Đang tải... (xem toàn văn)
ki thuat rapd
2.2.6. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD ở điều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tương ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lượng và chiếu dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến. Kỹ thuật RAPD giúp nhận diện những chỉ thị phân tử trội [1] [6]. Các bước tiến hành kỹ thuật RAPD Bước 1: Tách chiết DNA DNA được tách chiết có chất lượng tốt (tương đối sạch và không bị gãy nhiều). Sử dụng phương pháp của Doyle và Doyle (1988) [1] [13]. Phương pháp này sử dụng CTAB (Hexadecyltrimethylammoniumbromid) – một chất tẩy cation hình thành phức hợp với những polysaccharide, protein, polyphenol,…. Phức hợp này sau đó được tách ra khỏi dung dịch tách chiết bằng hỗn hợp chloroform – isoamyl alcohol, bằng cách hình thành 2 pha: pha thứ nhất là dung dịch sạch ở phía trên có chứa DNA, pha thứ hai đặc hơn ở dưới chứa chloroform và tất cả những thành phần cần loại bỏ khác (polysaccharides, protein,…). Sau khi ly tâm, thu được DNA. Thông thường quy trình ly trích DNA ở thực vật gồm 3 giai đoạn: • Giai đoạn 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân. Tế bào lá được nghiền với dịch trích EB (extraction buffer) để phá vỡ màng tế bào, giải phóng các thành phần có trong tế bào ra ngoài môi trường dịch trích. • Giai đoạn 2: Làm biến tính protein, loại bỏ protein và các thành phần hữu cơ khác (polysaccharides, polyphenols, lipids,…). • Giai đoạn 3: Tủa DNA bằng isopropanol hay ethanol 100 %, thường tủa bằng isopropanol lạnh trước, sau đó tiếp tục tủa bằng ethanol 100 % kết hợp với muối. Một số vấn đề có thể gặp phải khi tách chiết DNA: • DNA bị phân hủy hoặc bị gãy. • Có RNA trong mẫu DNA. • Có polysaccharide trong mẫu DNA. • Có polyphenol trong mẫu DNA. Bảng 2.6. Thành phần và tác dụng của từng chất dùng để tách chiết DNA. Thành phần Tên gọi Bản chất Tác dụng pH Ức chế hoạt động của những enzyme phân hủy (như enzyme DNase hoạt động ở pH=7). Tris-HCl Dung dịch đệm Duy trì pH phù hợp. EDTA ethylenediamine-tetraacetate Ức chế những enzyme phân hủy DNA. sodium acetat. Muối -Kết hợp với ethanol 100% kết tủa và rửa sạch DNA. -Bảo vệ DNA. CTAB hexadecyltrime-thylammonium-bromide. Chất tẩy cation. -Hòa tan màng tế bào. -Biến tính protein. -Thành lập phức hợp với những protein, polysaccha-ride. CIA chloroform-isoamylalcohol. Chiết xuất protein và những polycaccharide. isopropanol Kết tủa DNA. ß-mercaptoetha-nol Tác nhân phá hủy màng nhân và kháng lại sự oxi hóa. -Ức chế quá trình oxi hóa. -Phá vỡ màng nhân. -Bảo vệ DNA khỏi những quinone, disulfite, peroxi-dase, polyphenoloxydase. ethanol 100% -Kết tủa DNA. -Rửa sạch DNA. Có thể gây hại cho DNA do vậy phải kết hợp với muối. ethanol 70% Rửa sạch DNA. Không gây hại cho DNA do ở nồng độ thấp. Bước 2:Thực hiện phản ứng PCR: Phản ứng PCR được thực hiện với các primer ngắn, thiết lập điều kiện phản ứng nghiêm ngặt để hạn chế tạo ra những sản phẩm không chính xác. Bước 3: Điện di phát hiện: Kết quả PCR – RAPD được điện di trên gel agarose. Bước 4: Dùng kết quả điện di mã hoá và chạy trên chương trình NTSYS để phân tích đa dạng di truyền giữa các chủng giống Kết quả : Có được bảng hệ số đồng dạng di truyền và sơ đồ cây thông từ đó có thể biết được mức độ gần gũi giữa các loài 2.2.6.2. Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD Về mặt kỹ thuật: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trước trình tự bộ gene của đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản. Chất lượng DNA khuôn không cần độ tinh sạch cao. Thời gian thực hiện nhanh. Khả năng nhân bản cao. Về mặt kinh tế: Chi phí thực hiện thấp. Kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao [6]. 2.2.6.3. Những hạn chế của kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao, không ổn định (thể hiện ở mức độ lặp lại giống nhau thấp). Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhưng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao. Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao [1] [6]. 2.2.6.4. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD được phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời, mặc dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhưng vẫn còn được sử dụng do ưu điểm dễ thực hiện và chi phí thấp. Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD: Đánh giá đa dạng di truyền: Đã được áp dụng trên các đối tượng: cúc lai, cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây, khoai tây, cà chua,… Nhận diện chỉ thị phân tử: Ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền và mối tương quan giữa kiểu gene RGA và kiểu hình phản ánh bệnh đạo ôn của một số giống lúa ở Việt Nam (Lã Tuấn Nghĩa và ctv, 1999) [1] [6]. Xây dựng bản đồ gene: Sử dụng phương pháp BSA kết hợp kỹ thuật RFLP và RAPD lập bản đồ gene tms – 1 của dòng lúa TGMS (5460S) (Wang và ctv, 1995) [1] [6].[/b] 2.3.4. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 2.3.4.1. Giới thiệu về kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết truớc, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng RAPD ở điều kiện nhu nhau sẽ tạo ra số lƣợng các đoạn DNA bằng nhau và chiều dài các đoạn DNA tƣơng ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lƣợng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến. Kỹ thuật RAPD giúp nhận diện những chỉ thị phân tử (marker) trội Về cơ bản kỹ thuật RAPD đƣợc thực hiện theo ba bƣớc: - Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR - Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid - Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram) các số liệu thu đƣợc cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu 2.3.4.2. Một số vấn đề thƣờng gặp khi thực hiện phản ứng RAPD Nồng độ primer tối ƣu thƣờng nằm trong khoảng từ 0,2 – 0,3 mM. Nồng độ DNA mẫu khác nhau có thể làm thay đổi số băng trên bảng gel điện di. Vì vậy nồng độ DNA mẫu xem là thích hợp cho mỗi phản ứng: 10 – 50 ng/25 μl thể tích phản ứng. PCR buffer thƣờng đƣợc cung cấp theo Taq - polymerase và có thể có hoặc không có Mg2+. Kỹ thuật RAPD phụ thuộc rất nhiều vào nồng độ Mg2+, nếu nồng độ Mg2+ khác nhau thì sản phẩm RAPD sẽ khác nhau, sự thay đổi nồng độ Mg2+ thƣờng thay đổi số lƣợng băng DNA trên gel. Taq - polymerase của các nhà sản xuất khác nhau cho kết quả sản phẩm khác nhau rất lớn. Vì vậy, loại Taq - polymerase và nồng độ của Taq đòi hỏi phải chính xác và đƣợc xác định qua thực nghiệm. Việc chọn loại Taq polymerase phù hợp là rất quan trọng Chu kỳ nhiệt có thể có sự thay đổi về số chu kỳ và nhiệt độ, điều này phụ thuộc vào máy PCR và độ dày của eppendorf. RAPD thƣờng đƣợc tiến hành với 45 chu kỳ (KurtWeising và ctv, 1995). 2.3.4.3. Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD Về mặt kĩ thuật : phƣơng pháp RAPD không đòi hỏi ta phải biết trƣớc trình tự gen của sinh vật cần nghiên cứu. Số lƣợng DNA cần thiết ít và không cần quá tinh sạch. Thời gian thực hiện ngắn, thao tác đơn giản. Về mặt kinh tế: chi phí thực hiện thấp. Kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá sự đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao (Nguyễn Thị Lang, 2002). 2.3.4.4Những hạn chế của kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao và không ổn định. Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhƣng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao. Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao (Nguyễn Thị Lang, 2002) 2.3.4.5. Ứng dụng cũa kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD đƣợc phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời, mặc dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhƣng vẫn còn đƣợc sử dụng do ƣu điểm dễ thực hiện và chi phí thấp. Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD Đánh giá đa dạng di truyền: đã đƣợc áp dụng trên các đối tƣợng: cúc lai, cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây, khoai tây, cà chua.v.v. Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm, chƣơng trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao. Đối với nấm bệnh thực vật thì kỹ thuật RAPD đã đƣợc áp dụng để phân tích đa dạng di truyền của nhiều loại nấm khác nhau: Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. et de Not, Corynespora cassiicola Nhận diện chỉ thị phân tử: ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền và mối tƣơng quan giữa kiểu gen RGA và kiểu hình phản ánh bệnh đạo ôn của một số giống lúa ở Việt Nam (Nguyễn Thị Lang, 2002). Ngoài ra kỹ thuật RAPD còn đƣợc áp dụng xây dựng bản đồ gen (Nguyễn Thị Lang, 2002) .3.4.6. Những cải tiến của kỹ thuật RAPD Đã có vài cải tiến của kỹ thuật RAPD đƣợc mô tả. Kỹ thuật thứ nhất là sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau thay vì sử dụng 1 primer nhƣ kỹ thuật RAPD thông thƣờng. Phƣơng pháp này có thể làm tăng hoặc giảm đi số băng so với khi sử dụng một primer. Việc lựa chọn, sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau một cách phù hợp cũng có thể làm tăng tính đa hình của những primer cho sản phẩm ít đa hình. Cải tiến thứ 2 là cắt DNA bằng các enzyme giới hạn trƣớc hoặc sau khi thực hiện phản ứng PCR. Sự cắt này cũng có thể tạo ra hai kết quả. Một là có thể làm giảm số lƣợng các băng khó xác định (complex band), điều đó làm dễ dàng hơn cho việc đánh giá đa dạng di truyền. Hai là tạo ra sự đa hình ở các mẫu có hạn chế về sự đa hình. Tuy nhiên việc sử dụng những cải tiến tuỳ thuộc vào chiến lƣợc nhằm làm tăng số chỉ thị đa hình có thể hoặc đạt đƣợc các chỉ thị đồng trội. Những cải tiến này có hạn chế là làm giảm đi lợi thế của kỹ thuật RAPD cụ thể là tốc độ, giá thành và sử dụng phức tạp hơn (Kurt Weising và ctv, 1995) VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.2.2.3. Những hoá chất sử dụng để điện di sản phẩm RAPD - Agarose - TAE 0,5X - Loading dye 6X - Ethidium bromide 3.2.3.2. Các dụng cụ và thiết bị được sử dụng trong phản ứng RAPD: - Hộp đá khô -20oC - Eppendorf 0,2 ml - Micropipette 10 µl, 100 µl và các loại đầu tip tƣơng ứng - Máy luân nhiệt - Tủ thao tác vô trùng