PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Từ nhiều năm nay, ngành chăn nuôi chiếm một vai trò quan trọng trong nền kinh tế ở nƣớc ta vì nƣớc ta là một nƣớc nông nghiệp. Nó đã cung cấp một phần nhu cầu thực phẩm thiết yếu của cuộc sống con ngƣời. Trong đó ngành chăn nuôi heo không ngừng phát triển để cung cấp đủ số lƣợng cũng nhƣ chất lƣợng cho ngƣời tiêu dùng. Do nhu cầu xã hội phát triển nên số lƣợng heo nuôi ngày càng tăng cao. Song song với quá trình phát triển của ngành chăn nuôi heo thì giới chăn nuôi cũng phải đối mặt với không ít khó khăn, đặc biệt là những bệnh ảnh hƣởng trực tiếp đến thành tích sinh sản và tăng trƣởng của heo nhƣ: bệnh FMD, bệnh dịch tả heo, bệnh đóng dấu son, bệnh giả dại…và gần đây nhất là một vấn đề đang làm đau đầu giới chăn nuôi, nó ảnh hƣởng không nhỏ đến hiệu quả kinh tế của ngành chăn nuôi là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS: porcine reproductive and respiratory syndrome). Bệnh do virus PRRS tiến triển phức tạp, khó khống chế lại ít biểu hiện triệu chứng, tỷ lệ mắc bệnh cao, bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi. Bệnh gây sảy thai ở thời kỳ cuối, chậm động dục, gia tăng số thai chết và heo con sơ sinh yếu, heo con chết trƣớc khi sinh, còi cọc, chậm lớn. Những nghiên cứu về PRRS trƣớc đây chỉ dừng lại ở việc điều tra tỷ lệ nhiễm bằng phản ứng ELISA để phát hiện kháng thể kháng virus PRRS. Mặc dù việc nuôi cấy phân lập virus trên môi trƣờng tế bào khó, tuy nhiên xác định sự hiện diện của virus từ mẫu huyết thanh dƣơng tính và các mẫu lâm sàng là rất cần thiết để làm cơ sở cho công tác phòng bệnh và các nghiên cứu sau này. 2 Xuất phát từ thực tế trên, đƣợc sự phân công của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM, dƣới sự hƣớng dẫn tận tình của ThS. Trần Thị Bích Liên và BSTY Hoàng Thanh Hải, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC- 145 và xác định virus bằng kỹ thuật RT- PCR”.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƯỜNG

TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS

BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007

Sinh viên thực hiện: VÕ NGỌC THƠ

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƯỜNG

TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS

LỜI CẢM ƠN

 Chân thành cảm ơn:

Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm

Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Các Thầy Cô và anh chị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trường Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp

Thầy Hải, Cô Hà và các Thầy Cô Bộ Môn Vi Sinh-Truyền Nhiễm đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Anh Lê Hồng Phong ở Cục Thú Y vùng 6 đã rất tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khoá luận

Anh Uyên đã động viên và chia sẻ vấn đề của tôi

Các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 (nhất là các bạn trong phòng 14A, cư

xá B) đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

 Đặc biệt tôi xin gởi lời biết ơn sâu sắc đến Cô Trần Thị Bích Liên và Anh Hoàng Thanh Hải đã rất tận tình dạy bảo, hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận

 Con xin gởi lòng mang ơn đặc biệt nhất đến với cha mẹ, những người sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ và luôn cho con một tinh thần thoải mái để luôn chú tâm vào chuyện học

 Và lời cám ơn đặc biệt nhất tôi xin gởi đến người bạn thân thiết nhất, Nguyễn Minh Khôi, đã luôn luôn bên tôi, an ủi và động viên để tôi làm tốt nhất Xin cám ơn, cám ơn từ tận đáy lòng tôi

Thủ Đức, tháng 8 năm 2007

Võ Ngọc Thơ

TÓM TẮT

Đề tài: “Phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145 và xác định virus bằng kỹ thuật RT-PCR” Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 tại phòng Vi Sinh Truyền Nhiễm Khoa Chăn Nuôi Thú Y và tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh

Mục tiêu của đề tài là phân lập virus từ các loại mẫu khác nhau và xác định sự hiện diện của virus bằng kỹ thuật RT-PCR Nội dung nghiên cứu gồm:

 Hồi phục tế bào và xác định thời gian một lần cấy chuyển (thời gian tế bào phát triển đầy bề mặt nuôi cấy tạo thành tế bào một lớp) trên bình nuôi cấy 25cm2với những lượng tế bào là 7.105 và 106

 Khảo sát bệnh tích tế bào MARC-145 sau khi nuôi cấy phân lập từ các loại mẫu khác nhau: huyết thanh, hạch amiđan, phổi, hạch phổi

 Xác định sự hiện diện của virus PRRS từ bệnh tích tế bào MARC-145 sau gây nhiễm bằng kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) Sau thời gian thực hiện, chúng tôi có các kết quả sau:

o Thời gian một lần cấy chuyển ở lọ 25cm2 với những lượng tế bào: 7.105, 106lần lượt là 72,56 giờ và 46 giờ

o Tế bào MARC-145 sau khi được hồi phục từ nitơ lỏng vẫn phát triển bình thường

o Phân lập virus PRRS từ hạch phổi, phổi, huyết thanh trên môi trường tế bào MARC-145 Ghi nhận được 3 mẫu có biểu hiện bệnh tích tế bào là 2 mẫu hạch phổi và 1 mẫu phổi chiếm tỷ lệ 27,27% (3/11)

o Bằng kỹ thuật RT-PCR, trong 3 mẫu có bệnh tích tế bào có 1 mẫu cho kết quả dương tính chiếm tỷ lệ 33,33% trên mẫu xét nghiệm

Purpose of this reseach: Isolate PRRS virus from different specimens and determine its appearance by RT-PCR technology The contain is concerned about:

 Reviewing the cell and determine how long once transfer, length of time for cells grows to make monolayer, in flash with the amount of 7.105 and 106

 Observating MARC-145 cell`s pathology after infecting the cells with different specimens such as: serum, lung, lympho nodes

 Determine virus` appearance from MARC-145 cell's pathology after days postinfection by RT-PCR technology (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)

Finally, we have results:

o The average period of one transfer with the amount of 7.105

cells is 72,565 hours, 106 cells is 46 hours.

