Năm 2012, trênthế giới đã có hơn 40 nước xuất khẩu hoa lan và 60 nước nhập khẩu hoa lan vớitổng giá trị thương mại toàn cầu là 504.740.644 USD (Jayarama Reddy, 2016)

Hà Lan là nước dẫn đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu hoa lan (39,7%), tiếptheo là Thái Lan (28,4%), Đài Loan (10%), Singapore (10%) và New Zealand (6%)

Các nước nhập khẩu chủ yếu là Nhật Bản (30%), Anh (12%), Ý (10%), Pháp (7%)

và Mỹ (6%) Tổng số lan cắt cành thương mại trên thế giới chủ yếu các loài lan

Dendrobium chiếm 85% và Phalaenopsis, Cymbidium chiếm 15%

(Cheamuangphan et al., 2013; De et al., 2014) Tại Hà Lan, việc sản xuất hoa lan

Dendrobium trong chậu đã tăng ổn định đạt 40 đến 50 triệu cây (De et al., 2014).

Thái Lan là nước xuất khẩu lớn nhất thế giới về các loài lan cắt cành nhiệt đới

và là nhà cung cấp lớn thứ hai chiếm 22% nguồn cung vào thị trường EU Thái Lan

có vị thế mạnh trong sản xuất lan Hoàng thảo (De et al., 2014) Năm 2012, tại Thái

Lan ước tính 46% sản lượng hoa lan đã được tiêu thụ trong nước và 54% được xuấtkhẩu (Thammasiri, 2015)

1.5.2 Sản xuất và tiêu thụ hoa lan Hoàng thảo (Dendrobium) ở Việt Nam

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm nên chủngloại lan rừng rất phong phú, đặc biệt có điều kiện khí hậu thuận lợi thích hợp phát

triển các loài lan thuộc chi Hoàng thảo (Dendrobium), chi Cát lan (Cattleya), chi lan

Vũ nữ (Oncidium) Diện tích trồng hoa lan ở Việt Nam còn ở mức hết sức khiêm

tốn, chỉ chiếm 10% tổng diện tích các loại hoa đang được trồng Sản xuất hoa lan ởViệt Nam tập trung theo 2 hướng chính là sản xuất theo quy mô công nghiệp cácloài lan mới lai tạo hoặc được nhập nội (lan công nghiệp); Khai thác và nuôi trồngcác loài hoa lan bản địa (lan rừng)

Lan bản địa (lan rừng) chủ yếu được nuôi trồng nhỏ lẻ ở quy mô hộ gia đình,tập trung chủ yếu ở Hà Nội và một số vùng phụ cận Xã Đông La, La Phù, La Khêthuộc huyện Hoài Đức - Hà Nội những năm gần đây trở nên nổi tiếng với nghềtrồng lan Đây được coi là trung tâm nuôi trồng phong lan rừng lớn nhất miền Bắc

và chủ yếu là chi lan Hoàng Thảo Bên cạnh Hoài Đức, một số địa phương như GiaLâm, Đông Anh (Hà Nội), Văn Giang (Hưng Yên), Mộc Châu (Sơn La), Phổ Yên(Thái Nguyên) cũng đã có nhiều hộ gia đình tập trung đầu tư vào sản xuất và nuôitrồng phong lan bản địa, với quy mô từ 300 - 500m2,…(Hoàng Xuân Lam, 2014)

Ở TP Hồ Chí Minh chủ yếu trồng các loài lan của chi Hoàng thảo, Cát lan, Vũ nữ…với diện tích khoảng 200ha, bằng 5,4% diện tích so với hoa lan của Thái Lan

Ở miền Bắc, một số cơ quan nghiên cứu như Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện

Nghiên cứu Rau quả, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Viện Ứng dụng Côngnghệ, trong những năm vừa qua đã tập trung nghiên cứu phương pháp nhân giống

vô tính in vitro Kết quả đã sản xuất mỗi năm được hàng vạn cây con các loài hoa lan có giá trị trong đó có lan Hoàng thảo.

Năm 2015, Viện Di truyền Nông nghiệp đã xây dựng mô hình nhân giống cácgiống hoa lan Hoàng thảo ở Văn Giang - Hưng Yên với diện tích 1.000m2 quy mô30.000 cây/năm, mô hình sản xuất hoa thương phẩm diện tích 15.000m2, sản xuấtđược 60.000 cây giống Doanh thu đạt 280 triệu/1.000m2

Đối với thị trường trong nước, sản lượng hoa phong lan cũng chưa đáp ứngđược nhu cầu của người tiêu dùng Các cơ sở sản xuất hoa lan cũng chỉ đáp ứngđược 30 - 40% nhu cầu lan cắt cành còn lại phải nhập từ các nước khác Hiện nay,mỗi năm Việt Nam vẫn phải chi hàng tỷ đồng để nhập phong lan từ các nước lánggiềng cho nhu cầu nội địa Thị trường nhập khẩu lan cắt cành chính của Việt Nam

trong thời gian qua là Thái Lan với gần 90% lượng lan cắt cành (Dendrobium) và lan chậu (Cattleya, Oncidium) (Minh Trí và cs., 2010).

Ở Việt Nam hiện nay chưa có công trình nào công bố về sản xuất sản phẩm chức

năng và thuốc từ lan Hoàng thảo (Dendrobium) Chỉ có một số người dân tộc vùng núi

lấy quả tươi ngâm rượu hoặc lấy cây tươi và cây khô để sắc uống chữa bệnh

Như vậy, vấn đề sản xuất, kinh doanh, hoa lan ở Việt Nam từ trước đến nay vẫn

ở dạng tiềm năng Trong khi đó, sức cạnh tranh trên thị trường thế giới là rất lớn.Những hoạt động kinh doanh và xuất khẩu trong thời gian qua chỉ mới có ý nghĩakhởi động, hứa hẹn một sự phát triển trong tương lai dựa trên những điều kiện thuậnlợi sẵn có cho sự phát triển ngành trồng lan

1.6 Cơ sở khoa học về nhân giống và tạo hạt giống nhân tạo

1.6.1 Bảo tồn hoa lan

Trên thế giới nhiều loài lan đang có nguy cơ tuyệt chủng, hiếm và được liệt kêtrong phụ lục II của CITES, do nhiều nguyên nhân như biến đổi khí hậu, khai thác quámức, buôn bán bất hợp pháp và lấn chiếm đất đai Hoa lan được biết đến như là câycảnh quan trọng ở Việt Nam, đặc biệt là lan rừng Các loài lan rừng của Việt Nam nổitiếng với vẻ đẹp và tính năng riêng biệt của chúng và đang có nhu cầu sử dụng

làm cảnh và làm thuốc cao trên toàn thế giới Do đó cần có các biện pháp kỹ thuật

để nhân giống, bảo tồn và phát triển loài lan có giá trị của Việt Nam

Hoa lan, có thể được duy trì trong tự nhiên (bảo tồn in situ) và chuyển khỏi môi trường sống của chúng (bảo tồn ex situ) Bảo tồn in situ là cách tốt nhất để bảo tồn

sự đa dạng di truyền các loài lan, nhưng nó rất khó khăn để duy trì trong một thời

gian dài và có nguy cơ bị mất do bị sâu bệnh, sinh học và stress phi sinh học Ngoài

ra, rất tốn kém do sử dụng lao động và đất Bảo tồn nguồn gen bằng nuôi cấy mô cóthể mất một thời gian dài và phải cấy chuyển nhiều lần Việc duy trì lan trong ốngnghiệm rất tốn kém, mất thời gian, có thể xảy ra biến dị soma và mất nguyên liệu do

bị nhiễm Để khắc phục những vấn đề này, tạo hạt giống nhân tạo và bảo quản lạnhđược sử dụng để bảo tồn đa dạng di truyền của chúng (Montakarn Pimsen, 2014).Đây là cơ sở khoa học để đề tài ứng dụng kỹ thuật này trong công tác bảo tồn hailoài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ

