Nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất selen hóa từ pectin phân lập từ cây cúc quỳ tithonia diversifolia

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HOÁ HỌC  NGUYỄN TRUNG ANH NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP DẪN XUẤT SELEN HÓA TỪ PECTIN PHÂN LẬP TỪ CÂY CÚC QUỲ TITHONIA DIVERSIFOLIA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA HỌC Đà Nẵng – 2018 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HỐ HỌC NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP DẪN XUẤT SELEN HĨA TỪ PECTIN PHÂN LẬP TỪ CÂY CÚC QUỲ TITHONIA DIVERSIFOLIA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HÓA HỌC SVTH: Nguyễn Trung Anh LỚP : 14CHD GVHD: TS Giang Thị Kim Liên Đà Nẵng – 2018 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐH SƯ PHẠM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc KHOA HÓA NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: NGUYỄN TRUNG ANH Lớp: 14CHD Tên đề tài Nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất selen hóa từ pectin phân lập từ cúc quỳ Tithonia Diversifolia Nguyên liệu, dụng cụ thiết bị - Nguyên liệu: Pectin phân lập từ cúc quỳ Tithonia Diversifolia Dụng cụ, thiết bị: ống sinh hàn, bình cầu, cốc thủy tinh, bình định mức, ống đong, pipet, giấy loc, máy bơm chân không, phễu, máy khuấy từ, … Nội dung nghiên cứu - Tổng hợp dẫn xuất selen hóa từ pectin phân lập từ cúc quỳ Tithonia Diversifolia đường hóa học Xác định phương án tối ưu (thay đổi khối lượng) để tổng hợp dẫn xuất selen hóa Nghiên cứu cấu trúc cúa chất hữu tổng hợp phương pháp phổ Nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa khả gây độc tế bào dẫn xuất thu Giáo viên hướng dẫn: TS Giang Thị Kim Liên Ngày giao đề tài: 3/2017 Ngày hoàn thành: 3/2018 Chủ nhiệm khoa Giáo viên hướng dẫn PGS.TS Lê Tự Hải TS Giang Thị Kim Liên tháng Sinh viên hoàn thành nộp báo cáo cho khoa ngày năm 2018 Kết điểm đánh giá Ngày tháng năm 2018 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này, em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Giang Thị Kim Liên tận tình hướng dẫn, giúp đỡ , nhiệt tình tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian làm khóa luận Em xin cảm ơn chị học viên cao học Bùi Vũ Thục Uyên giúp đỡ em nhiều suốt trình thực nghiên cứu Em xin cảm ơn thầy quản lí phòng thí nghiệm khoa Hóa tạo điều kiện cho em sử dụng phòng thí nghiệm tham gia nghiên cứu Do lần đầu tham gia nghiên cứu thực nghiệm nên em khơng thể tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận ý kiến đóng góp thầy để em hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Nghiên cứu tài trợ Quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia (NAFOSTED) đề tài mã số 106-NN.02-2013.49 Em xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, ngày 20 tháng năm 2018 Sinh viên thực Nguyễn Trung Anh MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Đối tượng phạm vi nghiên cứu Mục đích nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu 4.1 Phương pháp nghiên cứu lí thuyết 4.2 Phương pháp thực nghiệm Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 5.1 Ý nghĩa khoa học 5.2 Ý nghĩa thực tiễn Bố cục đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây cúc quỳ 1.1.1 Đặc điểm chung 1.1.2 Nguồn gốc phân bố 1.1.3 Ứng dụng 1.2 Pectin 