o MARC-145 after reviewing from liquid nitrogen grow normally

o Isolating PRRS virus from lung, lympho nodes, serum in MARC-145 cell invironment 3 specimens have MARC-145 cell's pathology postinfection: 2 lymphonotes, 1 lung (3/11 specimens)

o We detect the positive form of PRRS RNA by RT-PCR: lympho node

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT iv

SUMMARY v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH x

DANH SÁCH CÁC BẢNG xi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xii

Chương 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích - Yêu cầu 2

Chương 2: TỔNG QUAN 3

2.1 Tổng quan về nuôi cấy tế bào 3

2.1.1 Một số đặc điểm của tế bào động vật 3

2.1.2 Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy 4

2.1.3 Điều kiện nuôi cấy 6

2.1.4 Sự tạp nhiễm và cách hạn chế 6

2.2 Phương pháp PCR 6

2.2.1 Nguyên tắc 7

2.2.2 Thực nghiệm 7

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 8

2.2.4 Phương pháp RT-PCR 9

2.3 Sơ lược về căn bệnh, bệnh do virus 10

2.3.1 Lịch sử bệnh 10

2.3.2 Căn bệnh học 11

2.3.2.1 Phân loại 11

2.3.2.2 Một số đặc điểm về hình thái và cấu trúc 12

2.3.2.3 Đặc điểm nuôi cấy 14

2.3.2.4 Sức đề kháng 16

2.3.3 Dịch tễ học bệnh PRRS 16

2.3.3.1 Loài mắc bệnh 16

2.3.3.2 Phương thức lây lan 16

2.3.3.3 Đường xâm nhập 17

2.3.3.4 Cơ chế sinh bệnh 17

2.3.4 Triệu chứng lâm sàng 20

2.3.5 Chẩn đoán 20

2.3.5.1 Chẩn đoán lâm sàng 20

2.3.5.2 Chẩn đoán phi lâm sàng 21

2.3.5.2.1 Phương pháp phát hiện kháng thể 21

2.3.5.2.2 Các phương pháp phát hiện kháng nguyên 22

2.3.5.2.3 Phát hiện gen của virus PRRS 23

2.3.5.2.4 Phân lập virus trên môi trường tế bào 23

Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 25

3.1 Thời gian và địa điểm 25

3.2 Đối tượng và số lượng mẫu 25

3.3 Nội dung nghiên cứu 25

3.4 Vật liệu và dụng cụ 26

3.4.1 Thiết bị và dụng cụ dùng cho nuôi cấy tế bào và phân lập virus 26

3.4.2 Vật liệu dùng cho nuôi cấy tế bào MARC-145 26

3.4.3 Thiết bị và dụng cụ dùng cho phản ứng PCR 27

3.4.4 Vật liệu và hoá chất cho chiết tách RNA 27

3.4.5 Vật liệu và hoá chất sử dụng cho RT-PCR 27

3.4.6 vật liệu và hoá chất cho điện di sản phẩm RT-PCR 28

3.5 Phương pháp tiến hành 28

3.5.1 Phương pháp lấy mẫu 28

3.5.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào MARC-145 28

3.5.2.1 Hồi phục tế bào 28

3.5.2.2 Cấy chuyển tế bào 29

3.5.3 Phương pháp phân lập virus 30

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

4.1 Thời gian một lần cấy chuyển tế bào MARC-145 34

4.2 Kết quả gây nhiễm lần một trên môi trường tế bào MARC-145 35

4.3 Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trường tế bào MARC-145 37

4.4 Kết quả RT-PCR 40

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Tồn tại 44

5.3 Đề nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ cơ chế sinh bệnh của virus PRRS 19

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ phân lập và xác định virus PRRS 31

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ thực hiện phản ứng RT-PCR 33

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Virus PRRS 12

Hình 2.2 Đại thực bào bình thường 15

Hình 2.3 Đại thực bào bị nhiễm virus PRRS 15

Hình 2.4 Triệu chứng bệnh tai xanh 20

Hình 2.5 Sảy thai do virus PRRS 20

Hình 3.1 Buồng đếm Neubauer 30

Hình 4.1 Đối chứng âm 40

Hình 4.2 Mẫu không có bệnh tích tế bào 40

Hình 4.3 Đối chứng dương 40

Hình 4.4 Bệnh tích tế bào vào ngày thứ 7 sau gây nhiễm ở mẫu HP 41

Hình 4.5 Bệnh tích tế bào vào ngày thứ 7 sau gây nhiễm ở mẫu P2 41

Hình 4.6 Kết quả RT-PCR mẫu ly trích từ dịch nuôi cấy tế bào 42

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 4.1 Thời gian một lần cấy chuyển tế bào MARC-145 34

Bảng 4.2 Kết quả gây nhiễm lần một trên môi trường tế bào MARC-145 36

Bảng 4.3 Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trường tế bào MARC-145 38

Bảng 4.4 Kết quả RT-PCR từ mẫu dịch tế bào sau gây nhiễm 46

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AMV: Avian Myeloblastosis Virus

cDNA: Complement Deoxynucleotide Acid

DEPC: Diethyl Pyrocarbonate

DNA: Deoxynucleotide Acid

dNTP: Deoxynucleotide Triphosphate

EDTA: Ethylene Diamine Tetra Acetate

ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay

EMEM: Eagle Minimum Essential Medium

FA: Florescent Antibody Staining

HRPO: Horseradish Peroxidase

IFA: Immuno Peroxidase Monolayer Assay

IHC: Immunohistochemistry Staining

IPMA: Immuno peroxidase Monolayer Assay

LAH: Lactalbumin Hydrolysate

MSD: Mystery Swine Disease

Nu: Nucleotide

ORF: Open Reading Frame

PAM: Porcine Alveolar Macrophage

PBS: Phosphate Buffer Saline

PBSA: Phosphate Buffer Saline Solution A

PCR: Polymerase Chain Reaction

PRRS: Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome

RNA: Ribonucleotide Acid

RT-PCR: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

SN: Serum Neutralization

TBE: tris Borate EDTA

µl: Microlit

Bệnh do virus PRRS tiến triển phức tạp, khó khống chế lại ít biểu hiện triệuchứng, tỷ lệ mắc bệnh cao, bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi Bệnh gây sảy thai ở thời kỳ

cuối, chậm động dục, gia tăng số thai chết và heo con sơ sinh yếu, heo con chết trước khi sinh, còi cọc, chậm lớn Những nghiên cứu về PRRS trước đây chỉ dừng lại

