Nghiên cứu vi sinh vật nội sinh đối kháng nấm gây bệnh thực vật trên cây hồ tiêu tại đăk lăk

1 BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Thị Hoàn NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT NỘI SINH ĐỐI KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT TRÊN CÂY HỒ TIÊU Ở ĐẮK LẮK LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội- 2019 BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Thị Hoàn NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT NỘI SINH ĐỐI KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT TRÊN CÂY HỒ TIÊU Ở ĐẮK LẮK Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 842 0114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Lê Gia Hy Hà Nội- tháng năm 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan viết luận văn tìm tòi, học hỏi thân hướng dẫn tận tình PGS.TS Lê Gia Hy ThS NCS Vũ Thị Hạnh Nguyên Mọi kết nghiên cứu ý tưởng tác giả khác, có trích dẫn cụ thể Đề tài luận văn chưa bảo vệ hội đồng bảo vệ luận văn thạc sĩ chưa công bố phương tiện Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan Hà Nội, ngày 19 tháng 04 năm 2019 Người cam đoan Nguyễn Thị Hồn LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Lê Gia Hy ThS NCS Vũ Thị Hạnh Nguyên trực tiếp định hướng, tận tình hướng dẫn tơi hồn thành luận văn Tôi xin cảm ơn động viên giúp đỡ bảo tận tình anh chị Phòng Cơng nghệ lên men, Viện Cơng nghệ sinh học, tạo điều kiện điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận văn Tơi xin trân gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo thầy cô giáo trường Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam truyền đạt kiến thức giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực luận văn Cuối xin bày tỏ lòng biêt ơn đến gia đình, người thân, bạn bè đồng nghiệp – người ln động viên, tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học Học viên Nguyễn Thị Hồn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nội dung DNA Axit deoxyribonucleic KB King’B RI Relative inhibition (Phần trăm ức chế tăng trưởng sợi nấm) RPM Revolutions per minute (Tốc độ lắc vòng/phút) v/v Đơn vị thể tích/thể tích VKNS Vi khuẩn nội sinh VSVNS Vi sinh vật nội sinh VSV Vi sinh vật w/v Đơn vị khối lượng/thể tích DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tiêu đề Trang 1.1 Các tác nhân gây bệnh gây bênh chết nhanh, chết chậm thán thư hồ tiêu 2.1 Trình tự cặp mồi sử dụng phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA 27 3.1 Kết phân lập vi sinh vật nội sinh từ mẫu rễ, thân, hồ tiêu Đắk Lắk 30 3.2 Số lượng chủng phân lập môi trường khác 33 3.3 Khả kháng nấm gây bệnh vi khuẩn nội sinh hồ tiêu 33 3.4 Khả kháng nấm hồ tiêu chủng nội sinh hồ tiêu Đắk Lắk 37 3.5 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn nội sinh hồ tiêu Đắk Lắk 38 3.6 Ảnh hưởng nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến khả phát triển chủng HDL34 40 3.7 Khả đồng hóa nguồn carbon nitơ chủng HDL3 41 3.8 Phân tích trình tự gen 16S rDNA chủng HDL34 42 3.9 Ảnh hường nguồn cacbon nitơ đến khả sinh chất kháng sinh chủng HDL34 44 3.10 Ảnh hưởng nhiệt độ pH đến khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng HDL34 45 3.11 Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống đến khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng HDL34 nội sinh 46 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tiêu đề Hình Trang 1.1 Cây hồ tiêu 1.2 Hình dạng khuẩn lạc (A) bào tử nấm (B) nấm Fussarium gây bệnh hồ tiêu 1.3 Bệnh thối rễ hồ tiêu nấm Phytophthora 1.4 Nấm Phytophthora công dây lươn hồ tiêu 3.1 Vi sinh vật nội sinh theo vị trí phân lập hồ tiêu 31 3.2 Khả kháng nấm gây bệnh vi sinh vật nội sinh phân lập 35 3.3 Khả đối kháng nấm gây bệnh chủng vi sinh vật nội sinh hồ tiêu 37 3.4 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn