Kỹ thuật tách chiết và xử lý mẫu trong kỹ thuật phân tích hiện đại

Xử lý mẫu là gì - Xử lý mẫu là quá trình hoà tan (dissolution) và phân huỷ (digestion), phá huỷ cấu trúc mẫu ban đầu lấy từ đối tượng phân tích, để giải phóng và chuyển các chất cần xác định về một dạng đồng thể phù hợp (ví dụ dạng dung dịch) cho một phép đo đã chọn để xác định hàm lượng của chất mà chúng ta mong muốn. - Xử lý mẫu có hai quá trình xẩy ra đồng thời là: • Phá huỷ cấu trúc ban đầu của chất mẫu (digestion of Sample Matrix), • Hòa tan giải phóng chất cần xác định về dạng dung dịch đồng thể. - Xử lý mẫu có hai quá trình xẩy ra đồng thời là: • Phá huỷ cấu trúc ban đầu của chất mẫu (digestion of Sample Matrix), • Hòa tan giải phóng chất cần xác định về dạng dung dịch đồng thể.

Trường Đại Học Tôn Đức Thắng

Khoa: Khoa Học Ứng Dụng Ngành: Công Nghệ Sinh Học

Báo Cáo Môn Các Phương Pháp Hóa Sinh Hiện Đại

KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT VÀ XỬ LÝ

MẪU TRONG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI

1 Yêu cầu chung của các kỹ thuật xử lý mẫu phân tích

1.1 Xử lý mẫu là gì

- Xử lý mẫu là quá trình hoà tan (dissolution) và phân huỷ (digestion), phá huỷ cấu trúc mẫu ban đầu lấy từ đối tượng phân tích, để giải phóng và chuyển các chất cần xác định về một dạng đồng thể phù hợp (ví dụ dạng dung dịch) cho một phép đo đã chọn để xác định hàm lượng của chất mà chúng ta mong muốn - Xử lý mẫu có hai quá trình xẩy ra đồng thời là:

• Phá huỷ cấu trúc ban đầu của chất mẫu (digestion of Sample Matrix),

• Hòa tan giải phóng chất cần xác định về dạng dung dịch đồng thể

- Xử lý mẫu có hai quá trình xẩy ra đồng thời là:

• Phá huỷ cấu trúc ban đầu của chất mẫu (digestion of Sample Matrix),

• Hòa tan giải phóng chất cần xác định về dạng dung dịch đồng thể

1.2 Tại sao phải xử lý mẫu phân tích

- Để đưa các chất cần xác định về một trạng thái thích hợp cho phép đo, theo phương pháp phân tích đã chọn

- Các kết quả phân tích phải phản ánh và đại diện đúng cho đối tượng cần nghiên cứu,

theo dõi

- Với bất kỳ một phương pháp xác định, mỗi chất phân tích chỉ có thể được xác định

chính xác khi nó tồn tại ở một trạng thái nhất định và đồng nhất phù hợp với kỹ thuật phân tích

Ví dụ: Để xác định các kim loại (ví dụ: Fe, Cu, Mn, ) trong mẫu thịt, chúng ta không thể bỏ ngay mẫu thịt vào máy quang phổ hấp thụ nguyên tử để đo, cần phải đưa các kim loại tồn tại trong mẫu về trạng thái ion hay hợp chất tan được trong dung dịch nước, sau đó míi xác định được chúng trong dung dịch này

- Mẫu phân tích có nhiều chủng loại, đa dạng, có thành phần đơn giản đến loại có thành

phần phức tạp Chúng có thể tồn tại ở các trạng thái khác nhau như rắn từng cục, từng mảnh, hay lỏng, khí, và huyền phù Không thể cho nguyên mẫu như thế vào các máy để đo và xác định được phải xử lý để đưa các chất cần phân tích (cần xác định) về trạng thái phù hợp nhất cho một phương pháp đã được chọn để xác định nó