ở việc điều tra tỷ lệ nhiễm bằng phản ứng ELISA để phát hiện kháng thể kháng virus PRRS Mặc dù việc nuôi cấy phân lập virus trên môi trường tế bào khó, tuy nhiên xác định sự hiện diện của virus từ mẫu huyết thanh dương tính và các mẫu lâm sàng

là rất cần thiết để làm cơ sở cho công tác phòng bệnh và các nghiên cứu sau này

Xuất phát từ thực tế trên, được sự phân công của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM, dưới sự hướng dẫn tận tình của ThS Trần Thị Bích Liên và BSTY Hoàng Thanh Hải, chúng tôi tiến hành thực hiện đề

tài: “Phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC- 145 và xác định

Ghi nhận bệnh tích tế bào sau 7 ngày nuôi cấy

Dùng kỹ thuật RT- PCR (Reverse Trascriptase - Polymerase Chain Reaction)

để xác định sự hiện diện của virus PRRS từ dịch tế bào nuôi cấy

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 Tổng quan về nuôi cấy tế bào

Nuôi cấy tế bào là kỹ thuật duy trì và phát triển các tế bào ở ngoài cơ thể sống nhưng vẫn thực hiện đầy đủ các chức năng biến dưỡng và chức năng chuyên biệt của tế bào Quá trình nuôi cấy tế bào cho phép mỗi tế bào đóng vai trò như những tế bào độc lập, nó có thể phân chia nhờ quá trình nguyên phân và quần thể tế bào tiếp tục phát triển cho đến khi bị giới hạn bởi bề mặt nuôi cấy hay sự cạn kiệt dinh dưỡng Kỹ thuật nuôi cấy tế bào được tiến hành lần đầu tiên vào năm 1907 bởi Harrison Ngày nay kỹ thuật này đã được ứng dụng rộng rãi trong y học và thú y học để nghiên cứu tác động của các chất lên tế bào hay nghiên cứu virus để phân lập, giám định, chuẩn độ virus, xác định tính chất huyết thanh học, quan sát hình thái siêu cấu trúc của virus và đặc biệt là sản xuất vaccine Quá trình nuôi cấy thường gồm những tế bào thuộc cùng một loại

2.1.1 Một số đặc điểm của tế bào động vật

Tính cơ học yếu: tế bào động vật không vách và kích thước tế bào khá lớn (khoảng 10 µm) nên tính bền cơ học yếu Do đó, khi nuôi cấy, tế bào động vật rất

dễ vỡ do các lực tác động khi thao tác trên tế bào như khuấy trộn để tách tế bào, di chuyển mẫu tế bào

Tăng trưởng và phân chia chậm: thời gian tăng trưởng gấp đôi của tế bào trung bình là 30 giờ Trong khi đó thời gian này của vi khuẩn chỉ khoảng 30 phút

Tính cần giá đỡ: hầu hết tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống

và phân chia Thông thường, tế bào phát triển tốt khi gắn vào bề mặt rắn Tế bào sẽ ngừng phân chia khi đã hình thành một lớp đơn liên tục trên bề mặt dụng cụ nuôi Tuy vậy một số tế bào như tế bào ung thư có thể sinh trưởng và phân chia ở trạng thái lơ lửng không cần giá đỡ

Tế bào động vật có thể được bảo quản trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -1960C, ở nhiệt độ này tế bào có thể giữ được khả năng sống không hạn định và sẽ phát triển trở lại trên môi trường nuôi cấy khi hồi phục

Ngoài ra tế bào còn có các đặc tính khác như: kém thích nghi với môi trường, nhạy cảm với các ion kim loại và đa số tế bào động vật cần huyết thanh, hormone tăng trưởng để phân chia (Phan Kim Ngọc, 2002)

2.1.2 Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy tế bào

Môi trường nuôi cấy tế bào phức tạp và giàu chất dinh dưỡng để tạo điều kiện tốt nhất cho sự phát triển của tế bào Môi trường có thể được cung cấp dưới dạng dung dịch để sử dụng ngay hay dưới dạng dung dịch đậm đặc hoặc dạng bột Dạng dung dịch đậm đặc có thể sử dụng sau khi pha loãng với nước cất tiệt trùng, trong khi dạng bột phải được hoà tan trong nước và tiệt trùng bằng cách lọc qua lưới lọc 0,22µm

Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy:

Carbonhydrate: glucose (5-10mM) được dùng trong hầu hết các công thức để cung cấp nguồn năng lượng cũng như tiền chất cho tổng hợp sinh học, như ribose cần cho tổng hợp acid nucleic Có thể dùng fructose thay thế cho glucose Glucose

có trong hầu hết môi trường là nguồn ly giải tạo pyruvate vào chu trình acid citric

và sinh ra CO2

Amino acid (0,1-0,2mM) cũng được dùng như là nguồn tiền chất cho tổng hợp protein Người ta thường sử dụng glutamine, tuy nhiên, ammoniac được thành lập từ chuyển hoá glutamine có thể ức chế sự sinh trưởng trong một số quá trình nuôi cấy

Muối cũng được dùng để làm cho môi trường có tính đẳng trương, duy trì sự cân bằng với phần bên trong tế bào

Bicarbonate (NaHCO3) cũng được dùng để đóng vai trò như hệ thống đệm trong sự kết hợp với 5-10% CO2 được cung cấp bởi tủ ủ Điều này cho phép môi trường duy trì có pH từ 7,2-7,4

Vitamin và hormone hiện diện ở nồng độ tương đối thấp và được dùng để kích thích sinh trưởng Lượng vitamin và hormone thay đổi nhiều giữa các công thức môi trường khác nhau Điều này cho thấy nhu cầu vitamin của các dòng tế bào

là khác nhau

Huyết thanh: được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cải thiện sự sinh trưởng của tế bào, giúp tế bào dễ bám vào bề mặt thủy tinh và phát triển mạnh hơn Huyết thanh thai bò (Fetal Bovine Serum- FBS) thường được sử dụng bổ sung vào cho môi trường nuôi cấy, nhưng lại đắt tiền và hiếm Nồng độ huyết thanh thường được dùng từ 5- 20% Những dòng tế bào liên tục có xu hướng thích nghi với môi trường có nồng độ huyết thanh thấp Xu hướng hiện nay là sử dụng môi trường không huyết thanh nhưng chỉ mới thành công trong nuôi cấy tế bào Hela và L292 Các protein trong huyết thanh như albumin, fibronectin, globulin giúp tế bào bám dính và phát triển