1.2.1 Nguồn gốc 1.2.2 Cấu tạo 1.2.3 Tính chất đặc trưng 1.2.4 Ứng dụng 11 1.3 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 12 1.3.1 Ngoài nước 12 1.3.2 Trong nước 13 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên liệu 14 2.2 Hóa chất thiết bị 14 2.2.1 Hóa chất 14 2.2.2 Thiết bị, dụng cụ 14 2.3 Các phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Phương pháp tổng hợp hợp chất hữu 15 2.3.2 Phương pháp tinh chế 15 2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất hữu .16 2.3.4 Phương pháp khảo sát hoạt tính gây độc tế bào 21 2.4 Sơ đồ nghiên cứu 23 2.5 Quy trình tổng hợp 24 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28 3.1 Cấu trúc dẫn xuất Selen hóa 28 3.1.1 Sắc kí thẩm thấu gel GPC dẫn xuất selen hóa .28 3.1.2 Phổ hồng ngoại dẫn xuất Selen hóa 30 3.1.3 Phổ khối lượng ESI-MS dẫn xuất selen hóa 32 3.2 Hoạt tính chống oxy hóa pectin dẫn xuất Selen hóa 34 3.3 Xác định khả gây độc tế bào ung thư pectin dẫn xuất Selen hóa 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 Kết luận 37 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AAS : Phổ hấp thu nguyên tử (Atomic Absorption Spectrometry) ESI : Phương pháp phun mù điện tử (Electron Spray Ionization) FT-IR : Phổ kế hồng ngoại GPC : Sắc ký gel (Gel Permeation Chromatography) Hela : Ung thư cổ tử cung HepG2 : Ung thư gan IC50 : Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50) IR : Phổ hồng ngoại (Infrared Spectrometry) MCF7 : Ung thư vú MKN7 : Tế bào ung thư dày MS : Phổ khối lượng (Mass Spectrometry) NCI : Viện Ung thư Quốc Gia Hoa Kỳ (Nation Cancer Institue) OD : Mật độ quang học (Optical Density) SRB : Sulforhodamine B TCA : Axit trichloroaxetic TDP : Pectin phân lập từ cúc quỳ Tithonia Diversifolia TDP-Se : Dẫn xuất pectin selen hóa DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu bảng 1.1 3.1 3.2 Tác dụn Khối lượ Các phâ pectin v 3.3 Hoạt tín TDP- DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu hình 1.1 Cây hoa cúc qu 1.2 D – Galacturon 1.3 Đơn vị cấu trúc 1.4 Mơ hình cấu tạ 1.5 Công thức HM 1.6 Công thức LM 2.1 Pectin phân lập 2.2 Qúa trình thẩm 2.3 Sơ đồ minh họ 2.4 Mơ hình hoạt đ 2.5 Mơ hình máy đ 2.6 Mơ hình máy q 2.7 Quy trình tổng 2.8 Bộ thiết bị dùn 2.9 Hỗn hợp thu đư 2.10 Dung dịch (pH 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Cấu trúc dẫn xuất selen hóa 3.1.1 Sắc kí thẩm thấu gel GPC dẫn xuất selen hóa Để chứng minh phản ứng tổng hợp xảy ra, cần xác định cấu trúc số thơng số sản phẩm thơng qua sắc kí GPC quang phổ AAS Được đặc trưng khối lượng phân tử trung bình khối lượng (Mw), khối lượng phân tử trung bình số(Mn), khối lượng phân tử trung bình z(Mz), độ phân tán (PDI, Mw/Mn) cho tất mẫu trình bày Bảng 3.1 Kết cho thấy dẫn xuất pectin selen hóa có hàm lượng Se trọng lượng phân tử khác thu cách thay đổi điều kiện phản ứng Bảng 3.1 Khối lượng phân tử pectin dẫn xuất selen hóa Mẫu Pectin Pectin Selen hóa TDP – Se01 Pectin Selen hóa TDP – Se02 Pectin Selen hóa TDP – Se03 − Giá trị Mw tăng -OH mà thay HSeO [10] Vì vậy, giả định Mw mẫu pectin selen hóa cao diện nhóm chức chứa selen thêm vào thay nhóm hydroxyl pectin 29 Hình 3.1 Sắc kí đồ thẩm thấu gel - GPC mẫu Pectin Hình 3.2 Sắc kí đồ thẩm thấu gel - GPC mẫu dẫn xuất Selen hóa 30 3.1.2 Phổ hồng ngoại dẫn xuất Selen