1.6.2 Các kỹ thuật về nhân giống và tạo hạt giống nhân tạo hoa lan

1.6.2.1 Nhân giống hữu tính

Hạt lan rất nhỏ, có cấu tạo không hoàn chỉnh Một quả lan có thể chứa 1.300 4.000.000 hạt Hạt lan có hình dạng, kích thước và màu sắc rất khác nhau Hầu hếtcác hạt lan có chiều rộng 0,09 - 0,27 mm và chiều dài 0,25 -1,2 mm Trọng lượnghạt từ 0,0003 - 0,0014 mg (0,3 - 1,4 µg) Các hạt có chứa một phôi nhỏ, thiếu nộinhũ, do đó muốn hạt nảy mầm phải tạo đủ điều kiện dinh dưỡng và môi trường Mặtkhác, trong tự nhiên hạt lan phải được nhiễm nhiều loại nấm kí sinh thuộc chi

-Rhizoctonia mới có thể nảy mầm được Quá trình nhân giống từ gieo hạt cho đến

khi cây ra hoa mất thời gian rất dài có thể từ 3 - 4 năm Tuy nhiên, nhân giống hữutính thường xảy ra biến dị nên sẽ không thuận lợi cho việc sản xuất hạt đồng nhất vềmặt di truyền (Montakarn Pimsen, 2014)

1.6.2.2 Nhân giống vô tính

Một số phương pháp nhân giống vô tính bằng tách chồi vượt, giâm hom nhưng đềucho hệ sống nhân giống thấp, cần diện tích lớn, cần nhiều cây mẹ, cây dễ bị bệnh,nhanh bị lão hóa, khả năng sinh trưởng kém, rất khó sử dụng vào mục đích thương mại

Kỹ thuật nuôi cấy mô đang phát triển rộng rãi để nhân giống các loài lan, nhờ

kỹ thuật này, những giống lan quý đã có thể nhân giống dễ dàng với hệ số nhângiống cao, cây đồng đều, ổn định về mặt di truyền, sạch bệnh, có sức sống cao Cóthể dùng nhiều bộ phận của hoa lan làm bộ phận nuôi cấy như: đỉnh sinh trưởng,mắt ngủ trên thân, phương pháp lớp mỏng tế bào…

a) Các phương pháp nhân giống in vitro

- Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là một trong những kỹ thuật hữu hiệu nhằm đảm bảocác đặc tính di truyền của mẹ trong các cây tái sinh (Morel, 1960) Khi nuôi cấyđỉnh sinh trưởng, mô phân sinh ở vùng đỉnh này, không như một số giống cây khác

là hình thành cấu trúc protocorm để sau đó có thể biệt hóa thành cây Nhân các

protocorm sẽ tạo thành các protocorm mới gọi là protocorm like body (Morel,

1964) Không như trong nuôi cấy mô sẹo in vitro của những loài thực vật khác, việc thiết lập gen của protocorm được xác định ngay từ protocorm hình thành ban đầu (Neumann et al., 2009).

- Thể tiền chồi (Protocorm like body)

Protocorm like body (PLB) là thuật ngữ đề chỉ những cấu trúc giống với protocorm và có nguồn gốc từ nuôi cấy in vitro đỉnh sinh trưởng hay mô phân sinh

của chồi bất định ở các loài lan (Joseph and Robert, 1992) Đây là cấu trúc lần đầu

tiên được đặt ra bởi Morel khi nuôi cấy đỉnh chồi của Cymbidium để tạo ra những cây sạch virus với các protocorm hình thành từ đỉnh sinh trưởng mà không phải là

từ hạt Như vậy, nuôi cấy mô phân sinh họ Lan sẽ hình thành các protocorm like

body (Morel, 1964) Kỹ thuật này vừa tạo ra cây sạch bệnh virus, đồng nhất về kiểu

gen vừa cho tỷ lệ nhân giống cao

- Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào

Lớp mỏng tế bào (TCL) bao gồm các mẫu có kích thước nhỏ cắt từ những tổ chứcthực vật (thân, lá, phát hoa, sơ khởi hoa hay tổ chức hoa, lá mầm trụ trên/dưới lá mầm,vùng đỉnh hay phôi) Các lát cắt có thể cắt dọc (lTCL), hay cắt ngang (tTCL) Các1TCL chỉ chứa một loại mô như tầng các tể bào biểu bì nhưng các tTCL lại bao gồmcác tế bào từ các kiểu mô khác nhau: tế bào biểu bì, vùng vỏ, tầng phát sinh gỗ, quanhmạch và lõi, nhu mô Nuôi cấy các TCL có thể phân lập các tế bào, các tầng

mô và phụ thuộc vào trạng thái di truyền, các yếu tố ngoài gen, các điều kiện sinhtrưởng có kiểm soát (ánh sáng, nhiệt độ, pH, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, các

chất bổ sung vào môi trường ) dẫn tới sự cảm ứng in vitro phát sinh hình thái Khả

năng phát sinh hình thái của một TCL phụ thuộc các yếu tố như: sự nhận biết cácdấu hiệu đúng, sự truyền tính trạng, khả năng di truyền để đáp ứng và phản ứng vớicác dấu hiệu này, tình trạng sinh lý và nguồn gốc (mô hay tổ chức) của TCL, cácyếu tố stress, các trạng thái im lặng của gen Các tế bào trong TCL có thể phản biệthóa dẫn đến việc thiết kế các kiểu hình Trong các TCL, con đường phát sinh hìnhthái của những mô chuyên trách xuất phát từ các tế bào, các mô có thể được điềukhiển và kiểm soát rõ ràng, cho phép nghiên cứu về sự thay đổi phân tử, sinh lý,sinh hóa có thể xảy ra Các TCL cũng sử dụng trong tăng cường trao đổi các hợpchất thứ cấp, dược chất qua việc nuôi cấy các tổ chức chuyển gen, nuôi cấy thực vật

tự dưỡng bằng bioreactor (Dương Tấn Nhựt, 2007)

Các lớp tế bào mỏng đã được sử dụng thành công trong thể tiền chồi

(protocorm-like body) và tạo callus ở Aranda, Coelogyne cristata, Cymbidium spp.,

Dendrobium spp., Doritaenopsis, Paphiopedilum, Renanthera, Rhynchostylis, Spathoglottis và Xenikophyton (Jaime A Teixeira da Silva, 2013b).

b) Môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy in vitro

Có nhiều loại môi trường nuôi cấy thích hợp cho vi nhân giống hoa lan như:Knuson C (1946), Murashige & Skoog (MS) (1962), Vacin & Went (VW) (1949)…Mỗi loại môi trường đều có chất vi lượng và đa lượng, vitamin khác nhau Nói

chung, sự sinh trưởng và phát triển của cây in vitro đều phụ thuộc vào môi trường

nuôi cấy

- Các hợp chất hữu cơ tự nhiên

Một số lượng lớn các chất hữu cơ tự nhiên như: peptone, nước ép cà rốt, nước ép

cà chua, chiết xuất từ thịt bò, dịch khoai tây, nước dừa và dịch chuối, dịch bí ngô, tảo,

…thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tác dụng rất tốt trong việc pháttriển cây giống đã được báo cáo ở nhiều loài lan như: Nước dừa được bổ sung vào môi

trường nuôi cấy hoa lan để kích thích mô sẹo hoặc hình thành protocorm và thường

được sử dụng là 10 - 25% Nước dừa 30% cho tỷ lệ phôi nảy mầm tối đa với

lan D ovatum (Willd.) (Thejaswini et al., 2017).