- Các chất cần xác định tồn tại ở trạng thái liên kết hoá học khác nhau, trong các hợp

chất vô cơ, hữu cơ khác nhau, có khi rất bền vững, lượng chất ở mỗi vị trí trong mẫu cũng không đồng đều, nên không thể xác định đúng hàm lượng của nó trong một tổ hợp phức tạp, bền vững và bị các nguyên tố, các chất liên kết khác cản trở, do đó cần phải xử lý mẫu để phá

vỡ các hợp chất mà chất phân tích đang tồn tại, đưa chúng sang một dạng phù hợp để định lượng tốt và đúng theo phương pháp đã chọn

Vậy muốn phân tích một đối tượng nào, chúng ta phải lấy mẫu, xử lý phù hợp để có được một trạng thái hay một dung dịch mẫu phân tích xác định các chất mong muốn

- Việc xử lý mẫu theo cách nào, là tuỳ thuộc vào:

+ Đối tượng mẫu, matrix của mẫu

+ Bản chất, tính chất của các chất cần phân tích

+ Trạng thái tồn tại, cấu trúc vật lý hoá học của các chất trong mẫu

+ Phương pháp phân tích được lựa chọn để xác định chúng

+ Hàm lượng của chất cần xác định ở mức nào trong mẫu

Trên cơ sở các yếu tố đó chúng ta chọn cách xử lý phù hợp cho chất phân tích

Ngày nay các kỹ thuật xử lý mẫu phân tích đã và đang được dùng đó là:

• Kỹ thuật vô cơ hoá khô (xử lý khô),

• Kỹ thuật vô cơ hoá ướt (xử lý ướt)

• Kỹ thuật vô cơ hoá khô- ướt kết hợp,

• Các kỹ thuật chiết (lỏng-lỏng, chiết rắn-lỏng, chiết rắn-khí, ),

• Kỹ thuật vi chiết pha rắn: SPME

• Chiết nhờ sự khuấy trộn của thanh khuấy từ: SBSE

Tuy nhiên trong quá trình lấy mẫu một số đối tượng cần phải xử lý sơ bộ ngay trước khi mang mẫu về phòng thí nghiệm

2.Các phương pháp tách chiết theo phương pháp hóa sinh hiện đại ngày nay:

Nguyên tắc: Chiết là dựa trên cơ sở sự phân bố (hay hoà tan) khác nhau của chất phân tích vào trong hai pha (2 dung môi) không trộn lẫn vào nhau Tức là các chất phân tích tan tốt trong dung môi này, nhưng lại không tan tốt trong dung môi kia Nghĩa là sự phân bố của một chất trong hai dung môi ( 2 pha) là rất khác nhau Nhờ đó mà chúng ta lấy được chất cần phân tích ra khỏi pha mẫu ban đầu, chuyển nó vào pha thứ 2 (dung môi) mà chúng ta mong muốn Sau đó xác định nó trong dung môi chiết Như thế yếu tố quyết định sự tách và xử lý mẫu ở

đây là hệ số phân bố của chất trong 2 pha ( dung mơi), và các điều kiện thực hiện lắc chiết Khi hệ số K pb lớn sẽ cĩ hiệu suất chiết cao

Các điều kiện của sự chiết

Để cĩ được kết quả chiết tốt, quá trình chiết phải cĩ các điều kiện và đảm bảo được các yêu cầu nhất định sau đây:

Dung mơi chiết phải tinh khiết cao, để khơng làm nhiễm bẩn thêm các chất phân tích vào mẫu

Dung mơi chiết phải hồ tan tốt các chất phân tích, nhưng lại khơng hồ tan tốt với các chất khác cĩ trong mẫu

Hệ số phân bố của hệ chiết phải lín, để cho sự chiết được triệt để

Cân bằng chiết nhanh đạt được thuận nghịch, để giải chiết được tốt

Phải chọn mơi trường axit, pH, loại axit thích hợp

Phải thực hiện ở nhiệt độ thích hợp

Phải lắc trơn đều để quá trình tách được tốt

2.1 Phương pháp vi chiết pha rắn (Solid phase microextraction): SPME

2.1.1 Giới thiệu:

SPME là lớp polymer mỏng ( là một lớp phủ bên ngồi lớp silicagel trong thiết bị SPME)