+ Những bất lợi của môi trường có huyết thanh

- Thay đổi huyết thanh cần làm nhiều xét nghiệm nên tốn kém

- Khi cấy nhiều loại tế bào cần nhiều loại huyết thanh

- Nguy cơ lan truyền mầm bệnh

- Huyết thanh thường nhiễm virus và Mycoplasma, do đó ảnh hưởng đến kết

quả nuôi cấy

- Giá thành đắt

+ Bất lợi của môi trường không có huyết thanh

- Tế bào phát triển và sinh sản chậm

- Môi trường được pha chế sẵn, khó kiểm tra chất lượng và đắt tiền

Kháng sinh thường được cho vào môi trường nuôi cấy trong thời gian ngắn nhằm làm giảm nguy cơ tạp nhiễm Nồng độ tối ưu của kháng sinh được xác định theo kinh nghiệm của người tiến hành nuôi cấy Kháng sinh thường được dùng dưới dạng kết hợp Có thể sử dụng Penicilin G, Streptomycin và Amphotericin B để ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram dương, Gram âm và chống nấm (Butler, 2004)

2.1.3 Điều kiện nuôi cấy

Hầu hết tế bào trong môi trường nuôi cấy sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 370C và

pH 7,4 Nếu ở nhiệt độ thấp hơn một chút so với 370C thì tốc độ sinh trưởng sẽ giảm xuống nhưng tế bào không bị phá hủy Tuy nhiên nhiệt độ cao hơn, từ 39-

400C sẽ phá huỷ tế bào Do vậy, việc đảm bảo rằng nhiệt độ không tăng trong tủ cấy

Rửa tay với xà phòng diệt khuẩn trước và sau quá trình có liên quan đến cấy

tế bào Có thể dùng găng tay nhựa

Hạn chế những con đường tới phòng thí nghiệm khi thí nghiệm đang tiến hành

Làm sạch bề mặt làm việc trước và sau mỗi quá trình nuôi cấy

Dùng không gian tiệt trùng (ví dụ tủ cấy tiệt trùng) cho tất cả các thao tác Dùng ống nghiệm nuôi cấy bằng plastic được tiệt trùng và chỉ dùng một lần Mua môi trường và huyết thanh từ nhà cung cấp đáng tin cậy để đảm bảo rằng sự tạp nhiễm không phát sinh từ nguồn này (Butler, 2004)

2.2 Phương pháp PCR

Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng Phương pháp này được K.Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988 Sự khác biệt giữa tạo dòng và phương pháp PCR là ở chỗ phương pháp PCR được thực hiện hoàn toàn trong các eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thể thu nhận rất nhiều bản sao DNA Trong khi đó phương pháp tạo dòng phải được thực hiện trong tế bào

sinh vật Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến định hướng, nghiên cứu sự tiến hoá của sinh vật ở mức độ phân tử,…

2.2.1 Nguyên tắc

Phương pháp này được thực hiện in vitro với sự hiện diện của enzyme DNA

polymerase để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự có mặt của những mồi chuyên biệt

Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài để hình thành mạch mới Nếu ta cung cấp 2 mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với 2 đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp được đoạn DNA nằm giữa 2 đoạn mồi Điều đó nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm một mồi xuôi (sens primer) và một mồi ngược (antisens primer)

 Giai đoạn 2: Đây là giai đoạn bắt cặp (annealation) Giai đoạn này thường được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 400

C- 700C trong 30-60 giây tuỳ thuộc vào primer sử dụng cho phản ứng Ở nhiệt độ này, primer sẽ tiến hành gắn kết với DNA mẫu Việc xác định nhiệt độ lai này là rất quan trọng, nó quyết định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR Nếu nhiệt độ lai trong giai đoạn này quá thấp sẽ dẫn đến sự bắt cặp không đặc hiệu, dẫn đến kết quả khuếch đại bị sai Nếu nhiệt độ lai quá cao sẽ dẫn đến độ nhạy của phản ứng kém vì primer sẽ không bắt cặp được

Nhiệt độ này có thể được tính thông qua Tm Tm là nhiệt độ mà ở đó việc lai bắt cặp đúng phân ly Thông thường nhiệt độ lai được sử dụng thấp hơn

 Giai đoạn 3: Đây là giai đoạn kéo dài (elongation) Giai đoạn này thường được tiến hành ở nhiệt độ 720

C- 740C trong 30 giây đến vài phút tuỳ thuộc vào

chiều dài đoạn DNA cần tổng hợp Điều kiện nhiệt độ này sẽ giúp cho Taq

polymerase (là emzyme chịu nhiệt được tách chiết từ một loại vi khuẩn suối nước

nóng, Thermus aquaticus) hoạt động và tiến hành tổng hợp sợi DNA mới (Hồ

Huỳnh Thuỳ Dương, 1998)

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

2.2.3.1 DNA mẫu

Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch Nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận được trực tiếp từ dịch chiết tế bào Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có xu hướng giảm (1µg xuống còn 100ng) với việc sử dụng các DNA polymerase có hiệu quả cao

2.2.3.2 Enzyme

Taq polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ vi khuẩn sống ở các suối nước

nóng Thermus aquaticus Enzyme này không bị phá vỡ ở nhiệt độ biến tính Ngày

nay, nhiều polymerase chịu nhiệt khác được đưa ra thị trường với nhiều chức năng

chuyên biệt và hoàn thiện hơn Tth polymerase là một enzyme tách chiết từ

Thermus themophilus, có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi

có mạch RNA khuôn và ion Mg++, nhưng với sự hiện diện của DNA khuôn và

Mg++, Tth polymerase lại xúc tác cho phản ứng khuếch đại DNA

2.2.3.3 Primer và nhiệt độ lai

Primer là chìa khóa quan trọng cho sự thành công hay thất bại của một thí nghiệm PCR Nếu primer được thiết kế một cách chính xác thì thí nghiệm sẽ mang lại kết quả về sự khuếch đại của một mảnh DNA đơn Việc lựa chọn primer cần tuân thủ theo một số nguyên tắc sau:

Độ dài của đoạn mồi khoảng từ 17-30 Nu Các đoạn mồi không nên chứa hơn 3 Nu giống nhau xếp liên tiếp

Tỷ lệ GC lý tưởng trong đoạn mồi vào khoảng 50% để nhiệt độ bắt cặp của đoạn mồi là không quá thấp

Hai đoạn mồi không được có trình tự Nu bổ sung lẫn nhau

Nhiệt độ lúc bắt đầu phản ứng, nghĩa là lúc đã cho enzyme tổng hợp DNA vào, không nên thấp hơn nhiệt độ bắt cặp cặp của đoạn mồi

