Nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan của ba loài thực vật dứa dại (pandanus odoratissimus), nhó đông (morinda longissima), chùm ruột (phyllanthus acidus) ở việt nam tt

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN CÔNG THÙY TRÂM NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH BẢO VỆ GAN CỦA BA LỒI THỰC VẬT DỨA DẠI (PANDANUS ODORATISSIMUS), NHĨ ĐƠNG (MORINDA LONGISSIMA), CHÙM RUỘT (PHYLLANTHUS ACIDUS) Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh lý học người động vật Mã số: 42 01 04 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2019 Luận án hoàn thành tại: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Đỗ Thị Thảo - Viện Công nghệ sinh học PGS TS Nguyễn Mạnh Cường - Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên Người phản biện 1: PGS TS Trần Thu Hương - Trường ĐH Bách khoa, Hà Nội Người phản biện 2: PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung - Trường ĐH KHTN, Hà Nội Người phản biện 3: PGS.TS Lê Trọng Sơn - Trường ĐH Khoa học Huế Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án Tiến sĩ Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Vào hồi giờ, ngày Có thể tìm luận án tại, - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Viện Công nghệ sinh học tháng năm 2019 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Gan nội quan lớn thể người động vật, đóng vai trò thiết yếu q trình trao đổi chất, thải độc quan miễn dịch quan trọng thể Máu cung cấp cho gan từ hai nguồn, khoảng 75% lưu lượng máu đến gan từ phận hệ tiêu hóa, lách thơng qua tĩnh mạch cửa 25% lại từ động mạch gan Chính vậy, áp suất riêng phần oxy máu mang đến cung cấp cho gan thấp Ngoài ra, gan nhận chất, trao đổi chất chuyển hóa chất từ máu mang đến Do gan thường xuyên tiếp xúc với với nội độc tố, chất độc, vi khuẩn, virut nguyên nhân làm gan tổn thương dẫn đến bệnh gan (Higuchi Gores, 2003) Các gốc tự độc tố vào gan, gây tổn thương gan cách kích thích tế bào Kupffer tế bào miễn dịch bẩm sinh khác Những yếu tố làm cho tế bào gan sản xuất cytokine tiền viêm yếu tố hoại tử khối u (TNF-) , interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10)…, cytokine đóng vai trò quan trọng q trình miễn dịch gây chết tế bào Các cytokine tiền viêm gây phản ứng viêm gan, khởi động cho trình tự điều chỉnh để chữa bệnh Tuy nhiên tình trạng viêm khơng giảm dần sau thời gian ngắn, việc sản xuất cytokine liên tục dẫn đến bệnh gan Do đó, thơng qua việc kiểm sốt q trình sản xuất hoạt động cytokine để bảo vệ gan Ngoài ra, stress oxy hóa nguyên nhân dẫn đến tổn thương hoại tử tế bào gây bệnh gan Các gốc tự đóng vai trò quan trọng việc thay đổi bệnh lý gan, trường hợp gan bị nhiễm độc chất độc nội sinh, ngoại sinh nhiễm độc rượu Các gốc oxy hóa hydroxyl, anion superoxide hidrogen peroxide… phá hủy mô gan, gây tổn thương tế bào thơng qua q trình peroxy hóa màng lipid, đột biến ADN Peroxy hóa lipid acid béo khơng bão hòa màng tế bào làm giảm tính linh động màng ảnh hưởng đến cấu trúc, chức màng Khi màng chức sinh học, tế bào bị chết kéo theo thối hóa mơ, ngun nhân dẫn đến bệnh lý Vì việc tìm tác nhân có nguồn gốc tự nhiên tổng hợp có hoạt tính chống oxy hóa đề xuất để ngăn ngừa điều trị bệnh gan stress oxy hóa Cây dược liệu đóng vai trò quan trọng việc chăm sóc sức khỏe người Theo thống kê, Việt Nam có khoảng 5.117 lồi lồi thực vật bậc cao có mạch sử dụng dân gian làm thuốc chữa bệnh (Viện Dược liệu, 2017) Đây nguồn thuốc quý giá cần nghiên cứu, khai thác, sử dụng có hiệu bảo tồn phát triển bền vững cho hệ tương lai Pandanus oddoratissimus, Morinda longissima Phyllathus acidus sử dụng nhiều phương thuốc truyền thống để điều trị bệnh bao gồm bệnh gan Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học ba cung cấp nguyên liệu thô sử dụng điều trị bệnh gan Xuất phát từ lý trên, tiến hành nghiên cứu đề tài Nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan ba lồi thực vật Dứa dại (Pandanus odoratissimus), Nhó đơng (Morinda longissima), Chùm ruột (Phyllanthus acidus) Việt Nam với mục tiêu sau: Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa từ dịch chiết Dứa dại, rễ Nhó đơng, Chùm ruột phân bố Việt Nam Chiết tách phân lập số hợp chất từ loài thực vật này, xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan in vitro hợp chất phân lập Những đóng góp luận án Lần hợp chất phân lập từ Dứa dại hợp chất phân lập rễ Nhó đơng tiến khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bảo vệ tế bào gan HepG2 chống lại tác động gây độc CCl4 11 hợp chất phân lập từ Chùm ruột phân bố Việt nam xác định cấu trúc có hợp chất drabanemoroside lần phân lập từ chi Phyllanthus hợp chất lần phân lập từ thiên nhiên kaempferol3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester Các hợp chất tách chiết từ Chùm ruột khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bảo vệ gan, hợp chất myricitrin thể hoạt tính bảo vệ tế bào gan mạnh thông qua hoạt động chống oxy hóa Đặc biệt hợp chất kaempferol-3-O-[αL-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester cho thấy hoạt tính bảo vệ gan thơng qua hoạt động điều chỉnh hàm lượng cytokine TNF-α, IL-6, IL10 đường signal transducer and activator of transcription (STAT3) Cấu trúc luận án Ngoài lời mở đầu, kết luận, tài liệu tham khảo phụ lục, luận án gồm chương - Chương Tổng quan tài liệu - Chương Vật liệu phương pháp nghiên cứu - Chương Kết nghiên cứu - Chương Bàn luận kết CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Phần tổng quan tài liệu tập hợp nghiên cứu nước quốc tế vấn đề liên quan đến gan, bệnh gan, stress oxy hóa chất chống oxy hóa liên quan đến bảo vệ gan, loài thực vật nghiên cứu; CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1 Vật liệu sử dụng nghiên cứu - Vật liệu thực vật: Dứa dại (Pandanus odoratissimus), thân rễ Nhó đơng (Morinda longissima Y.Z Ruan), Chùm ruột (Phyllanthus acidus) phân bố Việt Nam - Vật liệu động vật: Chuột nhắt trắng dòng BALB/c - Vật liệu tế bào: tế bào macrophages dòng RAW 264.7 (ATCC-TIB-71), tế bào dòng HepG2 2.1.