GLYCOSIDE NHÓM CARDENOLIDE mới từ hạt của cây DƯƠNG địa HOÀNG

Một nghiên cứu về hạt của cây dương địa hoàng đưa tới sự phân lập 3 glycoside cardenolide (1,8,11). Với 12 cấu trúc cardenolide đã biết 2,3,4,5,6,7,9,10,12,13,14,15. Cấu trúc của 1,8,11 được xác định dựa trên phổ NMR 1D và 2D và kết quả của một acid hoặc một enzyme thủy phân. Độc tố của dạng 1 đến 15 chống lại tế bào bạch cầu HL 60 đã được chứng minh. Dạng 2,9,11 và 12 đã chỉ ra sự gây độc mạnh đối với tế bào HL 60 khi tương ứng 50% nồng độ ức chế (IC50) ở các giá trị 0.060; 0.069; 0.034;0.038 µmol. Dạng 2,9,11 và 12 cũng đã chỉ ra sự gây độc mạnh đối với tế bào gan ung thư ở người HepG2 tương ứng liều IC50 ở giá trị 0.38; 0.79; 0.71 µmol. 1 cuộc khỏa sát về cấu trúc và tác dụng chỉ ra rằng sự gây độc được làm giảm bởi sự có mặt của 1 nhóm OH ở vị trí C16 của phần aglycone digitoxigenin, nhóm methyl ở vị trí C3’ của nhóm OH trên vòng fucopyranose, nhóm acetyl ở vị trí C3’ của nhóm OH trên đường digitoxopyranoyl

1 NHỮNG GLYCOSIDE NHÓM CARDENOLIDE MỚI TỪ HẠT CỦA CÂY DƯƠNG ĐỊA HOÀNG VÀ TÁC ĐỘNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CHÚNG Một nghiên cứu hạt dương địa hoàng đưa tới phân lập glycoside cardenolide (1,8,11) Với 12 cấu trúc cardenolide biết 2,3,4,5,6,7,9,10,12,13,14,15 Cấu trúc 1,8,11 xác định dựa phổ NMR 1D 2D kết acid enzyme thủy phân Độc tố dạng đến 15 chống lại tế bào bạch cầu HL 60 chứng minh Dạng 2,9,11 12 gây độc mạnh tế bào HL 60 tương ứng 50% nồng độ ức chế (IC50) giá trị 0.060; 0.069; 0.034;0.038 µmol Dạng 2,9,11 12 gây độc mạnh tế bào gan ung thư người HepG2 tương ứng liều IC50 giá trị 0.38; 0.79; 0.71 µmol khỏa sát cấu trúc tác dụng gây độc làm giảm có mặt nhóm OH vị trí C16 phần aglycone digitoxigenin, nhóm methyl vị trí C3’ nhóm OH vòng fucopyranose, nhóm acetyl vị trí C3’ nhóm OH đường digitoxopyranoyl Cardenolide nhóm hợp chất tự nhiên tìm thấy số họ giới hạn họ mõm chó, trúc đào, hành, họ hồng liên Chúng tơi theo dõi phân lập đặc tính cấu trúc cardenolide từ thân rễ linh lan họ hành hạt Adonis aestivalis họ hồng liên, gây đơc chún chống lại tế bào khối u invitro, tế bào bình thường từ 1950-1960 hóa hợp chất tự nhiên thực hạt dương địa hoàng 10 cardenolide đươc phân lập xác định.1 phần nghiên cứu tiếp tục với cardenolide với gây độc, chúng tơi thực hệ thống kiểm tra hóa phân tích thực vật hạt dương địa hồng với kết phân lập đc 15 cardenolide với dạng 1,8,11 Chún báo cáo cấu trúc dạng xác định phân tích quang phổ bao gồm phổ NMR 2D kết enzyme thủy phân Đôc tố 1-15 chống lại tế bào bạch cầu liên quan cấu trúc tác dụng kiểm tra Dạng 2,9,11 mõi dạng rõ đơc tính chống lại tế bào HL60, đươc đánh giá gây độc với tế bào ung thư gan người HepG2 Kết bàn luận MeOH trích từ hạt Digitalis qua cột màng xốp polymer polystiren EtOH làm tinh khiết Silicagel octadecylsilanized cột sắc kí pha đảo HPLC, tách dạng từ đến15.các dạng biết đến7,9,10,12 đến 15 đc xác định digitoxigenin 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1-> 4)- β -D-fucopyranoside (glucodigifucoside, 2), digitoxigenin 3-O- β -D-glucopyranosyl-(1->4)- β -Ddigitalopyranoside (odorobioside G, 3), gitoxigenin 3-O- β -Dglucopyranosyl-(1->4)- β -D-fucopyranoside (glucogitofucoside, 4),gitoxigenin 3-O- β -D-glucopyranosyl-(1-> 4)- β -D-digitalopyranoside (digitalin, 5), gitoxigenin 3-O- β -D-glucopyranosyl-(1>6)- β -D-glucopyranosyl-(1-> 4)- β -D-digitalopyranoside(neogitostin,6), gitoxigenin 3-O- β -D-glucopyranosyl-(1->4)- β -D-glucopyranosyl-(1-> 4)- β -Ddigitalopyranoside (gitostin, 7), digitoxigenin 3-O- β -D-glucopyranosyl-(1->4)-3-Oacetyl- β -D-digitoxopyranoside (3’-O-acetylglucoevatromonoside, 9), gitoxigenin 3Oβ -D-glucopyranosyl-(1->4)-3-O-acetyl β -D-digitoxopyranoside (acetylglucogitoroside, 10), digitoxigenin 3-O- β -D-glucopyranosyl-(1->4)- β -Ddigitoxopyranosyl-(1->4)- β -D-digitoxopyranosyl-(1->4)- β - D-digitoxopyranoside (purpurea glycoside A, 12), gitoxigenin 3-O- β -D-glucopyranosyl-(1->4)- β -Ddigitoxopyranosyl-(1->4)- β -D-digitoxopyranosyl-(1->4)- β -D-digitoxopyranoside (purpurea glycoside B, 13), digitoxigenin 3-O- β -D-glucopyranosyl-(1->4)- β -Ddigitoxopyranosyl-(1->4)- β -D-digitoxopyranosyl-(1->4)-3-O-acetyl- β -Ddigitoxopyranoside (purlanoside A, 14), gitoxigenin 3-O- β -D-glucopyranosyl-(1>4)- β -Ddigitoxopyranosyl-(1->4)- β -D-digitoxopyranosyl-(1->4)3-O-acetyl- β -Ddigitoxopyranoside (purlanoside B, 15) Đây báo cáo phân lập dạng từ hạt digitalis Dữ liệu quang phổ chi tiết hầu hết khơng có sẵn cho xác định dạng 2-7,9,10, 12-15 Vì xác định cấu trúc dạng tiến hành dựa phân tích quang phổ bao gồm liệu phổ NMR 2D 3 Hợp chất thu dạng chất rắn vơ định hình có cơng thức phân tử xác định C43H66O16, dựa liệu HR-ESI-TOF-MS (m/z=861,4305 M + Na+) Phổ IR cho thấy dãy hấp thụ cho hydroxyl (3378 cm -1) cacbonyl (1740 cm-1) nhóm Phổ 1H-NMR chứa hai nhóm methyl riêng rẽ H 1.01 0.88 (Me-18 Me-19), nhóm oxymethylene 1H 5.32 5.04 (Mỗi dd, J ¼ 18: 1, 1,5 Hz, H2-21), nhóm olefin tạ i? H 6.14 (br s, H-22), đặc trưng khung cardenolide Ngoài ra, báo hiệu cho ba anomeric proton có mặt H 4,93 (d, J ¼ 7: Hz), 5,35 (dd, J ¼ 9: 6, 1,8 Hz) 5,15 (dd, J ¼ 9: 5, 1,8 Hz) Các tín hiệu methyl carbon C 18.60 18.39, proton tín hiệu H 1,59 (d, J ¼ 6: Hz)? Và 1,41 (d, J ¼ 6: Hz) cho có chứa hai deoxy đường 1H-NMR [? H 2,11 (3H, s)] 13CNMR [? C 170,14 (C = O) 21,26 (Me)] đỉnh diện nhóm acetyl Thủy phân với 0,025 M HCl cho 3?, 14? -dihydroxycard-20 (22) – enolide (Digitoxigenin), gốc thuốc carbohydrate D-digitoxose D-glucose Xác định D-digitoxose D-glucose, bao gồm cấu hình tuyệt đối , thực phân tích HPLC trực tiếp thủy phân, xác định monoacetate digitoxigenin triglycoside Một phân tích phổ COSY 1H-1H HMQC phổ cho phép trình tự xác đường monosacarit xác định tập từ H-1 để H2-6 Me-6 monosaccharide thành lập thí nghiệm COSY 1H-1H Các mẫu tín hiệu multiplet khớp nối số (Bảng 1) cho thấy diện hai? –Ddigitoxopyranosyl (4C1) đơn vị (Dgt0 Dgt00) -Dglucopyranosyl? (4C1) đơn vị (Glc000) Phổ HMQC cho thấy cộng hưởng proton có tương quan với người cacbon trái phiếu (Bảng 2) Các cấu hình anomeric DGT gốc thuốc GLC xác định giá trị J tương đối lớn họ proton anomeric (7,8-9,6 Hz) Phổ HMBC cho thấy mối tương quan tầm xa H-1 Glc000 tại? H 4.93 C-4 Dgt00 tại? C 83,39, H-1 Dgt00 tại? H 5,35 C-4 Dgt0 tại? C 79,84, H-1 Dgt0 tại? H 5.15 C-3 aglycone tại? C 73,83, H-3 Dgt0 tại? H 5.81 carbon acetyl cacbonyl tại? C 170,14 Cấu trúc phù hợp thành lập digitoxigenin 3-O -? - D-glucopyranosyl- (1 4) -! - D-digitoxopyranosyl- ( ! 