Dịch nghiền cà chua thường được bổ sung vào môi trường vi nhân giống hoa

lan và có hiệu quả với một số loài lan như: D noblie (Soares et al., 2013, D ovatum (Willd.) (Thejaswini et al., 2017) Bổ sung bột tảo Spirulina ở nồng độ 50 mg/l có tác động hiệu quả đến tỷ lệ sống của chồi và số chồi đạt của lan Paphiopedilum

delenatii (Nguyễn Thị Cúc và cs., 2014).

Than hoạt tính được bổ sung vào môi trường giúp làm giảm độc tố bằng cáchđào thải các hợp chất độc phenolic tiết ra trong thời gian nuôi cấy Bổ sung thanhoạt tính có tác dụng hiệu quả lên sự phát sinh và tăng sinh mô sẹo, sự phát sinh

phôi và nhân phôi cũng được đề cập trên đối tượng D dixanthum (Su et al., 2014).

Không chỉ có các chất hợp chất hữu cơ được bổ sung vào môi trường nuôi cấy,các chất điều hòa sinh trưởng thực vật cũng được sử dụng phổ biến trong nuôi cấyhoa lan Có hai nhóm chính của điều hòa sinh trưởng thực vật: cytokinin và auxin.Các cytokinin thường được dùng trong môi trường nuôi cấy mô thực vật: BA,kinetin và TDZ để kích thích sự phân chia tế bào, gây ra sự hình thành chồi và sựgia tăng chồi nách và làm chậm sự hình thành rễ Các Auxin (2,4-D, αNAANAA, IAA vàIBA) thường được dùng trong nuôi cấy hoa lan để kích thích sự phân chia tế bào,biệt hoá rễ, hình thành mô sẹo, kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ.Ngoài ra, Axit abscisic (ABA) được bổ sung để ức chế hoặc kích thích sự phát triển

mô sẹo, thúc đẩy sự trưởng thành của phôi sinh dưỡng, ức chế sự nhân phôi thứ cấp,

ngăn cản sự nảy mầm sớm của phôi sinh dưỡng (Saad et al., 2012).

- Các hợp chất chứa carbon

Carbon là thành phần rất quan trọng trong môi trường nuôi cấy cho sự tăng trưởng

và phát triển của các mô Hiện nay cacbon được bổ sung vào môi trường nuôi cấy vìthiếu ánh sáng và nồng độ CO2 thấp trong điều kiện in vitro Đường đã được sử dụng

như một nguồn carbon và như là cơ quan quản thẩm thấu trong môi trường nuôi cấy

Có nhiều loại đường được sử dụng trong nuôi cấy in vitro như: sucrose, glucose,

maltose, fructose, lactose và sorbitol Sucrose ở nồng độ 20 và 30 g/l được sử dụng phổbiến nhất trong nghiên cứu nuôi cấy mô hoa lan (Montakarn Pimsen, 2014)

1.6.2.3 Tạo hạt nhân tạo và ứng dụng trong nhân giống cây trồng

a) Khái niệm về hạt nhân tạo (artificial seed)

Hạt tổng hợp (synthetic seed) hay hạt nhân tạo là một thuật ngữ dùng để chỉ đếnphôi sinh dưỡng được bọc bởi lớp vỏ bọc, có thể bảo quản và vận chuyển, được gieo

trồng, phát triển thành cây trong điều kiện in vitro hay ex vitro và đây là dạng hạt

mô phỏng hạt tự nhiên (Redenbaugh et al.,1986).

Khái niệm về hạt nhân tạo, với vỏ bao bọc phôi sinh dưỡng đã được Murashige đềcập đầu tiên vào năm 1977 Từ việc tạo hạt nhân tạo làm khô cho phôi sinh dưỡng càrốt, cần tây và đến năm 1984, Redenbaugh phát triển kỹ thuật bao phôi sinh dưỡng cỏ

Linh lăng (Medicago sativa) bằng lớp vỏ hydrogel Từ lúc này, vỏ bọc hydrogel được nghiên cứu nhiều nhất trong sản xuất hạt nhân tạo (Redenbaugh et al., 1987).

Mô phỏng cấu tạo của hạt tự nhiên, hạt nhân tạo cũng bao gồm “nội nhũ” thườngđược tạo từ các chất dinh dưỡng giúp phôi phát triển, các loại hydrogel như alginate,agar và phần “phôi” tạo ra bất kỳ mô, cơ quan hay phôi sinh dưỡng nào có khả năngtái tạo cơ thể hoàn chỉnh của cây giống quan tâm Với kích thước nhỏ gọn và lớp gelbảo vệ bên ngoài, hạt nhân tạo rất tiện lợi trong vận chuyển, cất giữ, phân phối, trao đổigiống và hơn cả là tiềm năng tự động hoá trong trồng trọt Cho đến nay, mặc dù khảnăng áp dụng thực tế hạt nhân tạo còn nhiều hạn chế, đòi hỏi thêm nhiều nghiên cứu,

kỹ thuật này vẫn đã và đang được nghiên cứu trên nhiều đối tượng thực vật khác nhau

như cúc, lily, cẩm chướng, khoai tây…(Hussain et al., 2000).

Saiprasad (2001) đã chỉ ra để sản xuất hạt nhân tạo phải có một quy trình sản xuấtphôi sinh dưỡng đảm bảo cung cấp phôi chất lượng cao, khỏe, có kiều hình đồng dạng

và phát triển bình thường Đối với vật liệu tạo vỏ bọc nhân tạo thì vỏ bao không nhữngphải đủ mềm để bảo vệ phôi, cho phép hạt nảy mầm mà còn phải bền trong suốt quátrình sản xuất, lưu trữ, vận chuyển và gieo trồng Ngoài ra, vỏ bao còn phải chứa cácchất dinh dưỡng, các nhân tố kiềm soát tăng trưởng như chất điều tiết sinh trưởng thựcvật, các thành phần cần thiết khác cho hạt nảy mầm và phát triển

b) Ứng dụng sản xuất hạt nhân tạo trong nhân giống cây trồng

Sản xuất hạt nhân tạo là một phương pháp thu nhiều lợi nhuận dựa trên khả năngnhân giống cây trồng thông qua sự phát sinh phôi sinh dưỡng Hạt có thể được gieo

trồng trong điều kiện in vitro hay ex vitro và tạo ra các cây con đồng dạng Đây là kỹ

thuật phục vụ thiết thực cho việc sản xuất thương mại một số dạng cây vô tính(Bornman, 1993) Hạt nhân tạo có nhiều ưu điểm như: nhân giống đồng nhất, dễdàng vận chuyển và bảo quản giống lâu dài, có tiềm năng nhân giống với số lượng

lớn và giá cả sản xuất thấp Zouine et al., (2007) đề xuất tự động hóa toàn bộ quy

trình sản xuất hạt nhân tạo Đây cũng là một thuận lợi của công nghệ hạt nhân tạobởi vì ứng dụng thương mại của sự phát sinh phôi sinh dưỡng đòi hỏi hạt được sảnxuất trong những thiết bị có thể tích lớn Việc trữ lạnh hạt cũng rất quan trọng đốivới khả năng sống sót và khả năng nảy mầm của hạt sau quá trình trữ lạnh (Hussain

et al., 2000) Hạt nhân tạo cũng có thể cung cấp nguồn giống cho những dạng thực

vật mới - những cây chuyển gen, cây không hạt, cây đa bội - được tạo ra từ sự tiến

bộ của công nghệ sinh học (Reddy et al., 2012).