Nhiệt độ nóng chảy của 2 mồi không nên cách nhau quá xa

Đoạn gene cần khuếch đại không nên lớn hơn 3kb và chiều dài lý tưởng là nhỏ hơn 1kb

2.2.3.4 Các thành phần khác của phản ứng

Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ 20- 200µM/mỗi nucleotide Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh” Sự mất cân bằng trong các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase

và đa hình dựa vào những trình tự phiên mã ngược và sử dụng trong việc định lượng mức độ phân tử của gene Ngoài ra, RT- PCR còn có một ứng dụng quan trọng nữa đó là chúng được sử dụng trong việc chẩn đoán các bệnh do virus RNA

 Nguyên tắc

Trong kỹ thuật RT-PCR có sự tham gia của 2 loại enzyme tổng hợp chuỗi oligonucleotide: enzyme phiên mã ngược ( reverse transcriptase) và DNA polymerase Enzyme reverse transcriptase cần cho quá trình tổng hợp sợi cDNA từ RNA và enzyme cần cho sự tổng hợp sợi DNA từ cDNA Do enzyme reverse transcriptase chịu nhiệt kém nên quá trình phiên mã ngược để tạo ra cDNA phải

được thực hiện ở nhiệt độ thấp (thường khoảng từ 42-450C) Điều này gây ra những trở ngại:

Sự tạo thành các sản phẩm khuếch không mong muốn do sự bắt cặp không đặc hiệu của các primers

Giảm hiệu quả kéo dài chuỗi gen do sự hình thành RNA cấu trúc bậc hai Tuy nhiên những trở ngại này có thể được giải quyết nhờ vào việc sử dụng enzyme DNA polymerase chịu nhiệt được chiết từ vi khuẩn Thermus thermophilus Enzyme này trong những điều kiện nhất định, có đặc tính sinh học đặc biệt là có thể thực hiện cùng lúc 2 chức năng: chức năng của reverse transcriptase và chức năng của DNA polymerase

2.3 Sơ lược về căn bệnh, bệnh do virus PRRS

Trong chăn nuôi heo, một trong những bệnh mới xuất hiện trong thời gian gần đây và được nhắc đến nhiều đó là hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp trên heo (porcine reproductive and respiratory syndrome - PRRS) Bệnh xuất hiện lần đầu tiên ở Bắc Mỹ vào đầu những năm 1980, sau đó bệnh xuất hiện ở Châu Âu và Châu

Á và được xác định là do một loại virus thuộc họ Arteriviridae, có khả năng xâm

nhiễm vào đại thực bào và mô Virus PRRS là một virus RNA có vỏ bọc, gây cả thiệt hại về sinh sản trong đàn lợn giống và về các triệu chứng hô hấp trong đàn heo thịt Heo nái biểu hiện kém ăn, thở khó và có thể kèm theo sốt ngắn Sảy thai, đặc biệt là cuối thời kỳ chửa, tăng số lượng con chết khi đẻ, heo vẹo chân, heo yếu và xảy ra tử vong ở heo con Ở heo nuôi thịt, mức độ bệnh hô hấp tăng lên, thường kết hợp với các bệnh khác (Thanh Thuận, 2001) Ở ổ dịch cấp tính, ước tính giảm sản lượng 5-20%, giảm từ 1-3.8 heo con/nái/năm, thiệt hại từ 100-155$/nái/năm (dẫn liệu của Hoàng Văn Năm, 2001) Thể mãn tính làm cho heo thịt chậm lớn, tăng chi phí thuốc để điều trị các bệnh kế phát

2.3.1 Lịch sử bệnh

Năm 1987, bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ với tên gọi “bệnh thần bí trên heo” (Mystery Swine Disease - MSD)

Tháng 11 năm 1990, ổ dịch PRRS đầu tiên xảy ra ở Đức và lan tràn nhanh chóng sang các quốc gia khác ở Châu Âu

Mùa đông năm 1990- 1991, lần lượt các quốc gia Châu Âu như Hà Lan, Bỉ, Pháp và Tây Ban Nha đã báo cáo về hội chứng này với nhiều tên gọi khác nhau:

“Bệnh tai xanh” (Blue-eared Pig Disease), “Hội chứng hô hấp và sảy thai trên heo” ( Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome -PEARS), hay “Hội chứng

hô hấp và vô sinh” (Swine Infertility and Respiratory Disease - SIRD)

Năm 1991, lần đầu tiên Wenvoort và cộng sự đã phân lập được căn bệnh ở Viện thú y trung ương Lelytad – Hà Lan đã phân lập được căn bệnh và đặt tên cho loại virus này là “Lelystad”

Năm 1992, Collins và cộng sự ở Mỹ cũng báo cáo về việc phân lập được virus gây bệnh và sử dụng tên gọi VR-2332 để chỉ các chủng phân lập ở Bắc Mỹ Cũng trong năm 1992, hội nghị quốc tế và tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) đã nhất trí đặt tên cho bệnh này là “Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo” (porcine reproductive and respiratory syndrome- PRRS) (Võ Thị Đan Thanh, 2006)

Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ (10/51 con có huyết thanh dương tính) Các nghiên cứu về bệnh trên những trại giống lớn tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29% Ở các nước khác, tỷ lệ đàn trong vùng bệnh có huyết thanh dương tính rất cao, như ở Anh là 6-75%, Mỹ là 36%,… (Phòng Dịch tễ-Cục Thú y)

Hình 2.1 Virus PRRS

(Nguồn: http//www agraroldal.hu)

2.3.2.2 Một số đặc điểm về hình thái và cấu trúc

Virus PRRS có cấu trúc RNA mạch đơn dương, có đường kính 40-70 nm, có

vỏ bọc, kích thước genome dài 14,5 kb mã hoá cho việc tái tạo virus (Jeong-Ki Kim

và cs, 2005)

Bộ gene của virus PRRS gồm có 8 khung độc mở (ORFs) mã hoá cho các thành phần khác nhau của virus Tuy nhiên chỉ có 3 khung ORFs có ý nghĩa quan trọng trong định danh virus, đó là ORFs 7,6 và 5 quy định tổng hợp các protein tương ứng: nucleocapsid (N) 15-kDa, matrix (M) 19-kDa và glycoproteins envelope (protein GP5) 25-kDa Đây là những protein cấu trúc quan trọng nhất, chúng chiếm 90-95% lượng protein cấu trúc của virus