4) -3-Oacetyl -? - D-digitoxopyranoside Hợp chất chứng minh có công thức phân tử C42H66O19 liệu HR-ESI-TOF-MS (m = z 897: 4096 TH Na] ỵ) thy phân enzyme với? - D-glucosidase sản xuất thủy phân phần, xác định 5, với D-glucose Các suy luận phân tử Công thức cho giống người đồng thời cô lập cardenolide glycosides Ngoài ra, phổ đặc trưng tương tự người Phổ 13C-NMR cho đồng phân và thiết bị đầu cuối? –Dglucopyranosyl (Glc000) đơn vị gắn vào C-3 đơn vị Glc00 bên (Bảng 2) Trong phổ HMBC 8, Tương quan tầm xa quan sát H-1 Glc000 C-3 Glc00, H-1 Glc00 C4? –Ddigitalopyranse (Dtl0), H-1 Dtl0 C-3 aglycone hợp chất xây dựng gitoxigenin 3-O -? - glucopyranosyl- (1 3) -! - D-glucopyranosyl( 4)! -? - D-digitalopyranoside Các liu HR-ESI-TOF-MS (m = z: 893,4169 ẵM ỵ Na? ị) cho thấy 11 để có cơng thức phân tử C 43H66O18 Các liệu phổ 1Hvà 13C-NMR gợi ý cấu trúc phân nưa aglycone 11 giống hệt Công thức phân tử 11 khác biệt từ cho C6H10O5, 1HNMR quang phổ cho thấy tín hiệu cho ba anomeric proton (Bảng 1) thủy phân enzyme 11 cho D-glucose Khi phổ 13C-NMR 11 so với 9, sáu tín hiệu bổ sung tương ứng với thiết bị đầu cuối? đơn vị -D-glucopyranosyl (Glc000) quan sát (Bảng 2) Các tín hiệu từ C-4 phân nưa Glc00 cacbon lân cận khác nhau, tất tín hiệu khác chủ yếu bị ảnh hưởng Trong phổ HMBC 11, H-1 Glc000 trưng bày tầm xa tương quan với C-4 Glc00 HMBC mối tương quan quan sát H-1 Glc00 C-4 Dgt0, H-1 Dgt0 C-3 aglycone, H-3 Dgt0 carbon acetyl cacbonyl Cấu trúc 11 xác định digitoxigenin vv 3-O -? - D-glucopyranosyl- (1 4) -! - Dglucopyranosyl- (1 4) -3-O-acetyl -? - D-digitoxopyranoside Các glycosides cardenolide (1-15) bị cô lập nghiên cứu đồng thời đánh giá cho độc tế bào họ hoạt động chống lại HL-60 tế bào bạch cầu (Bảng 3) Các chứng dương etoposide cisplatin, mà có giá trị IC50 tương ứng 0,46 mM 1,6 mM chống lại HL-60 tế bào Các hợp chất 2, 9, 11 12 cho thấy tiềm Hoạt động gây độc tế bào chống lại-60 HL tế bào, với trung bình giá trị IC50 0,060, 0,069, 0,038, 0,034 mM Các khả gây độc đáng kể tổng số 1, 3, 4, 10, 13 14 tương đương với etoposide, với trung bình giá trị IC50 dao động 0,19-0,56 mM, 5-8 15 người vừa độc tế bào với trung bình IC50 giá trị 1,9-3,7 mM Khi hoạt động độc tế bào glycosides digitoxigenin (2, 3, 9, 12 14) so với gitoxigenin tương ứng glycosides (4, 5, 10, 13 15), có nưa đường C-3 aglycone digitoxigenin nưa, glycosides digitoxigenin hiển thị cao Hoạt động gây độc tế bào glycosides gitoxigenin, đời nhóm hydroxy vị trí C-16 aglycone giảm gây độc tế bào Hoạt động Mặt khác, 4, có diglycoside -D-glucopyranosyl- (1 4)? -? - D-fucopyranoside, cho thấy hoạt động cao so với 5, bị tương ứng với dẫn xuất 3-O-metyl nội fucopyranosyl nưa Các hợp chất 14 15 dẫn xuất 3-Oacetyl đơn vị digitoxopyranosyl 12 13, gây độc tế bào 12 13 Kết ngụ ý sửa đổi chút gốc thuốc đường ảnh hưởng đến độc tế bào chống lại tế bào khối u Ngược lại, glycosyl hóa phân nưa glucosyl thiết bị đầu cuối có ảnh hưởng đến hoạt động Các hợp chất 2, 9, 11 12, cho thấy hoạt động gây độc tế bào mạnh chống lại HL-60 tế bào, độc tế bào để tế bào ung thư gan người HepG2 với nghĩa giá trị IC50 0,38, 0,79, 0,71 3.2 mM (Bảng 4) Những hoạt động mạnh bằng, mạnh actinomycin D sử dụng kiểm sốt tích cực (IC50 1,2 mM) Thực nghiệm: Thơng tin chung Dữ liệu đo quay quang học đo với máy phân cực kế tự động P -1030 ( Jasco, Tokyo, Nhật Bản ) Phổ hồng ngoại ghi lại máy quang phổ Jasco FT-IR 620, phổ UV ghi lại máy quang phổ Jasco V-630 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) thu máy quang phổ kế DRX-500 ( 500 MHz – 1H-NMR; Bruker, Karlsruhe, Đức ), sử dụng chương trình xung động Bruker chuẩn Những