nội sinh 38 3.5 Ảnh nhuộm Gram chủng HDL34 (A) hình ảnh khuẩn lạc chủng HDL34 (B) môi trường MPA 39 3.6 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA gel agarose 1,0% 42 3.7 Khả kháng nấm bệnh chủng HDL34 môi trường khác 43 3.8 Ảnh hưởng độ thơng khí đến khả sinh tổng hợp chất kháng nấm chủng HDL34 46 3.9 Khả kháng nấm bệnh P capsici VTN chủng HDL34 47 MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY HỒ TIÊU, BỆNH NẤM TRÊN CÂY HỒ TIÊU 1.1.1 Cây hồ tiêu tiềm phát triển hồ tiêu Việt 1.1.2 Hiện trạng canh tác trồng hồ tiêu Đăk Lăk 1.1.3 Bệnh ảnh hưởng bệnh nấm trồng 1.1.4 Khả đối kháng vi sinh vật nấm gây bệnh thực vật 1.1.5 Các loại bệnh gây hại hồ tiêu biện pháp phòng chống Tây Nguyên 1.1.6 Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng đấu tranh sinh học phòng chống bệnh cho trồng 13 1.2 VI SINH VẬT NỘI SINH TRÊN CÂY HỒ TIÊU VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT 16 1.2.1 Vi sinh vật nội sinh (endophylic microorganisms) hồ tiêu 16 1.2.2 Sự đa dạng vi sinh vật nội sinh kháng nấm gây bệnh hồ tiêu 16 1.2.3 Khả ứng dụng vi sinh vật nội sinh phòng chống nấm gây bệnh hồ tiêu 18 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ NẤM GÂY BỆNH CÂY HỒ TIÊU Ở VIỆT NAM 18 Nam 1.3.1 Nghiên cứu bệnh gây hại hồ tiêu 18 1.3.2 Biện pháp phòng trừ bệnh hồ tiêu biện pháp sinh học 20 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 22 2.1.1 Các mẫu hồ tiêu chủng giống vi sinh vật kiểm 22 2.1.2 Hóa chất thiết bị 22 2.1.3 Môi trường nuôi cấy 23 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 định 2.2.1 Phương pháp thu mẫu 23 2.2.2 Khử trùng bề mặt phân lập vi sinh vật nội sinh 24 2.2.3 Phương pháp phân lập vi sinh vật nội sinh 24 2.2.4 Xác định hoạt tính đối kháng chủng vi sinh vật nội sinh với nấm bệnh 24 2.2.5 Xác định khả ức chế nấm bệnh dịch lọc vi sinh vật nội sinh 25 2.2.6 Đánh giá hoạt tính kháng nấm bệnh 2.2.7 Nghiên cứu đặc điểm sinh học định danh chủng lựa chọn 25 26 2.2.8 Đánh giá khả sinh enzyme ngoại bào 27 2.2.9 Lựa chọn môi trường điều kiện nnuooi cấy thích hợp 28 2.2.10 Thử nghiệm khả phòng trừ nấm Phytophthora capsici 28 2.2.11 Xử lý số liệu 29 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG VI SINH VẬT NỘI SINH CĨ 30 HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY HỒ TIÊU Ở ĐĂK LĂK 3.1.1 Kết phân lập chủng vi sinh vật nội sinh từ mẫu hồ tiêu 30 3.1.2 Sơ phân nhóm vi sinh vật nội sinh hồ tiêu phân lập 31 3.1.3 Phân bố vi sinh vật nội sinh theo môi trường phân lập 32 3.1.4 Khả đối kháng với nấm gây bệnh hồ tiêu nhóm vi sinh vật phân lập 33 3.2 TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG DIỆT NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY HỒ TIÊU CAO Ở ĐẮK LẮK 36 3.2.1 Hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh hồ tiêu chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ hồ tiêu tỉnh Đắk Lắk 36 3.2.2 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ hồ tiêu tỉnh Đắk Lắk 37 3.3 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, PHÂN LOẠI VÀ AN TOÀN SINH HỌC CỦA CHỦNG HDL34 39 3.3.1 Đặc điểm sinh học 3.3.2 Phân loại chủng HDL34 dựa phân tích trình tự gen 16S rDNA 3.3.3 Độ an toàn sinh học chủng HDL34 3.4 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM CỦA CÁC CHỦNG CHỦNG HDL34 39 41 42 43 44 Ảnh hường thành phần môi trường đến khả sinh trưởng kháng nấm chủng HDL34 a Ảnh hưởng nguồn cacbon Trên sở môi trường MPA lựa chọn, thay đổi nguồn cacbon khác Glucose, rỉ đường, saccharose, dextriose, tinh bột tan manitol để xác định mức độ ảnh hưởng nguồn cacbon tới khả sinh trưởng hình thành chất kháng nấm chủng vi sinh vật nội sinh HDL34 Bảng 3.9: Ảnh hường nguồn cacbon nitơ đến khả sinh chất kháng sinh chủng HDL34 Nguồn cacbon Glucose Hoạt tính kháng nấm (mm) Bột đậu tương