hóa Hình 3.3 Phổ FT-IR TDP (được kế thừa từ nghiên cứu trước) Hình 3.4 Phổ FT-IR dẫn xuất pectin selen hóa TDP-Se01 31 Hình 3.5 Phổ FT-IR dẫn xuất pectin selen hóa TDP-Se02 Hình 3.6 Phổ FT-IR dẫn xuất pectin selen hóa TDP-Se03 32 Dựa vào phổ FT-IR dẫn xuất pectin selen hóa so sánh với phổ FT-IR pectin (kế thừa nghiên cứu trước), nhận thấy chúng tương đồng với -1 Đỉnh khoảng 3400 2930 cm TDP Se-TDP tương ứng hấp thụ -1 C-H dao động kéo dài O-H Các dao động thuộc vùng từ 2200 đến 950 cm , coi "dấu vân tay" cacbohydrat, đặc trưng cho loại polysaccharide -1 [12] Các dải 1722 1651 cm quy kết tương ứng với nhóm cacbonyl (C = O) kéo giãn rung động nhóm methyl este hóa khơng este hóa carboxyl pectin Đặc biệt, so sánh phổ hồng ngoại pectin pectin selen hóa cho thấy, -1 phổ dẫn xuất selen hóa xuất thêm dải hấp thụ 640 cm , vạch hấp thụ không xuất phổ TDP Theo nghiên cứu trước -1 [13], dải đặc trưng 600 - 700 cm biểu dao động kéo dài Se-O-C bất đối xứng Điều chứng tỏ dẫn xuất pectin selen hóa tổng hợp thành cơng theo quy trình 3.1.3 Phổ khối lượng ESI-MS dẫn xuất selen hóa Như biết, phổ khối lượng ESI-MS công cụ nghiên cứu cấu trúc hữu hiệu hợp chất hữu nói chung polysaccharide nói riêng Con đường phân mảnh để tạo nên ion q trình ion hóa phân tử polysaccharide dựa phân ly liên kết C-O đơn vị saccharide chuỗi phân tử [11] Trong phổ MS TDP đỉnh (đỉnh có cường độ cao nhất) m/z 177 đỉnh m/z 189 axit galacturonic thành phần phân tử TDP Thêm vào đó, đỉnh 358 tồn đơn vị rhamnose galacturonic liên kết phân tử.Trong phổ này, đỉnh m/z 475 có cường độ thấp gán cho phân mảnh [(GalA - OH + Na) RhaAra] + cho thấy thay arabinose chuỗi bên trái xương sống rhamnogalacturonan Tuy nhiên, phổ MS TDP-Se, đỉnh m/z 475 có cường độ cao + góp mặt đáng kể ion [(GalA-O) (NaSeO 3) Rha + H ] Bên cạnh đó, phổ Se-TDP xuất số ion 521, 645, điều không chứng minh thành công q trình Selenyl hóa mà khẳng định mối liên kết homogalacturan rhamnogalacturonan TDP (Bảng 3.2.) 33 Bảng 3.2 Các phân mảnh phổ khối ESI-MS mẫu pectin pectin selen hóa m/z Phân mảnh + 177 [GalA – OH] 189 [GalA –CO + Na] 340 [GalARha ] 358 [GalARha + H2O] + + + + + [(GalA – O –H +Na )RhaAra ] + 475 + + [{(GalA–O )(NaSeO3)} Rha +H ] 521 [GalA{(GalA–OH) (NaSeO3)} + H2O] 534 645 + [GalAGalARha + H2O] + [GalA{(GalA-OH)(NaSeO3)}Rha – + Na + H3O] + Nói tóm lại, kết chứng minh nhóm selenyl thay thành cơng TDP q trình selenyl hóa 34 Hình 3.7 Phổ ESI-MS mẫu TDP Hình 3.8 Phổ ESI-MS mẫu TDP-Se01 3.2 Hoạt tính chống oxy hóa pectin dẫn xuất selen hóa 35 Đồ thị biểu diễn khả quét gốc hydroxyl tự pectin từ cúcquỳ dẫn xuất Selen hóa trình bày hình 3.9 Hình 3.9 Khả quét gốc hydroxyl tự pectin dẫn xuất Selen hóa Từ đồ thị cho thấy, khoảng nồng độ nghiên cứu từ 0,01 – mg/mL, nồng độ pectin TDP dẫn xuất TDP-Se tăng, khả quét gốc tự pectin dẫn xuất tăng dần Hoạt tính dẫn quét gốc hydroxyl mẫu TDP-Se01 cao so với pectin va dẫn xuất Tại nồng độ nghiên cứu mg/mL, khả quét gốc hydroxyl tự mẫu TDP-Se01, TDP-Se02, TDP-Se03 65,7, 59,5 55,3% khả quét gốc tự pectin nồng độ đạt 42,8% Kết cho thấy q trình selen hóa giúp tăng cường rõ rệt hoạt tính chống oxy hóa pectin 36 3.3 Xác định khả gây độc tế bào ung thư pectin dẫn xuất Selen hóa Hoạt tính gây độc tế bào ung thư mẫu TDP-Se TDP khảo sát thử nghiệm SBR