1.6.2.4 Các phương pháp tạo hạt nhân tạo và các bước tiến

hành a) Phát triển phôi sinh dưỡng

Đây là vật liệu chủ chốt trong quá trình phát triển thành cây con Vì vậy, việc cảmứng tạo phôi sinh dưỡng, nhân phôi và tạo sự trưởng thành cho phôi có ý nghĩa rất quantrọng trong đảm bảo sức sống cũng như khả năng bảo quản cho hạt nhân tạo Cần cógiai đoạn làm phôi thành thục với việc xử lý làm khô, dự trữ protein (các nguồn N hữu

cơ, glutamine, nguồn lưu huỳnh vô cơ, kali sunfat ), dự trữ tinh bột

Có thể lợi dụng stress thẩm thấu cho phôi bằng cách sử dụng 5 - 6% sucrosethay vì 2 - 3% như nuôi cấy bình thường trong môi trường, giúp ngăn ngừa sự nảymầm sớm và duy trì sự phát triển phôi Để phôi phát triển, việc dự trữ protein,cacbohydrat với các nguồn N hữu cơ, glutamine, nguồn lưu huỳnh vô cơ như K2SO4được tiến hành ở phôi

Trong giai đoạn trưởng thành, môi trường chứa glutamine và sunfat, phôi sẽ tổnghợp, tích lũy protein khoảng 50% khối lượng được tìm thấy trong phôi hợp tử Phần dựtrữ tổng hợp protein và tinh bột được điều hòa bởi tỷ lệ C/N trong môi trường Khi tỷ lệ

này cao sẽ gia tăng tổng hợp protein từ tinh bột (Lai et al.,1994) Giai đoạn cuối cùng

trong sự trưởng thành của phôi đạt được bằng chuyển phôi sang môi trường chứa ABA.Chất điều hòa sinh trưởng này có thể làm tăng khả năng chịu khô của hạt nhân tạo.Những xử lý vật lý khác như làm lạnh, làm nóng, stress thẩm thấu hay stress

dinh dưỡng có thể gây ra sự đáp ứng tương tự vì chúng kích thích tổng hợp ABA

nội sinh (Mayer et al., 2011).

Trong quá trình trưởng thành của phôi sinh dưỡng khi xử lý với ABA, sự pháttriển phôi dừng lại, sự nảy mầm bị ức chế và phôi sinh dưỡng thay đổi từ xanh đếnvàng hay trắng Có một sự gia tăng có ý nghĩa khối lượng tươi, hàm lượng chất khôvới sự tích lũy tinh bột cao của phôi sinh dưỡng Các phân tích tế bào cho thấy, tinhbột được dự trữ trong các lá mầm của phôi sinh dưỡng và một ít ở các phần kháccủa phôi Ngược lại, phôi sinh dưỡng được xử lý trong điều kiện lạnh (4°C) không

có ABA đã không thay đổi khối lượng tươi và hàm lượng chất khô, rất ít hay không

có tinh bột trong phôi và tỷ lệ nảy mầm thành cây trong đất rất thấp hay bị chết

hoàn toàn (Fujii et al.,1987).

Nồng độ cao của sucrose 13% với ABA trong suốt giai đoạn trưởng thành cũng

đã làm tăng mức tổng hợp tinh bột hay các chất dự trữ cần thiết khác, giúp phôi sinhdưỡng chuyển đổi thành cây trong đất Tuy nhiên, nếu chỉ sử dụng nồng độ đườngcao thì không có tác động có lợi trong việc chuyển đổi phôi sinh dưỡng thành cây.Nồng độ sucrose 9% sẽ làm giảm sự chuyển đổi Ảnh hưởng thẩm thấu của nồng độ

đường cao có thể làm tổn hại đến phôi (Fujii et al.,1990).

b) Phương pháp bọc hạt

Ngoài mầm hạt phôi sinh dưỡng, vỏ bọc cho hạt nhân tạo cũng rất quan trọngtrong việc tạo hạt nhân tạo Vỏ bọc vừa là nơi phôi được bảo vệ, vừa có thể dự trữchất dinh dưỡng để phôi nảy mầm và chuyển đổi thành cây con có sức sống Cónhiều phương pháp tạo vỏ bọc nhưng chủ yếu có những phương pháp sau:

- Bọc hạt bằng các loại vật liệu hydrat hóa

Đây là phương pháp phổ biến nhất trong việc sử dụng vật liệu làm vỏ bọc chohạt nhân tạo, điển hình là sodium alginate với lớp vỏ hyđrogel trong môi trườngnước Hạt bọc lớp vỏ hydrat thường áp dụng cho phôi khó sống và nhạy cảm vớiviệc làm khô

Alginate là muối của acid alginic nhưng cũng có thể xem nó là acid alginic và cácdẫn xuất của acid alginic, được Standford phát hiện ra năm 1898 Alginate hiện diện

trong vách tế bào của tảo nâu Laminaria sp dưới dạng muối calcium, magiesium

và sodium Muối sodium alginate tan trong nước, còn muối calcium, magiesiumkhông tan Trong tự nhiên alginate tồn tại dưới dạng polyanionic bao gồm β-D-mannuronate (M) và mảnh bên C5 là αNAA - L - guloronate (G) Công thức phân tử:(C5H7O4COONa)n Khối lượng monomer của phân tử sodium alginate 216g/mol.Alginate gồm các monomer M và G kết hợp ngẫu nhiên Trong phân tử alginate có

từ 80 - 750 monomer M và G kết hợp ngẫu nhiên (Dương Tấn Nhựt, 2011)

Khác với agar, khi giảm nhiệt độ thì dung dịch alginate cũng không đông lạingay cả khi làm lạnh (độ nhớt và bề ngoài đều không thay đổi) Sodium alginate tanđược trong protein, gelatin, tinh bột, đường, glycerine và có khả năng hình thànhsợi và mảng Các alginate có khả năng tạo gel khi có mặt các ion can-xi khi ở nhiệt

độ phòng, trong khoảng pH 4 - 10 Khi tham gia tạo gel, các tương tác tĩnh điện quacầu calcium có vai trò quan trọng Các gel không thuận nghịch với nhiệt và ít đànhồi Alginate hòa tan trong nước khi kết hợp với các ion hoá trị I (Na+, K+, NH4 + )

và ở dạng khi kết hợp với ion hóa trị II hoặc đa hóa trị (Ca2+, Mg2+, Al3+ ) Do đónếu nhỏ một giọt dung dịch sodium alginate vào dung dịch CaCl2 thì phần điện tíchngoài của giọt sodium alginate sẽ chuyển hóa ngay thành calcium alginate tạo nênmột màng không thấm nước tạo nên các viên alginate (Dương Tấn Nhựt, 2011)

- Bọc bằng những vật liệu hydrogel khác

Những vật liệu hydrogel khác cũng được thử nghiệm trong sản xuất hạt nhântạo như xanthan gum tách chiết từ vi sinh vật, chitosan, alginate poly-L-lysin vàagarose nhưng những chất này không thật sự hữu hiệu như dùng calcium alginate.Các chất tạo gel như gelrite, agar, carboxy methyl cellulose, carrageenan chiết xuất

từ rong biển, polyox, gum, gelatin có thể hình thành lớp vỏ tạo hạt nhân tạo nhưngsodium alginate vẫn là vật liệu thích hợp hơn cả với tính chất nhớt, dễ tạo gel,không độc, giá thành thấp và có sự tương hợp sinh học (Saiprasad, 2001)

c) Tạo nội nhũ nhân tạo (Các chất đi kèm trong vỏ bọc hạt nhân tạo)