Rỉ đường 15,0±0,15 14,0±0,13 Hoạt tính kháng nấm (mm) 13,9±0,23 Cao nấm men 15,0±0,19 Saccharose 12,0±0,11 Pepton 12,5 ±0,12 Dextriose 13,7 ±0,18 Trypton 13,5 ±0,24 Tinh bột tan 12,0±0,22 Cao malt 14,0 ±0,15 Manitol 14,5±0,16 Cao thịt 12,9 ±0,18 Nguồn nitơ Kết trình bày Bảng 3.9 cho thấy, nguồn cacbon sử dụng chủng HDL34 nội sinh phát triển sinh chất kháng nấm cao môi trường có nguồn cacbon glucose cho nghiên cứu b Ảnh hưởng nguồn nitơ Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ khác như: bột đậu tương, cao nấm men, pepton, trypton, cao malt, cao thịt Kết nghiên cứu thể qua Bảng 3.9 Chủng HDL34 phát triển tốt môi trường tuyển chọn với nguồn nitơ cao nấm men, đường kính kháng nấm cao Như vậy, nguồn nitơ sử dụng chủng HDL34 phát triển sinh chất kháng nấm cao mơi trường có nguồn nitơ cao nấm men cho nghiên cứu 45 Ảnh hường điều kiện nuôi cấy đến khả sinh trưởng kháng nấm chủng HDL34 a Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi Để nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp chất kháng nấm chủng tuyển chọn, tiến hành lên men môi trường thay với nhiệt độ ban đầu thay đổi từ 20-40˚C vi khuẩn 15-40˚C vi nấm Kết trình bày bảng 3.10 Bảng 3.10: Ảnh hưởng nhiệt độ pH đến khả sinh tổng hợp chất kháng nấm chủng HDL34 20 Hoạt tính kháng nấm (mm) 10,5±0,35 Hoạt tính kháng nấm (mm) 11,5±0,2 25 14,6±0,26 13±0,15 30 37 16,3±0,15 15,6±0,2 14,0 ±0,2 7,0 ±0,34 40 7,0 ±0,14 Nhiệt độ (˚C) pH Kết thu Bảng 3.10 cho thấy, nhiệt độ thích hợp cho chủng sinh trưởng sinh tổng hợp chất kháng nấm chủng HDL34 30°C, với đường kính vòng kháng nấm đạt tới 16.3 mm b Ảnh hưởng pH ban đầu Nghiên cứu ảnh hưởng pH đến khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn chủng HDL34 tiến hành lên men môi trường với pH ban đầu thay đổi từ 5-8 Kết trình bày bảng 3.10 cho thấy, chủng HDL34 nội sinh kháng nấm tốt mơi trường có pH 7, đường kính vòng kháng nấm cao nhất, nhiên pH khả kháng nấm chủng thấp không đáng kể c Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống 46 Lượng giống tỷ lệ: 1, 3, 5, % theo thể tích dịch lên men, sau lên men với thời gian 24 giờ, xác định hoạt tính kháng nấm Phytophthora capsici CNLM thể bảng 3.11 Bảng 3.11: Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống độ thơng khí đến khả sinh tổng hợp chất kháng nấm chủng HDL34 nội sinh Tỷ lệ tiếp giống % Hoạt tính kháng nấm (mm) 8,5±0,2 Độ thơng khí (%, v/V) Hoạt tính kháng nấm (mm) 12,0±0,19 13±0,15 14,0 ±0,2 13,0 ±0,34 10 15 14,5±0,19 14,0 ±0,23 20 12,0 ±0,27 10,0 ±0,34 25 13,0 ±0,24 Kết cho thấy tỷ lệ tiếp giống cho trình lên men chủng HDL34 thích hợp 5% với đường kính vòng kháng nấm Phytophthora capsici CNLM đạt cao d Ảnh hưởng độ thơng khí Độ thơng khí được khảo sát cách lên men chủng HDL34 bình tam giác 500 ml có tỷ lệ thể tích dịch lên men so với thể tích bình khác Kết thể Hình 3.10 Hình 3.8: Ảnh hưởng độ thơng khí đến khả sinh tổng hợp chất kháng nấm chủng HDL34 (Trong đó: v: thể tích mơi trường lên men (ml); V: thể tích bình lên men (ml)) 47 Kết hình 3.9 cho thấy, nhu cầu sử dụng oxy hòa tan chủng HDL34 cao, độ thơng khí cao chủng vi sinh vật nội sinh sinh trưởng phát triển tốt Ở độ thơng khí 10% chủng phát triển sinh chất kháng nấm Phytophthora capsici CNLM mạnh nhất, độ thơng khí 10% (v thể tích dịch/V thể tích bình) lựa chọn cho nghiên cứu 3.4.2 Thử nghiệm khả kháng nấm chủng HDL34 quy mơ phòng thí nghiệm Chủng B.subtilis HDL34 nuôi môi môi trường điều kiên lên men lựa chọn, sau 24 giờ, dịch nuôi cấy thử nghiệm sơ khả kháng nấm Phytophthora capsici Cách làm: Mẫu đối chứng nhiễm nấm Phytophthora capsici mẫu thí nghiệm sau nhiễm nấm Phytophthora capsici xử lý dịch nuôi cấy chủng B.subtilis HDL34 (Hình 3.11) Hình 3.9: Khả kháng nấm bệnh P capsici VTN chủng HDL34 1: Đối chứng (Nhiễm P capsici VTN + nước khử trùng); 2: Nhiễm P capsici VTN + HDL34 Kết thử nghiệm ảnh hưởng dịch nuôi cấy chủng B.subtilis HDL34 (Hình 3.11) cho thấy, nhiễm nấm bệnh có xử lý bị nhiễm mức độ (26-50% diện tích bị nhiễm nấm) so với mẫu đối chứng bị nhiễm 100% diện tích Như vậy, dịch ni cấy chủng B.subtilis HDL34 có khả kháng nấm Phytophthora capsici gây bệnh cho hồ tiêu 48 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật nội sinh có hoạt tính kháng nấm gây bệnh hồ tiêu Đắk Lắk, số chủng phân lập từ rễ cao (44,44%), sau thân (38,89%) thấp (16,67%) số chủng phân lập cao mơi trường MPA (36,11%), sau đến NA, TSA chiếm tỷ lệ 22,22% thấp môi trường KB chiếm 19,45% Trong số 36 chủng phân lập có 32 chủng có hoạt tính kháng loại nấm kiểm định, đó, có chủng kháng loại nấm kiểm định, chủng kháng hai loại nấm kiểm định 18 chủng kháng ba loại nấm kiểm định Đã nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật nội sinh hồ tiêu có hoạt tính kháng nấm gây bệnh thực vật cho thấy, chủng vi sinh vật tuyển chọn có khả ức chế nấm R solani, P capsici F oxysporum (RI%) 50%; 3/6 chủng có khả sinh chitinase, 4/6 chủng sinh protease chủng sinh cellulase; chủng HDL34 lựa chọn để nghiên cứu tiếp vừa có khả ức chế mạnh lên phát triển sợi nấm, vừa có khả sinh protease, cellulase chitinase ngoại bào Chủng HDL34 phát triển tốt môi trường MPA; dải nhiệt độ từ 2040°C; pH 6-8; nồng độ NaCl từ 0,5-2%; tố ưu 30°C, pH nồng độ NaCl thích hợp 1%; vi khuẩn Gram dương, tế bào hình que sinh bào tử định danh Bacillus subtilis HDL34 chủng an toàn sinh học Đã nghiên cứu môi trường điều kiên ni cấy thích hợp để lên men sản xuất chế phẩm thử nghiệm dịch lên men lên khả kháng nấm Phytophthora capsici hồ tiêu cho thấy, chủng HDL34 có khả ứng dụng tạo chế phẩm sinh học phòng chống bệnh nấm cho hồ tiêu 4.2 KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu quy trình công nghệ lên men sản xuất tạo chế phẩm sinh học thử nghiệm khả kháng nấm gây bệnh cho hồ tiêu 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Quyết định 1442/QĐ-BNN-TT ngày 03/07/2014 Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn: Quy hoạch phát triển ngành hồ tiêu Việt Nam đến năm 2020, tầm nhìn đến năm 2030 Phạm Văn Biên, Nguyễn Văn Tá, Mai Thị Vinh, Trần Minh Tú, Nghiêm Bảo Tuấn, 1990, Kết nghiên cứu sâu bệnh hại tiêu (Piper nigrum), Tạp chí nơng nghiệp cơng nghiệp thực phẩm, số 339: 544 - 548 Phạm Văn Biên, 2005, Nghiên cứu giải pháp khoa học công nghệ thị trường để phát triển vùng hồ tiêu nguyên liệu phục vụ chế biến xuất khẩu, Báo cáo tổng kết đề tài cấp Nhà nước, 2005 Đỗ Trung Bình, 2012, Nghiên cứu biện pháp kỹ thuật tổng hợp sản xuất tiêu theo hướng bền vững, Báo cáo tổng kết đề tài trọng điểm cấp Bộ, 2012 Nguyễn Ngọc Châu, 1995, Thành phần sâu bệnh hại hồ tiêu Quảng Trị Tạp chí Bảo vệ thực vật (139): 14-18 Nguyễn Ngọc Châu, 2003, Tuyến trùng thực vật sở phòng trừ NXB KHKT Hà Nội, 302 trang Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh, 1991, Kết bước đầu nghiên cứu phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne incognita hồ tiêu” Những thành tựu khoa học kỹ thuật đưa vào sản xuất, số 1: 11 - 15 Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh, 1993, Tuyến trùng ký sinh hồ tiêu bệnh chúng gây Tuyển tập cơng trình nghiên cứu sinh thái tài nguyên sinh vật (1990 – 1992, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật 265 - 270 Đào Thị Lan Hoa, Phan quốc Sủng, Trần Thị Kim Loang, Tôn Nữ Tuấn Nam, Nguyễn Xuân Hoà Tạ Thanh Nam, 2003, Nghiên cứu bệnh vàng chết chậm tiêu Tây Nguyên biện pháp phòng trừ, Kỷ yếu hội thảo khoa học bảo vệ thực vật phục vụ cho chủ trương chuyển đổi 50 cấu trồng tỉnh phía Nam Tây Nguyên ngày 26-27/6/2003 Vũng Tàu 10 Lê Gia Hy, 2012, Công nghệ sản xuất kháng sinh, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội 11 Trần Kim Loang, Đào