Protein N là một protein nhỏ (15 kDa) và có tính kiềm cao, điều này có thể giúp nó tương tác dễ dàng hơn với bộ gen RNA Protein N hiện diện ở mức độ cao trong những tế bào bị nhiễm virus PRRS và chiếm từ 20- 40% lượng protein của phân tử virus Hiện nay protein N được dùng như là một kháng nguyên để phát hiện kháng thể trong huyết thanh của heo

Protein M có trọng lượng phân tử khoảng 18 kDa Mặc dù chức năng của nó được biết rất ít nhưng nó được xem như có vai trò trong sự kết hợp với thụ thể trên

tế bào đích, vì protein M kết hợp GP5 tạo phức hợp M-GP5 để kết hợp với thụ thể trên tế bào đích (Delputte và cs, 2001)

Protein GP5 có trọng lượng phân tử khoảng 25 kDA, là nguyên nhân gây ra hiện tượng apoptosis và đóng vai trò quan trọng trong việc nhận diện thụ thể trên tế bào đích (Nathalie và cs, 2003)

Về mặt di truyền, khi phân tích gene của các dòng virus PRRS gây bệnh khác nhau, người ta xác định được 2 dòng virus riêng biệt: dòng Châu Âu (Lelystad) và dòng Châu Mỹ (VR-2332) Hai dòng virus này không những khác biệt về đặc tính gây bệnh mà khác nhau về mức độ nhất định về kiểu gene

Qua phân tích gene và theo dõi sự thay đổi trình tự Nu của các dòng PRRS, người ta đã xác định rằng ở dòng Châu Mỹ, các ORFs 7 và 6 có tính ổn định rất cao, chúng gần như không thay đổi trong suốt quá trình tiến hoá của dòng virus này, tuy nhiên, sự khác biệt giữa dòng virus Châu Âu và Châu Mỹ ở 2 khung đọc mở này là rất rõ, chẳng hạn sự tương đồng về trình tự axit amin của ORFs 7 giữa 2 dòng virus này chỉ vào khoảng 57-59% và của ORFs 6 là 70-81% Trong khi đó, khung đọc mở ORFs 5 lại biến đổi nhiều giữa các chủng trong cùng 1 dòng Châu

Mỹ và chỉ tương đồng với dòng Châu Âu khoảng 51-59% Sự tương đồng về trình

tự axit amin quy định do các khung đọc mở ORFs 2, 3 và 4 giữa các dòng Châu Mỹ

và Châu Âu tương ứng chỉ ở từ 63,58% và 68% (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) Phân tích trình tự cho thấy các virus đang tiến hoá do đột biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp trong gen (Trần Đức Minh) Sự khác biệt về kiểu gene đương nhiên sẽ liên quan đến

sự khác biệt về kiểu hình và như vậy có thể dựa vào đặc điểm gene để chẩn đoán dòng virus và ngược lại Như vậy, trên cơ sở về kiểu gene, dịch tễ học phân tử cho phép xác định chính xác bản đồ dịch tễ của một căn bệnh, quá trình xuất hiện, phát triển của virus PRRS (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

Nghiên cứu virus ở mức độ phân tử còn cho phép xác định được khả năng sản xuất và sử dụng virus nhược độc để làm văcxin Người ta đã ghi nhận nhiều trường hợp hội chứng PRRS trở nên trầm trọng hơn sau khi đàn heo được tiêm vắcxin virus PRRS nhược độc vì cấu trúc gene của virus nhược độc thay thế glycine bằng arginine ở vị trí 151 của ORFs 5 sẽ hoàn nguyên rất nhanh bộ gene của chúng so

với bộ gene của virus nguyên thuỷ ngay sau khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ, và như thế độc lực của chúng cũng được phục hồi (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)

2.3.2.3 Đặc điểm nuôi cấy

Virus rất thích hợp với đại thực bào đặc biệt là đại thực bào hoạt động ở vùng phổi Bình thường đại thực bào sẽ tiêu diệt tất cả vi khuẩn, virus xâm nhập vào cơ thể, riêng đối với virus PRRS, virus có thể nhân lên trong đại thực bào, sau đó phá huỷ và giết chết đại thực bào (tới 40%) (phòng Dịch tễ-Cục Thú y) Virus xâm nhập vào tế bào bằng con đường nhập nội bào (endocytosis) qua trung gian receptor Người ta đã xác định heparan sulfate là thụ thể của đại thực bào phế nang đối với virus(Delputte và cs, 2001; Nathalie và cs, 2003) và trên MARC-145 là vimentin, vimentin là một yếu tố quan trọng trong việc làm ổn định cấu trúc của tế bào chất trong nhiều loại tế bào khác nhau (Jeong-Ki Kim và cs, 2005) Theo Jeong-Ki Kim

và cs, 2005 thì kháng thể kháng vimentin ngăn cản sự gây nhiễm của virus trên tế bào MARC-145 Khi chuyển vimentin tái tổ hợp vào 2 dòng tế bào BHK-21 và CRFK (Crandall Rees feline kidney), không nhạy cảm với virus PRRS, thì 2 dòng

tế bào này trở nên nhạy cảm với PRRSV, điều đó chứng tỏ sự tấn công và gây nhiễm của virus liên quan tới vimentin, 1 loại intermediate-filament protein (Jeong-

Ki Kim và cs, 2005)

Bằng kính hiển vi điện tử, người ta phát hiện những tiểu phần của virus hiện diện trong những khoang nhỏ Kháng nguyên virus có thể phát hiện ngay 6 giờ sau gây nhiễm (Dea, 2000; Pol, 1997) Virus PRRS được lắp ráp khi nucleocapsid xuất hiện trong khoang của lưới nội chất không hạt hay vùng Golgi hoặc cả hai Robison

và cs (1997) đã tìm thấy trong tế bào gây nhiễm MARC-145 protein M định vị tại

bộ Golgi và protein N thì định vị quanh nhân và hạch nhân Lớp vỏ bọc ngoài (envelope) chủ yếu được hình thành trong khoang của lưới nội chất và cũng là nguyên nhân làm cho bào quan này phình to ra (Dea và cs, 1995; Mardassi và cs, 1994; Pol, 1997) Sau khi hình thành, virion được tập hợp lại và di chuyển ra màng bào tương để giải phóng virus (Meulenberg, 2000) Theo Pol và Wagenaar, 1992;