dịch chuyển hố học tìm thấy giá trị δ với tham chiếu TMS (Tetramethylsilane) đóng vài trò chất chuẩn nội Dữ liệu ESITOF-MS (Electrospray ionization-Time of flight-Mass) thu từ máy khối phổ MICROMASS LCT ( Waters, Manchester, Anh ) Sắc kí cột sử dụng cột Diaion HP-20 màng xốp nhựa polimer polystyren (Hóa chất Mitsubishi, Tokyo,Nhật Bản), 300 lớp silica gel ( Hoá chất Fuji-Silysia, Aichi, Nhật Bản), 75 mm silica gel ODS ( NacalaiTesque, Kyoto, Nhật Bản), gel Sephadex LH-20 (GE Healthcare Nhật Bản, Tokyo, Nhật Bản) TCL thực mỏng dày 0,25mm phủ silica gel 60 F254 (Merck, Darmstadt, Đức) mỏng dày 0,25mm phủ silica gel RP-18 F254S ( Merck), vết cách phun dung dịch thuốc thử H 2SO4 10% nóng HPLC thực hệ thống bao gồm máy bơm CCPM (Tosoh, Tokyo, Nhật Bản), điều khiển CCP PX-8010 (Tosoh), đầu dò khúc xạ RI8010 (Tosoh) đầu dò Shodex OR-2 (Showa-Denko, Tokyo, Nhật Bản), phận tiêm mẫu Rheodyne Cột sắc kí Tosoh TSK gel ODS-100Z ( đường kính 10mm x dài 250mm, kích thước hạt 5µm) sử dụng để chạy HPLC Các vật liệu thuốc thử sau sử dụng để nuôi cấy tế bào khảo nghiệm hoạt động gây độc tế bào : máy trắc quang microplate Spectra Classic (Tecan, Salzburg, Áo); khuây đáy phẳng 96 đĩa (Iwaki Glass, Chiba, Nhật Bản);Các tế bào JCRB (Japanese Collection of Research Bioresources) 0085 HL-60 (Ngân hàng Nghiên cứu Khoa học Nhân sự, Osaka, Nhật Bản); FBS ( Fatal Bovine Sera _ Huyết thai bò) FCS (Flash Chromatography Sorbents_ Chất hấp thụ sắc kí) (Bio-Whittaker, walkersville, MD, USA); môi trường RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640, môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium), thuốc chống ung thư Etoposide, Cisplatin, thuốc thử MTT (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5Diphenyltetrazolium Bromide) (Sigma, St Louis, MO, USA);Kháng sinh actinomycin D (Nhà máy hoá chất tinh khiết Wako, Osaka, Nhật Bản) kháng sinh Penicillin G ( dạng muối natri) kháng sinh Streptomycin sulfate (Meiji-Seika, Tokyo, Nhật Bản) Tất hóa chất khác sử dụng loại thuốc thử sinh hóa 8 Bảng Dữ liệu 13C – NMR 15 hợp chất dung môi pyridine (C5D5N) Nguyên liệu thực vật Các hạt giống D purpurea thu năm 2008 từ doanh nghiệp Richters, Ontario, Canada Một vài hạt nảy mầm nhân định tác giả (Y.M.) Một mẫu chứng gửi vào phòng thí nghiệm Chiết xuất phân lập Các hạt giống D purpurea (2,0 kg) chiết xuất hai lần với MeOH nóng (6 L) Dịch chiết MeOH lọc áp suất giảm cô đặc sệt lại (140g) cho vào sắc kí cột Diaion HP-20 rửa giải liên tục với MeOH 20%, EtOH, EtOAc Phần EtOH rửa giải (phần B, 80g) phân lập sắc kí cột silica gel với hỗn hợp CHCl - MeOH chế độ gradient (9:1, 4:1, 2:1) sau với MeOH thu 11 phần (phần B-I đến XI) Phần B-II thêm vào cột ODS silica gel, rửa giải với MeCN-H2O (2:3) MeOH 17 phần phụ ( phần B-II-A đến Q) Phần B-II-E phân lập sắc kí cột silica gel với hỗn hợp CHCl 3-MeOHH2O (60:10:1), sắc kí cột ODS silica gel với MeCN- H2O (1: 2), chạy HPCL sử dụng MeCN-H2O (3: 2, 1: 2) thu sản phẩm (88,0 mg) 10 (9,2 mg) Phần BII-H phân lập sắc kí cột silica gel với hốn hợp CHCl3-MeOH (9: 1) sắc kí cột ODS silica gel với MeCN-H2O (1: 2) thu 13 (14,4 mg) Phần B-II-J phân tách HPLC sử dụng MeCN-H2O (2: 3) thu (35,6 mg) 15 (92,6 mg) Phần B-II-L bị sắc ký silica gel rửa giải với CHCl3-MeOH-H2O (40: 10: 1) có (17,0 mg) hợp chất tinh khiết, 12 với số tạp chất Hợp chất 12 (6,9 mg) phân lập sắc kí cột silica gel rửa