Tài liệu tóm tắt về những hiểu biết cơ bản về tải nạp, biến nạp, tiếp hợp Mặc dù tái tổ hợp gen ở sinh vật nhân chuẩn đã được nghiên cứu trong một thời gian dài nhưng những khám phá về tái tổ hợp ở sinh vật nhân sơ chỉ biết trong thời gian gần đây. Ở sinh vật nhân chuẩn, từ hai giao tử (đơn bội n) cơ thể hợp thành một tế bào lưỡng bội được gọi là hợp tử. Trái lại ở vi khuẩn, tế bào sinh sản bằng cách phân đôi, hiện tượng hình thành “hợp tử” rất hiếm khi xảy ra, trong quá trình đó một phần hoặc gần như toàn bộ bản sao ADN của vi khuẩn A sẽ chuyển sang vi khuẩn B. Hệ gen của vi khuẩn nhận B được gọi là hệ gen nội, trong khi một phần của gen vi khuẩn cho được gọi là gen ngoại. Ngày nay, đã biết được ba cách chuyển thông tin di truyền tèu tế bào cho sang tế bào nhận: biến nạp (Transformation), tải nạp (Transduction) và tiếp hợp (Conjugaison).
Tóm tắt q trình biến nạp, tải nạp tiếp hợp vi khuẩn Tác giả: Đỗ Thị Loan (Tổng hợp tài liệu) Mặc dù tái tổ hợp gen sinh vật nhân chuẩn nghiên cứu thời gian dài khám phá tái tổ hợp sinh vật nhân sơ biết thời gian gần Ở sinh vật nhân chuẩn, từ hai giao tử (đơn bội n) thể hợp thành tế bào lưỡng bội gọi hợp tử Trái lại vi khuẩn, tế bào sinh sản cách phân đơi, tượng hình thành “hợp tử” xảy ra, q trình phần gần toàn ADN vi khuẩn A chuyển sang vi khuẩn B Hệ gen vi khuẩn nhận B gọi hệ gen nội, phần gen vi khuẩn cho gọi gen ngoại Ngày nay, biết ba cách chuyển thông tin di truyền tèu tế bào cho sang tế bào nhận: biến nạp (Transformation), tải nạp (Transduction) tiếp hợp (Conjugaison) - Biến nạp (Transformation): tượng chuyển thông tin di truyền đoạn thể nhiễm sắc vi khuẩn cho chiết dạng vơ bào sang vi khuẩn nhận, sau gia nhập vào thể nhiễm sắc vi khuẩn nhận hình thành trình tái tổ hợp (đoạn ADN vi khuẩn nhận thường mạch đơn) - Tải nạp (Transduction): truyền đoạn vật chất thể nhiễm sắc tế bào cho (thường chuỗi kép) sang vi khuẩn nhận nhờ tác nhân trung gian chuyển gen phage - Tiếp hợp (Conjugaison): truyền thông tin di truyền plasmid hay đoạn thể nhiễm sắc chuyển vào tế bào nhận qua cầu tiếp hợp hai tế bào I Biến nạp (Transformation) - Biến nạp trình xâm nhập ADN trần từ tế bào vi khuẩn (thể cho) sang tế bào vi khuẩn khác (thể nhận) Hiện tượng biến nạp nhà vi khuẩn học Griffith phát vào năm 1928 tiến hành vi khuẩn Diplococcus pneumoniae Vi khuẩn có dạng: dạng S (Smooth) có màng nhày, gây bệnh viêm phổi nặng, dạng R (Routh) khơng có màng nhày, không gây nguy hiểm - Tiến hành: + Tiêm vi khuẩn dạng S chuột chết + Tiêm vi khuẩn dạng S bị xử lý nhiệt Chuột sống + Tiêm vi khuẩn dạng R chuột sống + Tiêm vi khuẩn dạng R vi khuẩn dạng S bị xử lý nhiệt chuột chết Phân lập từ máu chuột chết Thu vi khuẩn dạng S điển hình Các vi khuẩn dạng S bị chết vi xử lý nhiệt truyền khả tạo vỏ nhày cho tế bào dạng R Các tế bào dạng S điển hình - Tuy nhiên Griffith sai lầm cho tượng biến nạp tác động chất polyholosidic màng nhày Đến năm 1944, nhờ có thực nghiệm Avery cộng sự, chứng minh thực nghiệm invitro: - Avery cộng chứng minh tác nhân q trình biến nạp axit nuclêic Chính ADN Diplicoccus pneumonia dạng S bị xử lý nhiệt truyền tính trạng hình thành màng nhày xâm nhập vào tế bào dạng R làm cho vi khuẩn trở nên có màng nhày gây độc - Tiến trình biến nạp: Đầu tiên, vi khuẩn tiếp nhận ADN thể cho Khi chui qua màng tế bào thể nhận, sợi ADN thể cho bị phân huỷ để cung cấp lượng xảy tái tổ hợp ADN sợi đơn lại thể cho với gen thể