Các mẫu cấy được sử dụng như một phôi giao tử và thường không có vỏ hạt vànội nhũ để cung cấp dinh dưỡng và bảo vệ cây con trong quá trình sinh trưởng Đểtăng cường hiệu quả của mẫu cấy thì việc bổ sung dinh dưỡng và các nhân tố điềuhòa sinh trưởng cho môi trường nuôi cấy là cần thiết để đảm bảo chức năng của nó

như một nội nhũ nhân tạo Các chất dự trữ cần thiết để nuôi cây mầm như: Hyponex(6,5 N - 6 P - 19 K) hoặc môi trường MS; các vitamine như: Bl, B6, PP; các acidamin như: glycine; myo-inositol và nguồn carbon hydrate như sucrose, Để tránhnhiễm khuẩn, có thể bổ sung chất kháng sinh (rifampicin: 0,25 - 60 mg/l, cefatoxim:

250 mg, tetracycline: 25 mg pha trong 5 ml dimethyl sulphoxide để tạo chất nền gel),0,1% topsin M (thiophanate methyl esterv- chất chống nấm), 4 mg/l bavastin chất diệt

nấm Than hoạt tính (0,1%) cũng được thêm vào để hấp thụ polyphenol (Ganapathi et al., 2001) Nội nhũ nhân tạo này nâng cao hiệu quả nảy mầm và sức sống của hạt đồng

thời có thể lưu giữ trong một thời gian dài mà không bị giảm sức sống

d) Bảo quản hạt nhân tạo

- Bảo quản phôi bằng phương pháp trữ lạnh

Có thể sử dụng phương pháp trữ lạnh và làm khô trong bảo quản hạt nhân tạo

Tuy nhiên, chỉ có phôi sinh dưỡng của một số loài có khả năng trữ lạnh như: Citrus

sinensis, Coffea arabica, Manihot esculenta (Florin et al., 1991).

Việc bảo tồn khả năng sống sót của phôi sinh dưỡng là vấn đề quan trọng trongcông nghệ sản xuất hạt nhân tạo Phôi sinh dưỡng khác với hạt bình thường là sinhtrưởng mà không có rễ Vì vậy, sẽ gây khó khăn trong dự trữ và đưa cây ra đồng.Việc dùng vỏ bọc hydrogel cũng có những bất thuận như phôi sinh dưỡng khônhanh khi phơi trong không khí, dẫn tới sự chết của phôi Ví dụ: phôi sinh dưỡng

của cỏ Linh lăng (Medicago sativa) bọc alginate, trữ ở 4°C sẽ gây ức chế hô hấp của

phôi hay bao phôi sinh dưỡng với nhựa polyox WSR-N, làm khô cũng dẫn tới giảmkhả năng sống của phôi trong thời gian dự trữ (IUCN/SSC, 1996)

Phôi sinh dưỡng cũng có thể được giữ ở điều kiện nhiệt độ lạnh hoặc bằng phươngpháp lạnh đông sâu mà không làm mất đi khả năng nảy mầm Bằng cách này, phôi cóthể bảo quản được ở nhiệt độ gần 0°C trong vài tuần hoặc có thể dài hơn rất nhiều,nhiệt độ bảo quản thường là 4°C Khả năng kéo dài thời gian dự trữ của hạt nhân tạođạt được khi phôi được làm khô ở độ ẩm ít hơn 20% (Karna and Fowke, 1988)

- Bảo quản dài hạn

Bảo quản lạnh sâu thường đề cập đến việc sử dụng nhiệt độ cực thấp (-80°C đến-196°C) để bảo quản vật liệu sinh học Tại nhiệt độ này, các phân chia ở mức độ tế

bào, các quá trình biến dưỡng được ngưng lại hoàn toàn Ưu điểm của bảo quản lạnhsâu là kiểm soát được nhiệt độ và độ ẩm, tránh được tác hại của sâu bệnh và côn trùngtăng cường sức sống và có ảnh hưởng rất nhỏ hoặc không ảnh hưởng về mặt di truyền.Khi cần, nó có thể được phục hồi và phát triển để tái tạo một cây trồng hoàn chỉnh.Phương pháp này thường được áp dụng để bảo quản các vật liệu bao gồm callus (mô

sẹo), mô phân sinh, mô phân sinh rễ, hạt, phấn hoa, phôi, protocorm hoặc PLBs.

Tuy nhiên, hầu hết những nguồn nguyên liệu bảo quản lạnh sâu không chịu được

ở nhiệt độ này, dễ bị những thương tổn (như hiện tượng tạo tinh thể đá, làm tổn hại phôi) Để giải quyết vấn đề này đã có một số phương pháp cải tiến như:

Hoá thủy tinh: là việc chuyển trực tiếp nước có trong nguồn mẫu bảo quản từpha lỏng sang pha vô định hình, để tránh xảy ra việc tạo tinh thể đá với việc bảoquản lạnh trong ni-tơ lỏng (-196°C)

Tạo vỏ bao dinh dưỡng: nguồn mẫu được bọc một lớp áo dinh dưỡng trước khiđược giữ ở nhiệt độ thấp

Làm khô: nguồn mẫu được khử nước trước khi được bảo quản lạnh

Bảo quản bằng những phương pháp này có thể tránh được các nguy cơ nhưnhiễm nấm, các đột biến sinh dưỡng Tuy nhiên, động tác kiểm tra lại sức sống, kiểugen, sự ổn định của nguồn mẫu trước khi mang sử dụng là cần thiết nhằm loại bỏnhững mẫu đã bị đột biến nếu có (Dương Tấn Nhựt, 2007)

1.6.2.5 Đánh giá sức sống của hạt nhân tạo sau bảo quản

Có ba phương pháp kiểm tra sức sống của hạt nhân tạo: Tetrazolium (TTC);Fluorescien diacetate (FDA); Màu xanh của Evan Trong số đó phương phápTetrazolium (TTC) là thích hợp cho việc xác định sức sống của hạt trong hầu hết

các loài trong đó có lan, đặc biệt là trạng thái ngủ hay chậm nảy mầm (Muñoz M et

al., 2008).

Phương pháp kiểm tra Tetrazolium (TTC): Các mẫu cây đã qua bảo quản lạnhđược ủ trong một dung dịch không màu TTC (2, 3, 5 - Triphenyl tetrazolium chloride)trong phòng tối ở 25 ± 2°C trong 24 giờ Các tế bào sống sẽ hiển thị màu đỏ vì enzymedehydrogenase trong tế bào sống làm giảm triphenyl tetrazolium chloride không màu

thành triphenyl formazan (giảm TTC) trong ty thể (Maneerattanarungroj et al., 2007).