giải với CHCl3-MeOH (19: 1) Hợp chất 14 (23,5 mg) phân lập từ phần B-II-N qua HPLC sử dụng MeCN-H2O (2: 3) Phần B-IV bị sắc kí ODS silica gel rửa giải với MeCN-H2O (1: 2) để (102 mg) (230 mg) hợp chất tinh khiết, 11 với số tạp chất Hợp chất 11 (6.1 mg) tinh chế sắc kí cột ODS silica gel rửa giải với MeCN-H2O (2: 3) HPLC sử dụng MeCN-H2O (2: 3) Phần B-VI bị sắc kí sắc kí cột ODS silica gel rửa giải với MeCN-H2O (1: 2) sau với MeOH sản xuất phần phụ (phần B-VI-A đến H) Phần B-VI-A sau cho cột silica gel ODS giải hấp phụ với MeCN-H2O (1: 5) sau với MeCN thu 10 phần phụ (phân số BVI-A-1-10) Phần B-VI-A-9 tinh chế sắc kí cột silica gel với CHCl3MeOH-H2O (20: 10: 1) sau với MeOH, phần phụ (phần B-VI-A-9-i đến ix) thu lấy Phần B-VI-A-9-ii tinh chế HPLC sử dụng MeCN-H2O (2: 5), thu (5,7 mg) Phần B-VI-A-9-iv phân lập sắc kí cột ODS silica gel rửa giải với MeCN-H2O (1: 3) cột sắc kí Sephadex LH-20 tách rửa với MeOH cho (23,2 mg) (4,0 mg) Phần B-VI-A-9-vi tinh khuyết cột sắc kí ODS silica gel rửa giải với MeCN-H2O (1: 3, 3: 2) thu (14,0 mg) 10 Bảng Khả chống tế bào ung thư HL-60 15 hợp chất, Etoposide, Cisplatin * Dữ liệu trình bày giá trị trung bình ± SEM ba thí nghiệm thực ba lần Bảng Khả chống tế bào HepG2 2, 9, 11, 12, actinomycin * Dữ liệu trình bày giá trị trung bình ± SEM ba thí nghiệm thực ba lần Hợp chất 1: chất rắn vơ định hình; [α]26D +14.460 (c 0.145, MeOH); HR-ESITOF-MS m/z: 861.4305 [M+Na]+ (calcd for C43H66NaO16, 861.4249); UV λmax (MeOH) nm (logε): 217 (3.67); IR νmax (film) cm-1: 3378 (OH), 1740 (C=O); HNMR (C5D5N) δ : 6.14(1H, br s, H-22), 5.32 (1H, dd, J = 18.1, 1.5 Hz, H-21a), 5.04 (1H, dd, J = 18.1, 1.5 Hz, H-21b), 4.25 (1H, br s, W1/2=8.3Hz, H-3), 2.79 (1H, dd, J = 8.8, 5.4 Hz, H-17), 1.01 (3H, s, Me-18), 0.88 (3H, s, Me-19); xem Bảng tín hiệu gốc đường, xem Bảng liệu C-NMR (C5D5N) Hợp chất 2: chất rắn vơ định hình; [α] 25D +9.530 (c 0.10, MeOH); HR-ESITOF-MS m/z: 705.3447 [M+Na]+ (calcd.for C35H54NaO13, 705.3462); UV λmax (MeOH) nm (logε): 218 (3.14); IR νmax (film) cm-1: 3427 (OH), 1740 (C=O); H- 11 NMR (C5D5N): 6.14 (1H, br s, H-22), 5.32 (1H, br d, J = 17.9Hz, H-21a), 5.21 (1H, d, J = 7.8Hz, H-1”), 5.04 (1H, br d, J = 17.9Hz, H-21b), 4.72 (1H, d, J = 7.7Hz, H-1'), 4.35 (1H, br s, H-3), 2.79 (1H, dd, J = 8.0, 5.8 Hz,H-17), 1.64 (3H, d, J = 6.4Hz, H-6'), 1.00 (3H, s, Me-18), 0.82 (3H, s, Me-19); xem Bảng liệu C-NMR (C5D5N) Hợp chất 3: chất rắn vơ định hình; [α] 25D -2.650 (c 0.11, MeOH); HR-ESITOF-MS m/z: 719.3550 [M+Na]+ (calcd for C36H56NaO13, 719.3619); UV λmax (MeOH) nm (logε): 217 (3.16); IR νmax (film) cm-1: 3460 (OH), 1736 (C=O);H-NMR (C5D5N) δ: 6.14 (1H, br s, H-22), 5.32 (1H, dd, J = 18.2, 1.5 Hz, H-21a), 5.04 (1H, dd, J = 18.2, 1.5 Hz, H-21b), 5.15 (1H, d, J = 7.7Hz, H-1”), 4.69 (1H, d, J = 7.7Hz, H-1'), 4.34 (1H, br s, H-3), 3.67 (3H, s, methoxyl), 2.79 (1H, dd, J = 8.4, 5.7 Hz, H-17), 1.59 (3H, d, J = 6.4Hz, H-6'), 1.01 (3H, s, Me-18), 0.79 (3H, s, Me-19); xem Bảng liệu C-NMR (C5D5N) Hợp chất 4: chất rắn vơ định hình; [α] 25D -4.180 (c 0.11, MeOH); HR-ESITOF-MS m/z: 721.3371 [M+Na]+ (calcd for C35H54NaO14, 721.3411); UV λmax (MeOH) nm (logε): 218 (3.18); IR νmax (film) cm-1: 3426 (OH), 1738 (C=O); HNMR (C5D5N) δ: 6.25 (1H, br s, H-22), 5.68 (1H, br d, J = 18.2Hz, H-21a), 5.57 (1H, br d, J = 18.2Hz, H-21b), 5.20 (1H, d, J = 7.8Hz, H-1”), 4.99 (1H, t-like, J = 8.0Hz, H16), 