nhận vùng tương đồng thông qua trao đổi chéo Các giai đoạn trình biến nạp: - Giai đoạn 1: Cố định ADN lên tế bào nhận vị trí có thụ thể protein thích hợp - Giai đoạn 2: Sự xâm nhập ADN biến nạp vào tế bào khả biến (là tế bào nhận giai đoạn sinh trưởng hay mơi trường thích hợp có khả tiếp nhận ADN), nguyên tử đánh dấu P 32 chứng minh qua tế bào ADN biến nạp - Giai đoạn 3: Sự liên kết ADN biến nạp với đoạn tương đồng thể nhiễm sắc tế bào nhận Sau chui qua màng tế bào khả biến, ADN thể cho chịu tác động enzyme nuclease phân giải mạch tạo thành ADN mạch đơn ADN sợi đơn khơng nhanh chóng tìm thấy đoạn tương đồng thể nhiễm sắc tế bào nhận đế tái tổ hợp bị phân giải - Giai đoạn 4: Tái tổ hợp sợi đơn ADN thể cho với thể nhiễm sắc tế bào nhận tạo thành ADN tái tổ hợp - Giai đoạn 5: Sự nhân lên ADN tái tổ hợp tế bào nhận Hiệu biến nạp phụ thuộc vào yếu tố: - Chủng vi khuẩn khả trở thành vi khuẩn nhận (tế bào khả biến): + Trên bề mặt tế bào nhận phải có nhân tố dung nạp (competence factor), tức protein thụ thể tiếp nhận ADN thể cho Khả biến nạp xuất khoảng 15-30phút cuối pha sinh trưởng cấp số, phụ thuộc vào sản phẩm loại chất – tác nhân biến nạp, tác nhân chiết từ Diplococcus pneumoniae, loại protein bền nhiệt có khối lượng phân tử thấp (khoảng 10 000 daltons) làm cho tế bào thành tế bào khả biến + Khả biến nạp có vi khuẩn cho chiu qua phân tử ADN tế bào cho có khối lượng phân tử 5.10 daltons, ADN chiếm khoảng 1/300 hệ gen tế bào vi khuẩn - Đoạn ADN biến nạp tính chất nó: + Điều quan trọng thứ hai để thực biến nạp ADN phải có mạch kép đoạn biến nạp phải có trọng lượng phân tử tối thiểu 400 000 dalton (khoảng 1/200 gen vi khuẩn) + Số lượng tế bào biến nạp tăng tỉ lệ thuận với nồng độ ADN lúc điểm thụ thể bão hoà đoạn ADN thể cho gắn vào Hiện tượng biến nạp chứng minh tính di truyền đặc trưng ADN có ý nghĩa to lớn thực tiễn thực biến đổi định hướng tính di truyền Người ta tiến hành lập đồ gen số vi khuẩn biến nạp Và kỹ thuật cơng nghệ ADN tái tổ hợp biến nạp E.Coli khâu quan trọng II Tải nạp (Transduction) - Tải nạp tượng chuyển vật liệu di truyền từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận phage - Có loại phage: phage độc, ký sinh làm sinh tan tế bào vi khuẩn chủ giải phóng hạt phage hệ con; phage ơn hồ tồn trạng thái tiềm tan (lysogenly), tức prophage, chuyển sang trạng thái sinh tan phage độc - Có dạng tải nạp: + tải nạp khơng đặc hiệu: phage gắn đoạn gen vào tế bào vật chủ truyền gen sang tế bào nhận + Tải nạp đặc hiệu: phage chuyển gen xác định tế bào cho sang tế bào nhận Tải nạp không đặc hiệu (Generalized Transduction) - Thí nghiệm Lederberg học trò ông Zinder với chủng khuyết dưỡng Salmonella: Chủng 22A khuyết dưỡng Tryptophan (T-) chủng 2A khuyết dưỡng với Histadine (H-) Bố trí thí nghiệm hình sau: - Kết thí nghiệm: Sau thời gian, nhánh chứa chủng 22A có xuất chủng tự dưỡng với tần số 10-5 không thấy tế bào tự dưỡng nhánh chứa chủng 2A - Giải thích: Các chủng 22A mang phage (P 22) P22 chui qua màng kính làm tan tế bào 2A P22 mang gen tổng hợp tryptophan chủng 2A sang nhánh truyền cho số tế bào chủng 22A trở thành tế bào tự dưỡng Trong trường hợp đoạn thể nhiễm sắc tế bào cho tải nạp, tải nạp khơng đặc hiệu Tải nạp đặc hiệu (Specialized Transduction) - Tải nạp đặc hiệu trường hợp chuyển vài gen định, có đặc điểm: + Những gen chuyển nằm sát chỗ prophage gắn vào + Chỉ prophage kiểu λ thực + Do kết cắt sai prophage