dòng tế bào MKN7 Kết trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư MKN7 mẫu TDP dẫn xuất TDP-Se Nồng độ (µg/ml) 200 100 50 20 IC50 Kết cho thấy TPD-Se ức chế gia tăng tế bào ung thư dày người MKN7, tỷ lệ ức chế Se-TDP tăng đáng kể tăng liều tỷ lệ ức chế Se-TDP cao hẳn so với TDP Ngoài ra, TDP với liều thấp tạm thời gây tăng sinh tế bào Giá trị IC 50 TDP-Se01 (72.93 μg/mL), TDPSe02 (83.59 μg/mL), TDP-Se03 (92.58 μg/mL) thu từ tỷ lệ ức chế Điều gợi ý seleno-polysaccharide thu từ selenyl hóa tăng lên đáng kể độc tế bào tế bào khối u, hứa hẹn giải pháp tạo dẫn xuất có hoạt tính chống ung thư 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua trình nghiên cứu, thu kết sau đây: Tổng hợp dẫn xuất selen hóa từ pectin thơng qua đường hóa học thấy điều kiện tối ưu (khối lượng) để tổng hợp dẫn xuất selen hóa 70 C lượng pectin ban đầu 500mg Xác định cấu trúc pectin selen hóa phương pháp phổ IR với -1 dải phổ có bước sóng 700 – 600 cm đặc trưng cho dao động kéo dài Se – O – C bất đối xứng; phương pháp GPC xác định thơng số Mw, Mn, Mz Từ đó, so sánh cấu trúc dẫn xuất pectin selen hóa với pectin chứng minh thành công q trình selenyl hóa từ pectin Hoạt tính sinh học pectin selen hóa nghiên cứu so sánh với pectin Khả quét gốc hydroxyl tự mẫu dẫn xuất selen hóa 65,7% (TDP-Se01), 59,5 (TDP-Se02) 55,3%( TDP-Se03); Giá trị IC 50 dẫn xuất TDP-Se01 (72.93 μg/mL), TDP-Se02 (83.59 μg/mL), TDP-Se03 (92.58 μg/mL) thu từ tỷ lệ ức chế Kết nghiên cứu hoạt tính cho thấy nhóm selen thêm phân tử pectin làm tăng hoạt tính chống oxi hóa hoạt tính gây độc tế bào ung thư dòng MKN7 Kết hứa hẹn q trình selenyl hóa giải pháp hiệu nâng cao hoạt tính chống ung thư pectin Kiến nghị Do thời gian nghiên cứu có hạn, thông qua kết đề tài tiếp tục nghiên cứu hồn chỉnh quy trình bán tổng hợp dẫn suất selen hóa để nâng cao hiệu suất tiến hành quy mô lớn, tiếp tục khảo sát điều kiện khác (như nhiệt độ) ảnh hưởng đến q trình tổng hợp phản ứng hóa học nghiên cứu sâu đến hoạt tính sinh học dẫn xuất selen hóa phục vụ Y học 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1]Lê Hoàng Duy, Bài giảng Các phương pháp phổ nghiệm xác định hợp chất hữu [2]Nguyễn Thị Hiếu, Đồ án chuyên môn: Nghiên cứu Pectin ứng dụng công nghệ thực phẩm [3]Nguyễn Thị Thanh Ngọc, Chiết xuất pectin từ phế Bưởi [4]Hồ Viết Quý , Các phương pháp phân tích đại ứng dụng hóa học, NXB Đại học Quốc gia, Hà Nội, 1998 [5]Trần Minh Trang, Phạm Tiến Dũng, Lê Quốc Phong, Đinh Minh Hiệp, Nghiên cứu khả hấp thu Selenium nấm Ophiocordyceps sinensis ni cấy lỏng, Tạp chí phát triển KH&CN, Tập 19, Số T6, 53-60, 2016 [6]Nguyễn Đình Triệu, Các phương pháp phân tích vật lý hóa lý, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 2001 [7]Lê Ngọc Tú (chủ biên), Hóa sinh cơng nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội, 2002 TIẾNG ANH [8]Bo Yuan, Xu-qin Yang, Meng Kou, Chang-yan Lu, Yuan-yuan Wang, Jun Peng, Ping Chen, and Ji-hong Jiang, Selenylation of Polysaccharide from the Sweet Potato and Evaluation of Antioxidant, Antitumor, and Antidiabetic Activities, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2017 [9]Ji Y-B, Dong F, Lang L, et al, Optimization of Synthesis, Characterization and Cytotoxic Activity of Seleno-Capparis spionosa L Polysaccharide, International