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu Hóa chất sử dụng nghiên cứu hóa học chiết xuất - Dichloromethan (DCM), ethyl acetat (EtOAc), chloroform, (CHCl 3), methanol (MeOH), aceton, n-butanol (Trung Quốc, Merck) - Bản sắc ký lớp mỏng Silica gel F254 tráng sẵn đế nhôm (Merck, Art 1,05554) - Silica gel 60 dùng cho sắc ký cột (Merck, cỡ hạt 15-40µm) - Các dung mơi thơng thường khác Hóa chất sử dụng cho thử nghiệm sinh học - Trolox, Cucumine, (Sigma Aldrich); 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH); Dimethylsulfoside (DMSO) (Fisher Scientific), Axit ascorbic, dung dịch đệm phosphat PBS (pH=7,4) - L-Glutamine, axit 4-2-hidroxyetyl-1-piperazineetansulfonic (HEPES), Sodium Pyruvate, Fetal Bovine Serum – FBS (Gibco, Hoa kỳ), Phosphate buffered saline PBS (Gibco, Hoa kỳ), Dulbecco’s Modified Eagle Madium - DMEM (Gibco, Hoa kỳ), Invitrogen (Sigma), Goldbio Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide - MTT (Sigma) - Bộ KIT định lượng Interleukin (IL-6 mouse ELISA Kit), Interleukin 10 (IL-10 mouse ELISA Kit) Tumor Necrosis factor Alpha (TNF-) (BioVision, Chester Springs, PA, USA) 2.1.3 Thiết bị Các thiết bị sử dụng nghiên cứu hóa học chiết xuất Phổ khối ion hóa học áp suất khí cao (PACI-MS) đo máy Agilent 6310 Ion Trap Viện Hóa học hợp chất tự nhiên, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Phổ khối ion phun mù điện tử (ESI-MS) đo máy Agilent 1100 LCMSD Trap Viện Hóa học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Phổ khối HR-ESI-MS đo máy FT-ICR-MS Varrian (USA) viện Hóa học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Phổ UV-Vis đo máy UV-2450, Shimazu, Nhật Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) đo máy Vance 500, 1H(500MHz) 13C-(125 MHz) Viện Hóa học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Các thiết bị sử dụng thử nghiệm sinh học Máy đọc ELISA 96 giếng (Bio rad) Và thiết bị thông thường khác 2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HÓA HỌC 2.2.1 Phương pháp điều chế phần chiết từ nguyên liệu thực vật để sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan Mẫu thực vật sau thu hái loại bỏ tạp chất, rửa sạch, đem phơi ráo, sấy khô nhiệt độ 50-60oC Mẫu thực vật phân tách thành phân đoạn chiết có độ phân cực khác với dung môi methanol, ethanol, n-hexan, clorofom, dichlomethane, ethyl acetate, nước Khảo sát sơ thành phần hóa học áp dụng phương pháp trường đại học Dược khoa Rumani có cải tiến cho phù hợp với phòng thí nghiệm 2.2.2 Phương pháp phân lập hợp chất Sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng phương pháp sắc ký cột 2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất Để xác định cấu trúc hợp chất phân lập được, sử dụng kết hợp thông số vật lý phương pháp phổ đại, đồng thời kết hợp tra cứu tài liệu tham khảo Các phương pháp phổ sử dụng gồm: phương pháp phổ khối, phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC 2.3.1 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa DPPH Sử dụng DPPH tạo gốc tự để sàng lọc chất chống oxy hóa (Yuvaraj cs., 2013) 2.3.2 Phương pháp xác định khả ức chế peroxidation lipid (thử nghiệm MDA) Xác định khả ức chế peroxy hoá lipid mẫu nghiên cứu qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA), sản phẩm trình peroxy hoá lipid màng tế bào (Stroev Makarova, 1989; Jelili cs., 2011) 2.3.3 Phương pháp xác định khả bảo vệ tế bào gan (Moussa cs., 2013; Özerka cs., 2015) 2.3.3.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào Dòng tế bào HepG2 ni cấy mơi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 1,0 mM sodium pyruvate, bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO) nuôi tủ ấm CO2 điều kiện 37oC, 5% CO2 2.3.3.2 Xác định khả gây độc tế bào in vitro phương pháp MTT Sự phát triển tế bào tác động mẫu thử xác định phương pháp MTT 2.3.3.2 Phương pháp xác định khả bảo vệ tế bào gan Khả sinh sống tế bào HepG2 tác động CCl xác định thông qua phép thử MTT 2.3.4 Phương pháp xác định cảm ứng/ức chế cytokine 2.3.4.1 Nuôi cấy tế bào xử lý mẫu Tế bào RAW macrophage dòng 264.7 ni cấy môi trường DMEM (Dulbecco’s modified eagle madium) với thành phần kèm theo gồm 2mM L-glutamine, 10mM HEPES 1,0mM sodium pyruvate, có bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO), nuôi tủ ấm CO2 điều kiện nhiệt độ 37oC, 5% CO2 Sau 24 h, thu dịch nuôi tế bào thử chất để xác định có mặt interleukin 6, Interleukin 10 (IL-10 mouse ELISA Kit) TNF-α có mơi trường ni cấy 2.3.3.2 Xác định khả gây độc tế bào Sự phát triển tế bào tác động mẫu thử xác định phương pháp MTT 2.3.4.2 Phương pháp xác định interleukin 6, interleukin 10 tumor necrosis factor anpha Được thực dựa IL-10, IL-6 mouse ELISA Kit TNF – α mouse ELISA Kit (BioVision) theo hướng dẫn nhà sản xuất 2.3.5 Các phương pháp xử lí số liệu Các số liệu xử lí Excel, trình bày dạng mean ± SD/SE Các thuật toán thống kê Student's t-test, F’test phương pháp phân tích phương sai nhân tố ngẫu nhiên (one way ANOVA) để kiểm tra sai khác có ý nghĩa so với đối chứng âm, với P 100 µg/ml) Do đó, chất có khả bảo