tách khỏi nhiễm sắc thể tế bào chủ + Các vi khuẩn tái tổ hợp lưỡng bội phần Tải nạp đặc hiệu nghiên cứu kĩ phage λ tải nạp nòi vi khuẩn - Điểm gắn phage λ vào gen vi khuẩn nằm gen gal (galactose) bio (gen tổng hợp biotin) Đầu phage chứa lượng ADN giới hạn, nên prophage tách từ ADN vi khuẩn cắt nhầm tải nạp gen gal bio Phage tải nạp gen galactose gọi λgal hay λdg Nếu tế bào gal - nhiễm λgal (mang gen gal+), ráp phage biến dạng vào tế bào chủ tạo lưỡng bội phần - Đoạn ADN tế bào cho sau tải nạp vào tế bào nhận xảy trường hợp sau: + Đôi đoạn gen tải nạp bị qua lần phân chia tế bào tiếp sau, kiểu gen tế bào nhận không thay đổi +Khi hệ gen vi khuẩn sinh sản, đoạn gen tải nạp không sinh sản sau lần phân chia tế bào, chuyển đến tế bào + Phần vật chất di truyền tế bào chủ mang hệ gen mang đoạn ADN tế bào cho nhân lên tạo dòng tế bào (dòng dị gen tử) Đơi tế bào dị gen tử xảy tượng tái tổ hợp đoạn tải nạp phần tương đồng hệ gen vi khuẩn + Đoạn tải nạp gắn với hệ gen vi khuẩn cách thay thể đoạn tương đồng hệ gen Tải nạp sử dụng để phân tích di truyền gen tế bào nhờ phage.Tải nạp cung cấp thơng tin hai đột biến gần xác định trình tự tương đối gen tiến hành nghiên cứu đồng thời gen… III Tiếp hợp (Conjugation) - Tiếp hợp tượng truyền vật chất di truyền (plasmid phần gen) từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận thông qua cầu tiếp hợp tế bào tiếp xúc với - Lederberg Tatum (1946) phát tái tổ hợp tiếp hợp hai vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp Hai ơng tiến hành thí nghiệm dòng khuyết dưỡng khác E.Coli theo hình - Sau trộn lẫn chủng A chủng B ta chủng nguyên dưỡng với loại nhân tố sinh trưởng met, bio, thr, leu thi Đó chủng E Coli tái tổ hợp - Để tiếp hợp xảy ra, điều kiện cần phải có tiếp xúc tế bào tế bào cho phải có nhân tố giới tính F (Fertility), plasmid - Plasmid phân tử ADN vòng kín hai mạch nằm ngồi thể nhiễm sắc có kích thước nhỏ (bằng 1/100 thể nhiễm sắc vi khuẩn), có khả tự nhân lên độc lập với tế bào Các plasmid trạng thái cài vào thể nhiễm sắc Plasmid mang số gen khác như: gen kháng thuốc, gen quy định đặc tính chống lại với điều kiện bất lợi…và gen hình thành lơng giới tính F - Bản chất di truyền dòng F+, F- Hfr xác định plasmid sau: F- không chứa plasmid F+ chứa plasmid dạng độc lập Hfr chứa plasmid gắn vào gen vi khuẩn - Muốn xảy tái tổ hợp dòng vi khuẩn phải tiếp xúc với (F + x F-) (Hfr x F-) Dòng tế bào F+ coi tế bào đực có khả tạo protein pilin, từ protein tạo ống tiếp hợp pilus Tế bào F- gọi tế bào + Trong tiếp hợp, plasmid tự chuyển từ tế bào cho sang tế bào nhận cách chuyển sợi đơn ADN sang thể nhận Ở tự tổng hợp bổ sung để thành sợi kép - Khi yếu tố F gia nhập vào thể nhiễm sắc vi khuẩn F + trở thành tế bào Hfr Ngược lại, nhân tố F tạo vòng tách khỏi thể nhiễm sắc tế bào F+ - Tiếp hợp phương thức chuyển gen sinh vật nhân sơ đòi hỏi phải có tiếp xúc hai tế bào Tiếp hợp điều khiển gen plasmid (như gen quy định tính trạng lơng giới tính ADN truyền sang tế bào nhận theo chế tái vòng lăn Tiếp hợp sử dụng để lập đồ di truyền vi khuẩn Kết luận: Sự chuyển thông tin di truyền từ tế bào cho sang tế bào nhận sinh vật nhân sơ theo cách: biến nạp, tải nạp tiếp hợp Tuỳ theo cách thức truyền vật liệu di truyền: ADN trần trực tiếp qua màng tế bào nhận (biến nạp), qua phage (tải nạp) plasmid qua cầu tiếp hợp (tiếp hợp) Người ta ứng dụng chúng để chuyển gen để phân tích di truyền sinh vật nhân sơ