Định lượng eurycomanone trong rễ cây bá bệnh (eurycoma longifolia) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

,V NU ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI an dP rm TRẦN THỊ THU PHƢƠNG ac y KHOA Y DƢỢC ici ne ĐỊNH LƢỢNG EURYCOMANONE TRONG RỄ CÂY BÁ BỆNH (Eurycoma Longifolia) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC Co py rig ht @ Sc ho ol of Me d KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Hà Nội - 2018 ,V NU ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI an dP rm TRẦN THỊ THU PHƢƠNG ac y KHOA Y DƢỢC ici ne ĐỊNH LƢỢNG EURYCOMANONE TRONG RỄ CÂY BÁ BỆNH (Eurycoma Longifolia) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC Me d KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Khóa: QH.2013.Y Co py rig ht @ Sc ho ol of Ngƣời hƣớng dẫn: TS Nguyễn Hữu Tùng Hà Nội - 2018 ,V NU LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp đƣợc thực mơn Hóa dƣợc Kiểm nghiệm thuốc thuộc Khoa Y Dƣợc, Đại học Quốc gia Hà Nội rm ac y Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn tất thầy cô Khoa Y Dƣợc, Đại học Quốc gia Hà Nội dạy dỗ truyền đạt kiến thức cho em suốt năm học vừa qua Em xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới thầy mơn Hóa dƣợc Kiểm nghiệm thuốc tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp an dP Em xin phép bày tỏ kính trọng lòng biết ơn sâu sắc tới thầy Nguyễn Hữu Tùng nhiệt tình, tận tâm hƣớng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm giúp đỡ em hồn thành tốt khóa luận ici ne Em xin cảm ơn dƣợc sỹ Nguyễn Thị Huệ (QH.2012.Y) bạn nhóm nghiên cứu Thùy, Phƣợng, Chuyên tập thể lớp Dƣợc học khóa (QH.2013.Y) sát cánh, động viên, cổ vũ tinh thần giúp em hồn thành khóa luận cách tốt Me d Qua đây, em cảm ơn gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ em suốt q trình hồn thành khóa luận Co py rig ht @ Sc ho ol of Mặc dù nỗ lực, cố gắng để hồn thành khóa luận, song kiến thức kinh nghiệm hạn chế nên khơng thể tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận đƣợc cảm thơng góp ý tận tình thầy để khóa luận đƣợc hoàn thiện Hà Nội, ngày 25 tháng năm 2018 Sinh viên Trần Thị Thu Phƣơng Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril DAD Diode array detector Detector mảng điốt HPLC High performace liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao IL Interleukin Interleukin LOD Limit of detection LOQ Limit of quantification LPS Lipopolysaccharide MeOH Methanol RSD Relative standard deviation Ultra violete Visible py rig ht @ Sc ho ol of VIS rm Giới hạn phát an dP ici ne Me d UV ac y Từ viết tắt TN Co ,V NU DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Giới hạn định lƣợng Methanol Độ lệch chuẩn tƣơng đối Thí nghiệm ,V NU DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Co py rig ht @ Sc ho ol of Me d ici ne an dP rm ac y ảng 1.1 Thành phần hóa học rễ bá bệnh .5 ảng 3.1 hƣơng trình chạy dung mơi pha động phân tích dịch chiết rễ bá bệnh .20 ảng 3.2 Tính thích hợp hệ thống 23 ảng 3.3 Kết khảo sát khoảng tuyến tính eurycomanone 24 ảng 3.4 Kết độ lặp lại phƣơng pháp .25 ảng 3.5 Kết độ phƣơng pháp 26 ảng 3.6 Kết định lƣợng eurycomanone rễ bá bệnh 27 ,V NU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Co py rig ht @ Sc ho ol of Me d ici ne an dP rm ac y Hình 1.1 Cây bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack.) Hình 1.2 Cấu trúc chung nhóm quasinoid Hình 1.3 Cấu trúc hóa học eurycomanone .9 Hình 1.4 Mối quan hệ đại lƣợng thời