SPME hay là một phương pháp vi chiết pha rắn do hai nhà khoa học Berlardi và Pawliszyn khi hai ông tiến hành phân tích các hợp chất hóa học trong môi trường

Kĩ thuật SPME có thể được sử dụng để phân tích các cấu tử rất đa dạng trong cả thể rắn, lỏng và khí Đây là kĩ thuật dựa trên nguyên lý cân bằng giữa hai pha, và để phân tích định lượng chính xác thì quá trình tách cấu tử từ pha này sang pha kia phải được điều khiển vô cùng nghiêm ngặt Mỗi cấu tử cần phân tích đều có sự khác nhau về độ phân cực, độ bay hơi, hệ số phân bố trong pha nước và pha “dầu”, thể tích trong mẫu và trong không gian headspace, tốc độ dịch chuyển khi khuấy trộn

Quá trình thực hiện kĩ thuật SPME không cần sự hỗ trợ của các dung môi hữu cơ và cũng cần không gia nhiệt mẫu nên sự hình thành các cấu tử thứ cấp không mong muốn cũng giảm đáng kể

2.1.2 Mơ tả cấu tạo thiết bị:

Hình: cấu tạo thiết bị SPME

Thiết bị có dạng một ống tiêm có piston gắn lò xo và một bộ phận chứa cho phép piston dịch chuyển, thay đổi vị trí trong quá trình tách cấu tử hay khi giải hấp phụ Trong bộ phận chứa còn có một kim tiêm bằng thép không rỉ, và bên trong kim tiêm đó là một ống cũng bằng thép không rỉ được gắn chặt với cột làm bằng silicagel Phần dưới của cột được bọc bên ngoài bằng một lớp pha tĩnh Pha tĩnh này chính là tác nhân hấp phụ để tách các cấu tử hương đi ra khỏi dung dịch ban đầu Chức năng của “kim tiêm” là để đâm xuyên qua vách ngăn giữa bộ phận chứa mẫu và bộ phận tiêm mẫu vào thiết bị

GC, đồng thời nó còn dùng để bảo vệ cột silicagel không bị vỡ trong khi lưu giữ và sử dụng

PDMS là một trong các pha tĩnh không phân cực chịu được các điều kiện khắc nghiệt nhất và cột PDMS có khả năng hấp phụ và giải hấp phụ nhiều lần Khi cần phân tích các cấu tử có độ phân cực thấp thì có thể sử dụng cột PA Bề dày lớp chất mang PDMS thường là 7µm, 30µm, 100µm ; PA là 85µm; carboxen-PDMS là 75µm; PDMS-DVB là 65µm

Yêu cầu của pha tĩnh:

• Độ phân cực của pha tĩnh phải gần với độ phân cực của cấu tử cần tách

• Pha tĩnh phải chịu được các điều kiện nhiệt độ cao, pH, muối

Bề dày của pha tĩnh của các loại pha tĩnh được đưa ra như trên là do tính toán dựa vào yêu cầu về độ nhạy và tốc độ hấp phụ:

• Bề dày 100µm thường được sử dụng khi cần độ nhạy cao và ít quan tâm đến thời gian

Bề dày 7µm sử dụng khi cần thời gian ngắn và không cần quá nhạy (trường hợp nồng độ cấu tử cần phân tích đủ cao)

Cột SPME thường được bao bên ngoài một lớp polymer có bề dày xác định, có thể là loại không phân cực như Polydimethyl Silosane (PDMS) hay phân cực hơn như Carbowax Người ta có thể kết hợp các loại polymer với nhau (Carboxen, PDMS, carbowax, polymer của diphenylbenzen) để tạo ra các pha tĩnh có những đặc tính riêng dùng để tách các loại hợp chất dễ bay hơi đặc trưng