1.7 Nghiên cứu thực vật học và nhân giống lan Hoàng thảo (Dendrobium)

trên thế giới và ở Việt Nam

1.7.1 Nghiên cứu thực vật học và nhân giống lan Hoàng thảo (Dendrobium)

trên thế giới

17.1.1 Nghiên cứu thực vật học lan Hoàng thảo (Dendrobium)

a) Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học lan Dendrobium

Shi-Jian Yang et al., (2016) nghiên cứu đặc điểm giải phẫu, tỷ lệ mất nước, sinh

lý của lá và giả hành của bốn loài Dendrobium trong việc duy trì sự cân bằng nước Kết quả cho thấy loài D chrysotoxum và D officinale có tỷ lệ mất nước thấp hơn, lớp biểu bì trên của lá dày hơn, nhưng độ dày lớp biểu bì thấp hơn Còn hai loài D.

chrysanthum và D crystallinum có lớp cutin mỏng hơn và tỷ lệ mất nước cao hơn,

mật độ tế bào ít hơn và hàm lượng nước bão hòa cao hơn trong giả hành Do đó, hai

loài D chrysanthum và D crystallinum có thể chống lại khô hạn bằng cách trữ nước

trong các giả hành để bù cho lớp cutin mỏng và nước nhanh mất qua lá Tương tự,trong điều kiện phòng thí nghiệm, giả hành mang lá bị cắt tỉa có tỷ lệ thoát nướcthấp hơn so với các mẫu chỉ cắt lá Điều này có nghĩa là hoa lan phụ sinh sử dụnghai phương thức khác nhau để duy trì cân bằng nước: lớp biểu bì dày để giữ nước ở

lá và trữ nước trong giả hành Kết quả cho thấy loài Dendrobium sp với lớp biểu bì

mỏng thường có giả hành với khả năng lưu trữ nước cao để bù đắp cho tốc độ mấtnước nhanh hơn

Metusala et al., (2017) đã nghiên cứu vi phẫu lá và thân của hai loài

Dendrobium từ môi trường sống khác nhau liên quan đến khả năng thích ứng của

chúng với điều kiện khô hạn Loài D capra được biết đến là một loài thích nghi với môi trường sống rừng khô, nơi mà hầu hết cây rụng lá vào mùa hè, trong khi D.

arcuatum thích nghi với rừng ẩm So với D arcuatum, đặc điểm giải phẫu của lan

D capra cho thấy thích nghi với điều kiện khô hạn hơn Lan D capra có lớp cutin,

lớp biểu bì, lớp dưới biểu bì và thịt lá dày hơn, bó mạch chính rộng hơn, mô cứngphát triển, mật độ khí khổng thấp hơn, lớp tế bào biểu bì cao hơn

Những kết quả này là cơ sở giúp các nhà trồng lan về cách thức sử dụng nướcthích hợp cho loài lan Hoàng thảo, có lợi cho việc bảo tồn và nuôi trồng hoa lan và

cũng là cơ sở để đưa ra các chế độ tưới nước, các loại phân bón và giá thể phù hợp cho lan Hoàng thảo nói chung và hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ nói riêng.

b) Nghiên cứu một số thành phần hóa sinh của chi lan Hoàng thảo (Dendrobium)

Chi Hoàng thảo (Dendrobium) được biết trong các bộ phận của cây có chứa một

số hoạt chất như: phenol, alkaloids, coumarin, tecpen, flavonoids và

polysaccharides…(Sunita Shailajan et al., 2015) Polysaccharides từ chi Hoàng thảo

có chức năng điều hòa miễn dịch, chống oxy hoá và hoạt động bảo vệ gan; alkaloidschống đục thủy tinh thể và bảo vệ thần kinh, các hợp chất thơm và sesquiterpenoid

có hoạt tính chống tạo mạch, chống khối u và tác dụng chống biến chứng,…(Jun

Xu, 2015)

Theo nghiên cứu của y học cổ truyền và y học hiện đại cho thấy, nhiều loài thuộcchi Hoàng thảo có tác dụng tốt cho sức khỏe con người: làm thuốc bổ, thúc đẩy việcsản xuất các chất dịch cơ thể, có lợi cho dạ dày, kéo dài tuổi thọ, chống lão hóa, giảmđau, hạ sốt, chống viêm, chống sự kết tụ tiểu cầu, bảo vệ gan, chống chứng xơ hóa,chống virút, trị nấm, kháng khuẩn, chất chống oxy hóa, điều trị bệnh tiểu đường, bảo vệ

thần kinh, điều hòa miễn dịch và chống ung thư, (Veronika Cakova et al., 2017) Các hợp chất khác nhau được xác định từ D nobile có khả năng kháng u và chống

gây đột biến Các alkaloids như: dendramine, nobilonine, erianin và phenanthrene có

khả năng chống khối u ác tính được phân lập từ D nobile, chất gigantol trong D ovatum rất hiệu quả trong chữa bệnh đau dạ dày, bài tiết mật và cũng được sử dụng như thuốc nhuận tràng Lan D tokai được sử dụng làm thuốc tránh thai ở Ấn Độ Trong hầu hết các loài của chi Dendrobium, các flavonoids chính là quercetin và kaempferol Erianin và chrysotoxine được phân lập từ D chrysotoxum, thường được sử dụng hạ sốt

và thuốc giảm đau trong y học cổ truyền Trung Quốc Một số hợp chất (gigantol,

moscatilin, homoeriodictyol, scoparone, scopoletin) được phân lập từ D densiflorum

có tác dụng chống kết tụ tiểu cầu (Jaime TeixeiradaSilva, 2013a)

Lan D speciosum đã được sử dụng như một loại lương thực chống đói khẩn cấp Lan D teratifolium và D discolor đã được sử dụng như một vị thuốc để điều

trị bệnh lỵ, giảm đau và trị nấm ngoài da (Bijaya Pant, 2013)

Theo y học cổ truyền, lan Nghệ tâm (D loddigesii) có tác dụng chống tế bào ung

thư dạ dày và ung thư phổi, chất chống đông máu (Tsai et al., 2010), điều trị bệnh tiểu đường type 2 (Zhang et al., 2011) Trong lan Nghệ tâm có chứa shihunine, 9,10

dihydrophenanthrene 2,4,7 triol, moscatin, loddigesiinols C, moscatilin, gigantol và

tristin (Li Chunyan et al., 2013).

Theo nghiên cứu của Ho Kyung Jung et al., (2015) chất chiết xuất từ lan Nghệ

tâm có hiệu quả ức chế melanin, ức chế hoạt động tyrosinase và phát triển dendrite,

có tác dụng làm trắng da

Theo Caimei Gu et al., (2017) trong lan Nghệ tâm có polysaccharides (14,923%), alkaloids (0,109 %), bibenzyn gigatol (0,08973%) Veronika Cakova et

al., (2017) cho rằng moscatilin trong Nghệ tâm có tác dụng ngăn ngừa tế bào ung

thư tuyến giáp, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thực quản, ung thư tuyến tụy.Loddigessinol G-J, Crepidatuol B có tác dụng điều trị bệnh tiểu đường

Gần đây nhất, Huiping Chen et al., (2018) sử dụng phương pháp sắc ký, xác

định được trong Nghệ tâm có diglucoside, flifimdioside A (1), một alkaloids dạngimidazolium, anosmine (4)

Lan Hạc vỹ (D aphyllum) được coi là một loại cây thuốc quý, trong số các

“Thần nông thảo dược” và được xếp vào loại sản phẩm cao cấp có tác dụng bổ âmthanh nhiệt, tạo nước bọt có lợi cho dạ dày, bổ phế và giảm ho Bằng phương phápphân tích quang phổ, các nhà khoa học đã chứng minh các polysaccharides (đườngđa) AP là Acetylglucose - O, chứa liên kết β (l-›4), dạng vòng của mỗi chất cặn thủyphân có dạng tháp trong đó các mạch chính được cấu tạo bởi D-manose và D-glucose Các thí nghiệm lâm sàng tiến hành trên động vật cho thấy AP có hoạt tính

tổng hợp chất miễn dịch tốt (Zhao Yong-Ling et al., 1994).

Zhang, (2008) đã xác định được trong thân lan Hạc vỹ có chứa: moscatilin,gigantol, batatasin, tristin, moscatin, hircinol, salidroside và p-hydroxylbenzylacetic

acid Veronika Cakova et al., (2017) cho rằng ngoài polysaccharides còn có các hợp

chất phenol như moscatin, moscatilin và tricetin 3', 4', 5'-trimetyl ete glucopyranoside, ức chế sản xuất NO, có hoạt động điều hòa miễn dịch

7-O--Các chất chống oxy hoá peptide được chiết xuất từ Hạc vỹ (D aphyllum) bao

gồm superoxidedismutase, catalase và glutathione peroxidase Các axit amin: Ala,

Val, Ile, Leu, Tyr, Phe, Try, Pro, Met và Cys chỉ ra rằng peptit DA-P có hàm lượng

chất dinh dưỡng cao và có hoạt động chống oxy hoá tối ưu (Huifan Liu et al., 2017).