vệ gan thơng qua hoạt tính chống oxy hóa Các chất tách chiết từ phân đoạn PO-B tiếp tục khảo sát hoạt tính bảo vệ gan in vitro 3.3.1.2 Hoạt tính gây độc tế bào HepG2 tác dụng bảo vệ tế bào HepG2 tác động gây độc CCl4 hợp chất tách chiết từ phân đoạn PO-B Dứa dại a Hoạt tính gây độc tế bào HepG2 hợp chất tách chiết từ phân đoạn PO-B Dứa dại Cả hợp chất tách chiết từ Dứa dại không gây độc cho tế bào HepG2 nồng độ nghiên cứu b Tác dụng bảo vệ tế bào HepG2 tác động gây độc CCl hợp chất tách chiết từ phân đoạn PO-B Dứa dại Ở giếng đối chứng sau ủ với 40 mM CCl4 , khả sống tế bào HepG2 giảm xuống 37,36±1,32 %, điều cho thấy CCl 40mM gây độc tính mạnh tế bào HepG2 Tỷ lệ phần trăm sống sót tế bào HepG2 tăng lên giếng ủ với hợp chất (+)-pinoresiol; (+)-medioresinol nồng độ 50 100 µg/ml hợp chất vanillin, (+)-syringaresinol nồng độ 100 µg/ml trước xử lý CCl4, nhiên mức tăng không đáng kể Tỷ lệ phần trăm sống sót tế bào HepG2 giếng xử lý (+)-pinoresiol nồng độ 50 100 µg/ml 46,88 ± 0,70 %; 41,07 ± 0,58 %; xử lý (+)-medioresinol nồng độ 50 100 đạt giá trị 41,07 ± 2,44% 42,78 ± 2,54%, giếng xử lý vanillin, (+)syringaresinol nồng độ 100 µg/ml có tỷ lệ tế bào Hep2G sống sót 42,61± 1,54%; 40,08 ± 0,60% 3.3.2 Hoạt tính chống oxy hóa bảo vệ gan hợp chất tách chiết từ 13 phân đoạn ML-B thân rễ Nhó đơng 3.3.1.2 Hoạt tính chống oxy hóa hợp chất phân lập từ phân đoạn ML-B thân rễ Nhó đơng a Xác định hoạt tính chống oxy hóa hợp chất phân lập từ phân đoạn ML-B thân rễ Nhó đơng phương pháp DPPH Kết nghiên cứu cho thấy hợp chất morindone-5-methyl ether, morindone methyl ether, soranjidiol khơng thể hoạt tính chống oxy hóa thông qua hoạt động loại bỏ gốc tự Giá trị IC50 chất lớn 100 b Xác định hoạt tính chống oxy hóa hợp chất phân lập từ phân đoạn ML-B thân rễ Nhó đơng thơng qua thử nghiệm MDA Kết khảo sát cho thấy hợp chất morindone-5-methyl ether, morindone methyl ether, soradidiol hoạt tính chống oxy hóa thơng qua hoạt động ức chế q trình peroxy hóa lipid Như vậy, mơ hình nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa phương pháp DDPH MDA, hợp chất morindone-5-methyl ether, morindone methyl ether, soradidiol hoạt chống oxy hóa Các chất tiếp tục khảo sát hoạt tính bảo vệ tế bào HepG2 chống lại tác động gây độc CCl4 3.3.1.2 Hoạt tính gây độc tế bào HepG2 tác dụng bảo vệ tế bào HepG2 tác động gây độc CCl4 hợp chất tách chiết từ phân đoạn ML-B thân rễ Nhó đơng a Hoạt tính gây độc tế bào HepG2 hợp chất tách chiết từ phân đoạn ML-B thân rễ Nhó đơng hợp chất tách chiết từ thân rễ Nhó đơng chưa thể hoạt tính gây độc tế bào HepG2 nồng độ nghiên cứu b Tác dụng bảo vệ tế bào HepG2 tác động gây độc CCl hợp chất tách chiết từ phân đoạn ML-B thân rễ Nhó đơng Tỷ lệ phần trăm tế bào HepG2 sống sót giếng có bổ sung hợp chất morindone-5-methyl ether, morindone methyl ether, soradidiol mức nồng độ khác đạt giá trị từ 38,14 ± 2,12 đến 46,33 ± 1,49 tăng cao so với nhóm đối chứng (37,36 ± 1,32%), nhiên mức tăng khơng đáng kể 3.3.3 Hoạt tính chống oxy hóa bảo vệ gan hợp chất tách chiết từ phân đoạn PA-C Chùm ruột 3.3.3.1 Hoạt tính chống oxy hóa hợp chất phân lập từ phân đoạn PA-C Chùm ruột a Xác định hoạt tính chống oxy hóa hợp chất phân lập từ phân đoạn PA-C Chùm ruột phương pháp DPPH 11 hợp chất tách chiết từ Chùm ruột chia thành nhóm: nhóm thứ nhóm có hoạt tính chống oxy hóa thông qua hoạt động loại bỏ gốc tự DPPH từ cao xuống thấp rutin , myricitrin, quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside (Quercitrin) , isoquercitrin, kaempferol, kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-Dgalactopyranosidevới giá trị IC50 7.37; 9,37; 10,61; 12,41; 15,34 79,32 14 µg/ml, hợp chất myricitrin, quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside (quercitrin), isoquercitrin có hoạt tính chống oxy hóa thơng qua hoạt động loại bỏ gốc tự cao so với chất chuẩn ascorbic acid (IC50 = 13,23 µg/ml) Nhóm thứ hai nhóm khơng thể hoạt tính chống oxy hóa thơng qua hoạt động loại bỏ gốc tự do, nhóm bao gồm hợp chất kaempferol 3-O- β-D-glucopyranoside, kaempferol-3-O-α-Lrhamnopyranoside, kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-Dglucuronopyranoside, kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-Dglucuronopyranosyl methyl ester, kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(12)-α-Larabinopyranoside với giá trị IC50 lớn 100 µg/ml b Xác định hoạt tính chống oxy hóa hợp chất phân lập từ phân đoạn PA-C Chùm ruột thông qua thử nghiệm MDA Hoạt tính chống oxy hóa thơng qua hoạt động ức chế q trình peroxy hóa lipid 11 hợp chất tách chiết từ Chùm ruột chia làm nhóm Nhóm thứ nhất, nhóm có hoạt tính ức chế q trình peroxy hóa lipid xếp theo thứ tự từ cao xuống thấp gồm: myricitrin, quercitrin, isoquercitrin, rutin, kaempferol, kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside (PA4) với giá trị IC50 1,67; 5,69; 8,33; 10,21; 13,36; 54,55 µg/ml Nhóm thứ hai nhóm hợp chất khơng thể hoạt tính ức chế q trình peroxy hóa lipd với giá trị IC50 lớn 100 bao gồm hợp chất: kaempferol 3-O- β-D-glucopyranoside, kaempferol-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside, kaempferol-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(12)]-β-D-galactopyranoside, kaempferol-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester , kaempferol 3-O-αL-rhamnopyranosyl-(12)-α-L-arabinopyranoside Như mơ hình nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa phương pháp DDPH MDA, hợp chất gồm kaempferol, quercetin-3-O-α-Lrhamnopyranoside (Quercitrin), myricitrin, isoquercitrin, rutin