Trong hầu hết các phép phân tích, người ta thường sử dụng PDMS có bề dày 100µm Nếu cần thiết phải đạt trạng thái cân bằng hấp phụ sớm hơn thì người ta có thể dùng pha tĩnh PDMS có bề dày nhỏ hơn (30µm), còn bề dày 7µm thích hợp với những mẫu chứa các cấu tử có nhiệt độ bay hơi cao hoặc khi cần phải giải hấp phụ ở nhiệt độ cao trước khi vào sắc kí khí Pha tĩnh có có bề dày lớn hơn thích hợp với những hệ cần đạt cân bằng hấp phụ trong thời gian dài, nhưng những cột này sẽ nhạy hơn và hấp phụ được cả các cấu tử có khối lượng phân tử lớn

3 Cơ chế tách cấu tử trong phương pháp SPME:

Qúa trình gồm 2 giai đoạn: Giai đoạn chiết và giai đoạn nhả hấp phụ:

• Giai đoạn chiết:

Mẫu được chứa trong lọ chứa mẫu trước khi tiến hành tách mẫu, cột phải được làm sạch tại vì pha tĩnh cĩ thể hấp thụ các chất trong pha khí trước lúc lấy mẫu và sẽ cho ra các peak lạ trong quá trình phân tích

Lấy mẫu trực tiếp: kim tiêm sẽ đâm xuyên qua vách ngăn của bình chứa mẫu, sau đĩ cột sẽ bị đẩy nhơ ra ngồi khỏi kim tiêm và tiếp xúc với mẫu.Phần hấp phụ chứa PDMS sẽ hấp phụ các cấu tử trong mẫu

Nếu tách chiết mẫu bằng nguyên lý headspace (headspace là phần không gian ngay trên mẫu trong bộ phận chứa mẫu), cột chỉ nhô ra ngoài kim tiêm nhưng không đi vào dung dịch mà chỉ nằm trong phần không gian ngay trên mẫu Các cấu tử ( cấu tử bay hơi) trong không gian headspace sẽ hấp phụ lên bề mặt pha tĩnh

• Giai đoạn nhả hấp phụ

Sau thời gian lấy mẫu thích hợp (từ 1-20 phút), cột sẽ được rút vào trong kim tiêm và kim tiêm sẽ được tháo tách rời khỏi vách ngăn và sẽ được gắn vào bộ phận bơm mẫu của thiết bị chạy sắc kí khí Các cấu tử sẽ được giải hấp phụ bằng nhiệt nhờ nhiệt cung cấp từ bộ phận tiêm mẫu và sau đó sẽ được đưa vào cột sắc kí khí

Mỗi loại cột đều có mức độ phù hợp khác nhau đối với các cấu tử khác nhau Nhìn chung thì cột với chất mang không phân cực sẽ thu hồi tốt các cấu tử hương hơn Cột Polyacrylat sẽ nhạy khi phân tích cồn, phenol, aldehyde hơn là các ester và hydrocacbon

Bảng: so sánh mức độ thu hồi giữa cột PDMS 100µm và cột Polyacraylat 85µm: cấu tử hương nồng độ 10 ppm.

Cấu tử Cột PDMS Cột Polyacrylat

Ethyl acetate

n-Butanol

Hexanal

cis-3-Hexenol

Benzaldehyde

Ethyl caproate

Limonene

Linalool

Eugenol

β-Ionone

dimethyl sulfide

Pyrrolidine

Pyridine

4 1 54 6 22 320 1410 117 32 530 7 7 11

3,1 3,3 48,1 19,5 59 320 1410 117 32 530 6,3 7 3,7 Từ bảng trên, ta thấy cột Polyacrylat tách tốt các cấu tử có nhóm chức rượu (butanol, cis-3-hexenol, linalool), benzaldehyde, các hợp chất phenol như eugenol ;

trong khi đó đối với các cấu tử thuộc nhóm ester (ethyl acetat, ethyl caproat), hydrocacbon và pyridin thì khả năng tách kém hơn