Từ các nghiên cứu trên cho thấy rất cần thiết phải nhân giống hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ phục vụ cho sức khỏe con người cũng như bảo tồn nguồn gen quý

1.7.1.2 Nghiên cứu về nhân giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới

a) Nghiên cứu về nhân giống in vitro

- Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân giống

Nền môi trường nuôi cấy với nồng độ và tỷ lệ khác nhau của các nguyên tố

khoáng đa, vi lượng, vitamin có ảnh hưởng rất rõ đến kết quả nuôi cấy in vitro cây lan Dutta et al., (2011) đã sử dụng hạt của Hạc vỹ 15 tuần tuổi được nảy mầm trên môi trường MS Hạt giống hình thành protocorm sau 5 tuần nuôi cấy Các PLBs cho

tỷ lệ nảy mầm, số chồi và rễ nhiều hơn trên môi trường MS bổ sung IAA + KIN

Mohammad Musharof Hossain et al., (2013) nghiên cứu nhân giống lan Hạc vỹ

lại cho rằng trên môi trường Phytamax (Sigma) + 1 mg/l BA cho tỷ lệ hạt nảy mầm;

hệ số nhân protocorm đạt cao hơn khi bổ sung thêm 1 mg/l αNAANAA vào môi trường

nuôi cấy

Sagaya Mary and Divakar (2015), nghiên cứu trên ba loại môi trường VW, B5

và KC cho gieo hạt in vitro với lan D macrostachyum, môi trường VW + 0,5 mg/l

BAP + 5 mg/l αNAANAA là phù hợp nhất cho sự hình thành cây con Môi trường VW+1,5 mg/l BAP + 1,5 mg/l αNAANAA + 50 ml/l sữa dừa + 500 mg/l THT phù hợp cho

tạo rễ cây in vitro.

Đối với loài lan D jerdonianum Wight, Sagaya Mary et al., (2016) cho rằng

môi trường MS thích hợp cho nuôi cấy từ hoa Môi trường KC phù hợp với nuôi cấy

từ lá Môi trường VW phù hợp với nuôi cấy từ đốt thân

- Ảnh hưởng của nguồn các bon hữu cơ đến kết quả nhân in vitro

Ảnh hưởng của nguồn các bon hữu cơ đến nuôi cấy in vitro cây lan đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu Theo Ferreira et al., (2011) trên loài

Dendrobium Second Love ở các giai đoạn khác nhau thì thích hợp với các nồng độ

sucrose khác nhau, số rễ hình thành nhiều khi sucrose ở hàm lượng 60 g/l, ở nồng

độ 20 g/l thuận lợi cho nhân chồi và ở 40 g/l chiều dài rễ phát triển cao nhất

Tapash Kumar Bhowmik et al., (2017) sử dụng 3 loại carbohydrate khác nhau, sucrose, glucose và lactose thúc đẩy sự nảy mầm của loài D palpebra, kết quả cho

thấy sử dụng 20 g/l sucrose thích hợp nhất cho sự nảy mầm của hạt trên môi trườngPhytamax (PM)

- Ảnh hưởng của các hỗn hợp chất hữu cơ tự nhiên đến kết quả nhân giống in

vitro

Trong nuôi cấy in vitro cây lan, hàng loạt các tác giả trong và ngoài nước đã

nghiên cứu sâu về ảnh hưởng của các hỗn hợp chất hữu cơ tự nhiên đến sự sinh trưởngphát triển của mẫu cấy Dịch nghiền cà chua thường được bổ sung vào môi trường vi

nhân giống hoa lan và có hiệu quả với một số loài lan như: D noblie (Soares et al.,

2013) Nước ép cà chua và nước dứa 15% cho thấy tỷ lệ nảy mầm tốt nhất đối với gieo

hạt in vitro lan D ovatum (Willd.) (Thejaswini and Narasimhan, 2017).

Trên đối tượng D lasianthera, bổ sung 2 g/l peptone trong môi trường VW đã

được chứng minh là hàm lượng thích hợp cho sự nảy mầm của hạt (100%) và sự

hình thành chồi với sự phát triển của protocorm lên tới 84% Bổ sung 15% nước

dừa đã cải thiện hiệu quả sự phát triển của chồi, rễ và lá đều phát triển tốt (Edy

Setiti WidaUtami et al., 2017).

- Ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng thực vật đến kết quả nhân giống

in

vitro

Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đã được nhiều tác giả

quan tâm Lu Wenyun et al., (2004) đã nghiên cứu nhân giống lan Nghệ tâm (D.

loddigesii) cho kết quả: môi trường khởi động thích hợp nhất: MS + 0,1 mg/l αNAANAA

+ 1 mg/l BA, môi trường nhân nhanh phù hợp: MS + 0,1 mg/l αNAANAA + 3,0 mg/l

BA, môi trường tạo cây hoàn chỉnh ½ MS + 0,7 mg/l αNAANAA Bai et al., (2004) đã nuôi cấy các đoạn thân mang mầm ngủ của Nghệ tâm (D loddigesii) ghi nhận rằng

môi trường khởi động thích hợp nhất MS + 0,3 - 0,9 mg/l BA + 0,1 - 0,3 mg/lαNAANAA Môi trường nhân nhanh MS + 0,9 mg/l BA + 0,2 mg/l αNAANAA, pH 5.8

Dake Zhao et al, (2013) nghiên cứu nhân giống và tạo hoa trong ống nghiệm loài lan D wangliangii, các tác giả tiền xử lý 1 mg/l GA3 trong 15 ngày, sau đó cấy trên

môi trường ½ MS + 2 mg/l BA + 0,1 mg/l αNAANAA + 100 ml/l sữa dừa, tỷ lệ protocorms

tăng lên 54,68% Ngoài ra, sự tạo cảm ứng cây ra hoa (100%) trên môi trường bổsung 2 mg/l TDZ và sự phát triển hoa tốt nhất khi bổ sung 0,3 mg/l paclobutrazol(PP333) và 0,5 mg/l αNAANAA.

Xin Qian et al, (2014) nghiên cứu khảo sát sản xuất hoa và hạt giống của loài lan D officinate Calluses đã được tạo ra từ các đỉnh chồi trên môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l BA + 0,05 mg/l αNAANAA Nhiều chồi được tái sinh từ các mẫu PLBs khi cấy môi trường MS + 1 mg/l αNAANAA Các cây con in vitro cao 2 - 4 cm, duy trì

được sẽ ra hoa với tỷ lệ cao nhất 83,2% và hoa bình thường 73,6% khi được nuôicấy trên môi trường MS + 15% nước dừa + 0,1 mg/l TDZ trong 9 tuần Phân tíchcác mô cho thấy hoa có hình thái bình thường so với giống gốc

Kanjana Juntada et al., (2015) tạo phôi soma từ protocorm và lá của loài D.