thể hoạt chống oxy hóa cao Ngồi ra, hợp chất kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(12)]-β-D-galactopyranoside thể hoạt tính loại bỏ gốc tự DPPH hợp chất kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside thể hoạt tính ức chế q trình peroxy hóa lipid nhiên hoạt tính chống oxy hóa hai chất thấp Các chất lại gồm kaempferol 3-Oβ-D-glucopyranoside, kaempferol-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside, kaempferol-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester, kaempferol 3-O-αL-rhamnopyranosyl-(12)-α-L-arabinopyranoside khơng thể hoạt tính chống oxy hóa mơ hình nghiên cứu Các chất tiếp tục khảo sát hoạt tính bảo vệ tế bào HepG2 chống lại tác động gây độc CCl 3.3.3.2 Hoạt tính gây độc tế bào HepG2 tác dụng bảo vệ tế bào HepG2 tác động gây độc CCl4 hợp chất tách chiết từ phân đoạn PA-C Chùm ruột a Hoạt tính gây độc tế bào HepG2 hợp chất tách chiết từ phân đoạn 15 PA-C Chùm ruột 11 hợp chất tách chiết từ Chùm ruột chưa thể hoạt tính gây độc tế bào HepG2 nồng độ nghiên cứu b Tác dụng bảo vệ tế bào HepG2 tác động gây độc CCl hợp chất tách chiết từ phân đoạn PA-C Chùm ruột Trong số 11 hợp chất tách chiết từ Chùm ruột có hợp chất biểu hoạt tính bảo vệ tế bào HepG2 chống lại tác động gây độc CCl Trong đó, hợp chất quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside (quercitrin), kaempferol-3-O-α-Lrhamnopyranoside, kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(12)-α-Larabinopyranoside biểu hoạt tính bảo vệ tế bào Hep2G nồng độ 100µg/ml, nhiên tỷ lệ tế bào Hep2G sống sót tăng không đáng kể 44,36 ± 0,66%; 51,76 ± 1,87%; 46,38 ± 0,69%; so với đối chứng 37,36% Sáu hợp chất khác gồm kaempferol-3-O-(2-α-L-rhamnopyranosyl)-β-Dglucuronopyranoside, kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-Dgalactopyranoside), myricitrin, kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-Dglucuronopyranosyl methyl ester, isoquercitrin rutin biểu hoạt tính bảo vệ tế bào HepG2 nồng độ 50 100µg/ml Tỷ lệ tế bào Hep2G sống sót tác động bảo vệ chất đạt từ 42% trở lên cao so với đối chứng (37,36%.) Đáng ý nồng độ 100µg/ml hợp chất myricitrin có khả bảo vệ tế bào HepG2 cao, tỷ lệ tế bào HepG2 sống sót đạt 96,53 ± 1,45% 3.3.3.3 Ảnh hưởng số hợp chất phân lập từ phân đoạn PA-C chùm ruột đến TNF-α, IL-6 IL-10 từ tế bào RAW 264.7 xử lý LPS a Hoạt tính gây độc tế bào RAW 264.7 hợp chất tách chiết từ phân đoạn PA-C Chùm ruột Kết nghiên cứu cho thấy 96% tế bào sống sót bổ sung hợp chất kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside, kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-galactopyranoside, kaempferol3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester isoquercitrin nồng độ 20µM b Ảnh hưởng hợp chất phân lập từ phân đoạn PA-C Chùm ruột đến trình sản xuất TNF-α từ tế bào RAW xử lý LPS Kết nghiên cứu cho thấy với tác động LPS, đại thực bào RAW 264.7 tăng trình sản xuất TNF-α từ 42,24 ± 17,29 lên 773,43 ± 50,55 pg/ml thời điểm 24h từ 57,65 ± 17,67 lên 896,62 ± 28,88 thời điểm 48h Quá trình sản xuất TNF-α bị ức chế hợp chất kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside, kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]β-D-glucuronopyranosyl methyl ester, isoquercitrin, ức chế trình sản xuất TNF-α thay đổi tùy nồng độ chất thời điểm nghiên cứu Tại thời điểm 24h, nồng độ 10 µM, có hợp chất isoquercitrin biểu khả ức chế sản sinh TNF-α với hàm lượng TNF-α 705,84 ± 5,8 pg/ml thấp so 16 với đối chứng 773,43 ± 50,55 pg/ml Nhưng nồng độ 20µM, kaempferol-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside, kaempferol-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester, isoquercitrin biểu khả ức chế sản xuất TNF-α, hàm lượng TNF-α sản xuất 655,07± 38,82pg/ml; 622,89± 17,45pg.ml; 584,49± 13,10 pg/ml, thấp so với đối chứng Tại thời điểm 48h, hợp chất biểu khả ức chế trình sản xuất TNF-α nồng độ 10 20µM Ở nồng độ 10µM hợp chất isoquercitrin biểu khả ức chế cao hai hợp chất lại Tuy nhiên, nồng độ 20µM khả ức chế hợp chất kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-Dglucuronopyranosyl methyl ester gần tương đương với hợp chất isoquercitrin, hàm lượng TNF-α 674,62 ± 42,14; 635,52 ± 18,47 cao so với hợp chất kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside c Ảnh hưởng hợp chất phân lập từ phân đoạn PA-C Chùm ruột đến trình sản xuất IL-6 từ tế bào RAW xử lý LPS Kết nghiên cứu cho thấy, LPS làm tăng sản sinh IL-6 tế bào RAW Quá trình sản sinh IL-6 thay đổi tác động hợp chất kaempferol-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester Ở thời điểm 24h, điều trị kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-βD-glucuronopyranosyl methyl ester nồng độ 20µM hàm lượng IL-6 đạt giá trị 502,82 ± 13,53 pg/ml tăng cao so với đối chứng 417,89 ± 12,67 pg/ml (Hình 3.16) Tuy nhiên, thời điểm 48h, hàm lượng IL-6 đạt giá trị 459,60 ± 21,58 pg/ml điều trị kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-Dglucuronopyranosyl methyl ester nồng độ 20µM giảm thấp so với đối chứng 528,75 ± 20,39 pg/ml d Ảnh hưởng hợp chất phân lập từ phân đoạn PA-C Chùm ruột đến trình sản xuất IL-10 từ tế bào RAW 264.7 xử lý LPS Với tác động LPS, tế bào RAW 264,7 tăng tiết IL-10 từ 52,29± 11,32 pg/ml lên 230,94 ± 19,97pg/ml thời điểm 24h tăng từ 54,47 pg/ml lên 285,40 ± 16,45pg/ml thời điểm 48h Khi điều trị tế bào RAW264,7 hợp chất nghiên cứu, kết cho thấy hợp chất hợp chất kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-Dglucuronopyranoside kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-Dglucuronopyranosyl