ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ dẫn TRUYỀN THUỐC PACLITAXEL của hệ NANOGEL GELATIN PLURONIC p123 gắn FOLIC ACID HƯỚNG ĐÍCH TRONG điều TRỊ UNG THƯ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆPĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ DẪN TRUYỀN THUỐC PACLITAXEL CỦA HỆ NANOGEL GELATIN-PLURONIC P123 GẮN FOLIC ACID HƯỚNG ĐÍCH TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ Người hướng dẫn: PGS.TS TRẦN NGỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ DẪN TRUYỀN THUỐC PACLITAXEL CỦA HỆ

NANOGEL GELATIN-PLURONIC P123 GẮN FOLIC ACID HƯỚNG ĐÍCH

TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ

Người hướng dẫn: PGS.TS TRẦN NGỌC QUYỂN

Người thực hiện: TRẦN THU BÌNH

MSSV: 61403049 Lớp: 14060302

Khóa: 18

TP HỒ CHÍ MÌNH, NĂM 219

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ DẪN TRUYỀN THUỐC PACLITAXEL CỦA HỆ

NANOGEL GELATIN-PLURONIC P123 GẮN FOLIC ACID HƯỚNG ĐÍCH

TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ

Người hướng dẫn: PGS.TS TRẦN NGỌC QUYỂN

Người thực hiện: TRẦN THU BÌNH

MSSV: 61403049 Lớp: 14060302

Khóa: 18

TP HỒ CHÍ MÌNH, NĂM 219

Ngoài ra, em xin gửi lời cảm ơn đến nhà trường và các quý thầy cô trong Khoa KhoaHọc Ứng Dụng đã chỉ bảo tận tình, cung cấp em những kiến thức về lý thuyết và thực

tế, trong suốt quá trình em được đào tạo tại trường Đại Học Tôn Đức Thắng

Con xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện, ủng hộ, động viên con trong suốt quá trìnhhọc tập cũng như trong cuộc sống

Do thời gian có hạn nên việc thiếu sót là không thể tránh khỏi Rất mong những ý kiến

và góp ý của quý thầy cô giúp em hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn

LỜI CAM KẾTCÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI VIỆN VẬT LIỆU ỨNG DỤNG

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướngdẫn khoa học của của PGS.TS Trần Ngọc Quyển Các nội dung nghiên cứu, kết quảtrong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây.Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá đượcchính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo

Ngoài ra, trong luận văn còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệucủa các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc

Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

về nội dung luận văn của mình Trường Đại học Tôn Đức Thắng không liên quan đến

những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực hiện (nếu có)

TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2019

Tác giả

Trần Thu Bình

TÓM TẮT

Các nghiên cứu nhằm cải tiến, nâng cao hiệu quả trong việc điều trị ung thư đang đượcnghiên cứu không ngừng Việc ứng dụng công nghệ nano đã tạo ra một hướng mớitrong ngành dược phẩm là tổng hợp hệ vật liệu nanogel dùng nang thuốc Hệ nanogelđược ứng dụng để cải tiến các nhược điểm của thuốc như khả năng tan trong nước, kịsáng, độ ổn định,… Nhằm nâng cao hoạt tính sinh học, tăng khả năng hướng đíchchính xác

Paclitaxel là loại thuốc chống ung thư vú, buồng trứng, phổi, phổ biến hiện nay, cónguồn gốc từ thực vật- Taxol Nhưng do nhược điểm như ít tan trong nước, gây độccho tế bào,… nên việc sử dụng còn hạn chế

Khóa luận này của em tiến hành tổng hợp hệ nanogel Gelatin Pluronic gắn Folic acidvới tỉ lệ Gelatin: Pluronic là 1:4 mang Paclitaxel Tiến hành đánh giá cấu trúc, hìnhthái của hệ nanogel bằng việc đo phổ 1H-MNR và FT-IR Kích thước hạt được xác địnhbằng phương pháp đo DLS và thể zeta Khả năng nang hóa Paclitaxel được xác địnhbằng phương pháp đo UV-Vis Hiệu quả phóng thích thuốc được xác định bằng cáchreleased trong 72h ở môi trường đệm PBS 7.4 Từ những đánh giá trên có thể xác định

hệ nanogel Gelatin Pluronic gắn Foic acid có tiềm năng trong việc nang thuốcPaclitaxel trong điều trị ung thư