Journal of Molecular Sciences, 2012 [10] Lee J-H, Lee Y-K, Chang YH., Effects of Selenylation modification on structural and antioxidant properties of pectic polysaccharides extracted from Ulmus pumila, L International Journal of Biological Macromolecules, 2017 [11] Kailemia MJ, Ruhaak LR, Lebrilla CB, Amster IJ., Oligosaccharide Analysis By Mass Spectrometry: A Review Of Recent Developments, Analytical chemistry, 2014 39 [12] Kyomugasho C, Christiaens S, Shpigelman A, Van Loey AM, Hendrickx ME., FT-IR spectroscopy, a reliable method for routine analysis of the degree of methylesterification of pectin in different fruit- and vegetablebased matrices, Food Chemistry, 2015 [13] Qin T, Chen J, Wang D, Hu Y, Wang M, Zhang J, Nguyen TL, Liu C, Liu X, Optimization of Selenylation conditions for Chinese angelica polysaccharide based ống nghiệm immune-enhancing activity, Carbohydrate Polymers, 2013 [14] Yuan B, Yang X-q, Kou M, Lu C-y, Wang Y-y, Peng J, Chen P, Jiang J-h., Selenylation of Polysaccharide from the Sweet Potato and Evaluation of Antioxidant, Antitumor, and Antidiabetic Activities, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2017 [15] Wang J, Zhao B, Wang X, Yao J, Zhang J., Synthesis of Selenium- containing polysaccharides and evaluation of antioxidant activity in vitro, International Journal of Biological Macromolecules, 2012 [16] Zhen-Yuan Zhu, Synthesis, characterization and antioxidant activity of selenium polysaccharide from Cordyceps militaris WEBSITES [17] https://baigiang.violet.vn/present/show/entry_id/6851905 [18] http://biomedia.vn/review/phuong-phap-khoi-pho-ms.html 2.3.3 http://dieuduongchuyennghiep.vn/News/Default.aspx? Mod=ViewNews&Cate [19] ID=3&NewsID=10192 [20] http://doan.edu.vn/do-an/gioi-thieu-ve-pectin-25557/ [21] https://en.wikipedia.org/wiki/Pectin [22] https://en.wikipedia.org/wiki/Tithonia_diversifolia [23] https://glossary.periodni.com/glossary.php?en=dialysis https://hoadepviet.com/hoa-da-quy-cach-trong-va-cham-soc-hoa-da- [24] quy/ [25] http://hoatetdep.com/net-dep-cua-loai-hoa-da-quy/ [26] http://hungthinhvietnam.com/news/26-pectin-va-cac-ung-dung.html [27] http://nguyenquan.vn/tac-dung-lam-dep-da-cua-bot-pectin-chiet- xuat-tu-qua-tao/ 40 [28] http://www.ippa.info/types_of_pectin.htm 1.2.3 [29] pectin http://suckhoenamviet.com/co-che-tac-dung-va-duoc-tinh-cua- [30] http://thanhtrangpharma.com/selen-co-vai-tro-gi-doi-voi- co-the-con-nguoi.html [31] https://toc.123doc.org/document/374328-chuong-2-luoc-khao-tai- lieu.htm [32] https:// vi.wikipedia.org/wiki/Dã_quỳ [33] http://www.worldagroforestry.org/treedb/AFTPDFS/Tithonia_diversif olia.PD F ... Đối tượng phạm vi nghiên cứu Tổng hợp dẫn xuất selen hóa từ pectin phân lập từ cúc quỳ Tithonia Diversifolia Mục đích nghiên cứu - Thực nghiệm tổng hợp dẫn xuất selen hóa pectin - Xác định phương... khuấy từ, … Nội dung nghiên cứu - Tổng hợp dẫn xuất selen hóa từ pectin phân lập từ cúc quỳ Tithonia Diversifolia đường hóa học Xác định phương án tối ưu (thay đổi khối lượng) để tổng hợp dẫn xuất. .. tạo hợp chất hữu có hoạt tính sinh học cao 2 Do vậy, từ lí trên, em chọn đề tài Nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất selen hóa từ pectin phân lập từ cúc quỳ Tithonia Diversifolia. ” Đối tượng phạm vi nghiên