2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến việc xử lý mẫu:

 Phương pháp tách chiết:

Phương pháp Headspace (HS) thường được khuyến cáo sử dụng khi có thể vì khi đó sẽ làm giảm tải trọng của cột (không phải hấp thụ những chất cao phân tử như protein), vì vậy mà tuổi thọ của cột cũng cao hơn Mặt khác, phương pháp HS cũng tránh được tính thuận nghịch trong hấp phụ nên tính chính xác cũng cao hơn Các cấu tử có phân tử khối dưới 200, hay có cấu trúc không có những nhóm tạo liên kết hydro

(-OH,-NH2 ) rất phù hợp cho phương pháp HS vì chúng thường có áp suất hơi cao

Phương pháp thực hiện SPME trực tiếp trong pha lỏng (direct SPME) thường sử dụng khi phương pháp HS cho các peak quá nhỏ

 Sự khuấy đảo:

Thời gian để đạt trạng thái cân bằng hấp phụ sẽ rút ngắn nếu ta tiến hành khuấy mẫu Các phương pháp khuấy thường sử dụng là khuấy từ, khuấy cơ học, khuấy nhờ vào chuyển động của cột SPME, hoặc khuấy nhờ siêu âm

 Thể tích mẫu (V w ) và thể tích phần HS (V h ):

Với phương pháp Headspace SPME: Lượng cấu tử tách được sẽ càng nhiều khi Vw

càng lớn (trong mức giới hạn), đồng thời Vh nên nhỏ đối với những cấu tử bay hơi tốt

Phương pháp Direct SPME: Vw không ảnh hưởng đến tốc độ tách cấu tử

Đến nay người ta vẫn chưa tìm hiểu được ảnh hưởng của Vw và Vh đến thời gian tách cấu tử Tuy nhiên, các nhà khoa học khuyến cáo nên sử dụng Vh lớn hơn Vw chừng

20 lần Với HS SPME, Kfh (hằng số cân bằng giữa pha tĩnh và headspace) và Khw (hằng số cân bằng giữa headspace và pha lỏng của mẫu) lần lượt sẽ tăng và giảm theo việc tăng nhiệt độ Và theo [70] , việc tăng nhiệt độ sẽ làm giảm tính nhạy của phương pháp tách SPME dựa vào cân bằng, tuy nhiên, tốc độ tách mẫu sẽ tăng Khwcàng lớn thì các cấu tử có độ bay hơi thấp sẽ tách hiệu quả hơn Ngoài ra, do việc truyền nhiệt kém trong

HS nên nhiệt độ của cột hấp phụ sẽ thấp hơn nhiệt độ của mẫu nên lượng cấu tử cần tách sẽ hấp phụ chậm dần theo thời gian

Nhìn chung, với mỗi dung dịch, cột hấp phụ và loại cấu tử cần tách, nhiệt độ tối thích thường được xác định bằng thực nghiệm

 Thời gian tách cấu tử bằng hấp phụ (t e ) :

Thời gian te được xác định từ khi đưa cột vào để hấp phụ cho đến khi không còn thấy peak nào xuất hiện thêm Thời gian thí nghiệm càng gần với te thì càng tốt vì như thế thì sẽ giảm được những sai số trong quá trình thí nghiệm và khi đó độ nhạy sẽ là cực đại te trong SPME thường ngắn hơn trong các phương pháp khác

 Nhiệt độ:

Theo nhiệt dộng học thì hằng số cân bằng Kfw (là tỉ lệ giữa nồng độ cân bằng của cấu tử trong cột hấp phụ và nồng độ cân bằng của cấu tử trong mẫu) giảm khi nhiệt độ giảm

Nhiệt độ ảnh hưởng nhiều nhất đến phương pháp Direct SPME: hệ số khuếch tán càng tăng khi độ nhớt giảm (độ nhớt thấp khi nhiệt độ càng cao) nhưng khi đó thì độ nhạy sẽ giảm