Thị Lan Hoa, Lê Đăng Khoa, Hà Thị Mão, Lê Đình Đơn, Tạ Thanh Nam, Ngô Thị Xuân Thịnh, 2006, Nghiên cứu bệnh nấm Phytophthora số công nghiệp ăn quả”, Báo cáo trọng điểm cấp Bộ 2001-2005, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn 12 Trần Kim Loang, Lê Đình Đơn, Tạ Thanh Nam, Ngơ Thị Xuân Thịnh, Nguyễn Thị Tiến Sĩ, Trần Thị Xê, 2008, Phòng trừ bệnh nấm Phytophthora hồ tiêu chế phẩm sinh học Trichoderma (Tricho-VTN) Tây Nguyên, Kết nghiên cứu khoa học năm 2008, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Nhà xuất Nông nghiệp, 307315 13 Phan Quốc Sủng, 2000, Tìm hiểu Kỹ Thuật Trồng Chăm Sóc Cây Hồ Tiêu Nhà Xuất Bản Nơng nghiệp 14 Phan Quốc Sủng, 2001, Tìm hiểu kỹ thuật trồng chăm sóc hồ tiêu, Nhà xuất nơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, 43tr 15 Phạm Thị Thùy, 2013, Nông nghiệp hữu Việt Nam- trạng- tiêu chuẩn sản xuất hướng phát triển, Kỷ yếu Hội thảo “Nông nghiệp hữu cơ-Thực trạng định hướng phát triển” 2013 16 Nguyễn Tăng Tôn, 2009, “Nghiên cứu giải pháp quản lý tổng hợp dịch hại phát sinh từ đất hồ tiêu”, Báo cáo tổng kết đề tài cấp Bộ, 2009 17 Nguyễn Vĩnh Trường, 2008, Kỹ thuật bẫy theo dõi nguồn bệnh Phytophthora gây bệnh thối gốc rễ hồ tiêu đất, Tạp chí bảo vệ thực vật Số 4: 13 - 16 51 18 Tuat Nguyễn Văn Tuất, 2012, Nghiên cứu nấm Phytophthora gây bệnh chết nhanh hồ tiêu biện pháp quản lý bệnh hại tổng hợp, Nxb NN, Hà Nội, 2012 19 Diệp Đông Tùng, Nguyễn Xuân Niệm, Chu Hữu Tín (1999) Điều tragiám định số sâu bệnh hại tiêu Phú Quốc, Tạp Chí Bảo vệ thực vật, số 6: 20 - 23 20 Ngô thị Xuyên, 2002, Kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne phương pháp sinh học Hội thảo bệnh sinh học phân tử, lần thứ nhất, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh ngày 21/6/2002, Nhà xuất Nơng nghiệp, 113 - 119 Tài liệu tiếng Anh 21.Anandaraj M and Sarma IR, 1995, Dseases of black pepper (Piper nigrum L.) and their management, J Spices and Aromatic Crops, 4: 17-23 22.Anith, K.N., Radhakrishnan, N.V and Manomohandas, T.P., 2003)\, Screening of antagonistic bacteria for biologicalcontrol of nursery wilt of black pepper (Piper nigrum L.), Microbiol Res 158: 91–97 23.Aravind R, Kumar A, Eapen S and Ramana K , 2009, Endophytic bacterial flora in root and stem tissues of black pepper (Piper nigrum L.) genotype: isolation, identification and evaluation against Phytophthora capsici, Letters in applied microbiology 48(1): 58-64 24.Augstburger, F., Berger, J., Censkowsky, U., Heid, P., Milz, J and Streit, C., 2001, Organic farming in thetropics and subtropics: Pepper (2nd ed.), Germany: Naturlande V 25.Babadoost, M (2005) Phytophthora blight of cucurbits.The Plant Health Instructor, DOI: 10.1094/PHI-I-2005-0429-01 26.Bacon and White 2000, Physiological adaptation in the evolution of endophytism in the Clavicipitaceae In: Bacon CW, White JF Jr, eds Microbial endophytes, New York: Marcel Dekker, Inc 237–261 52 27.Bell, C.R., Dickie, G.A., Harvey, W.L.G and Chan, J.W.Y.F., 1995, Endophytic bacteria in grapevine, Can J Microbiol 41: 46–53 28.Chanway, C.P., 1996, Endophytes: they’re not just fungi, Can J Bot 74: 321–322 29.Chen, C., Bauske, E.M., Musson, G., Rodriguez-Cabana, R and Kloepper, J., 1995, Biological control of Fusarium wilt on cotton by use of endophytic bacteria Biol Control 5: 83–91 30.Chernin L and Chet I, 2002, “Microbial enzymes in biocontrol of plant pathogens and pests”, Enzymes in the Environment: Activity, Ecology, and Applications, 171-225 31.Compant S., Clément C and Sessitsch A., 2010, “Plant growth-promoting bacterial in the rhizo and endosphere of plant: their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization”, Soil Biol Biochem, 42, 669-678 32.Cook, J.R and Baker, K.F., 1983, The Nature and Practice of Biological Control of Plant