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM KẾT ii

TÓM TẮT iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC ĐỒ THỊ ix

DANH MỤC SƠ ĐỒ x

DANH MỤC HÌNH ẢNH xi

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

1.3 Ý nghĩa đề tài 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 2

2.1 Tổng quan về bệnh ung thư 2

2.1.1 Ung thư là gì và nguyên nhân dẫn đến ung thư? 2

2.1.2 Phương pháp điều trị [2],[6] 3

2.2 Tổng quan về nanogel [7], [8], [9], [11], [12] 3

2.3 Tổng quan về Gelatin [7], [8] 4

2.4 Tổng quan về Pluronic (P123) [7], [8], [9], [15] 5

2.5 Tổng quan về Folic acid [21], [22], 7

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 10

3.1 Vật liệu 10

3.1.1 Hóa chất 10

3.1.2 Dụng cụ 10

3.2 Phương pháp 11

3.2.1 Quy trình tổng quan 11

3.2.2 Tổng hợp hệ Nanogel Ge-P123 gắn DAB 12

3.2.3 Tổng hợp hệ Nanogel Gelatin-P123 gắn FA 14

3.2.4 Tổng hợp hệ Nanogel Ge-P123-FA mang Paclitaxel 1% 16

3.2.5 Đánh giá khả năng dẫn truyền thuốc của hệ 18

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 20

4.1 Kết quả phổ 1H-MNR, FTIR của hệ GP-FA 20

4.1.1 Kết quả phổ 1H-MNR của hệ GP-FA 20

4.1.2 Kết quả phổ FTIR của hệ GP-FA 21

4.2 Kết quả đo nồng độ micelles CMC 22

4.3 Kết quả đo kích thước và thế zeta 22

4.3.1 Đo kích thước hạt 22

4.3.2 Đo điện thế Zeta 22

4.4 Đánh giá hiệu quả sau khi nang thuốc PTX của hệ GP-FA 24

4.5 Đánh giá tốc độ giải phóng thuốc của hệ chất mang GP- FA ( PTX3%) 24

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29

5.2 Kiến nghị 29

TÀI LIỆU THAM KHẢO 30

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 30

TÀI LIỆU TIẾNG ANH 30

PHỤ LỤC 33

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng

Bảng 3.2: Khối lượng thuốc tương ứng với các hệ chất mang

Bảng 4.1 : Kết quả đo size DLS

Bảng 4.2: Kết quả đo thế zeta

Bảng: 4.3: Lượng Paclitaxel trong hệ GP-FA phóng thích ở PBS 7.4 Trong 72hBảng: 4.4: Lượng Paclitaxel trong hệ GP phóng thích ở PBS 7.4 Trong 72hBảng: 4.5: Lượng Paclitaxel trong hệ P123 thóng thích ở PBS 7.4 Trong 72h

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 4.1: Phương trình đường chuẩn Paclitaxel trong EtOH: PBS 7.4 (1:1)

Đồ thị 4.2: Khả năng giải phóng PTX trong 72h ở PBS 7.4

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1: Quy trình tổng quan

Sơ đồ 3.2: Quy trình tổng hợp hệ Ge-P123 gắn DAB

Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp hệ Gelatin-P123-FA

Sơ đồ 3.4: Quy trình tổng hợp P123- PTX 1% (a); Quy trình tổng hợp GP- PTX 1%(b); Quy trình tổng hợp GP-FA- PTX 1% (c)

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1: Phân chia ở tế bào bình thường (a); Phân chia ở tê bào ung thư (b)Hình 2.2: Giải phóng thuốc ở Nanogel

Hình 2.3: Cấu trúc của Gelatin (a); Bột Gelatin (b)

Hình 2.4: Cấu trúc của Pluronic

Hình 2.5: Sự hình thành micelle của Pluronic

Hình 2.6: Cấu trúc của Pluronic P123

Hình 2.7: Cấu trúc Folic acid (a); Bột Folic acid (b)

Hình 2.8: Cấu trúc của Paclitaxel(a); Cây thông đỏ chiết xuất Paclitaxel (b)Hình 3.1: P123-OH (a); Ge-P123-DAB sau khi đông khô (b)