methyl ester nồng độ 20 µM làm tăng nhẹ trình sản xuất IL-10 tế bào RAW 264,7 thời điểm 24h so với đối chứng, hàm lượng IL-10 tế bào điều trị kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-Dglucuronopyranoside kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-Dglucuronopyranosyl methyl ester 259,41 ± 19,83; 246,19 ± 22,95 pg/ml Khi kéo dài thời gian tác động hợp chất nghiên cứu lên 48h, kết cho thấy hợp chất kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl 17 methyl ester làm tăng hàm lượng IL-10 tăng 16% so với đối chứng Hợp chất isoquercitrin có dấu hiệu làm tăng q trình sản xuất IL-10 tế RAW264,7 Tại thời điểm 48h, điều trị hợp chất isoquercitrin nồng độ 20µM, hàm lượng IL-10 tế bào RAW264,7 tiết đạt giá trị khoảng 324,62 ± 16,45 pg/ml cao so với đối chứng Trong đó, hợp chất kaempferol-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(12)]-β-D-galactopyranoside khơng có biểu tác dụng tăng sản xuất IL-10 tế bào RAW264,7 Từ kết khảo sát khả điều hòa q trình tiết TNF-α, IL-6 IL-10, cho thấy, hợp chất khảo sát hợp chất kaempferol-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(12)]-β-D-galactopyranoside khơng có hoạt tính kháng viêm Hai hợp chất kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside isoquercitrin biểu hoạt tính kháng viêm thông qua hoạt động ức chế TNF-α IL-6 Hợp chất kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester - dẫn xuất glucoronopyranosyl kaempferol glycoside phân lập từ chùm ruột có hoạt tính bảo vệ gan thơng qua hoạt động điều chỉnh hàm lượng cytokine TNF-α, IL-6, IL-10 CHƯƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ 4.1 KẾT QUẢ SÀNG LỌC TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA QUẢ DỨA DẠI, THÂN RỄ CÂY NHĨ ĐƠNG VÀ LÁ CÂY CHÙM RUỘT Theo kết nghiên cứu hầu hết cao chiết phân đoạn Dứa dại, thân rễ Nhó đơng, Chùm ruột có hoạt tính loại bỏ gốc tự với IC50 đạt giá trị từ 14,11 đến 97,63 µg/ml, trừ số phân đoạn ML-D, PA-A PAC Trong đó, đáng ý cao chiết phân đoạn: phân đoạn PA-C từ Chùm ruột có hoạt tính loại bỏ gốc tự tốt với giá trị IC 50 14,11 ± 2,31 µg/ml gần tương đương với giá trị IC 50 acid ascorbic 13,23 ± 1,26 µg/ml; Phân đoạn PO-B từ Dứa dại có hoạt tính loại bỏ gốc tự mạnh với giá trị IC 50 15,54 ± 2,01 µg.ml cao với giá trị IC 50 acid ascobic; Phân đoạn ML-B từ thân rễ Nhó đơng, giá trị IC50 hoạt tính loại bỏ gốc tự 27,88 ± 1,48 µg/ml thấp so với acid ascobic Trong kết nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp MDA , phân đoạn Dứa dại, thân rễ Nhó đơng Chùm ruột có hoạt tính ức chế q trình peroxy hóa với IC 50 đạt giá trị từ 5,98 đến 81,12 µg/ml lipid, trừ số phân đoạn PO-D, ML-D Trong đó, phân đoạn PA-C, PO-B phân đoạn ML-B có hoạt tính ức chế q trình peroxy hóa cao so với phân đoạn lại, giá trị IC50 phân đoạn 5,98 ± 0,56 µg/ml, 8,07 ± 0,75 µg/ml 8,63 ± 1,18 µg/ml Kết cho thấy Dứa dại, thân rễ Nhó đơng, chất chống oxy hóa phân bố phân đoạn phân cực Chùm ruột, chất chống oxy hóa tập trung phân đoạn phân cực Theo kết phân tích sơ thành phần hóa học cho thấy phân đoạn PO-B 18 Dứa dại phân đoạn PA-C Chùm ruột có hoạt chất flavonoid, hợp chất biết có hoạt tính chống oxy hóa mạnh Trong đó, phân đoạn ML-B rễ Nhó đơng lại biểu có hoạt chất anthtraquinon hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa cao Kết phân tích sơ thành phần hóa học thể tương quan với kết khảo sát hoạt tính chống oxy phân đoạn tách chiết từ Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột Đây sở ban đầu cho định hướng bước nghiên cứu 4.2 CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ CÁC PHÂN ĐOẠN PO-B; ML-B VÀ PA-C 4.2.1 Chiết xuất phân lập hợp chất từ phân đoạn PO-B Dứa dại Dựa vào liệu phổ, hợp chất PO1, PO2, PO3, PO4 phân lập từ phân đoạn PO-B xác định vanillin, (+)-pinoresinol, (+)-syringaresinol, (+)mediresinol 4.2.2 Chiết xuất phân lập hợp chất từ phân đoạn ML-D thân rễ Nhó đơng Dựa vào liệu phổ, hợp chất ML1, ML2, ML3 phân lập từ phân đoạn ML-B xác định morindone-5-methyl ether, morindone – 6- methyl ether, soranjidiol 4.2.3 Chiết xuất phân lập hợp chất từ phân đoạn PA-C Chùm ruột Dựa vào liệu phổ, hợp chất PA1 đến PA11 phân lập từ phân đoạn PA-C xác định kaempferol, kaempferol 3-O- β-D-glucopyranoside, quercitrin, keampferol-3-O-rhamnopyranoside, kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]β-D-glucuronopyranoside, kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-Dgalactopyranoside, myricitrin, kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-Dglucuronopyranosyl methyl ester (hợp chất mới), drabanemoroside, isoquercitrin, rutin Hợp chất PA8 (Hợp chất mới) Hợp chất PA8 phân lập dạng bột màu vàng, cơng thức phân tử xác định C28H30O16 kết phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS pic m/z 645.14349 [M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho cơng thức C 28H30O16 Na 645.14315) (Phụ lục B15) Phổ 1H-NMR hợp chất PA8 giống hợp chất PA5 Phổ 1H-NMR PA8 xuất tín hiệu hai proton nằm vị trí ortho với vòng A δ 6,21 (brs) 6,40 (brs), bốn proton vòng B bị para đặc trưng khung kaempferol xuất δ 6,91 (2H, d, J = 8,5 Hz) 8,02 (2H, d, J = 8,5 Hz) Ngoài ra, tín hiệu đường rhamnose xác định δ 5,24 (1H, brs, H-1) nhóm methyl bậc hai δ 0,97 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-6) Tín hiệu proton anomer thứ hai xuất δ 5,78 (d, J = 7,5 Hz) nhóm methoxy δ 3,67 (3H, s) gợi ý có mặt đường glucoronopyranosyl methyl ester (Phụ lục B15) Phổ 13C-NMR DEPT hợp chất PA8 xuất tín hiệu 28 cacbon nhiều PA5 cacbon