gian HPLC .13 Hình 2.1 Mẫu bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack.) .17 Hình 3.1 Sắc ký đồ dung dịch eurycomanone chuẩn .21 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu trắng (đánh giá độ đặc hiệu) .22 Hình 3.3 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone (đánh giá độ đặc hiệu) 22 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ diện tích pic nồng độ eurycomanone 24 ,V NU MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 ac y HƢƠNG TỔNG QUAN TỔNG QUAN VỀ CÂY BÁ BỆNH rm 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Phân bố sinh thái 1.1.3 Thu hái, chế biến an dP 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Tác dụng dƣợc lý 1.1.6 Tính vị cơng 1.2 ici ne 1.1.7 Một số thuốc dân gian từ bá bệnh Tổng quan nhóm quassinoid .8 1.2.1 Khái quát chung quassinoid .8 1.3 Me d 1.2.2 Cấu trúc chung phân loại Tổng quan eurycomanone of 1.3.1 Cơng thức hóa học 1.3.2 Tính chất lí hóa 10 ol 1.3.3 Tác dụng sinh học Eurycomanone .10 Tổng quan sắc ký lỏng hiệu cao HPL 13 Sc 1.4 ho 1.3.4 Một số nghiên cứu định lƣợng eurycomanone HPLC .10 1.4.1 Nguyên tắc HPLC .13 @ 1.4.2 Một số thông số đặc trƣng 13 ht 1.4.3 Thẩm định phƣơng pháp HPL 15 Co py rig HƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU .17 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .17 2.1.1 Nguyên liệu 17 2.1.2 Dung mơi, hóa chất .17 2.2 ,V NU 2.1.3 Máy móc, dụng cụ .17 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU 17 2.2.1 Phƣơng pháp chiết xuất eurycomanone từ rễ bá bệnh 18 ac y 2.2.2 Phƣơng pháp phân tích HPLC 18 2.2.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu 19 rm HƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 KẾT QUẢ 20 3.1.1 Quy trình chiết rễ bá bệnh .20 an dP 3.1.2 Xây dựng quy trình định lƣợng 20 3.2 Thảo luận .28 3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 28 ici ne 3.2.2 Xây dựng phƣơng pháp phân tích eurycomanone HPLC 28 3.2.3 Định lƣợng eurycomanone dƣợc liệu bá bệnh 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .30 Me d KẾT LUẬN 30 Co py rig ht @ Sc ho ol of KIẾN NGHỊ .30 ,V NU ĐẶT VẤN ĐỀ Me d ici ne an dP rm ac y Việt Nam đất nƣớc nhiệt đới gió mùa với nguồn thuốc vơ phong phú Từ lâu nhân dân ta sử dụng nhiều cỏ tự nhiên để làm thuốc Ngày nay, với phát triển nhƣ vũ bão khoa học, kĩ thuật nên có nhiều dƣợc liệu tiềm đã, đƣợc nghiên cứu rộng rãi Trong đó, bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack.), họ Thanh thất (Simaroubaceae) đƣợc nhân dân ta sử dụng nhiều với số công dụng nhƣ vỏ dùng chữa trƣờng hợp ăn uống không tiêu, đau lƣng, dùng chữa lị Ở ampuchia, ngƣời ta dùng rễ chữa ngộ độc, say rƣợu, trị giun Lá đƣợc dùng để tắm trị ghẻ, lở ngứa Ngoài bá bệnh đƣợc biết đến với cơng dụng tăng cƣờng sinh lực, hỗ trợ điều trị yếu sinh lí nam giới, kích thích ham muốn [14,15,32] Hơn nữa, bá bệnh đƣợc chứng minh có tính chống viêm, chống sốt rét, chống oxy hóa [11,21,22,28,32,45], điều trị tiểu đƣờng [32], ứng cử viên tiềm điều trị ký sinh trùng đƣờng ruột Blastocystis [17] Trên giới, bá bệnh đƣợc đƣợc đánh giá dƣợc liệu có hiệu lực điều trị tốt đem lại hiệu kinh tế cao Bá bệnh đƣợc gọi Sâm Malaysia đƣợc sử dụng nhƣ loại thuốc bổ sức khỏe chống lão hóa [34,45] rig ht @ Sc ho ol of Nhóm quassinoid, nhóm hợp chất bá bệnh bao gồm số chất nhƣ eurycomanone, eurycomalactone, eurycomanol, eurycolactone… đƣợc báo cáo góp phần vào tính chất chữa bệnh tăng sức mạnh bắp, sức bền, giảm lo lắng, căng