Sonia ‘Earsakul’ trên môi trường ½ MS + (0,1; 0,3 và 1 mg/l TDZ) hoặc kết hợp 0,1

mg/l αNAANAA hoặc 1 mg/l (2,4-D) không có sự khác biệt đáng kể trong tỷ lệ tạo phôisoma từ PLBs đạt (38,18 - 49%) Tỷ lệ tạo phôi soma từ lá đạt cao nhất là (18,75%)

Abdul Aziz Mirani et al., (2017b) đã nghiên cứu bổ sung αNAANAA và IBA vào môi trường nuôi cấy lan D nobile Kết quả ghi nhận với nồng độ ở 3 mg/l αNAANAA cây in vitro cho số lượng rễ nhiều hơn và rễ dài hơn so với IBA Tuy nhiên, khi sử dụng IBA ở nồng độ 1mg/l cũng có tác dụng rất hiệu quả cho quá trình ra rễ in vitro lan D nobile, khi tăng nồng độ IBA lên quá 1 mg/l sự tạo thành rễ bị ức chế.

Saranjeet Kaur, (2017) nuôi cấy cắt lát mỏng ngang thân cây con in vitro lan D.

chrysotoxum (chiều dày 2 mm), các mẫu cấy trên môi trường cấy trên môi trường

MS bổ sung cytokinin (1 mg/l BA, 1 mg/l KIN) riêng lẻ hoặc kết hợp auxin (1 mg/l

αNAANAA) cho tỷ lệ hình thành (PLBs) và tái sinh chồi cao trên cả môi trường lỏng vàđặc Cây con phát triển tốt trên môi trường MS + 50 g/l dịch chuối nghiền nát

Paromik Bhattacharyya et al., (2018) nhân giống lan D aphyllum từ các lớp tế

bào lát mỏng cắt ngang (t-TCL) Trên môi trường MS + 15 µM meta-topolin +

10 µM TDZ + 10 µM AgNO3 thích hợp cho sự phát triển của chồi sau 8 tuần nuôicấy đạt 39,41 chồi/mẫu cấy Trên môi trường ½ MS + 15 µM IBA cho tỷ lệ tạo rễ caonhất là 82,34%

Gần đây nhất, Parthibhan et al., (2018) nghiên cứu tái sinh phôi soma được hình

thành từ các lớp tế bào lát mỏng cắt ngang (tTCL) của lan D aqueum Lindley Các

tế bào lát mỏng cắt ngang tTCL (dày 0,5 mm) được nuôi cấy trên môi trường 1/2MS+ 0,5 mg/l zeatin cho tỷ lệ 41,42% phôi tạo callus/tTCLs; trên môi trường 1/2MS +1,5 mg/l adenine (2iP) có tới 42,66 phôi soma hình cầu/tTCLs nhưng chỉ chiếm10,33% phôi soma/tTCLs Trên môi trường 1/2MS + 1,5 mg/l adenine (2iP) + 0,5mg/l BA có tới 34 phôi soma hình cầu chiếm 14,7% phôi soma/tTCLs, trong khi sựkết hợp của 2iP + 1 mg/l IBA tạo ra 7,4 phôi soma hình cầu đạt tỷ lệ 52,33% phôisoma/tTCLs

Nhìn chung các biện pháp nhân giống đã được các tác giả trên thế giới nghiêncứu thành công, từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, mắt ngủ trên thân, lớp mỏng tế bào,tạo hoa và hạt giống trong ống nghiệm Các tác giả cũng đã xác định được môitrường nuôi cấy, nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh Trong đó, có sử dụng cả môitrường hóa sinh và các hợp chất phụ gia tự nhiên Chất lượng cây giống sau nuôicấy đạt tiêu chuẩn, có thể đáp ứng cho sản xuất và tiêu dùng

b) Nghiên cứu về tạo hạt giống nhân tạo lan

- Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản đến tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo

Việc bảo quản lạnh sâu các nguồn gen thực vật với thời gian bảo quản ổn địnhtrong ni-tơ lỏng là một hướng triển vọng trong lưu giữ các mầm hạt có giá trị Ởnhiệt độ của ni-tơ lỏng, hầu hết tất cả hoạt động trao đổi chất của tế bào dừng lại vàchúng có thể được bảo quản trong trạng thái như vậy với một thời gian kéo dài Chođến nay, việc bảo quản lạnh sâu với các loài lan vẫn còn rất hạn chế

Qin et al., (2008) cho rằng lớp vỏ maltose 4%, 6-BA mg/l và αNAANAA mg/l tỷ lệ

10:1, active carbon 0,1%, sodium alginate 4% cho kết quả khả thi trên đối tượng hạt

nhân tạo D huoshanese với tỷ lệ nảy mầm của hạt đạt cao 90,1%, tỷ lệ sống sót

cấy trên môi trường MS bổ sung 2 mg/l IAA Các hạt được bảo quản trong 60 ngày

ở 4°C vẫn không giảm sức sống Các PLBs không bọc chỉ có thể sống sót ở 4°C sau

15 ngày bảo quản Từ đó, cho thấy ưu điểm của việc bảo quản lạnh hạt nhân tạo Tỷ

lệ nảy mầm của hạt nhân tạo giảm dần theo thời gian bảo quản Hạt không bảo quảncho tỷ lệ nảy mầm cao nhất (95%) Tỷ lệ nảy mầm của hạt khi bảo quản ở nhiệt độphòng (25°C) thì thấp hơn khi bảo quản ở 4°C (66,4% và 88%) Hạt bảo quản trong

90 ngày cho tỷ lệ nảy mầm khi bảo quản ở nhiệt độ phòng và ở 4°C là 33,6% và44% PLB không bọc khi bảo quản 30 ngày đã không nảy mầm ở cả hai loại nhiệt

độ bảo quản

Zhang et al., (2011) đã cho rằng điều kiện tối ưu cho hạt nhân tạo D candicum

khi bổ sung maltose 4%, tỷ lệ 6-BA và αNAANAA 12:1, than hoạt tính 0,3%, sodiumalginate 4%, tỷ lệ nảy mầm 95,45 % và tỷ lệ sống của hạt đạt 82,35%

Mohanty et al., (2013) cho rằng hạt giống nhân tạo từ PLBs của D densiflorum

được gói gọn trong 3% sodium alginate và dung dịch 100 mM (CaCl2.2H2O) đượcbảo quản (ở nhiệt độ, 4, 8, 16°C, RT với thời gian 15, 30, 45, 60, 75, 90 ngày) Cáchạt nhân tạo tái sinh tốt nhất trên môi trường MS + 2 mg/l BAP Các hạt được bảoquản thành công ở 8°C đến 60 ngày và tỷ lệ cây tái sinh từ hạt nhân tạo đạt 95%

Bustam Suryanti et al., (2013) đã nghiên cứu các PLBs từ D Shavin White có kích

thước đồng nhất 3 - 5 mm được đóng gói trong sodium alginate Các hạt nhân tạo táisinh tốt trên môi trường ½ MS Các hạt được bảo quản tốt ở 25 ± 2°C, sau 75 ngày tỷ lệsống của hạt đạt 80 - 92%, sau 135 ngày tỷ lệ sống của hạt giảm còn 52%

Sukhumpinij and Chanasit (2015), đã bảo quản ngắn hạn protocorm (PLBs) của loài lan D friedericksianum Rchb.f trong ống nghiệm PLBs được bọc 3% sodium

alginate và 100 mM CaCl2.2H2O, được bảo quản ở nhiệt độ 40C và 250C, trong thờigian 30, 60, 90, 150 và 180 ngày Sau khi bảo quản PLBs được chuyển sang môitrường VW, các PLBs được bảo quản ở nhiệt độ 250C có khả năng nảy mầm tốt hơn

ở nhiệt độ 4 0C sau 180 ngày bảo quản

- Ảnh hưởng của vật liệu vỏ bọc đến khả năng nảy mầm của hạt nhân tạo

Khor et al., (1998), đã thành công trong việc sử dụng lớp bọc hai lớp (lớp trong

là alginate, lớp ngoài là chitosan hoặc lớp trong là alginate và lớp ngoài là gelatin)