methoxy Trong đó, 15 nguyên tử cacbon thuộc khung kaempferol 13 nguyên tử cacbon thuộc phân tử đường Phân tử đường rhamnose 19 với cacbon xác định C: 102,7 (C-1′′′), 72,4 (C-2′′′), 72,3 (C-3′′′), 74,0 (C4′′′), 70,0 (C-5′′′) 17,5 (C-6′′′) Bảy nguyên tử cacbon lại C: 100,6 (C-1′′), 79,5 (C-2′′), 78,2 (C-3′′), 73,2 (C-4′′), 76,9 (C-5′′), 170,6 (C-6′′) 52,8 (6′′-OCH3) cho phép xác định cấu trúc đường glucoronopyranosyl methyl ester Các giá trị cộng hưởng proton liên kết trực tiếp với cacbon xác định xác nhờ vào kỹ thuật phổ chiều HSQC Tương tác HMBC proton H-5′′ (H 3,81) nhóm methoxy (H 3,67) với C-6′′ (C 170,6) khẳng định có mặt phân tử đường glucoronopyranosyl methyl ester Tương tác HMBC proton anomer đường glucoronopyranosyl methyl ester H-1′′ (H 5,78) với C-3 (C 134,1) khung kaempferol cho phép xác định đường liên kết với khung vị trí C-3 Bên cạnh đó, tương tác HMBC proton anomer đường rhamnose H-1′′′ (H 5,24) với C2′′ (C 79,5) cho thấy phân tử đường rhamnose nối với C-2′′ đường glucoronopyranosyl methyl ester ( Phụ lục B15) Từ kiện phổ trên, so sánh với hợp kaempferol-3-O-(2-α-L-rhamnopyranosyl)-β-Dglucuronopyranoside (Furusawa cs., 2005) hợp chất kaempferol 3-O-β-Dglucuronopyranosyl methyl ester (Jung cs, 2003), hợp chất PA8 xác định kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester 4.3 HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA, BẢO VỆ GAN CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƯỢC TÁCH CHIẾT TỪ QUẢ CÂY DỨA DẠI, THÂN RỄ CÂY NHĨ ĐƠNG VÀ LÁ CÂY CHÙM RUỘT 4.3.1 Hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan hợp chất tách chiết từ phân đoạn PO-B Dứa dại Hoạt tính chống oxy hóa Kết nghiên cứu cho thấy hợp chất tách chiết có hợp chất: (+)-pinoresiol, (+)-syringaresinol, (+)-medioresinol thuộc lớp chất lignan có hoạt tính chống oxy hóa Các hợp chất có khả kết hợp loại bỏ gốc tự tốt giá trị IC50 (+)-pinoresiol, (+)-syringaresinol, (+)-medioresinol 5,93± 0,97; 16,53 ± 1,69 7,50 ± 1,17 tương đương với đối chứng tham khảo ascorbic acid Bên cạnh đó, hai hợp chất (+)-pinoresiol, (+)-medioresinol biểu khả ức chế q trình peroxy hóa lipid với IC50 11,04 ± 0,67 5,82± 0,67 cao so với đối chứng tham khảo Phân tích đặc điểm cấu trúc (+)-pinoresiol hợp chất đối xứng hoàn toàn, (+)-medioresinol nhiều (+)-pinoresiol nhóm methoxy vị trí 5, biểu thị mối quan hệ đặc tính cấu trúc hoạt tính sinh học Tác dụng bảo vệ tế bào HepG2 Dưới tác động CCl4, số lượng tế bào HepG2 giảm xuống 37,36 ± 1,32%, bổ sung hợp chất (+)-pinoresiol; (+)-medioresinol, vanillin, (+)syringaresinoltỷ lệ sống sót tế bào HepG2 tăng lên, đáng ý hợp chất (+)-pinoresiol; (+)-medioresinol biểu hoạt tính bảo vệ tế bào HepG2 nồng độ 50µg/ml, hai hợp chất lại vanillin, (+)-syringaresinol biểu hoạt tính nồng độ 100µg/ml 20 Tổn thương CCl4 gây tế bào HepG2 tác động trực tiếp gián tiếp liên quan đến q trình chuyển hóa cacbontetraclorua thành gốc tự trichloromethyl, dẫn đến q trình peroxy hóa lipid gây độc tính gan Với hoạt tính chống oxy hóa thơng qua hoạt động loại bỏ gốc tự ức chế trình peroxy hoa tế bào, hợp chất tách chiết từ Dứa dại mà (+)-pinoresiol; (+)-medioresinol đóng vai trò quan trọng hoạt động bảo vệ tế bào gan HepG2 4.3.2 Hoạt tính chống oxi hóa, bảo vệ gan hợp chất tách chiết từ phân đoạn ML-B thân rễ Nhó đơng Hoạt tính chống oxy hóa Ba hợp chất anthraquinone gồm morindone-5-methyl ether, morindone methyl ether, sorajidiol tách chiết từ phân đoạn hoạt tính chống oxy hóa thơng qua hoạt động loại bỏ gốc tự ức chế trình peroxyl hóa lipid màng tế bào Theo kết phân tích hợp chất, hai hợp chất morindone-5-methyl ether, sorajidiol xuất nhóm hydroxyl vị trí ortho (6-OH) hợp chất morindone -6- methyl ether vị trí orthor khơng xuất nhóm hydroxyl, nguyên nhân dẫn đến kết hợp chất khơng biểu hoạt tính chống oxy hóa thử nghiệm thực Tác dụng bảo vệ tế bào HepG2 Khi quan sát hoạt tính chống CCl4 bảo vệ tế bào HepG2, hợp chất morindone-5-methyl ether, morindone methyl ether, sorajidiol có biểu hoạt tính bảo vệ tế bào HepG2 Tuy nhiên, ba mẫu hợp chất morindone-5-methyl ether, morindone methyl ether, sorajidiol có màu vàng đỏ, dẫn tới màu mẫu ảnh hưởng đến giá trị mật độ quang (DO) nồng độ Do đó, chưa thể kết luận hoạt tính bảo vệ tế bào HepG2 chống lại tổn thương CCl gây hợp chất tách chiết từ rễ Nhó đơng thử nghiệm 4.3.3 Hoạt tính chống oxi hóa, bảo vệ gan hợp chất tách chiết từ phân đoạn PA-C Chùm ruột Hoạt tính chống oxy hóa Từ phân đoạn PA-C Chùm ruột, hợp chất kaempferol, quercetin-3-O-αL-rhamnopyranoside (Quercitrin), myricitrin, isoquercitrin hợp chất tách chiết hợp có hoạt tính chống oxy hóa cao, hợp chất hợp chất thuộc flavonol – flavonoid có nhóm keton flavonol, hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa cao Bors cộng phân tích mối tương quan cấu trúc hoạt động loại bỏ gốc tự chống oxy hóa flavonoid nhận thấy, flavonoid có hoạt tính chống oxy hóa tốt cấu trúc đáp ứng yếu tố sau: (1) có cấu trúc 3´,4´-dihydroxy vòng B, (2) có liên kết đơi C2 C3 với xuất nhóm keton vòng C, (3) có mặt nhóm 3-hydroxyl vòng C nhóm 5-hydroxyl vòng A (Bors cs., 1990) Trong cấu trúc kaempferol, quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside (Quercitrin), myricitrin, isoquercitrin đáp ứng hầu hết yếu tố cấu trúc Tuy nhiên khả hoạt tính 21 chống oxy hóa hợp chất thay đổi khác khác cấu trúc, có mặt nhóm 3-hydroxyl vòng C yếu cầu cho hoạt động loại bỏ gốc tự tối ưu flavonoid, hợp chất quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside (Quercitrin), myricitrin có rhamnose hợp chất