Hình 3.2: Túi thẩm tách Ge-P123-FA (a); Ge-P123-FA sau khi đông khô (b)Hình 3.3: GP mang PTX 1%(a); GP-FA mang PTX 1%(b)

Hình 4.1: Phổ 1-MNR của hệ GP-FA

Hình 4.2: Phổ FTIR ghép của GP-FA

Hình 4.3: Giản đồ đo kích thước hệ nanogel GP-FA

Hình 4.4: Giản đồ đo zeta cảu hệ GP-FA

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Ung thư là một trong những bệnh có tỉ lệ tử vong cao hàng đầu hiện nay Việc pháthiện sớm và điều trị đúng cách giúp bệnh nhân kéo dài được sự sống cũng như giảmthiểu nguy cơ tử vong Trong vài thế kỉ qua, việc nghiên cứu nhằm cải thiện hoạt tínhsinh học và dược động học của thuốc điều trị ung thư được nghiên cứu rộng rãi và cảitiến không ngừng Cùng với sự phát triển của công nghệ nano trong ngành dược liệu,

đã phát triển tạo ra các hệ vật liệu chất mang nanogel nhằm nâng cao hiệu quả củadược liệu

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan về bệnh ung thư

Ung thư là nguyên nhân gây tử vong cao thứ hai chỉ sau các bệnh về tim mạch TheoWHO ( Tổ chức Y tế Thế giới) ước tính có 9.6 triệu người chết vì ung thư và có thêm18.1 triệu ca mắc mới vào năm 2018.[4],[5]

2.1.1 Ung thư là gì và nguyên nhân dẫn đến ung thư?

Ung thư được hình thành do sự phát triển không kiểm soát của các tế bào Tế bào tiếptục phát triển, phân chia và tái phân chia thay vì chết đi để hình thành tế bào mới, tạothành các mô gọi là khối u Một vài loại tế bào ung thư có thể di chuyển (di căn) đếncác bộ phân khác của cơ thể thông qua máu hoặc mạch bạch huyết (lymph system) nơichúng bắt đầu tiếp tục phát triển Các khối u lành tính thường không di căn sang các

mô lân cận, chúng thường có kích thước lớn và không tái phát sao khi loại bỏ như cáckhối u ác tính.[2],[5],[6]

Tế bào ung thư được hình thành từ tế bào bình thường do sự sai hỏng DNA Bìnhthường nếu có sự sai hỏng DNA, cơ thể sẽ tự sửa chữa, nhưng với tế bào ung thư thìkhông Cơ thể có thể nhận đoạn DNA sai hỏng đó từ cha mẹ, hoặc trong nhiều trườnghợp cơ thể chịu các tác động từ môi trường xung quanh dẫn đến sự sai hỏng đó như độtbiến, nhiễm phóng xạ [5],[6]

Ước tính có khoảng 30-50% các các ca tử vong do ung thư có thể ngăn ngừa được nhờvào việc thay đổi thói quen sinh hoạt như việc sử dụng thuốc lá, rượu bia, duy trì sứckhỏe tốt, kiểm tra sức khỏe định kì, …[4]

Hình 2.1: Phân chia ở tế bào bình thường (a); Phân chia ở tế bào ung thư (b)

2.1.2 Phương pháp điều trị [2],[6]

Muc tiêu của các phương pháp điều trị là nhằm chữa khỏi hoặc kéo dài sự sống chobệnh nhân Dựa vào các chẩn đoán ban đầu để lựa chọn ra phương pháp điều trị thíchhợp nhất cho bệnh nhân Các cách điều trị ung thư hiện nay gồm:

Phẫu thuật là cách cắt bỏ khối u

Hóa trị là phương pháp dùng hóa chất để ngăn chặn hoặc tiêu diệt tế bào ác tính

Xạ trị hay vật lý trị liệu là hương pháp dùng tia phóng xạ để tiêu diệt các tế bào ác tính