Pol, 1997, sau khi nuôi cấy 9-12 giờ, các tế bào bị xâm nhiễm sẽ vỡ ra và giải phóng các hạt virus hoàn chỉnh (dẫn liệu Võ Thị Đan Thanh, 2006)

Hình 2.2 Đại thực bào bình thường Hình 2.3 Đại thực bào bị nhiễm PRRSV

(Nguồn: http://www.animal-health-online.de ) Virus PRRS mã hoá các sản phẩm gen mà chúng có thể gây ra apoptosis, một kiểu chết phổ biến, đóng vai trò quan trọng trong sự cân bằng nội tại và loại bỏ những tế bào tổn thương và già cỗi Tuy nhiên cơ chế của hiện tượng này chưa được biết rõ Người ta xác định được protein GP5 của virus là tác nhân gây ra apoptosis (Meulenberg, 2000) Những thay đổi có tính thoái hoá do apoptosis gây ra trong tế bào bao gồm nhân tế bào cô đặc lại, vỡ ra, không bào bị thoái hoá, tế bào chất cô đặc, nhiễm sắc thể bị đứt ra từng mảnh (Suarez, 2000) Virus đạt đỉnh cao lúc 24-

48 giờ và có thể duy trì tới 60- 70 giờ sau nuôi cấy (Meng và cs, 1996) Theo Kim

và cs (1993), trong quá trình nhân lên của virus PRRS trên môi trường tế bào

MA-104 (MARC-145), hiệu giá virus có thể đạt tối đa 108,5 TCID50/0,1ml sau 48- 72 giờ nuôi cấy

Khi gây nhiễm tế bào, hầu hết các chủng virus PRRS đều gây bệnh tích tế bào nhưng vẫn có một số chủng virus PRRS thì không (Christianson và Joo, 1994; Yoon

và cs, 1992) Bệnh tích tế bào do virus PRRS gây ra là: tế bào co tròn, tập trung lại, sau đó dày lên, nhân co lại và cuối cùng là tách ra khỏi bề mặt nuôi cấy (dẫn liệu Hoàng Văn Năm, 2001) Benfield và cs (1992) cũng mô tả bệnh tích tế bào do virus PRRS gây ra như: các tế bào co tròn, trở nên thoái hoá (nhân kết đặc lại) và tách khỏi tế bào một lớp sau 2- 4 ngày nuôi cấy Toàn bộ lớp tế bào bong ra sau 6 ngày Kết quả cũng tương tự trên dòng tế bào PAM khi gây nhiễm virus PRRS (Pol và

Wagenaar, 1992; Wensvoort, 1992; Pol, 1997) (dẫn liệu Võ Thị Đan Thanh, 2006) Các dòng PRRSV của Bắc Mỹ phát triển khá tốt trên MARC-145 trong khi các dòng PRRSV của Châu Âu phát triển nhanh hơn trên PAM Nhiều phòng thí nghiệm ở Hàn Quốc và Bắc Mỹ chỉ sử dụng MARC-145 vì khó khăn khi phải nuôi cấy PAM (Han-Kook Chung và cs, 2002) Một nghiên cứu khác của Bloemraad (1994) cho thấy sau 40 giờ nuôi cấy, gần 40% tế bào PAM có bệnh tích tế bào Tuy nhiên, kết quả này có thể thay đổi giữa các phòng thí nghiệm (Yoon, 2003)

2.3.2.4 Sức đề kháng

Virus PRRS tồn tại được trong thời gian dài hơn 4 tháng ở -700C đến -200C nhưng khoảng 90% khả năng gây nhiễm của virus bị mất trong vòng 1 tuần ở 40

C khả năng hồi phục của virus đã được báo cáo kéo dài đến 20 phút ở 560C, 24 giờ ở

370C và 6 ngày ở 210C Virus bền vững ở pH từ 6,5 -7,5 nhưng chết nhanh khi pH

< 6 hay pH >7,65 (Benfield và cs, 1999) Như vậy, virus PRRS không bền với nhiệt

độ và pH Ngoài ra, virus dễ bị diệt bởi chất sát trùng và tia cực tím (dẫn liệu Trần Thanh Phong, 1996) Các chất tẩy uế có tác dụng làm giảm khả năng lây nhiễm của virus và các chất tan dầu mỡ như chloroform và eter đặc biệt hữu hiệu trong việc phá vỡ cấu trúc vỏ ngoài của virus và làm ngừng sự tái sản (Trần Đức Minh)

2.3.3 Dịch tễ học bệnh PRRS

2.3.3.1 Loài mắc bệnh

Loài heo, cả heo nhà lẫn heo rừng được cho là loài mắc bệnh duy nhất Tuy nhiên, vịt trời bài thải virus qua phân khi gây nhiễm thực nghiệm với virus PRRS bằng nước uống, chứng tỏ vịt trời cũng mẫn cảm với virus PRRS (Ausvetplan, 2004)

2.3.3.2 Phương thức lây lan

- Trực tiếp: do tiếp xúc trực tiếp giữa thú bệnh và thú khỏe từ mũi- mũi, qua giao phối, thú mẹ truyền virus cho thú con qua tử cung Ở lợn mẹ mang trùng, virus

có thể lây nhiễm cho bào thai ở giai đoạn giữa thai kỳ trở đi Lợn trưởng thành có thể bài thải virus trong vòng 14 ngày trong khi đó lợn con và lợn choai có thể bài thải virus trong1-2 tháng

- Gián tiếp: qua chất bài tiết như dịch mũi, phân hoặc qua những giọt khí dung

Theo Hoàng Văn Năm (2001), ngoài việc vận chuyển heo bệnh vào đàn cảm nhiễm và lây lan qua không khí thì ít có bằng chứng nói về cách truyền lây khác Tuy nhiên, người ta còn thấy việc lây lan trong đàn giống còn theo con đường truyền tinh dịch Ở những nọc nhiễm bệnh, tinh dịch trong thời kỳ virus huyết có thể gây bệnh cho đàn chưa có miễn dịch với mức độ biểu hiện tuỳ thuộc vào kích cỡ đàn, mật độ nuôi và tình trạng vệ sinh Như vậy, heo nọc là đối tượng truyền lây virus quan trọng trong đàn