Pathogens American Phytopathological Society, St Paul 33.Diby, P., Saju, K.A., Jisha, P.J., Sarma, Y.R., Kumar, A and Anandaraj, M., 2005, Mycolytic enzymes produced by Pseudomonas fluorescens and Trichoderma spp Against Phytophthora capsici, the foot rot pathogen of black pepper (Piper nigrum L.) Ann Microbiol 55: 129–133 34.Dinu A, Kumar A, Aravind R and Eapen SJ, 2007, “Novel in planta assay for selection of antagonistic bacteria against Phytophthora capsici on black pepper (Piper nigrum L.)”, J Spices Aromatic Crops, 16, 1-7 35.Drenth, A and Guest, D.I (Eds.)., 2004, Diversity andmanagement of Phytophthora in Southeast Asia, Australian Centre for International AgriculturalResearch Monograph no 114: 238p 36.El-Deeb B, Fayez K and Gherbawy Y, 2013, Isolation and characterization of endophytic bacteria from Plectranthus tenuiflorus medicinal plant in 53 Saudi Arabia desert and their antimicrobial activities Journal of plant interactions 8(1): 56-64 37.Farhana, S.N.M.D., Bivi, M.R., Khairulmazmi, A.,Wong, S.K and Sariah, M., 2013, Morphologicaland molecular characterization of Phytophthora capsici, the causal agent of foot rot disease of blackpepper in Sarawak, Malaysia International Journal ofAgriculture and Biology 15: 1083-1090 38.Fisher, M.C., Henk, D.A., Briggs, C.J., Brownstein, J.S.,Madoff, L.C., McCraw, S.L., Gurr, S.J., 2012, Emergingfungal threats to animal, plant and ecosystem health Nature 484 (7393): 186-194 39.Garbeva, P., Van Overbeek, L.S., Van Vuurde, J.W.L and Van Elsas, J.D., 2001, Analysis of endophytic bacterial communities of potato by planting and denaturing gradient gelelectrophoresis (DGGE) of 16s rDNA based PCR fragments Microb Ecol 41: 369–383 40.Gazis R., Miadlikowska J., Lutzoni F., Arnold A E., Chaverri P., 2012, Culturebased study of endophytes associated with rubber trees in Peru reveals a new class of Pezizomycotina: Xylonomycetes, Molecular Phylogenetics and Evolution, 65: 294-304 41.Gevens, A.J., Donahoo, R.S., Lamour, K.H and Hausbeck, M.K., 2008, Characterization of Phytophthora capsicicausing foliar and pod blight of snap bean in Michigan Plant Disease 92(2): 201-209 42.Gong M., Wang J D., Zhang J., Yang H., Lu X F., Pei Y., Cheng J Q., 2006, Study of the Antifungal Ability of Bacillus subtilis Strain PY-1 in Vitro and Identification of its Antifungal Substance (Iturin A) Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 38(4): 233-240 43.Hallmann, J Hallmann, A Hallmann, W.F Mahaffee, KloepperJ.W., 1997, Bacterial endophytes in agricultural crops.Can J Microbiol, 43: 895–914 44.Hamada M.; S Kondo; T Yokoyama; K Miura; K Iinuma; H Yamamoto; K Maeda; T Takeuchi; H Umezawa, 1974, 54 Minosaminomycin, a new antibiotic containing myo-inosamine J Antibiotics, 27: 81-93 45.Hardoim S, Pablo R, Overbeek LS, Elsas Y and Jan Dirk van, 2008, “Properties of bacteria endophytes and their proposed role in plant growth”, Trends in Microbiology, 16(10), 463-471 46.Hollis, J.P., 1951, Bacteria in healthy potato tissue Phytopathology 41: 350–366 47.Holt JG, Williams ST and Holt, 1989, Bergey's manual of systematic bacteriology, Vol 1989: Lippincott Williams & Wilkins 48.Jatala, (1986) Biological control of plant parasitic nematodes, Annual Review of phytopathology, Vol 24: 453-489 49.Jeyaseelan E C and Jashothan J P., 2012,” In vitro control of Staphylococcus aureus (NCTC 6571) and Escherichia coli (ATCC 25922) by Ricinus communis L.”, Asian Pac J Trop Biomed, 2(9), pp 717–721 50.Joshi R and M B Gardener , 2006, “Identification of genes associated with pathogen inhibition in different strains B subtilis phytopathology”, Antagonistic Activity of Endophytic, 96, 145-154 51.Kasana R C., Salwan R., Dhar H., Dutt S and Gulati A., 2008, “A rapid and easy method for the detection of