thẳng, diệt vi trùng sốt rét Plasmodium falcifarum kháng thuốc… [1,2,21,32], phòng ngừa điều trị lỗng xƣơng nam giới thiếu androgen [19] Trong đó, eurycomanone hợp chất mang lại hiệu cao tác dụng chữa bệnh Tuy nhiên, Việt Nam nghiên cứu eurycomanone – marker bá bệnh hạn chế Ngồi khả nhân giống cộng với tốc độ sinh trƣởng chậm việc khai thác rễ khơng hợp lí khiến cho nguồn dƣợc liệu cạn kiệt Ngoài ra, dƣợc điển Việt Nam chƣa có chuyên luận định lƣợng eurycomanone bá bệnh Bên cạnh đó, việc kiểm nghiệm bá bệnh nhƣ chế phẩm bá bệnh chủ yếu thực phẩm chức chƣa đƣợc thực Co py Trên sở với trang thiết bị đại sở vật chất vốn có phòng thí nghiệm mơn Hóa dƣợc Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dƣợc, ,V NU Đại học Quốc gia Hà Nội đề tài “Định lƣợng eurycomanone bá bệnh (Eurycoma longifoila) sắc ký lỏng hiệu cao HPLC” đƣợc tiến hành Kết đề tài sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm tra chất lƣợng dƣợc liệu bá bệnh nhƣ việc quản lí sản phẩm từ bá bệnh thị trƣờng ac y Các mục tiêu đề tài: Co py rig ht @ Sc ho ol of Me d ici ne an dP rm Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng eurycomanone HPLC thẩm định phƣơng pháp phân tích Xác định hàm lƣợng eurycomanone rễ bá bệnh Co rig py ht @ ho Sc ol of ici ne Me d ,V NU ac y rm an dP Co rig py ht @ ho Sc ol of ici ne Me d ,V NU ac y rm an dP Co rig py ht @ ho Sc ol of ici ne Me d ,V NU ac y rm an dP Co rig py ht @ ho Sc ol of ici ne Me d ,V NU ac y rm an dP Co rig py ht @ ho Sc ol of ici ne Me d ,V NU ac y rm an dP ho ol of Me d ici ne an dP rm ac y ,V NU Phụ lục 02: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone – Xây dựng đƣờng hồi quy tuyến tính Co py rig ht @ Sc Hình PL2.1 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone 18,75 µg/ml ,V NU ac y rm an dP ici ne Me d of ol Co py rig ht @ Sc ho Hình PL2.2 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone 25 µg/ml ,V NU ac y rm an dP ici ne Me d Co py rig ht @ Sc ho ol of Hình PL2.3 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone 37,5 µg/ml ,V NU ac y rm an dP ici ne Me d Co py rig ht @ Sc ho ol of Hình PL2.4 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone 50 µg/ml ,V NU ac y rm an dP ici ne Me d Co py rig ht @ Sc ho ol of Hình PL2.5 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone 100 µg/ml ,V NU ac y rm an dP ici ne Me d Co py rig ht @ Sc ho ol of Hình PL2.6 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn eurycomanone 200 µg/ml Co py rig ht @ Sc ho ol of Me d ici ne an dP rm ,V NU ac y Phụ lục 03: Sắc ký đồ dung dịch trắng (MeOH) Co rig py ht @ ho Sc ol of ici ne Me d ,V NU ac y rm an dP Phụ lục 04: Sắc ký đồ cao bá bệnh Co rig py ht @ ho Sc ol of ici ne Me d ,V NU ac y rm an dP Co rig py ht @ ho Sc ol of ici ne Me d ,V NU ac y rm an dP Phụ lục : Độ đồng pic ... rm TRẦN THỊ THU PHƢƠNG ac y KHOA Y DƢỢC ici ne ĐỊNH LƢỢNG EURYCOMANONE TRONG RỄ CÂY BÁ BỆNH (Eurycoma Longifolia) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC Me d KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC... Nội đề tài Định lƣợng eurycomanone bá bệnh (Eurycoma longifoila) sắc ký lỏng hiệu cao HPLC đƣợc tiến hành Kết đề tài sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm tra chất lƣợng dƣợc liệu bá bệnh nhƣ việc... tích HPLC a Lựa chọn điều kiện sắc ký Chúng sử dụng phƣơng pháp HPL để tách, định tính, định lƣợng eurycomanone từ rễ bá bệnh húng khảo sát điều kiện sau: - Cột sắc ký: Tiến hành cột sắc ký Eclipse