4.71 (1H, d, J = 7.6Hz, H-1'), 4.32 (1H, br s, H-3), 3.28 (1H, d, J = 7.9Hz, H-17), 2.72 (1H, dd, J = 14.5, 8.4 Hz, H-15a), 1.63 (3H, d, J = 6.4Hz, H-6'), 1.11 (3H, s, Me18), 0.83 (3H, s, Me-19); Hợp chất 5: chất rắn vơ định hình; [α] 25D -12.60 (c 0.10, MeOH); HR-ESITOF-MS m/z: 735.3875 [M+Na]+ (calcd, for C36H56NaO14, 735.3932); UV λmax (MeOH) nm (logε): 218 (3.22); IR νmax (film) cm-1: 3409 (OH), 1735 (C=O);HNMR (C5D5N) δ: 6.25 (1H, br s, H-22), 5.71 (1H, br d, J = 18.2Hz, H-21a), 5.57 (1H, br d, J = 18.2Hz, H-21b), 5.15 (1H, d, J = 7.7Hz, H-1”), 4.98 (1H, t-like, J = 7.7Hz, H16), 4.68 (1H, d, J = 7.6Hz, H-1'), 4.32 (1H, br s, H-3), 3.66 (3H, s, methoxyl), 3.28 (1H, d, J = 7.9Hz, H-17), 2.73 (1H, dd, J = 14.6, 8.4 Hz, H-15a), 1.59 (3H, d, J = 6.3Hz, H-6'), 1.11 (3H, s,Me-18), 0.80 (3H, s, Me-19); Hợp chất 6: chất rắn vơ định hình; [α] 25D +1.150 (c 0.10, MeOH); HR-ESITOF-MS m/z: 897.4096 [M+Na]+ (calcd for C42H66NaO19, 897.4096); UV λmax (MeOH) nm (logε): 217 (3.17); IR νmax (film) cm-1: 3421 (OH), 1735 (C=O);HNMR (C5D5N) δ: 6.25 (1H, br s, H-22), 5.70 (1H, dd, J = 18.3, 1.6 Hz, H-21a), 5.57 12 (1H, dd, J = 18.3, 1.6 Hz, H-21b), 5.20 (1H, d, J = 7.8Hz, H-1'''), 5.14 (1H, d, J = 7.8Hz, H-1”), 4.99 (1H, t-like, J = 8.0Hz, H-16), 4.63 (1H, d, J = 7.7Hz, H-1'), 3.64 (3H, s, methoxy), 3.28 (1H, d, J = 7.9Hz,H-17), 2.73 (1H, dd, J = 14.6, 8.4 Hz, H-15a), 1.70 (3H, d, J = 6.3Hz, H-6'), 1.11 (3H, s, Me-18), 0.80 (3H, s, Me-19); Hợp chất 7: chất rắn vơ định hình; [α] 25D +0.130 (c 0.10, MeOH); HR-ESITOF-MS m/z: 897.4006 [M+Na]+ (calcd for C42H66NaO19, 897.4096); UV λmax (MeOH) nm (logε): 218 (3.12); IR νmax (film) cm-1: 3423 (OH), 1732 (C=O); HNMR (C5D5N) δ: 6.25 (1H, br s, H-22), 5.69 (1H, br d, J = 18.2, H-21a), 5.56 (1H, br d, J = 18.2Hz, H-21b), 5.17 (1H, d, J = 7.8Hz, H-1'''), 5.08 (1H, d, J = 7.8Hz, H-1”), 4.98 (1H, t-like, J = 7.8Hz, H-16), 4.67 (1H, d, J = 7.6Hz, H-1'), 3.64 (3H, s, methoxy), 3.28 (1H, d, J = 7.9Hz, H-17), 2.72 (1H, dd, J = 14.6, 8.4 Hz, H-15a), 1.53 (3H, d, J = 6.3Hz,H-6'), 1.11 (3H, s, Me-18), 0.80 (3H, s, Me-19); Hợp chất 8: chất rắn vơ định hình; [α] 26D -3.480 (c 0.10 MeOH); HR-ESITOF-MS m/z: 897.4096 [M+Na]+ (calcd for C42H66NaO19, 897.4096); UV λmax (MeOH) nm (logε): 217 (4.30); IR νmax (film) cm-1: 3395 (OH), 1731 (C=O); HNMR (C5D5N) δ: 6.25 (1H, br s, H-22), 5.70 (1H, br d, J = 18.2Hz, H-21a), 5.57 (1H, br d, J = 18.2, H-21b), 4.98 (1H, dd, J = 8.4, 7.9 Hz, H-16), 4.31 (1H, br s, W1/2 = 8.1Hz, H-3), 3.28 (1H, d, J = 7.9Hz, H-17), 2.73 (1H, dd, J = 14.6, 8.4 Hz, H-15a), 1.11 (3H, s, Me-18), 0.81 (3H, s, Me-19) 13 14 Enzyme thuỷ phân 11 Hợp chất 11 xử lý với β-D–glucosidase (SigmaAldrich, 7.0mg) AcOH – AcONa 0.2M (pH=5, 2.0 mL) nhiệt độ phòng 15 24h Phản ứng theo dõi cột silica gel, dung môi rửa giải CHCl – MeOH – H2O (40:10:1) sau với MeOH (1.7mg) phần đường (0.2 mg) Dùng HPLC để phân tích phần đường điều kiện sắc ký cho thấy diện D – glucose Thử nghiệm nuôi cấy tế bào HL - 60 HL - 60 bảo quản môi trường RPMI 1640 chứa 10% FBS bổ sung mL – glutamine, 100 đơn vị/mL muối penicillin G Natri 100 µg/mL streptomycin sulfate Bạch cầu làm cho lơ lửng môi trưởng với mật độ 4x10 4/mL Đồng thời cho 196 µL dung dịch vào 96-well flat-bottom plate Các tế bào ni cấy khơng khí 5% CO 2, 37oC 24h Sau đó, pha lỗng để có µL nồng độ 0,1 – 10 µg/mL với EtOH – H2O, thêm EtOH – H2O vào giêng