microbial cellulases on agar plates using Gram’s iodine”, Current Microbiology, 57, pp.503-507 52.Kateka D., Shannaphimon W., Phichaya T., Prapaporn B., Arunee A., Panupong S and Ekachai C., 2009, “Comparative study of proteolytic activity of protease-producing bacteria isolated from thuanao”, Journal of Science and Technology, 3(02), pp 269-276 53.Kollakkodan N., Anith K N and Radhakrishnan N V., 2017, “Diversity of endophytic bacteria from Piper spp with antagonistic property against Phytophthora capsici causing foot rot disease in black pepper (Piper nigrum L.)”, Journal of Tropical Agriculture, (125), pp 531-752 55 54.Lamour, K.H., Stam, R., Jupe, J and Huitema, E., 2012b, The oomycete broad-host-range pathogenPhytophthora capsici Molecular Plant Pathology13(4): 329-337 55.Lee YK and Hwang BK , 1996, Differential induction and accumulation of β‐1, 3‐glucanase and chitinase isoforms in the intercellular space and leaf tissues of pepper by Xanthomonas campestris pv vesicatoria infection Journal of Phytopathology 144(2): 79-87 56.Mahafee, W.F and Kloepper, J.W., 1997, Bacterial communities of the rhizosphere and endorhiza associated with fieldgrown cucumber plants inoculated with a plant growth promoting rhizobacterium or its genetically-modified derivative Can J Microbiol 43, 344–353 57.Marín, F., Diánez, F., Santos, M., Carretero, F., Gea, F.J., Castañeda, C., Navarro, M.J and Yau, J.A., 2014, Control of Phytophthora capsici and Phytophthoraparasitica on pepper (Capsicum annuum L.) with compost teas from different sources, and theireffects on plant growth promotion Phytopathologia Mediterranea 53(2): 216-228 58.McInroy, J.A and Kloepper, J.W., 1995, Survey of indigenous bacterial endophytes from cotton and sweet corn Plant Soil 173, 333–342 59.Misaghi, I.J and Donndelinger, C.R., 1990, Endophytic bacteria in symptom-free cotton plants Phytopathology 80: 808–811.Mohd F K (2015), “In vitro antagonism of Phytophthora capsici and Fusarium solani by bacterial isolates from Sarawak”, Malaysian Journal of Microbiology, 11(2), pp 137-143 60.Mundt, J.O and Hinkle, N.F., 1976, Bacteria within ovules and seeds Appl Environ Microbiol 32: 694–698 61.Munjal, A., Philipe, J.M., Munro, E., Lecuit, T., 2015, A self-organized biomechanical network drives shape changes during tissue morphogenesis Nature, 524 (7565): 351-355 62.Nascimento, S.B., Lima, A.M., Borges B.N and de Souza C.R.B., 2015, Endophytic bacteria from Piper tuberculatumJacq.: isolation, molecular 56 characterization, and in vitro screening for the control of Fusarium solani f sp piperis, the causalagent of root rot disease in blackpepper (Piper nigrum L.) Genetics and molecular research, 14 (3): 7567-7577 63.Nazeem P.A., C.R Achuthan, T.D Babu, G.V Parab, D Girija, R Keshavachandran, and R.Samiyappan, 2008, Expression of pathogenesis related proteins in black pepper (Piper nigrum L.) in relation to Phytophthora foot rot disease, Journal of Tropical Agriculture 46 (1-2): 45–51 64.Nguyen Tang Ton and Bui Chi Buu, 2012, How to prevent the most serious diseases of black pepper (Piper nigrum L.)- a case study of Vietnam, Institute of Agricultural Sciences for Southern Vietnam 65.Nguyen, V.L., 2015, Spread of Phytophthora capsici in Black Pepper (Piper nigrum) in Vietnam Engineering 7: 506-513 66.Ou S.H., 1972, Rice Disease Commonwealth Mycological Institute Kew, Surrey, UK, 380 pp 67.Patriquin, D.G and Do ăbereiner, J., 1978, Light microscopyobservations of tetrazolium-reducing bacteria in the endorhizosphere of maize and other grasses in Brazil Can JMicrobiol 24: 734–742 68.Phister T., D J O’sullivam and L L Mckay, 2004, “Identification of Bacilysin, Chlorotetaine, and Iturin A Produced by Bacillus sp Strain CS93 Isolated from Pozol, a Mexican Fermented Maize