Pha tĩnh:

Chất mang sử dụng làm chất hấp phụ trong cột SPME bao gồm một hoặc hai loại polymer (như PDMS, PA, carboxen-PDMS, PDMS-polydivinylbenzen, carbowax- DVB)

Yêu cầu của pha tĩnh:

• Độ phân cực của pha tĩnh phải gần với độ phân cực của cấu tử cần tách

• Pha tĩnh phải chịu được các điều kiện nhiệt độ cao, pH, muối

2.1.5 Ưu và nhược điểm của SPME

 Ưu điểm

Các ưu điểm chính của SPME là không cần dùng dung môi trích ly, dễ thực hiện, cần ít thiết bị hơn các phương pháp khác, thời gian tiến hành ngắn, dễ tự động hóa, và có độ nhạy cao

Phương pháp SPME có thể sử dụng để tách các cấu tử có độ bay hơi thấp lẫn các cấu tử có độ bay hơi cao

 Nhược điểm

Quá trình tách cấu tử của SPME diễn ra chậm hơn hẳn các phương pháp khác (Liquid-liquid extraction, Solid-phase extraction với cột nhồi)

Thời gian tách cấu tử chậm, lượng cấu tử tách được là nhỏ làm cho độ nhạy của một số cấu tử có hàm lượng thấp là không đạt yêu cầu

Phương pháp tách trực tiếp (nhúng cột vào dung dịch) sẽ làm bẩn dung dịch cần phân tích

Thời gian giải hấp phụ cũng lâu hơn các phương pháp khác (SPE) Thường thời gian giải hấp là 12-20 phút, và do đó thời gian sắc kí cũng dài hơn

Cột hấp phụ sau mỗi lần sử dụng cần phải tốn thời gian để vệ sinh cột

SPME chỉ thường được sử dụng để tách các cấu tử có hàm lượng tương đối cao,

>0,1 mg/L

Một nhược điểm ảnh hưởng lớn đến chi phí thực hiện đó là phương pháp trên chỉ thực hiện gián đoạn

2.2 Phương pháp Chiết nhờ hấp phụ của thanh khuấy từ - Phương pháp Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE)

2.2.1 Giới thiệu

Phương pháp SBSE được phát minh bởi E.Baltussen Phương pháp này đã giải quyết được vấn đề tăng khả năng tách chiết (bằng hấp phụ) so với các phương pháp khác (SPME), nhờ vậy SBSE thường xuyên được sử dụng để xử lý mẫu có các cấu tử ở nồng độ vết Phương pháp này dựa vào nguyên tắc một thanh khuấy từ được bao phủ bởi một lớp pha tĩnh (PDMS), làm cho diện tích bề mặt pha tĩnh được nâng cao, từ đó làm tăng tỉ lệ pha và do đó tỉ lệ thu hồi cấu tử cũng được cải thiện đáng kể

2.2.2 Nguyên tắc

SBSE là phương pháp dựa vào nguyên tắc cân bằng pha, cấu tử cần phân tích sẽ phân bố trong pha lỏng chứa mẫu và pha chiết theo một tỉ lệ nhất định

Hình 2.21 :So sánh tỉ lệ thu hồi của cấu tử theo hai phương pháp xử lý mẫu SPME và SBSE với 100ml mẫu

Khi tiến hành phân tích các cấu tử có hàm lượng vết, ta cần chú ý đến tỉ lệ thu hồi lý thuyết, các yếu tố xử lý làm tăng nồng độ và lượng cấu tử thật sự được bơm vào máy sắc kí

Ngoài các yếu tố nhiệt động vừa kể trên thì động học của quá trình tách cấu tử vào cột SBSE cũng hết sức quan trọng Thời gian đạt cân bằng sẽ nhanh hơn nếu tăng thể tích cả hai pha Tuy nhiên, để xác định thể tích hai pha đem đi phân tích thì cần phải dựa vào thực nghiệm để xác định thời gian tách chiết thích hợp nhất