2.2 Tổng quan về nanogel [7], [8], [9], [11], [12]

Nanogel là vật liệu ba chiều hydrogel trong phạm vi kích thước nano (1-100 nm) đượctạo thành từ các mạng polymer liên kết với nhau, có thể là polymer tự nhiên, polymertổng hợp hoặc kết hợp giữa hai loại Các vật liệu nanogel có khả năng tải thuốc ổnđịnh, tương tích sinh học, phân hủy sinh học cao, tải thuốc mà không cần phản ứng hóahọc nên có thể giữ được hoạt tính của thuốc Do có kích thước nhỏ, nên các hạtnanogel dễ tiếp cận với các mao mạch, dễ xuyên bào, tăng hiệu quả của thuốc Thôngthường các loại thuốc khó tan, hấp thụ kém được đóng gói trong vỏ nanogel Thuốcđược giữ lại trong khoang trống được tạo bởi lớp mạng polymer

ba

Hình 2.2: Giải phóng thuốc ở Nanogel [15]

2.3 Tổng quan về Gelatin [7], [8]

Hình 2.3: Cấu trúc của Gelatin (a); Bột Gelatin (b)

a

b

Aspatic acid, Glutamin acid, Glycine, Histidine Hydroxyproline, Hydroxylysine,Isoleucin, Leucine, Lysine, Methionin, Phenylalanine, Proline, Serine, Threonine,Valine, Tyrosine Thủy phân hoàn toàn gelatin có thể thu nhận được các loại acid amintrên với tỉ lệ tùy thuộc vào nguyên liệu và phương pháp tiến hành.

Gelatin là một protein lưỡng tính ( có nhóm –COOH và nhóm –NH2), tích điện dươngtrong môi trường acid do sự phân ly của nhóm acid bị kìm hãm (gelatin tác dụng nhưmột bazo) và tích điện âm trong môi trường kiềm do sự phân ly nhóm bazo bị kìm hãm(gelatin tác dụng như một acid) Dễ tan trong nước nóng ( 40oC) và cô đặclại khi làm lạnh

Gelatin thương mại ở dạng khô, không mùi, màu từ vàng đến trắng thường được thunhận từ việc thủy phân collagen Gelatin loại A có nguồn thu nhận từ da heo, da cá,phân tử collagen đơn giản và được thủy phân bằng acid, điểm đẳng điện pI = 7.5-9,gelatin loại B được sản xuất từ da bò, da động vật già bị giết mổ, phân tử collagen phứctạp và được tạo thành nhờ thủy phân bằng kiềm, điểm đẳng điệm pI = 4.8-5.4.[8]

Gelatin là một chất keo sinh học được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực thực phẩm,dược phẩm,…Trong thực phẩm, Gelatin có tác dụng ngăn sự kết tinh của đường, tạo độdẻo cho kẹo; tạo độ mịn, sánh cho các sản phẩm bơ sữa Ứng dụng của gelatin trongdược phẩm để sản xuất bao nhộng Nó có tác dụng bảo vệ, chống biến tính thuốc docác tác nhân như oxi hóa, ánh sáng

2.4 Tổng quan về Pluronic (P123) [7], [8], [9], [15]

Tên khoa học: 2-methyloxirane

Công thức hóa học: C5H10O2

Hình 2.4: Cấu trúc của Pluronic [12]

Khối lượng phân tử 5800 g/mol, dạng rắn, không màu tan được trong nước, nhiệt độsôi trên 149oC, nhiệt độ nóng chảy trên 56oC Là chuỗi copolymer, chuỗi kị nước ởgiữa là poly (propylene oxide) (PPO) và hai chuỗi ưa nước bao ngoài Poly (ethyleneoxide) (PEO) Đầu kị nước PPO tạo thành lõi kỵ nước như môi trường để tải các thuốc

kị nước, đầu ưa nước PEO ngăn chặn sự kết tụ, hấp thụ protein, sự nhận dạng của lướinội mô

Tan được trong nước, không mang độc có tiềm năng mang được các thuốc không tantrong nước Puronic có khả năng tạo micelle với lõi là đầu kị nước và đầu ưa nước baobên ngoài Một đặc điểm khác là Puronic có nhóm –OH đầu mạch dễ tạo liên kết vớicác chất khác để tạo ra hệ nano mang thuốc

Hình 2.5: Sự hình thành micelle của PluronicVới Pluronic P123 (PEO20-PPO69-PEO20) Do P123 có từ 60 đến 70 nhóm kỵ nước nên

có HLB thấp ( độ cân bằng ưa kị nước- hydrophilic Lipophilic Balance-là giá trị thể

càng tốt, giá trị càng thấp hóa chất dễ tan trong dung môi không phân cực.[13], [16]