Dough”, Appl Environ Microbiol, 70(1), 631-634 69.Ramarathnam R, Bo S, Chen Y, Fernando WG, Xuewen G and Kievit T, 2007, “Molecular and biochemical detection of fengycin- and bacillomycin D-producing Bacillus spp., antagonistic to fungal pathogens of canola and wheat”, Can J Microbiol, 53(7), 901-912 70.Ravindran , S S., 2000, A reduced‐order approach for optimal control of fluids using proper orthogonal decomposition, International Journal for Numerical Methods in Fluids, 34 (5): 425-448 57 71.Samish, Z., Etinger-Tulczynska, R and Blick, M., 1961, Microflora within healthy tomatoes Appl Environ Microbiol 9:, 20–25 72.Sampson R A, 1994, Current systematics of the genus Aspergillus In: The genus Aspergillus From taxonomy and genetics to industrial application Plenum Press, New York, N.Y: 261-276 73.Sarma, Y.R., Manohara, D., Premkumar, T and Eapen, S.J.(Eds.), 2013, Diseases and insect pests of black pepper (Piper nigrum L.), Jakarta, Indonesia: InternationalPepper Community (IPC) 74.Sivaraman, K., Kandiannan, K., Peter, K.V andThankamani, C.K., 1999, Agronomy of black pepper(Piper nigrum L.) - A review Journal of Spices andAromatic Crops 8(1): 1-18 75 Smith GE, 1957, Inhibition of Fusarium oxysporum f Sp Lycopersici by a species of Micromonospora isolated from tomato Phytopathology, 47: 429-432 76.Stanley T Williams ME Sharpe and Holt JG (1989), “Bergey’s Mannual of Systematic bacteriology”, Williams & Wilkins, 4, 2452-2492 77.Sturz, A.V., Christie, B.R., Matheson, B.G., Arsenault, W.J and Buchanan, N.A., 1999, Endophytic bacterial communities in the periderm of potato tubers and their potential to improve resistance to soil-borne pathogens Plant Pathol 48: 360–369 78.Toh SC and Lihan S, 2016, “Screening for antifungal-producing bacteria from Piper nigrum plant against Phytophthora capsici”, International Food Research Journal, 23(6), 2616-2622 79.Trivedi P, Spann T and Wang N, 2011, Isolation and characterization of benefcial bacteria associated with citrus roots in Florida Microb Ecol 62: 324-336 80.Tsuge K., T Akiyama and M Shoda, 2001, “Cloning, Sequencing, and Characterization of the Iturin A Operon”, Journal of bacteriology, 183(21), 6265-6273 58 81.Usharani T R and Gowda T K., 2011, “Cloning of chitinase gene from Bacillus thuringiensis”, Indian Journal of Biotechnology, 10, pp 264-269 82.Van Buren, A.M., Andre, C and Ishimaru, C.A., 1993, Biological control of the bacterial ring spot pathogen by endophytic bacteria isolated from potato Phytopathology 83: 1406 83.Victor R Preedy (Editer) Essential Oils in food preservation, Flaver and safety, Elsevier Inc., 2016 84.Zinniel, D.K., Lambrecht, P.N., Harris, B., Zhengyu, F., Daniel,K., Phyllis, H., Carol, A.I., Alahari, A et al ,2002, Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteriafrom agronomic crops and prairie plants Appl Environ Microbiol 68: 2198–2208 85.Živković S, Stojanović S, Ivanović Ž, Gavrilović V, Popović T and Balaž J, 2010, “Screening of antagonistic activity of microorganisms against Colletotrichum acutatum and Colletotrichum gloeosporioides” Archives of Biological Sciences, 62(3), 611-623 ... 1.2 VI SINH VẬT NỘI SINH TRÊN CÂY HỒ TIÊU VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KHÁNG NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT 16 1.2.1 Vi sinh vật nội sinh (endophylic microorganisms) hồ tiêu 16 1.2.2 Sự đa dạng vi sinh vật nội sinh. .. CÂY HỒ TIÊU, BỆNH NẤM TRÊN CÂY HỒ TIÊU 1.1.1 Cây hồ tiêu tiềm phát triển hồ tiêu Vi t 1.1.2 Hiện trạng canh tác trồng hồ tiêu Đăk Lăk 1.1.3 Bệnh ảnh hưởng bệnh nấm trồng 1.1.4 Khả đối kháng vi. .. sinh kháng nấm gây bệnh hồ tiêu 16 1.2.3 Khả ứng dụng vi sinh vật nội sinh phòng chống nấm gây bệnh hồ tiêu 18 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ NẤM GÂY