2.3.3.4 Cơ chế sinh bệnh

Sau khi xâm nhập vào cơ thể, virus nhân lên trong đại thực bào ở tiểu phế nang

và trong tế bào nội mô của hệ thống lưới võng nội Tế bào biểu mô đường hô hấp trên cũng là nơi thích hợp cho sự nhân lên của virus PRRS Quá trình virus nhân lên

và phá hủy đại thực bào gây ra bệnh tích ở thành mạch, làm thủy thũng tế bào nội

mô của tĩnh mạch, giảm hàm lượng protein huyết tương đến các mô và tạo các cục huyết khối gây nhiều hậu quả bệnh lý khác nhau Những biểu hiện khác nhau của bệnh tuỳ thuộc vào khả năng nhân lên hay phá hủy tiểu phế nang, tế bào nội mô và

tế bào lympho (dẫn liệu Trần Thanh Phong, 1996)

Tác động phá huỷ đại thực bào phế nang, đặc biệt trên heo con, làm giảm khả năng đề kháng của vật chủ chống lại vi khuẩn kế phát hoặc xâm nhập của các virus khác Hầu hết sự nhiễm kế phát được quan sát sau ổ dịch PRRS là bệnh đường hô

hấp Rõ ràng là nếu những tế bào bảo vệ đầu tiên như PAM bị phá huỷ thì nó sẽ ảnh hưởng rất lớn đến khả năng của vật chủ chống lại vi khuẩn và virus gây bệnh (dẫn liệu Hoàng Văn Năm, 2001) Theo Trần Thanh Phong (1996), do gây suy giảm

miễn dịch, bệnh PRRS mở đường cho những vi sinh vật cơ hội như: Pasteurella

multosida, Haemophilus parasuis, Streptococcus suis, A pleuropneumoniae, Chlamydia psittaci, Leptospira interrogans, virus giả dại, virus cúm, Enterovirus, Parvovirus…

Trên nái mang thai, virus ở dạng tự do hay kết hợp với các tế bào bạch cầu, tế bào đơn nhân trong dòng máu để đến cơ quan sinh sản Cảm nhiễm có thể xảy ra ở bất cứ giai đoạn nào của quá trình mang thai nhưng biểu hiện lâm sàng phụ thuộc vào lớn vào giai đoạn nhiễm trùng của bào thai và độc lực của chủng virus gây bệnh Nhiễm trùng ở giai đoạn đầu và giai đoạn giữa của kỳ mang thai không có hay chỉ có tác động nhẹ so với cảm nhiễm ở giai đoạn sau Cảm nhiễm xảy ra trong thời kỳ phôi thường có mức độ biểu hiện bệnh rất thấp vì tế bào phôi chưa biệt hoá, không thích hợp cho sự nhân lên của virus Mặt khác, lúc này trứng thụ tinh chưa gắn chặt chẽ với nội mạc tử cung nên sự truyền virus từ mẹ sang phôi bị hạn chế Trong khi ở giai đoạn sau của kỳ có mang, nhau thai và mạch máu nuôi thai rất phát triển, nhau thai trở thành bộ phận trao đổi chất cần thiết, đồng thời là cầu nối truyền virus và kháng thể chống virus từ mẹ sang thai Virus có thể qua nhau ở dạng tự do hay kết hợp với các tế bào khác của thú mẹ Nhiễm trùng giai đoạn này tạo ra nhiều vết bong tróc nhỏ trên tế bào biểu mô nhau thai và bệnh tích hoại tử động mạch cuống rốn, từ đó làm cho bào thai bị thiếu dưỡng chất, thiếu O2, gây sảy thai kỳ cuối, heo con sinh ra yếu ớt, dị tật và tăng tỷ lệ thai chết tươi khi sanh (Prieto và cs, 2000; dẫn liệu của Hoàng Văn Năm, 2001) Nhiễm bệnh dai dẳng cũng là một đặc

trưng của Arterivirus, sự tồn tại dai dẳng gây ra nhiễm bệnh âm ỉ, virus hiện diện ở

mức độ thấp trong cơ thể thú và giảm dần theo thời gian (Trần Đức Minh) Theo R.Allende và cs (2000) vào ngày 150 sau gây nhiễm thực nghiệm không phân lập được virus bằng nuôi cấy tế bào và không phát hiện được RNA của virus bằng phương pháp RT-PCR

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ cơ chế sinh bệnh của virus PRRS

(Nguồn:Rosssow, 1998)

Virus PRRS

Lây lan trực tiếp qua đường tiêu hoá, gieo tinh và hô hấp

Nhân lên trong màng nhày phổi hoặc đại thực bào

Virus tấn công vào hạch lâm ba

Vào máu gây virus huyết

Phân bố đến các hệ thống của cơ thể và tới các tế bào đơn nhân hoặc đại thực bào

Biểu hiện lâm sàng

Nái

:

Sảy thai

Phối không đậu

Heo sơ sinh

Khó thở, dấu hiệu thần kinh và tỷ lệ chết cao

Heo sau cai sữa

2.3.4 Triệu chứng lâm sàng

Triệu chứng bệnh thể hiện rất khác nhau, theo ước tính, cứ 3 đàn đầu tiên tiếp xúc với mầm bệnh thì một đàn không có biểu hiện bệnh, một đàn có biểu hiện ở mức độ vừa và một đàn ở mức độ nặng Lý do cho việc này vẫn chưa có lời giải, tuy nhiên với những đàn khoẻ mạnh thì mức độ bệnh cũng giảm nhẹ hơn, và cũng có thể do virus tạo nhiều biến chủng với độc lực khác nhau Thực tế nhiều đàn có huyết thanh dương tính nhưng không có biểu hiện lâm sàng (phòng Dịch tễ, Cục Thú y) Theo Trần Đức Minh thì mức độ lâm sàng thay đổi tuỳ chủng virus, sự biến động khả năng gây bệnh của virus, hàm lượng virus tăng trong máu và các mô, khả năng của các chủng có độc lực cao để tái sản hữu hiệu hơn trong cơ thể ký chủ Bệnh tích

 Bệnh tích đại thể:

- Da có thể xuất huyết, thâm tím do chảy máu trong mô

- Phổi tụ huyết, viêm phổi thuỳ trước với những ổ viêm đốm màu xám, có nhiều dịch ở phổi và màng bao tim

- Có những ổ hoại tử trên nhau thai của nái bệnh

 Bệnh tích vi thể:

- Viêm phổi hoại tử

- Có sự thoái hoá các đại thực bào ở tiểu phế nang

Hình 2.4 Triệu chứng tai xanh Hình 2.5 Sảy thai do virus PRRS (Nguồn: http://www.porcilis-prrs.com và http://www.thepigsite.com)

2.3.5 Chẩn đoán

2.3.5.1 Chẩn đoán lâm sàng