Hình 2.6: Cấu trúc của Pluronic P123

2.5 Tổng quan về Folic acid [21], [22],

Tên khoa học: (S)-2-[[4-[(2-amino-4-oxo-1H-pteridin-6-yl) methylamino]

ba

nhạy cảm với nhiệt độ và ánh sáng Tan tốt trong dimethyl sulfoxide (DMSO) vàdiethyl formmide (DMF) với giới hạn hòa tan lần lượt là 20 mg/L và 10mg/L.

Khi vào cơ thể acid folic sẽ chuyển hóa thành tetrahydrofolat là coenzyme của nhiềuquá trình chuyển hóa, trong đó có quá trình tổng hợp các nucleotid có nhân purin vàpyrimidin Ngoài ra Folic aicd còn được sử dụng để điều trị thiếu máu, đặc biệt rất cầncho phụ nữ mang thai

2.6 Tổng quan về Paclitaxel [17], [18], [19], [20]

Hình 2.8: Cấu trúc của Paclitaxel (a); Cây thông đỏ chiết xuất Paclitaxel (b)

Vào những năm 1960, National Cancer Institute (NCI) thực hiện dự án tìm kiếm cácloại hợp chất tự nhiên mới,có tác dụng trong điều trị ung thư Paclitaxel được chiếtxuất từ vỏ cây Thông đỏ ( Taxus brevifolia) lần đầu tiên vào năm 1967 bởi Monroe E.Wall và Mansukh C, được đặt tên là Taxol Thông qua nghiên cứu lâm sang mãi đếnnăm 1992, paclitaxel mới được Food and Drug Administration (FDA- Cơ quan Quản lýThực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ) cấp phép sử dụng như chất điều trị ung thư buồngtrứng Dạng thương mại là bột trắng, không tan trong nước Là một trong những loạithuốc chống ung thư thành công nhất, được sử dụng để điều trị một dạng như ung thư

vú, ung thư phổi, Kaposi's sarcoma,

Tên khác: Taxol,Onxal

ba

Khối lượng phân tử là 853.91 g/mol, nhiệt độ nóng chảy 213 C 217 C

Paclitaxel liên kết với các β-tubulin của microtubules để ngăn cản sự phân ly củachúng, là sự phân bào bị ngừng lại Áp dụng cho hóa trị nhưng ít tan trong nước và cónhiều phản ứng phụ nên ứng dụng trong trị liệu còn hạn chế Một trong những tác dụngphụ thường thấy của bệnh nhân sau khi dùng Paclitaxel là ngoại ban, kém ăn, hạ huyếtáp,…

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Vật liệu

3.1.1 Hóa chất

STT Tên hóa chất Nguồn gốc

1 Pluronic P123 Sigma Aldrich

6 3-amino-1-propanol Acros Organic

7 Folic acid Acros Organic

10 Folic acid Acros Organic

Máy cô quay chân không Buxchi Rotavapor R-200, Heating Bath B-490

Máy đông khô FDU-1200 EYELA

Máy đo kích thước hạt (DLS) và thể Zeta, SZ-100 HORIBA Scientific

Máy UV-Vis Shimadzu UV-1800

Máy FTIR Perkinelmer Frontier

Tổng hợp hệ Gelatin-P123-FA mang Paclitaxel

Đánh giá khả năng mang thuốc của hệ nanogel Ge-P123-FA

Sơ đồ 3.2: Quy trình tổng hợp hệ Ge-P123 gắn DABCân 0.5g Gelatin cho vào cốc hòa tan bằng 25 mL H2O (t 40oC) (1) Cân2g P123-OH hòa tan trong 25 mL H2O (t 18oC) (2) Nhỏ từ từ (2) vào (1)trong 15 phút, cho phản ứng trong 12 giờ Hút 35μL DAB thêm vào 10 mL H2O vớixúc tác là 35 mg EDC và 0.05g NHS (3) Nhỏ từ từ (3) vào (A), phản ứng thực hiệntrong 6 giờ.

Nhỏ từ từ

Nhỏ từ từ

GelatinP123-OH

Đông khô