isoquercitrin có glucopyranoside vị trí C3 Chính đa dạng đường ảnh hưởng đến hoạt tính chống oxy hóa hợp chất flavonoid Tác dụng bảo vệ tế bào HepG2 Trong mơ hình nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan in vitro, hợp chất quercitrin, kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside, kaempferol 3-O-α-Lrhamnopyranosyl-(12)-α-L-arabinopyranoside, isoquercitrin, kaempferol-3-O-[αL-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside, kaempferol-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(12)]-β-D-galactopyranoside, myricitrin, kaempferol-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester thể hoạt tính bảo vệ tế bào tác động gây hại CCl4 Trong đáng ý hai hợp chất myricitrin hợp chất kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-Dglucuronopyranosyl methyl ester nồng độ 100 µg/ml có khả bảo vệ tế bào HepG2 chống lại tác động gây độc CCl4 tương đối cao Hợp chất myricitrin có hoạt tính bảo vệ tế bào mạnh hợp chất tách chiết từ Chùm ruột 96,53 ± 1,45 % tế bào HepG2 sống sót với tác dụng của hợp chất myricitrin tác động gây độc CCl thông qua hoạt động loại bỏ gốc tuwjdo ức chế trình peroxyl hóa lipid Hợp chất kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester, 50,19 ± 1,82% tế bào gan Hep2G sống sót tác động gây độc CCl4 Theo kết nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa, hợp chất kaempferol-3-O-[αL-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester khơng thể hoạt tính chống oxy hóa hai mơ hình thực nghiệm loại bỏ gốc tự DPPH ức chế q trình peroxyl hóa lipid MDA Như vậy, hợp chất kaempferol-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester bảo vệ tế bào gan HepG2 không thông qua đường chống oxy hóa Ảnh hưởng số hợp chất đến trình sản sinh TNF-α, Il-6 IL10 từ tế bào RAW 264.7 cảm ứng LPS Hợp chất kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-Dglucuronopyranoside isoquercitrin biểu hoạt tính ức chế sản xuất TNF-α, IL-6 từ tế bào RAW264.7 xử lý LPS thời điểm 24h 48h Ngoài ra, hợp chất kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-Dglucuronopyranoside nồng độ 20µM, có tác dụng làm tăng hàm lượng IL-10 thời điểm 24h hợp chất isoquercitrin có tác dụng tăng trình sản sinh IL-10 thời điểm 48h so với đối chứng, nhiên mức tăng không đáng kể Hợp chất kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl 22 methyl ester bên cạnh hoạt tính ức chế trình sản sinh TNF-α từ tế bào RAW 264,7 xử lý LPS, nồng độ 20µM, hợp chất có tác dụng làm tăng IL-6 thời gian đầu giảm hàm lượng IL-6 giai đoạn sau Tại thời điểm 24h, hàm lượng IL-6 tăng 20% so với đối chứng thời điểm 48h hàm lượng IL-6 bắt đầu giảm xuống giảm gần 9% so với đối chứng Ngoài ra, hợp chất kaempferol-3-O-[αL-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester có tác dụng làm tăng hàm lượng IL-10 thời điểm nghiên cứu Tại thời điểm 24h, mức tăng hàm lượng IL-10 không đáng kể kéo dài thời gian tác động hợp chất kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester đến 48h hàm lượng IL-10 tăng 16% so với đối chứng Theo kết công bố cho thấy, TNF-α cytokine xuất sớm gan bị tổn thương Đây cytokine tiền viêm, tham gia vào sinh lý bệnh học gan, chất trung gian làm tế bào gan bị chết đồng thời gây nên sản sinh cytokine khác Khi tế bào gan tăng trình sản sinh TNF-α, thụ thể TNF-α bề mặt tế bào hoạt hóa dẫn đến kích hoạt protein kinase liên quan đến stress JNK IKK Kết trình tế bào gan tăng tiết cytokie tiền viêm Do đó, ức chế TNF-α coi biện pháp ngăn chặn tổn thương gan, bảo vệ gan Bên cạnh TNF-α, gan bị tổn thương, IL-6 tổng hợp tăng tiết IL-6 đóng vai trò quan trọng cân nội môi tế bào gan, liên quan đến chức chuyển hóa gan tái tạo gan, nhiên đường tín hiệu IL-6 bị kích hoạt liên tục gây bất lợi cho gan dẫn đến hình thành, phát triển khối u gan IL-6 liên kết với IL-6R/gp80 tế bào gan sau tạo phức với protein gp130 Chính tạo phức dẫn đến q trình trùng nhị hóa hai phân tử protein pg130 nội bào Các phức hệ trùng nhị hóa phức hợp thụ thể kích hoạt phosphorylate kinase JAK kích hoạt yếu tố phiên mã STAT3 STAT3 kích hoạt dịch chuyển vào nhân điều chỉnh phiên mã gen bao gồm protein điều hòa ngăn cản tế bào chết tăng sinh tế bào Trong gan, trình thúc đẩy tái tạo tế bào gan, đáp ứng pha cấp tính bảo vệ gan chống lại Fas độc tố Selzner cộng báo cáo IL-6 trung gian hòa giải mạnh tăng sinh tế bào gan làm giảm tổn thương tế bào gan viêm gan thiếu máu cục hay nhiễm độc cấp tính Do đó, hợp chất kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester liên quan đến việc kích hoạt đường dẫn truyền STAT3 bảo vệ gan thơng qua hoạt động thúc đẩy trình sản xuất IL-6 Tuy nhiên, bên cạnh vai trò chất điều hòa miễn dịch kháng viêm, IL-6 gọi cytokine tiền viêm, trình sản xuất IL-6 kéo dài gây tổn hại cho gan Cytokine IL-6 tăng ngắn hạn (tăng lên nhanh chóng giảm) thể rõ đường STAT3 trường hợp nhiễm độc gan cấp tính rượu giảm dần có mặt cytokine IL-10 (Braun cs., 2013) 23 Khơng IL-6 mà IL-10 có khả kích hoạt đường truyền tín hiệu STAT3 kéo dài q trình kích hoạt Trong gan, cytokine IL-10 tạo tế bào Kupffer điều hòa viêm cách ức chế cytokine tiền viêm TNF-α IL-6 Như vậy, hợp chất kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-Dglucuronopyranoside isoquercitrin thông qua hoạt động ức chế trình sản xuất cytokine tiền viêm TNF-α IL-6 biểu tính kháng viêm Còn hợp chất kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester dẫn xuất glucoronopyranosyl kaempferol glycoside phân lập từ chùm ruột có hoạt tính bảo vệ gan giai đoạn cấp tính cách