điều khiển Ủ tiếp 72h phát triển tế bào đánh giá thử nghiệm modified MTT reduction Một thời gian ngắn sau, thêm vào giếng 10 µL MTT 5mg/mL PBS Rồi tiếp tục nuôi cấy môi trường cũ 4h Đĩa quay ly tâm 1500g phút để làm lắng tế bào MTT formazan Lấy từ phần giếng mẫu 150µL, thêm 175 µL DMSO để hồ tan tinh thể MTT formazan Khuấy máy 10 phút, đọc microplate reader bước sóng 550nm Thử nghiệm ni cấy HepG2 HepG2 nuôi cấy môi trường DMEM chứa 10% FCS, 50 đơn vị/mL muối penicillin G Natri, 50 µg/mL streptomycin sulfate khơng khí ẩm có 8.5% CO2 37oC Tế bào rửa, cho vào môi trường đến mật độ 1,7x104/mL, 6mL dịch cho vào đĩa 60 mm Chúng ủ môi trường 8.5%CO2 24h 37oC Sau thêm vào micro L DMSO chứa mẫu để đạt nồng độ 0.08-5.0 µM, thêm µL DMSO vào đĩa điều khiển Tiếp tục ủ 48h tiến hành đếm Tài liệu tham khảo 1) Higano T, Kuroda M, Sakagami H, and Mimaki Y, Chem Pharm Bull., 55, 337–339 (2007) 2) Kubo S, Kuroda M, Matsuo Y, Masatani D, Sakagami H, and Mimaki Y, Chem Pharm Bull., 60, 1275–1282 (2012) 3) Hoji K, Chem Pharm Bull., 9, 576–578 (1961) 4) Hoji K, Chem Pharm Bull., 9, 571–575 (1961) 5) Miyatake K, Okano A, Hoji K, Miki T, and Sakashita A,Chem Pharm Bull., 9, 519– 523 (1961) 6) Hoji K, Chem Pharm Bull., 9, 291–295 (1961) 7) Hoji K, Chem Pharm Bull., 9, 289–291 (1961) 16 8) Hoji K, Miki T, Sakashita A, Okano A, and Miyataka K, Chem Pharm Bull., 9, 276– 288 (1961) 9) Miyatake K, Okano A, Hoji K, Miki T, and Sakashita A, Chem Pharm Bull., 9, 375– 378 (1961) 10) Okano A, Hoji K, Miki T, and Sakashita A, Chem Pharm Bull., 7, 226–232 (1959) 11) Okano A, Hoji K, Miki T, and Sakashita A, Chem Pharm Bull., 7, 222–225 (1959) 12) Okano A, Hoji K, Miki T, and Sakashita A, Chem Pharm Bull., 7, 212–221 (1959) 13) Okano A, Pharm Bull., 6, 173–177 (1958) 14) Okano A, Pharm Bull., 5, 272–276 (1957) 15) Miyatake K, Okano A, Hoji K, and Miki T, Pharm Bull., 5, 163–167 (1957) 16) Miyatake K, Okano A, Hoji K, and Miki T, Pharm Bull., 5, 157–163 (1957) 17) Sato D, Ishii H, and Nishimura Y, Yakugaku Zasshi, 74, 560 (1954) 18) Imre Z and Yurdun T, Planta Med., 54, 529–531 (1988) 19) Sargent JM and Taylor CG, Br J Cancer, 60, 206–210 (1989) 17 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tính chất tác dụng cardenolide từ hạt Digitalis purpurea Dụng cụ, hoá chất - Sắc kí cột Diaion HP-20 (Hóa chất Mitsubishi, Tokyo,Nhật Bản), - Sắc kí cột silica gel ( Hố chất Fuji-Silysia, Aichi, Nhật Bản), - Sắc kí cột silica gel ODS ( Nacalai-Tesque, Kyoto, Nhật Bản), - Sắc kí cột gel Sephadex LH-20 (GE Healthcare Nhật Bản, Tokyo, Nhật Bản) - Sắc kí lỏng hiệu cao (Tosoh) - Các dung môi Chiết xuất: Các hạt D purpurea chiết xuất hai lần với MeOH nóng Dịch chiết MeOH lọc, cô đặc áp suất giảm Phân lập: Dịch lọc cho vào cột Diaion HP-20 CC rửa giải với 20% MeOH, EtOH, EtOAc Các chất phần EtOH phân lập sắc kí cột silica gel với hỗn hợp CHCl3 - MeOH chế độ gradient (9:1, 4:1, 2:1) sau với MeOH, thu 11 phần (phần B-I đến IX) Phần B-II thêm vào cột ODS silica gel, rửa giải với MeCN-H2O (2:3) MeOH 17 phần phụ ( phần B-II-A đến Q) Phần B-II-E phân lập sắc kí cột silica gel với hỗn hợp CHCl 3-MeOH-H2O (60:10:1), sắc kí cột ODS silica gel với MeCN- H2O (1: 2), chạy HPLC sử dụng MeCN- H 2O (3: 2, 1: 2) thu sản phẩm (88,0 mg) 10 (9,2 mg) ) Phần B-II-H phân lập sắc kí cột silica gel với CHCl 3-MeOH (9: 1) sắc kí cột ODS silica gel với MeCNH2O (1: 2) thu 