điều chỉnh số cytokine Hợp chất kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-Dglucuronopyranosyl methyl ester bảo vệ gan thơng qua đường tín hiệu STAT3 cách ức chế TNF-α, kích hoạt IL-10 điều chỉnh sản xuất IL-6 thời điểm khác Cùng với glycosides kaempferol khác, hợp chất kaempferol-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester hợp chất đóng dẫn đến hoạt tính bảo vệ gan Chùm ruột Kết phản ánh hoạt động bảo vệ gan hợp chất KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Các nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan Dứa dại, than rễ Nhó đông Cây chùm ruột thu kết sau: Các phân đoạn clorofom Dứa dại, diclomethane rễ Nhó đơng ethyl acetate Chùm ruột có hoạt tính chống oxy hóa mạnh thơng qua hoạt động loại bỏ gốc tự DPPH ức chế q trình peroxyl hóa lipid Kết nghiên cứu thành phần hóa học từ loài thực vật thu được: - hợp chất tách chiết từ phân đoạn clorofom Dứa dại vanillin (PO1), (+)-pinoresinol (PO2), (+)-syringaresinol (PO3), medioresinol (PO4) - hợp chất tách chiết từ phân đoạn diclomethane thân rễ Nhó đơng morindone-5-methyl ether (ML1), morindone-6- methyl ether (ML2), soranjidiol (ML3) - 11 hợp chất tách chiết từ phân đoạn ethyl acetate Chùm ruột kaempferol (PA1), kaempferol 3-O- β-D-glucopyranoside (PA2), quercitrin (PA3), kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside (PA4), kaempferol-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside (PA5), kaempferol-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(12)]-β-D-galactopyranoside (PA6), myricitrin (PA7), kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester (PA8, chất mới), drabanemoroside (PA9), isoquercitrin (PA10), rutin (PA11) Kết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan hợp chất tách chiết từ phân đoạn PO-B, ML-B PA-C từ loài thực vật cho thấy: 24 - Hai hợp chất (+)-medioresinol (PO4) (+)-pinoresiol (PO2) Dứa dại có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, đóng vai trò quan trọng hoạt động bảo vệ tế bào gan chống lại tác động gây độc CCl4 - Ba hợp chất morindone-5-methyl ether (ML1), morindone methyl ether (ML2), sorajidiol (ML3) than rễ Nhó đơng chưa thể hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ tế bào gan HepG2 thử nghiệm thực - Các hợp chất kaempferol (PA1), quercitrin (PA3), kaempferol-3-O-α-Lrhamnopyranoside (PA4), kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-Dgalactopyranoside (PA6), myricitrin (PA7), drabanemoroside (PA9), isoquercitrin (PA10), rutin (PA11) tách chiết từ Chùm ruột có hoạt tính chống oxy hóa thử nghiệm thu dọn gốc tự DPPH, ức chế peroxy hóa lipid Một số hợp chất lại cho thấy tác dụng bảo vệ tế bào gan tác động CCl tác động tới hoạt động cytokine tiền viêm TNF-alpha IL-6 Hợp chất kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-Dglucuronopyranosyl methyl ester - dẫn xuất glucoronopyranosyl kaempferol glycoside - phân lập từ Chùm ruột có hoạt tính bảo vệ gan thông qua hoạt động điều chỉnh hàm lượng cytokine phụ thuộc thời gian TNF-α, IL-6, IL-10 đường tín hiệu STAT3 KIẾN NGHỊ Những kết thu cơng trình khả quan nghiên cứu ban đầu Một số hướng nghiên cứu cần tiếp tục thực sau: Phân lập xác định cấu trúc chất khác từ phân đoạn có hoạt tính mạnh Dứa dại, rễ Nhó đơng Chùm ruột Thử nghiệm tác dụng bảo vệ gan in vivo phân đoạn chất tinh mô hình gây độc gan cấp tính mạn tính Nghiên cứu dạng chế phẩm thích hợp từ Dứa dại, rễ Nhó đơng, Chùm ruột để thử nghiệm dược lý lâm sàng nhằm sử dụng bảo vệ, điều trị bệnh gan 25 NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI Nguyễn Mạnh Cường, Ninh Thế Sơn, Đoàn Thị Vân, Nguyễn Công Thùy Trâm, Phạm Quốc Sự, Nguyễn Duy Thuần (2015), Chiết tách số chất thuộc nhóm Phenolic từ Dứa dại Pandanus odoratissimus L.f Tạp chí hóa học, 53(4): 432-435 Nguyen Manh Cuong, Pham Quoc Long, Ninh The Son, Đoan Thi Van, Pham Ngoc Khanh, To Đao Cuong, Vu Thi Ha, Nguyen Cong Thuy Trâm, Đo Quoc Viet, Tran Thi Thu Huong (2016) Phenylethanoid glucoside and anthraquinone compounds from Morinda longggissima Y.Z.Ruan roots Vietnam journal of chemistry 54(2e): 133-138 Nguyen Cong Thuy Tram, Ninh The Son, Do Thi Thao, Nguyen Manh Cuong (2016) Kaempferol and kaempferol glycosides from Phyllanthus acidus leaves, Vietnam Journal of Chemistry, International Edition, 54(6): 790-793 Nguyễn Công Thùy Trâm, Ninh Thế Sơn, Nguyễn Mạnh Cường, Nguyễn Thị Cúc, đỗ Thị Thảo (2017), Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro phân đoạn chiết xuất hợp chất phân lập từ Dứa dại (Pandanus odoratissimus L.F.), Tạp chí Y-dược học quân (6) Nguyen Cong Thuy Tram, Ninh The Sơn, Nguyen Thị Nga, Vu Thu Phuong, Nguyen Thi Cuc, Do Thi Phuong, Gilles Truan, Nguyen Manh Cuong, Do Thi Thao (2017), The hepatoprotective activity of a new derivative kaempferol glycoside from the leaves of Vietnamese Phyllanthus acidus (L.) Skeels Medicinal Chemistry Research, 26(9): 2057-2064 ... dẫn đến hoạt tính bảo vệ gan Chùm ruột Kết phản ánh hoạt động bảo vệ gan hợp chất KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Các nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan Dứa dại, than rễ Nhó đơng Cây chùm ruột thu... cứu hoạt tính bảo vệ gan ba lồi thực vật Dứa dại (Pandanus odoratissimus), Nhó đơng (Morinda longissima), Chùm ruột (Phyllanthus acidus) Việt Nam với mục tiêu sau: Sàng lọc hoạt tính chống oxy... bệnh gan, stress oxy hóa chất chống oxy hóa liên quan đến bảo vệ gan, loài thực vật nghiên cứu; CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1 Vật liệu sử dụng nghiên cứu