13 (14,4 mg) Phần B-II-J phân tách HPLC sử dụng MeCN- H2O (2: 3) thu (35,6 mg) 15 (92,6 mg) Phần B-II-L bị sắc ký silica gel rửa giải với CHCl3-MeOH- H 2O (40: 10: 1) có (17,0 mg) hợp chất tinh khiết, 12 với số tạp chất Hợp chất 12 (6,9 mg) phân lập sắc kí cột silica gel rửa giải với CHCl3-MeOH (19: 1) Hợp chất 14 (23,5 mg) phân lập từ phần B-II-N qua HPLC sử dụng MeCN-H2O (2: 3) Phần B-IV bị sắc kí ODS silica gel rửa giải với MeCN- H 2O (1: 2) để (102 mg) (230 mg) hợp chất tinh khiết, 11 với số tạp chất Hợp chất 11 (6.1 mg) tinh chế sắc kí cột ODS silica gel rửa giải với MeCN- H 2O (2: 3) HPLC sử dụng MeCN-H 2O (2: 3) Phần B-VI bị sắc kí sắc kí cột ODS silica gel rửa giải với MeCN- H 2O (1: 2) sau với MeOH sản xuất phần phụ (phần B-VI-A đến H) Phần B-VI-A 18 sau cho cột silica gel ODS giải hấp phụ với MeCN-H2O (1: 5) sau với MeCN thu 10 phần phụ (phân số B-VI-A-1-10) Phần B-VI-A-9 tinh chế sắc kí cột silica gel với CHCl 3-MeOH-H2O (20: 10: 1) sau với MeOH, phần phụ (phần B-VI-A-9-i đến ix) thu lấy Phần B-VI-A-9-ii tinh chế HPLC sử dụng MeCN-H2O (2: 5), thu (5,7 mg) Phần B-VI-A-9-iv phân lập sắc kí cột ODS silica gel rửa giải với MeCN-H2O (1: 3) cột sắc kí Sephadex LH-20 tách rửa với MeOH cho (23,2 mg) (4,0 mg) Phần B-VI-A-9-vi tinh khuyết cột sắc kí ODS silica gel rửa giải với MeCN-H2O (1: 3, 3: 2) thu (14,0 mg) Tính chất Cardenolide nhóm hợp chất tự nhiên tìm thấy số họ giới hạn họ mõm chó, trúc đào, hành, họ hồng liên Là glycoside tim có 23 carbon vòng lacton C, nối đơi vị trí α-β Chất kết tinh, khơng màu, vị đắng, có suất quay cực, tan nước, cồn, khơng tan ether benzene Dễ bị thuỷ phân enzyme, khó bị thuỷ phân acid (trừ glycoside có đường 2-desoxy) Tác dụng Giảm tần số co bóp tim, giảm thời kỳ tâm thu, kéo dài thời kỳ tâm trương làm cho tim bóp mạnh, chậm dẫn truyền xung Lợi niệu, thích hợp cho phù tim Chống lại phát triển tế bào bạch cầu HL 60 tế bào ung thư gan người (trong test HL 60 HepG2) Tác dụng giảm có nhóm OH vị trí C 16 phần aglycone digitoxigenin, nhóm methyl vị trí C3’ nhóm OH vòng fucopyranose, nhóm acetyl vị trí C3’ nhóm OH đường digitoxopyranose Tài liệu tham khảo Tiếng Việt Ngô Thu Vân – Trần Hùng (2010), Dược liệu học Tập 1, NXB Y học, trang 179-180 Tiếng Anh Minpei KURODA, Satoshi KUBO, Yukiko MATSUO, Tomomi ATOU, Junichi SATOH, Tomofumi FUJINO, Makio HAYAKAWA, Yoshihiro MIMAKI, New Cardenolide Glycosides from the Seeds of Digitalis purpurea and Their Cytotoxic Activity, Department of Medicinal Pharmacognosy, Tokyo University of Pharmacy and Life Sciences, School of Pharmacy, 1432-1 19 Horinouchi, Hachioji, Tokyo 192-0392, Japan; Department of Hygiene and Health Sciences, Tokyo University of Pharmacy and Life Sciences, School of Pharmacy, 1432-1 Horinouchi, Hachioji, Tokyo 192-0392, Japan  ... test HL 60 HepG2) Tác dụng giảm có nhóm OH vị trí C 16 phần aglycone digitoxigenin, nhóm methyl vị trí C3’ nhóm OH vòng fucopyranose, nhóm acetyl vị trí C3’ nhóm OH đường digitoxopyranose Tài... -1) cacbonyl (1740 cm-1) nhóm Phổ 1H-NMR chứa hai nhóm methyl riêng rẽ H 1.01 0.88 (Me-18 Me-19), nhóm oxymethylene 1H 5.32 5.04 (Mỗi dd, J ¼ 18: 1, 1,5 Hz, H2-21), nhóm olefin tạ i? H 6.14 (br... Khi hoạt động độc tế bào glycosides digitoxigenin (2, 3, 9, 12 14) so với gitoxigenin tương ứng glycosides (4, 5, 10, 13 15), có nưa đường C-3 aglycone digitoxigenin nưa, glycosides digitoxigenin